Vector chuyển gen
Việc nghiên cứu một gen xác định ở sinh vật eucaryote gặp phải nhiều khó
khăn, vì gen đó chỉ là trình tự nhỏ nằm lọt trong toàn bộ gen có kích thước
lớn. Để thu nhận lượng gen tinh sạch với hàm lượng lớn người ta phải chuyển
và tạo dòng gen đó.
Để chuyển gen từ tế bào A (tế bào cho) sang tế bào B (tế bào nhận) chỉ có thể
thực hiện bằng cách đính các gen cần chuyển vào một yếu tố trung gian được
gọi là đoạn dẫn. Những đoạn dẫn này có khả năng hướng dẫn, vận chuyển
các đoạn gen cần nghiên cứu vào tế bào nhận. Đoạn dẫn này chính là các
vector chuyển gen.
Vector
Vector là phân tử DNA nhỏ (ngắn) dạng thẳng hoặc dạng vòng, trong đó,
người ta sẽ cài một mảnh DNA (gen quí) cần nghiên cứu. Những mảnh DNA
đã được cài gọi là đoạn cài (insert) hoặc DNA ngoại lai hoặc DNA lạ.
Các phân tử DNA nhỏ này thường là những thực khuẩn thể hoặc các plasmid
mà trong bộ gen của chúng có tín hiệu cần thiết cho chúng tái bản, nhưng
chúng lại không biết tái bản (sinh sôi nẩy nở) một mình. Chúng cần đưa vào
trong các tế bào chủ (ví dụ như tế bào vi khuẩn chẳng hạn).
Những yêu cầu cơ bản của một vector chuyển gen
Vector phải có một vùng nhận biết đối với một enzyme giới hạn loại II. Vùng
này sẽ là vùng cài lắp một DNA (gen cần nghiên cứu) đã được xử lý bởi cùng
enzyme giới hạn. Thật vậy, mỗi một RE tạo ra một đầu so le riêng, có khả
năng gắn với một đoạn DNA mang đầu so le tương ứng. Hơn nữa, các vùng
nhận biết này thường được đặt vào giữa các gen chỉ thị để tiện theo dõi sự
biểu hiện hoạt động của gen tái tổ hợp. Thông thường, đó là những gen kháng
kháng sinh, hoặc gen mã hóa tổng hợp enzyme có khả năng chuyển hoá cơ
chất tạo màu dễ phát hiện trên mặt thạch.
Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn
trong tế bào chủ.
Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận lượng DNA tối đa
và dễ biến nạp vào tế bào chủ.
Vector phải có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, không
phụ thuộc vào sự sao chép bộ gen của tế bào chủ.
Đảm bảo sự di truyền bền vững của một DNA tái tổ hợp.
Chúng không có khả năng sống sót ngoài tế bào chủ và không chuyển
vào tế bào chủ khác bằng con đường tiếp hợp.
Có trình tự điều hoà tạo điều kiện thuận lợi cho việc phiên mã của
gen được đưa vào.
Khả năng biến nạp lớn nghĩa là có khả năng thấm tốt vào tế bào
chủ của vector mang gen tái tổ hợp.
Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp, yêu cầu này là cần thiết cho
việc phát hiện dòng cần tìm.
Tinh chế dễ dàng với khối lượng lớn bản sao của gen gắn vào vector.
Ngày nay các vector chuyển gen ngày càng hoàn thiện và tiện lợi cho việc sử
dụng. Không có vector nào toàn năng cho sự chuyển gen mà cần có sự lựa
chọn tùy đối tượng và tùy kích thước đoạn gen cần tạo dòng. Chúng được cấu
tạo với nhiều tính chất chuyên biệt để mang được các trình tự nucleotide như
mong muốn.
Các loại enzim tổng hợp axit nuclêic
Enzyme sao chép một axit nucleic: Quá trình sao chép chuỗi axit nucleic tức
là tổng hợp một chuỗi DNA hoặc RNA được tiến hành theo nguyên tắc bổ
sung và đối song song. Việc thêm một nucleotide mới được tiến hành theo
hướng 5’ → 3’.
1- Enzyme sao chép DNA → DNA
Là các enzyme DNA-polymerase I, enzyme T4 DNA-polymerase, Taq
polymerase tổng hợp chuỗi DNA từ một khuôn DNA hay còn gọi "enzyme
phụ thuộc DNA".
1.1- Enzyme DNA - polymerase I
Enzyme DNA-polymerase có nguồi gốc được tách từ vi khuẩn E. Coli, chúng
có ba hoạt tính:
- Hoạt tính tổng hợp DNA theo hướng 5’ → 3’ và sửa chữa trong
sao chép,
- Hoạt tính exonuclease theo hướng 3’ → 5’,
- Hoạt tính exonuclease theo hướng 5’ → 3’.
Ngày nay enzyme DNA-polymerase được dùng chủ yếu để xác định trình tự
DNA bằng phương pháp didesoxynucleotide của Sanger, ngoài ra, còn dùng
để tổng hợp mẫu dò có độ phóng xạ cao, hoặc xây dựng các vector từ DNA
mạch đơn.
Trong thực tế người ta hay sử dụng đoạn Klenow là sản phẩm thủy phân của
enzyme DNA-polymerase I, có hoạt tính exonuclease theo hướng 3’ → 5’ và
hoạt tính tổng hợp.
1.2- Enzyme T4 DNA - polymerase
Có nguồn gốc từ phage T4 xâm nhiễm E. Coli có hoạt tính exonuclease theo
hướng 3’ → 5’ . Enzyme này mạnh nên được sử dụng nhiều để tổng hợp
mẫu dò có độ phóng xạ cao.
1.3- Enzyme Taq - polymerase
Trích li từ vi khuẩn Thermocellus aquaticus, là enzyme chịu nhiệt cao, có tác
dụng khuyếch đại tổng hợp DNA. Enzyme này chủ yếu sử dụng để nhân
dòng gen trong phản ứng PCR.
2- Enzyme phiên mã ngược (Reverse transferase)
Là enzyme có khả năng sao chép bộ gen RNA của retrovirus khi ký sinh
trong tế bào chủ tạo ra cDNA, theo chiều 5’ → 3’ cần có mặt của mồi. Đây là
giai đoạn cần thiết để tạo ra ngân hàng cDNA.
Hiện nay trên thị trường enzyme phiên mã ngược có nguồn gốc từ AMV
(Avian Myeloblastosis Virus). Enzyme phiên mã ngược là một DNA-
polymerase 5’ → 3’, có các đặc tính sau:
- Là enzyme phụ thuộc RNA,
- Tổng hợp DNA theo hướng 5’ → 3’,
- Có hoạt tính RNase.
Chúng được ứng dụng để thiết lập ngân hàng cDNA hoặc tiến hành phản ứng
PCR trên mRNA, ngoài ra, chúng còn được sử dụng để xác định trình tự
DNA bằng phương pháp sử dụng các didesoxynucleotide của Sanger.
3- Các enzyme tổng hợp RNA (RNA-polymerase)
Có ba loại RNA polymerase được sử dụng nhiều nhất hiện nay là SP6 RNA-
polymerse có nguồn gốc từ phage xâm nhiễm Salmonella typhimurium. T3,
T7 RNA-polymerase được trích ly từ phage T3 và T7 xâm nhiễm E. Coli.
Các enzyme này hoạt động trên sợi khuôn DNA xúc tác sự tổng hợp RNA
theo hướng 5’ → 3’. Quá trình tổng hợp không cần mồi nhưng khuôn DNA
phải mang promoter đặc trưng của phage. Các enzyme này được ứng dụng
để:
- Để tổng hợp các mẫu dò RNA đánh dấu phóng xạ trong phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu bản phiên mã RNA của một DNA đã được dòng hóa
nhờ phương pháp PCR.
- Xác định trình tự DNA được gắn trong một vector có mang các
promoter đặc trưng của phare SP6, T3 , T7.
Ngoài ra người ta còn dùng enzyme này tổng hợp lượng lớn RNA từ DNA
được nối ngay sau promoter thích hợp.
4- Enzyme terminal - transferase
Enzyme này được trích ly từ tuyến ức bê. Có các đặc tính:
- Terminal-transferase xúc tác gắn cùng một loại nucleotide vào đầu
3’−OH tự do của phân tử DNA để tạo đuôi polynucleotide.
Chúng được ứng dụng để:
- Thêm đuôi polynucleotide để tạo đầu sole cho phân tử DNA dùng trong kỹ
thuật tạo dòng.
- Đánh dấu đầu 3’ (OH) của phân tử DNA để xác định trình tự axit nucleic
theo Manxam và Gilbert.
