ĐÀO THỊ TUYẾT – Xác định nồng độ các thành phần xơ dừa ..
1
XÁC ĐỊNH NỒNG ĐỘ CÁC THÀNH PHẦN XƠ DỪA, CÁM GẠO, BỘT ĐẬU
TƯƠNG VÀ URÊ ĐỂ CÁC CHỦNG NẤM MỐC Aspergillus awamori VTCC-F296,
A.niger VTCC-F128 VÀ A. oryzae MN SINH TỔNG HỢP NHIỀU
MANNANASE
Đào Thị Tuyết1*, Vũ Thị Thu Hằng1, Lã Văn Kính2 và Quyền Đình Thi1
1 Viện Công nghệ sinh học; 2 Viện Khoa học và Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam
*Tác giả liên hệ: Quyền Đình Thi - Viện Công nghệ sinh học - Hà Nội
Tel. (04) 37.568.260; Fax: 04.38.363.144; E-mail: quyen@ibt.ac.vn
ABSTRACT
Determination of culture component concentration of coconut fiber, rice bran, soya powder and urê for
filamentous strains Aspergillus awamori VTCC-F296, A. niger VTCC-F128 AND A. oryzae MN producing
high level of mannanase
Three strains A. niger VTCC-F128, A. oryzea MN02 and A. awamori VTCC-F296 screened from 131
filamentous strains Aspergillus, grew and produced a high level of mannanase on carbon and nitrogen sources as
agricultural by-product. The strain A. niger VTCC-F128 produces mannanase of 62.4 U/ml in the mineral culturê
medium Czapek (0,1% K2HPO4; 0.2% NaNO3; 0.05% MgSO4, 0.05% KCl) supplemented with 2% coconut fiber
and 0.1% soya powder. In the replaced culturê medium using 4% rice bran as the carbon source and 0.1% urê as
nitrogen, mannanase activity of the strain A. oryzae MN riched 63.7 U/ml; the strain A. awamori VTCC-F296
produced 186.5 U/ml with 3% rice bran and 0.4% urê. In the replaced culturê medium, the strain A. awamori
VTCC-F296 produced mannanase three times higher than in the basic culture medium.
Key words: coconut fiber, rice bran, soya powder; Aspergillus niger VTCC-F128, Aspergillus oryzae MN,
Aspergillus awamori VTCC-F296, culture condition, mannanase.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Endo--1,4-mannanase (EC 3.2.1.78) là enzyme xúc tác thủy phân ngẫu nhiên các liên kết -
1,4-mannopyranosyl trong chuỗi mannan và rất nhiều polysaccharide khác có thành phần chủ
yếu là mannose, sản phẩm thủy phân của mannanase là các mannobiose, mannotriose và các
oligosaccharide khác. Mannanase đã được sản xuất trên qui mô công nghiệp và được ứng
dụng trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp giấy (Kansoh, Nagieb, 2004), thực
phẩm, chế biến thức ăn gia súc (Wu và cs, 2005), dược phẩm cho đến dầu khí. Hiện nay, với
khả năng thủy phân bã cơm dừa, mannanase cũng được sử dụng để phân hủy nguồn thải của
các nhà máy chế biến thực phẩm từ dừa, sản xuất các oligosaccharide ứng dụng trong công
nghiệp dược phẩm, các loại thực phẩm chức năng.
Hiện nay việc sử dụng mannanase để chuyển hóa các nguyên liệu không có giá trị dinh dưỡng
thành sản phẩm có giá trị hoặc cải thiện một số đặc tính kĩ thuật của nguyên liệu đang được
nhiều nhà khoa học quan tâm. -mannosidase và -mannanase được sản xuất từ chủng A.
awamori K4 trong môi trường lỏng với bã cà phê 40% và 60% cám lúa mì, tối ưu pH 5
(Kurakake và Komaki, (2001). Tại Việt Nam, Đặng Thị Thu và cs, (2003) đã phân lập và
đánh giá tính chất endo--1,4-mannanase từ A. awamori BK. Chủng này sinh tổng hợp
mannanase cao sau 120 giờ nuôi ở môi trường lỏng có thành phần khoáng czapek, bã cà phê
(21,3 g/l), guargum (10 g/l), cao nấm men (22 g/l) (Đặng Thị Thu và cs, 2003). Trong một
nghiên cứu trước, tối ưu điều kiện nuôi cấy ban đầu cho thấy thời gian sinh tổng hợp
mannanase cao nhất của chủng A. niger VTCC-F128 là 120 giờ, nhiệt độ 37C, pH 6,0; chủng
A. oryzae MN là 96 giờ, nhiệt độ 28C, pH 5,0 và chủng A. awamori VTCC-F296 là 168 giờ,
nhiệt độ 37C, pH 7,0 (Đào Thị Tuyết và cs, 2009). Nguồn cơ chất cảm ứng tốt nhất cho sinh
tổng hợp mannanase của cả ba chủng là guargum. Cả 3 chủng trên đều là các chủng có khả
VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 18-Tháng 6-2009
2
năng phát triển và sinh tổng hợp mannanase cao trên nguồn cacbon và nitrogen là các sản
phẩm hoặc phụ phế liệu của sản xuất chế biến nông sản, chủng A. niger VTCC-F128 (xơ dừa,
bã mía và bột đậu tương); A. awamori VTCC-F296 và chủng A. oryzae MN (cám gạo và urê)
(Đào Thị Tuyết và cs, 2009).
Trong nghiên cứu này, tỷ lệ của các thành phần carbon và nitrogen như xơ dừa, cám gạo, bột
đậu tương và urê tiếp tục được khảo sát để xây dựng các công thức môi trường nuôi cấy các
chủng Aspergillus awamori VTCC-F296, A. niger VTCC-F128, A. oryzae MN sinh tổng hợp
mannanase cao nhằm sản xuất các chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn trong chăn nuôi.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Chủng giống nấm
Chủng Aspergillus awamori VTCC-F296 và Aspergillus niger VTCC-F128 do Viện Vi sinh
vật và Công nghệ sinh học cung cấp; chủng Aspergillus oryzae MN02 do Viện Khoa học Kỹ
thuật miền Nam cung cấp.
Môi trường và phương pháp nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy cơ bản cho sinh tổng hợp mannanase là môi trường khoáng (MTK)
Czapek (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3; 0,05% MgSO4, 0,05% KCl); 0,5% cao nấm men, 1%
peptone; 0,5% guargum. Để xác định TP môi trường nuôi tối ưu cho các chủng Aspergillus
sinh tổng hợp mannanase cao từ các nguồn phụ phế liệu sẵn có trên thị trường, cao nấm men
và peptone được thay thế bằng bã mía, bã sắn, xơ dừa và bột đậu tương cho A. niger VTCC-
F128; cám gạo và urê cho A. oryzae MN và A. awamori VTCC-F296. Chủng A. awamori
VTCC-F296 được nuôi trong môi trường thay thế bổ sung 0,5% guargum, lắc 200 v/ph, ở
37C, pH 7. Chủng A. niger VTCC-F128 được nuôi trong môi trường thay thế bổ sung 0,3%
guargum, lắc 200 v/ph, ở 37C, pH 6. Chủng A. oryzae MN02 được nuôi trong môi trường
thay thế bổ sung 0,7% guaragum, lắc 200 v/ph, ở 28C, pH 5.
Hóa chất: Các hóa chất dùng trong thí nghiệm được cung cấp từ các hãng khác nhau:
KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaNO3, KCl, guargum, locust bean gum (LBG) (Biochemika),
peptone (Merck),3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) (Fluka). Cột Microsep 10K Omega (Mexico).
Xác định hoạt tính
Hoạt tính endo--1,4-mannanase được định tính theo phương pháp khuếch tán enzyme trên
đĩa thạch đã mô tả trước đây (Nguyễn Sỹ Lê Thanh và cs, 2006) có cải tiến. Thời gian ủ trong
tủ lạnh 4C cho enzyme khuếch tán là 12 giờ và thời gian ủ cho phản ứng enzyme cơ chất xảy
ra là 6 giờ ở 37C. Hoạt tính endo--1,4-mannanase được định lượng chính xác theo phương
pháp quang phổ (Miller, 1959) với nhiệt độ phản ứng là 40C. Một đơn vị hoạt tính
mannanase được định nghĩa là lượng enzyme xúc tác thủy phân giải phóng 1mol mannose
trong 1 phút ở điều kiện thích hợp.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Môi trường thay thế nuôi chủng A. awamori VTCC-F296
Chủng A. awamori VTCC-F296 được nuôi trong môi trường MTK; 0,7% guargum; 0,1%
ĐÀO THỊ TUYẾT – Xác định nồng độ các thành phần xơ dừa ..
3
peptone, tỷ lệ cấy chuyển giống là 3% với nguồn carbon là cám gạo (1-5%). Sinh tổng hợp
mannanase của chủng A. awamori VTCC-F296 tăng lên 20% ở môi trường chứa 3% cám gạo
(78,8 U/ml) so với môi trường đối chứng MTK chứa cao nấm men (65,8 U/ml). Trong môi
trường bổ sung nhiều cám gạo (5%) khả năng sinh tổng hợp mannanase của chủng này kém đi
nhiều chỉ còn 50,1 U/ml (Bảng 1)
Bảng 1. Ảnh hưởng của nồng độ cám gạo và urê lên khả năng sinh tổng hợp mannanase của
chủng A. awamori VTCC-F296.
Hoạt tính Hoạt tính
Cám gạo (%) (U/ml) (%) Urê (%) (U/ml) (%)
1 71,5 109 0,1 44,6 85
2 73,3 111 0,2 49,6 94
3 78,8 120 0,3 51,7 98
4 70,2 107 0,4 64,5 123
5 50,1 76 0,5 60,0 114
ĐC 65,8 100 ĐC 52,6 100
Chủng A. awamori VTCC-F296 được nuôi trong môi trường MTK; 0,7% guargum; 3% cám
gạo, tỷ lệ cấy chuyển giống là 3% với nguồn nitrogen là urê (0,1-0,5%). Sinh tổng hợp
mannanase của chủng A. awamori VTCC-F296 tăng lên 23% (64,5U/ml) khi bổ sung 0,4%
urê (Bảng 1). (Alan và cs,1977) đã nghiên cứu khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp
mannanase ngoại bào của chủng A. niger và chủng này sinh tổng hợp mannanase cao trong
môi trường MTK bổ sung 1,4 g/l urê (Alan và cs, 1977).
Như vậy, thành phần môi trường thay thế tối ưu để chủng A. awamori VTCC-F296 sinh tổng
hợp mannanase cao là MTK Czapek (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3; 0,05% MgSO4, 0,05%
KCl); 3% cám gạo và 0,4% urê).
Môi trường thay thế nuôi chủng A. niger VTCC-F128
Khảo sát tỷ lệ (%) bã mía, bã sắn và xơ dừa
Bảng 2. Ảnh hưởng của tỷ lệ (%) bã mía, bã sắn, xơ dừa lên khả năng sinh tổng hợp
mannanase của A. niger VTCC-F128.
Hoạt tính Hoạt tính
Bã mía (%)
(U/ml) (%) Xơ dừa (%) (U/ml) (%)
1 53,7 101 0,5 48,4 91
2 69,3 130 1,0 53,3 100
3 61,5 116 1,5 69,8 131
4 49,4 93 2,0 77,1 145
Bã sắn (%) - - 2,5 75,3 142
1 54,0 102 3,0 55,7 105
2 48,5 91 Cao nấm men (%)
- -
3 50,4 95 0,5 53,2 100
4 35,9 68 - - -
Chủng A. niger VTCC-F128 được nuôi trong môi trường MTK chứa 0,3% guargum và 0,1%
peptone, tỷ lệ cấy chuyển giống là 2,5% với các nguồn carbon là bã mía, bã sắn, cao nấm men
và xơ dừa. Xơ dừa và bã mía là những nguồn carbon có thể thay thế cao nấm men với mức độ
VIỆN CHĂN NUÔI - Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi - Số 18-Tháng 6-2009
4
sinh tổng hợp mannanase cao hơn 30% (Đào Thị Tuyết và cs, 2009). Sinh tổng hợp
mannanase tăng lên 45% trong môi trường nuôi cấy chứa 2% xơ dừa (77,1 U/ml) và 30%
trong môi trường nuôi cấy chứa 2% bã mía (69,3 U/ml) so với môi trường chứa 0,5% cao nấm
men (53,2 U/ml) (Bảng 2). Sinh tổng hợp mannanase gần như giữ nguyên trong môi trường
chứa 1% bã sắn (54,0 U/ml) so với môi trường chứa 0,5% cao nấm men.
Khảo sát tỷ lệ (%) bột đậu tương
Mức độ sinh tổng hợp mannanase của chủng
A. niger VTCC-F128 tăng lên 33% khi giảm
tỷ lệ bột đậu tương từ 1% (57,6 U/ml)
xuống 0,1% (77,6 U/ml) và tăng lên 30% so
với môi trường đối chứng chứa 0,1%
peptone (59,6 U/ml) (Hình 1).
Như vậy, thành phần môi trường thay thế
phù hợp cho chủng A. niger VTCC-F128
sinh tổng hợp mannanase cao là MTK
Czapek (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3;
0,05% MgSO4, 0,05% KCl); 0,3% guargum;
0,1% bột đậu tương; 2% xơ dừa (2% bã mía
hoặc 1% bã sắn).
Môi trường thay thế nuôi chủng A. oryzae MN02
Chủng A. oryzae MN02 được nuôi trong MTK; 0,7% guargum; 0,1% peptone, tỷ lệ cấy
chuyển giống là 3% với nguồn carbon là cám gạo (1-5%) (Bảng 3). Với nguồn carbon 4%
cám gạo sinh tổng hợp mannanase (58 U/ml) tăng lên 16% so với nguồn carbon 0,5% cao
nấm men (50 U/ml). Nhưng có thể sử dụng 2% cám gạo (52 U/ml) để thay thế 0,5% cao nấm
men (50 U/ml) trong môi trường nuôi cấy chủng A. oryzae MN02. Chủng A. oryzae MN02
được nuôi trong MTK; 0,7% guargum; 4% cám gạo, tỷ lệ cấy chuyển giống là 3% với nguồn
nitrogen là urê (0,1-0,5%) (Bảng 3).
Bảng 3. Ảnh hưởng của tỷ lệ (%) cám gạo và urê lên khả năng sinh tổng hợp mannanase của
A. oryzae MN02.
Hoạt tính Hoạt tính
Cám gạo (%) (U/ml) (%) Urê (%) (U/ml) (%)
1 48,9 98 0,1 20,2 40
2 51,6 103 0,2 62,1 124
3 54,4 109 0,3 33,2 66
4 58,0 116 0,4 24,6 49
5 48,0 96 0,5 14,6 29
Đối chứng (0,5% cao nấm men và 0,1% peptone) 50,0 100
Mức độ sinh tổng hợp mannanase của chủng A. oryzae MN02 tăng lên 24% trong môi trường
MTK chứa 0,2% urê (62,1 U/ml) và 4% cám gạo so với trong môi trường đối chứng MTK
chứa 0,5% cao nấm men và 0,1% peptone (50 U/ml).
Như vậy, thành phần môi trường thay thế cho chủng A. oryzae MN02 sinh tổng hợp
mannanase cao là MTK Czapek (0,1% K2HPO4; 0,2% NaNO3; 0,05% MgSO4, 0,05% KCl);
4% gạo cám và 0,2% urê.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
Bột đậu tương (%)
Hoạt tính (U/ml)
Hình 1. Ảnh hưởng của tỉ lệ (%) bột đậu tương lên khả
năng sinh tổng hợp mannanase của A. niger VTCC-
F128.
ĐÀO THỊ TUYẾT – Xác định nồng độ các thành phần xơ dừa ..
5
Khả năng sinh tổng hợp mannanase theo thời gian trong môi trường thay thế của các
chủng nghiên cứu
Các kết quả thực nghiệm ở trên cho thấy
khả năng sinh tổng hợp mannanase của
chủng A. awamori VTCC-F296 (186 U/ml)
sau 7 ngày nuôi cấy cao gấp 3 lần so với
hoạt tính của chủng này khi nuôi trong môi
trường cơ bản (66 U/ml). Chủng A. niger
VTCC-F128 và chủng A. oryzae MN sinh
tổng hợp mannanase cao nhất lần lượt sau 5
ngày và 4 ngày nuôi cấy (64 U/ml và 62
U/ml) (Hình 2 và Bảng 4).
Từ những kết quả ở trên có thể kết luận thành phần môi trường nuôi thích hợp để các chủng
nghiên cứu sinh tổng hợp mananase cao (Bảng 4).
Bảng 4. Thành phần môi trường thay thế nuôi các chủng nghiên cứu
Hoạt tính Tên chủng Thành phần môi trường U/ml U/mg
A. awamori VTCC-F296
MTK + 0,5% guargum + 3% cám gạo + 0,4% urê 186,4
453,5
A. niger VTCC-F128 MTK + 0,3% guargum+ 2% xơ dừa +0,1% bột đậu
62,4 148,4
A. oryae MN02 MTK + 0,7% guargum + 4% cám gạo + 0,2 urê 63,7 165,6
Đặng Thị Thu và cs, (2003) đã tối ưu một số điều kiện để sinh tổng hợp mannanase của chủng
A. awamori BK phân lập tại Việt Nam trong môi trường lỏng có thành phần khoáng Czapek,
bã cà phê (21,3 g/l), guargum (10 g/l), cao nấm men (22 g/l). Chủng A. awamori BK sinh tổng
hợp mannanase đạt 120 U/ml sau 4 ngày nuôi cấy. Với môi trường nuôi cấy cơ bản, thay thế
cao nấm men và peptone lần lượt bởi 3% cám gạo và 0,4% urê, chủng A. awamori VTCC-
F296 sinh tổng hợp mannanase đạt 186,4 U/ml, nếu thay thế bởi 4% cám gạo và 0,2% urê,
chủng A. oryzae MN02 sinh tổng hợp mannanase cũng đạt 63,7 U/ml (Bảng 4). Kết quả
nghiên cứu này cũng phù hợp với công bố của Kurakake và cs. (2001) khi nghiên cứu -
mannosidase và -mannanase từ chủng A. awamori K4, chủng này sinh tổng hợp mannanase
cao trong môi trường lỏng bổ sung 60% cám lúa mỳ ; Alan và cs. (1977) khi nghiên cứu khả
năng sinh trưởng và sinh tổng hợp mannanase ngoại bào của chủng A.niger đã sử dụng MTK
có bổ sung 1,4 g/l urê.
Các nguồn carbon (xơ dừa cho chủng A. niger VTCC-F128; cám gạo cho A. oryzae MN02 và
A. awamori VTCC-F296) và nguồn nitrogen (bột đậu tương cho A. niger VTCC-F128; urê
cho A. oryzae MN02 và A. awamori VTCC-F296) đều là những nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn
có trên thị trường rất thích hợp cho việc sản xuất mannanase trên quy mô công nghiệp phục
vụ mục đích tạo ra một lượng lớn enzyme bổ sung vào thức ăn cho gia súc.
0
40
80
120
160
200
0 2 4 6 8 10 12 14
Thời gian (ngày)
Hoạt tính (U/ml)
Hình 2. Ảnh hưởng của thời gian nuôi đến sinh tổng
hợp mannanase của A. awamori VTCC-F296 (), A.
niger VTCC-F128 (); và A. oryzae MN () trong môi
trường thay thế.