Tp chí Khoa hc và Phát trin 2012: Tp 10, s 2: 340 - 349 TRƯỜNG ĐẠI HC NÔNG NGHIP HÀ NI
KHO SÁT MT S ĐẶC TÍNH SINH HC VÀ ĐỊNH DANH NM MEN
ĐƯỢC PHÂN LP T BÁNH MEN RƯỢU ĐỒNG BNG SÔNG CU LONG
Characterization of Yeast Isolated from Rice Wine Starter Cakes in Mekong Delta
Nguyn Hu Thanh1, Nguyn Th K Duyên1, Bng Hng Lam1, Nguyn Quang Thch2
1B môn Công ngh Sinh hc, Đại hc An Giang,
2Vin Sinh hc Nông nghip, Trường Đại hc Nông nghip Hà Ni
Địa ch email tác gi liên lc: nhthanh@agu.edu.vn.
Ngày gi bài: 06.03.2012; Ngày chp nhn: 21.04.2012
TÓM TT
Bánh men được sn xut đồng bng sông Cu long (ĐBSCL) phn ln dng th công nên
cha nhiu: nm men, vi khun, nm mc. Nm men Saccharomyces cerevisiae có trong bánh men
có vai trò chính trong quá trình lên men rượu. Vic phân lp các chng nm men ti ĐBSCL phc v
cho sn xut rượu rt quan trng vì các chng này phù hp vi điu kin khí hu, đất, nước…T
bánh men rượu ĐBSCL đã phân lp được 128 chng, trong đó phát hin được 30 chng chu nhit
50°C đồng thi chu cn 17ml/L, sinh bào t và lng tt, 10 trong s đó không sinh H2S. Gii mã
trình t 10 chng, 7 chng xác định là Saccharomyces cerevisiae, 3 chng là Clavispora lusitaniae.
T khóa: Saccharomyces cerevisiae, sinh H2S, rượu go.
SUMMARY
As a source of inoculation starters in the manufacture of alcohol from rice varieties from the
Mekong River Delta, Vietnam, Banh men has been produced since the ancient time. These starters,
which normally combine three groups of microorganisms, viz. yeasts, bacteria and moulds convert
the starchy materials into fermentable sugar and subsequently to alcohol and organic acids. Yeasts
are significant in the production of traditional beverage because they play the main role in alcoholic
fermentation. Of 128 strains of yeasts isolated from rice fermenting staters in the Mekong River delta,
30 yeast strains were identified to be thermo-resistant at 50 oC and ethanol tolerance at 17% (v/v) in
the challenge test with added ethanol with good flocculation and sporulation. From characterization of
10 yeast strains, 7 yeasts strains were identified as Saccharomyces cerevisiae and 3 others as
Clavispora lusitaniae.
Keywords: Alcohol tolerance, Saccharomyces cerevisiae, starter cakes, thermo-resistant.
1.ĐẶT VN ĐỀ
Ngh sn xut rượu t go, nếp đã xut
hin đồng bng sông Cu Long (ĐBSCL) t
rt lâu đời. Theo truyn thng, cư dân địa
phương dùng bánh men rượu để lên men go
đã được nu chín, t 5-7 ngày sau khi lên
men to thành rượu non và mang đi chưng
ct thì thu được rượu go. Bánh men rượu
cha rt nhiu h vi sinh vt trong đó có các
nhóm nm men có vai trò sn xut rượu
như: Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia
sp., Pichia anomala, Candida tropicalis, P.
ranongensis, Clavispora lusitaniae (Vũ
nguyên Thành & cs., 2008). Saccharomyces
cerevisiae phân lp t các bánh men c
truyn vùng ĐBSCL s dng lên men rượu
nếp than nhit độ 300C trong 03 ngày thu
được hàm lượng cn là 9.6% (v/v) (Ngô Th
Phương Dung & cs., 2005). Vn đề được đặt
340
Kho sát mt s đặc tính sinh hc và định danh nm men được ... đồng bng sông Cu Long
ra là ti sao hàm lượng cn đạt được luôn
thp hơn kh năng nm men có th sn xut
trong điu kin hàm lượng đường trong dch
lên men đầy đủ? Theo Đồng Th Thanh Thu
(2003) trong quá trình lên men, lượng cn
tích lũy và nhit độ ca dch lên men tăng,
tùy thuc vào kiu lên men có kh năng lên
đến 45 oC-50 oC. nhit độ này, phn ln
nm men b chết nên trong công nghip sn
xut cn và rượu, thường phi s dng nước
để làm ngui ni lên men, gây tăng chi phí
sn xut.
Nhm gii quyết vn đề trên, nhiu
nghiên cu ca Brasil, trong đó có công trình
ca Guimarães & cs. (2006) đã tiến hành
phân lp các chng nm men, chn lc các
chng có kh năng chu nhit, chu cn, có
kh năng lng, kh năng sinh kém hoc
không sinh H2S. Trong 61 chng tác gi
phân lp được có 14 chng được định danh là
Saccharomyces cerevisiae, 3 chng chu cn
nng độ 150 g/L, 2 chng chu nhit 45oC,
1 chng có kh năng kết lng, 7 chng
không sinh H2S. Oliveira & cs. (2007) đã
tuyn chn được 02 chng S.cerevisiae t
men t nhiên Minas Gerais, Brasil ng
dng sn xut cachaça t nước mía.
Khí hu vùng ĐBSCL nóng m quanh
năm, rt thích hp cho s phát trin ca
nm men, qun th nm men chc chn s
rt phong phú và đa dng. Kh năng thu
được nhiu chng nm men có các đặc tính
mong mun làm ging gc cho sn xut công
nghip và các nghiên cu v kh năng lên
men rượu trong điu kin nhit độ cao là
hoàn toàn có tính kh thi.
Nghiên cu này được tiến hành nhm
xác định đưc các chng nm men có kh
năng chu nhit, chu cn góp phn nâng cao
hiu qu và gim chi phí sn xut rượu go
địa phương, mt khác đánh giá tính đa dng
sinh hc ca các chng nm men ca đồng
bng sông Cu Long.
2. VT LIU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Môi trường nuôi cy
Môi trường nuôi cy s dng là môi
trường YPG (10 g/l cao nm men, 10 g/l
Pepton, 20 g/l agar, 20 g/l glucose). Môi
trường YPG b sung 6 g/L tartaric acid,
30mg/mL erythromycin hoc 30 mg/mL
chloramphenicol cho phân lp nm men, môi
trường LA có thành phn như sau: 40 g/L
glucose, 5 g/L yeast extract, 3 g/L peptone, 0.2
g/L ammonium sulfate, 1 g/L lead acetate và
20 g/L agar.
2.2. Thu thp mu và phân lp
Mu bánh men được thu thp t các cơ
sn xut rượu ti các địa phương như Đồng
Tháp, Long An, Bến Tre, An Giang, Kiên
Giang trong năm 2009 - 2010 dng viên và
dng bt, có nhãn hiu hàng hóa và đã được
cơ s s dng trong quá trình sn xut rượu.
Mu sau khi thu thp được gi trong túi
nilon hàn kín ming, bo qun 4oC và tiến
hành phân lp.
Ly 1g bánh men pha loãng trong 100
ml nước pepton thanh trùng, và cy trên môi
trường YPG 30oC trong 72h gi bng t
Memmert INB 400 (Đức). Sau khi khun lc
phát trin chn các khun lc đin hình cy
sang môi trường YPG có cha 30 mg/mL
Erythromycin và ng điu kin. Ly
khun lc nm men đã phát trin trên môi
trường này cy sang môi trường YPG có b
sung 6g/L tartaric acid và . Khun lc xut
hin, cy sang môi trường YPG có b sung 30
mg/mL Chloramphenicol nhit độ 30oC
trong 72 gi. Khi khun lc phát trin tt và
thun cy sang ng thch nghiên cha môi
trường YPG và bo qun 4oC.
341
Nguyn Hu Thanh, Nguyn Th K Duyên, Bng Hng Lam, Nguyn Quang Thch
2.3. Chun b ging nm men
Nm men được chun b và nuôi cy
trong môi trường YPG lng 30oC và trong
12 gi, mt s nm men tương ng vi OD =
0,1 bước 650 nm và nuôi cy trên môi
trường đặc hiu cho các nghiên cu v kh
năng chu nhit, chu cn, sinh H2S, kết
lng, mt s nm men tương ng vi OD =
0,2 cho nghiên cu v sinh hc phân t.
2.4. Kh năng chu cn
Nm men được nuôi cy trong 10 mL
môi trường YPG lng có b sung 130, 150 và
170 ml/L ethanol và nuôi cy 30oC trong 72
gi. Sau đó cy lên môi trường thch YPG ri
nuôi cy nhit độ 30oC trong 48-72h, nếu
nm men phát trin trên môi trường thch
YPG chng t chng có kh năng chu được
nng độ cn th nghim.
2.5. Kh năng chu nhit
Nm men được nuôi cy trên môi trường
thch YPG 30oC, 40oC, 45oC và 50oC trong
72 gi. Đánh gia kh năng phát trin ca
nm men trên môi trường thch YPG các
nhit độ th nghim.
2.6. Th nghim kh năng kết lng
Theo Guimarães & cs. (2006) nm men
được nuôi cy trong ng nghim cha 10 mL
môi trường Sabouraud lng, điu chnh nng
độ cht khô đến 18 độ Brix bng đường
saccharose và 30oC trong 72 gi. Sau khi
ly ng nghim ra lc đều, ri bt đầu đo
chiu cao đon lng trong các ng nghim
mi ngày. Nếu nm men có kh năng lng
tt thì trong 7 ngày sau khi lên men, chiu
dài đon dch trong > 75% chiu cao ca khi
môi trường lên men. Nm men có kh năng
lng trung bình, chiu dài đon dung dch
trong chiếm 50-75% chiu cao ca khi môi
trường lên men. Nm men có kh năng lng
yếu, chiu dài đon dch trong chiếm 25-50%
chiu cao ca khi môi trường lên men, nếu
chiu dài đon dch trong nh 25% chiu cao
ca khi môi trường lên men, thì nm men
không lng.
2.7. Kh năng sinh Hydrogen sulfide
Theo Guimarães & cs. (2006) và ONO
& cs. (1991) Nm men được nuôi cy trên
môi trường LA 30oC trong 10 ngày. Nếu
nm men không sinh H2S thì khun lc phát
trin không biến đổi màu, nm sinh H2S ít
thì rìa ca khun lc có màu nâu nht hoc
màu nâu đen, nm men sinh nhiu H2S toàn
b khun lc s có màu đen.
2.8. Định danh bng gii mã trình t
Tách chiết DNA ca nm men: Cho 1,5
ml dch nuôi nm men trong môi trường
YPG lng (1% yeast extract, 2% peptone, 2%
Glucose) trong 20 - 24 gi 30 oC vào ng
eppendorf. Ly tâm 15.000 vòng /phút trong
thi gian 4 phút. Loi b huyn phù thêm
200 µl đệm Harju, ngâm trong hn hp đá-
ethanol trong 2 phút, ngâm trong nước nóng
95 oC trong 1 phút thc hin 2 ln. Vortex
trong 30 giây. Thêm 200 µl chloroform và
vortex trong 2 phút. Ly tâm 3 phút, tc độ
15.000 vòng /phút. Chuyn pha lng vào ng
eppendorf khác có cha 400µl ice-ethanol.
nhit độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 5
phút vi vn tc 15.000 vòng /phút. Ra kết
ta bng 0,5 ml ethanol 70%, ly tâm 5 phút
vi vn tc 15.000 vòng /phút. Sy khô bng
không khí nhit phòng. Hòa tan DNA trong
25 - 50 ml TE (pH 8,0). Đo nng độ DNA bng
máy Biophotometer sao cho nng độ DNA đạc
(25- 500ng/ reaction) (Ralser, 2009).
Phương pháp PCR: Ly 5μl mu cho vào
phn ng PCR để nhân đặc hiu đon DNA
dài 260 bp trên vùng gen 28rDNA ca nm
men bng h thng máy PCR Thermal
Cycler ca Bio-Rad. Cp mi U1, U2 có trình
342
Kho sát mt s đặc tính sinh hc và định danh nm men được ... đồng bng sông Cu Long
343
t: U1 (GTGAAATTGT TGAAAGGGAA), U2
(GACTCCTTGG TCCGTGTT) (Sandhu
1995) Buffers: PCR Mastermix, 0,5 ml Taq
polymerase (5 U / ml), 2,5 ml 10x đệm: 1 ml
25x dNTP (5 mM); 0,5ml mi mi (100 pmol /
ml); 20 ml H2O
Đin di sn phm PCR trên gel agarose
2%, chp hình bng h thng máy Gel Doc
ca Bio-Rad. Tinh sch sn phm PCR bng
b clean up ca Promega. Đin di sn phm
đã tinh sch bng h thng máy Agilent
2100 Bioanalyzer. PCR SEQ sn phm đã
tinh sch trước khi gii trình t trên h
thng máy ABI 3103XL. Phân tích kết qu
bng phn mm sequecing analysis 5.3, và
so vi kết qu trên ngân hàng gen bng k
thut BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
Định danh nm men Saccharomyces
cerevisiae s dng primers là U1, U2 theo mô
t ca Sandhu (1995): Primer U1, U2 khuyếch
đại 1 đon gen có kích thước 260 bp trên gen
28 sRNA, hai khu vc này có trình t mang
tính bo tn cao cho loài, mi U1
(GTGAAATTGTTGAAAGGGAA) gn vào trình
t 403 đến 422, và mi U2 (GACTCCTTGG
TCCGTGTT) gn tương ng trình t 645 đến
662 ca gen 28S RNA tham chiếu trên nm
men Saccharomyces cerevisiae. Mi U1 và U2
đã được s dng để khuyếch đại đon DNA
độc lp được ly trích t nm men. Mi U1,
U2 được gn vào gen theo sơ đồ được miêu t
theo hình 1.
Hình 1. Sơ đồ được miêu t mi U1, U2
được gn vào gen
3. KT QU VÀ THO LUN
3.1. Phân lp và th nghim kh năng
chu nhit chu cn ca các chng nm
men thu thp
Qua nhiu ln phân lp trên môi trường
YPG có b sung kháng sinh và acid tartaric
đã thu được 128 chng nm men thun và
tr 4oC để làm cơ s cho nghiên cu này.
Kho sát kh năng chu nhit ca các chng
nm men va phân lp và quan sát hình
thái kết qu bng 1.
A B
A : Các chng nm men phát trin trên môi trường YPG sau khi test cn vi nng độ 170 ml/L
B : Các chng nm men phát trin trên môi trường YPG sau khi nhit độ 50 oC
Hình 2. Các chng nm men chu cn, chu nhit phát trin trên môi trường thch YPG
Nguyn Hu Thanh, Nguyn Th K Duyên, Bng Hng Lam, Nguyn Quang Thch
Bng 1 cho thy c 128 chng nm men
phân lp được điu có kh năng chu nhit
30 oC và 40oC do nhit độ môi trường vùng
ĐBSCL ph biến 30 oC-32 oC nên tt c các
chng nm men thu được điu có kh năng
phát trin nhit độ 30 oC và 40 oC, 61 dòng
có kh năng chu được nhit độ 45 oC và 30
dòng có kh năng chu được 50 oC, các
chng nm men này vn phát trin khi cy
lên môi trường thch YPG và nhit độ
50°C kết qu xem Hình 2B, Khun lc ca
các chng nm men xut hin trên môi
trường thch YPG. Chng t rng các dòng
nm men này có kh năng chu nhit nhit
độ 50°C. Nếu so vi kết qu nghiên cu ca
Guimaraes & cs. (2006) phân lp nm men
Saccharomyces cerevisiae ti các vùng sn
xut rượu nho Brasil ch có 2 chng nm
men chu nhit 45 oC trong 15 dòng th
nghim, thì nm men trong bánh men rượu
vùng ĐBSCL có kh năng chu nhit cao hơn
so Brasil. Bên cnh đó kh năng chu được
nng độ cn ca các dòng nm men cũng
được kho sát, vì sn phm ca quá trình lên
men rượu là cn, nng độ cn tăng li là độc
t giết chết nm men. Vi 30 dòng nm men
có kh năng chu nhit 50°C đưc mang đi
th nghim kh năng chu cn kết qu cho
Bng 2 T đó cho thy c 30 dòng điu có
kh năng sng trong môi trường có nng độ
cn lên đến 170 ml/L các dòng nm men sau
khi nuôi trong môi trường có b sung 170
ml/L vn có kh năng phát trin khun lc
trên môi trường thch YPG (Hình 2A) nếu so
vi kết qu nghiên cu ca Guimaraes & cs.
(2006) các dòng nm men Saccharomyces
cerevisiae đưc phân lp ti các vùng sn
xut rượu Brasil ch có 3 chng nm men
chu cn 170 ml/L trong 15 dòng th
nghim. Qua đó nói lên rng trong bánh men
rượu ca ĐBSCL có các chng nm men chu
được nhit độ cao và chu được nng độ cn
cao thích hp để tuyn chn ging nm men
cho công ngh sn xut cn trong tương lai.
Bên đó hình dng nm mem cũng đưc quan
sát và ghi nhn kết qu Bng 1, trong 128
dòng nm men quan sát thy có 30 chng
hình cu và 98 chng hình elip, như vy
nm men được phân lp t bánh men cũng
có s đa dng v hình dng tế bào.
Bng 1. Kh năng chu nhit ca các chng nm men
thu thp được
Kh năng chu nhit Hình dng tế bào
STT
30 oC 40
oC 45
oC 50
oC Hình cu Hình elip
S chng 128 128 61 30 30 98
Bng 2. Các đặc đim sinh hc ca các chng nm men chu nhit
Kh năng chu cn (ml/L) Kh năng sinh H2S
STT
130 150 170 Không Ít Nhiu
Lng Sinh
bào t
S dòng 30 30 30 10 16 4 30 30
344