1
PHÂN LẬ P, ĐỊ NH DANH VÀXÁC ĐỊ NH CÁC CHỦ NG LACTOBACILLUS
CÓ TIỀ M NĂNG PROBIOTIC TỪCON NGƯ Ờ I
Hoàng Quố c Khánh (1),Phạ m Thị Lan Thanh (2)
(1) Việ n Sinh Họ c Nhiệ t Đớ i – Việ n Khoa Họ c và Công Nghệ Việ t Nam
(2) Trư ờ ng Đạ i họ c Lạ c Hồ ng
TÓM TẮ T:Vi khuẩ n Lactobacillus đư ợ c sử dụ ng trong nhiề u sả n phẩ m probiotic. Bài báo này
đề cậ p đế n các chủ ng Lactobacillus có đặ c tính probiotic ở đư ờ ng dạ dày –ruộ t ngư ờ i. 15 chủ ng
Lactobacillus đãđư ợ c phân lậ p từ các mẫ u phân củ a nhữ ng trẻ em bú sữ a mẹ và xác đị nh bằ ng các
phư ơ ng pháp truyề n thố ng kế t hợ p phư ơ ng pháp PCR vớ i cặ p mồ i đặ c hiệ u cho giố ng Lactobacillus.
Các thí nghiệ m in vitro đãđư ợ c thiế t kế để nghiên cứ u mộ t số đặ c điể m probiotic củ a các chủ ng
Lactobacillus như : kháng vớ i pH thấ p và mậ t, tính kỵ nư ớ c củ a bề mặ t tế bào, hoạ t tính kháng khuẩ n,
tạ o bacteriocin và các chấ t kháng khuẩ n khác, kháng vớ i kháng sinh và khử cholesterol. Kế t quả chọ n
lọ c đư ợ c 12 chủ ng Lactobacillus có các đặ c tính probiotic. Trong đó, 11 chủ ng có khả năng làm giả m
mứ c cholesterol huyế t thanh đáng kể 10% – 33,34%. Bằ ng phư ơ ng pháp phân tích trình tự rDNA
16S, các chủ ng Lactobacillus có đặ c tính probiotic này đư ợ c đị nh danh đế n mứ c loài gồ m:
Lactobacillus gasseri, L. fermentum, L. salivarius, L. rhamnosus và L. paracasei/ casei.
Từ khóa: Lactobacillus, probiotic, PCR, rDNA 16S
1. MỞ ĐẦ U:
Vi khuẩ n lactic (LAB) có vai trò rấ t quan trọ ng trong cuộ c số ng củ a chúng ta. Chúng tạ o ra các
thự c phẩ m lên men và bả o quả n thự c phẩ m khỏ i bị hư hỏ ng. Từ đầ u thế kỷ 20, Elie Metchnikoff
(1845-1916) đãđề xuấ t sử dụ ng các LAB cho mụ c đích chữ a bệ nh. Từ đó, lĩnh vự c nghiên cứ u
probiotic đã ra đờ i và phát triể n. Đế n nay, nhữ ng nghiên cứ u về probiotic đã không ngừ ng cung cấ p
nhữ ng bằ ng chứ ng có tính khoa họ c về hiệ u quả thự c sự củ a probiotic đố i vớ i sứ c khỏ e con ngư ờ i. Bên
cạ nh đó, các sả n phẩ m chứ c năng sử dụ ng các vi khuẩ n probiotic xuấ t hiệ n ngày càng nhiề u ở Châu
Âu, Nhậ t, Mỹ … Hiệ n nay, mộ t số sả n phẩ m probiotic cũng đư ợ c bày bán trên thị trư ờ ng Việ t Nam
như : sữ a bộ t Gain IQ (Abbott Laboratories)…
Probiotic bắ t nguồ n từ ngôn ngữ Hy Lạ p có nghĩa làvì sự số ng (for life). Guarner và Schaafsma
(1998) đãđị nh nghĩa: “probiotic là nhữ ng vi sinh vậ t số ng mà khi tiêu thụ mộ t lư ợ ng thích hợ p, sẽ tạ o
nên nhữ ng hiệ u quả tố t đố i vớ i sứ c khỏ e củ a cơ thể chủ ”[3]. Nhiề u nghiên cứ u về đặ c tính probiotic
củ a các LAB đãđư ợ c công bố trên các tạ p chí khoa họ c. Trong đó, Lactobacillus là LAB đư ợ c sử
dụ ng phổ biế n trong các nghiên cứ u cơ bả n vàứ ng dụ ng về probiotic cho ngư ờ i vì tính an toàn củ a
chúng đố i vớ i con ngư ờ i. Lactobacillus đư ợ c tìm thấ y ở nhiề u nơ i trong tự nhiên như : thự c phẩ m; thự c
vậ t; chấ t thả i; đư ờ ng dạ dày –ruộ t, đư ờ ng miệ ng và đư ờ ng sinh dụ c củ a con ngư ờ i và độ ng vậ t…
Phầ n lớ n các loài Lactobacillus có nguồ n gố c từ đư ờ ng dạ dày –ruộ t ngư ờ i là đố i tư ợ ng nghiên cứ u về
probiotic cho ngư ờ i sử dụ ng, vì chúng thư ờ ng liên quan đế n nhữ ng ích lợ i đố i vớ i sứ c khỏ e con ngư ờ i
như : kháng các vi khuẩ n gây bệ nh, khử cholesterol huyế t thanh…
Các chủ ng Lactobacillus trong nghiên cứ u này đư ợ c phân lậ p từ phân trẻ em bú sữ a mẹ và đị nh
danh bằ ng các phư ơ ng pháp truyề n thố ng kế t hợ p vớ i các phư ơ ng pháp sinh họ c phân tử hiệ n đạ i. Các
đặ c tính probiotic củ a chúng đư ợ c xác đị nh thông qua các thí nghiệ m in vitro vềkhả năng tồ n tạ i và
số ng sót củ a probiotic trong đư ờ ng dạ dày –ruộ t ngư ờ i, nhữ ng lợ i ích củ a probiotic đố i vớ i sứ c khỏ e
con ngư ờ i và đặ c điể m an toàn củ a probiotic đố i vớ i ngư ờ i sử dụ ng.
2. VẬ T LIỆ U VÀ PHƯ Ơ NG PHÁP:
2.1. Vậ t liệ u:
Các chủ ng Lactobacillus đư ợ c phân lậ p từ các mẫ u phân trẻ em bú sữ a mẹ khoẻ mạ nh (dư ớ i 12
tháng tuổ i) ở 6 đị a điể m, gồ m: bệ nh việ n Thố ng Nhấ t (Đồ ng Nai), bệ nh việ n Đồ ng Nai (Đồ ng Nai),
bệ nh việ n Hùng Vư ơ ng (Tp. Hồ Chí Minh), các gia đình tạ i Tp. Biên Hoà (Đồ ng Nai), các gia đình tạ i
Tp. Hồ Chí Minh và các gia đình tạ i Tp. Đà Lạ t.
2.2. Phư ơ ng pháp:
2.2.1. phư ơ ng pháp phân lậ p:
Các mẫ u phân trẻ em đư ợ c phân lậ p trên môi trư ờ ng MRS – Agar pH 5,5, trong điề u kiệ n kỵ
khí và nhiệ t độ nuôi ủ ở 37oC. Điề u kiệ n kỵ khí đư ợ c tạ o ra bằ ng cách sử dụ ng túi kỵ khí Anaerocult
A®(Merck). Nhữ ng khuẩ n lạ c phát triể n trên môi trư ờ ng đặ c trư ng về màu sắ c, hình dạ ng, kích thư ớ c
2
và có tế bào ởdạ ng hình que khi quan sát dư ớ i kính hiể n vi đư ợ c chọ n lọ c và làm thuầ n. Các chủ ng
thuầ n đư ợ c bả o quả n trong các ố ng thạ ch nghiêng ở 4oC và trong dung dị ch glycerol ở – 20 oC.
2.2.2. Phư ơ ng pháp xác đị nh giố ng Lactobacillus:
Để xác đị nh các chủ ng vi khuẩ n thuộ c giố ng Lactobacillus, mộ t số thử nghiệ m đư ợ c thự c hiệ n
như sau: quan sát hình thái tế bào dư ớ i kính hiể n vi; xác đị nh mố i quan hệ vớ i oxy bằ ng cách cấ y trên
môi trư ờ ng thạ ch sâu; xác đị nh đặ c điể m Gram bằ ng phư ơ ng pháp “String Test”; xác đị nh khả năng
tạ o axít lactic dự a vào sựphân giả i CaCO3trên môi trư ờ ng Carbonate – Agar và sự đổ i màu thuố c thử
Uphenmen; thử nghiệ m Catalase đư ợ c thự c nghiệ m bằ ng cách sử dụ ng dung dị ch H2O23%; xác đị nh
khả năng lên men glucose bằ ng cách nuôi cấ y chủ ng trong môi trư ờ ng chứ a glucose và chỉ thị đỏ
phenol. Sau đó, các chủ ng vi khuẩ n có nhữ ng đặ c điể m cơ bả n củ a giố ng Lactobacillus đư ợ c xác đị nh
chính xác giố ng Lactobacillus bằ ng phư ơ ng pháp PCR. DNA củ a vi khuẩ n đư ợ c tách khỏ i tế bào bằ ng
DNAzol® Direct (Molecular Research Center, Inc.). 2 mồ i Lac1 và Lac2 đặ c hiệ u cho giố ng
Lactobacillus đư ợ c sử dụ ng. Thiế t lậ p chư ơ ng trình phả n ứ ng PCR cho máy luân nhiệ t (Eppendorf –
Gene Amp, Biosystem, PCR system 9700) như sau: bư ớ c 1 – 95oC trong 5 phút; bư ớ c 2 – lặ p lạ i 30
chu kỳ (mỗ i chu kỳ gồ m: 95oC trong 1 phút, 55oC trong 1 phút, 72oC trong 2 phút); bư ớ c 3 – 72oC
trong 7 phút. Sả n phẩ m PCR mong đợ i là các đoạ n DNA có kích thư ớ c 340 bp.
2.2.3. Phư ơ ng pháp nghiên cứ u đặ c tính probiotic trong điề u kiệ nin vitro:
2.2.3.1. Khả năng thích ứ ng pH thấ p:
Tế bào củ a các chủ ng Lactobacillus sau 24 giờ nuôi cấ y đư ợ c rử a sạ ch và đặ t trong các dung
dị ch PBS (phosphate buffer saline) pH 1, pH 2, pH 3 và pH 6,4. Sau các thờ i điể m 0 giờ , 1 giờ , 2 giờ
và 3 giờ , chuyể n tế bào vi khuẩ n trong dung dị ch PBS vào môi trư ờ ng MRS vàủ ở 37oC trong 24 giờ .
Sau đó,đo mậ t độ quang OD củ a dị ch nuôi cấ y ở bư ớ c sóng 610nm. Khả năng kháng pH thấ p củ a các
chủ ng Lactobacillus đư ợ c xác đị nh bằ ng cách so sánh các giá trị OD 610 nm (so sánh ở các dung dị ch
PBS có pH khác nhau vớ i dung dị ch PBS pH 6,4 và ở các thờ i điể m khác nhau vớ i lúc 0 giờ ).
2.2.3.2. Khả năng kháng mậ t:
Các chủ ng Lactobacillus đư ợ c nuôi cấ y trong môi trư ờ ng MRS 1% Tween 80 bổ sung mậ t bò
(American Laboratories Inc.) vớ i các nồ ng độ mật 0%, 0,3%, 0,5%, 1% và 2%. Sau 24 giờnuôi ủ ở
37oC, đo mậ t độ quang OD củ a dị ch nuôi cấ y ở bư ớ c sóng 610 nm. Khả năng kháng mậ t củ a các
chủ ng Lactobacillus đư ợ c xác đị nh bằ ng cách so sánh các giá trị OD 610 nm củ a dị ch nuôi có các
nồ ng độ mậ t bò khác nhau vớ i dị ch nuôi không bổ sung mậ t bò.
2.2.3.3. Tính kỵ nư ớ c củ a bề mặ t tế bào:
Tế bào củ a chủ ng Lactobacillus sau 24 giờ nuôi cấ y đư ợ c rử a sạ ch và huyề n phù trong dung
dị ch nư ớ c muố i sinh lý sao cho giá trị OD 600nm củ a dung dị ch này đạ t khoả ng 0.4 – 0,6 (ODt). Tiếp
theo, dị ch huyề n phù tế bào này đư ợ c trộ n vớ i 1 trong 3 loạ i hydrocarbon (n-hexadecane, xylene,
toluen), rồ i giữ yên hỗ n hợ p này ở nhiệ t độ phòng để nư ớ c và hydrocarbon tách thành 2 pha, đo OD
600nm củ a pha nư ớ c (ODs). Sự giả m hấ p thu củ a pha nư ớ c đư ợ c dùng để đo lư ờ ng tính kỵ nư ớ c củ a
bề mặ t tế bào. Công thứ c tính % kỵ nư ớ c như sau: H% = (ODt –ODs) x 100 / ODt
2.2.3.4. Hoạ t tính kháng khuẩ n:
Chuyể n dị ch nuôi vi khuẩ n sau 24 giờ nuôi cấ y vào đĩa giấ y vô trùng trên bềmặ t môi trư ờ ng
MRS –Agar. Sau 24 giờ nuôi ủ ở 37oC, phủ lên trên môi trư ờ ng MRS – Agar mộ t lớ p môi trư ờ ng LB
–Agar hoặ c MRS – Agar (đố i vớ i vi khuẩ n chỉ đị nh làLactobacillus) chứ a vi khuẩ n chỉ đị nh, tiế p tụ c
nuôi ủ ở 37oC trong 24 giờ . Sau đó, ghi nhậ n vòng vô khuẩ n tạ o thành xung quanh các đĩa giấ y. Các
chủ ng vi khuẩ n chỉ đị nh gồ m: Escherichia coli ATTC 25922, Salmonella typhi, Staphylococcus
aureus ATCC 25923, Klebsiella sp. 371, Shigella sp. 1640 và L. acidophilus NRRL B-2092.
2.2.3.5. Khả năng tạ o bacteriocin và các chấ t kháng khuẩ n khác:
Chủ ng Lactobacillus đư ợ c nuôi cấ y 48 giờ trong môi trư ờ ng MRS 1% cao nấ m men và ở nhiệ t
độ 37oC. Dị ch nuôi cấ y đư ợ c loạ i bỏ tế bào bằ ng phư ơ ng pháp ly tâm, điề u chỉ nh đế n pH 6,5 bằ ng
NaOH và vô trùng bằ ng màng lọ c. Chuyể n dị ch nuôi cấ y này vào các giế ng thạ ch đã tạ o trên môi
trư ờ ng LB – Agar chứ a vi khuẩ n chỉ thị , nuôi ủ ở 37oC trong 48 giờ . Sau thờ i gian ủ , ghi nhậ n sự tạ o
thành vòng vô khuẩ n xuấ t hiệ n xung quanh giế ng thạ ch. Các vi khuẩ n chỉ thị gồ m: E. coli ATTC
25922 (Gram –) và St. aureus ATCC 25923 (Gram +).
2.2.3.6. Khả năng kháng vớ i kháng sinh:
Sựkháng vớ i kháng sinh củ a vi khuẩ n đư ợ c xác đị nh dự a theo phư ơ ng pháp khuế ch tán đĩa
(disc diffusion) củ a NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Đặ t các đĩa giấ y
kháng sinh lên bề mặ t môi trư ờ ng MRS –Agar chứ a vi khuẩ n thử nghiệ m,ủ ở 37oC trong 24 giờ . Sau
3
thờ i gian ủ , đo đư ờ ng kính vòng ứ c chế sinh trư ở ng và so sánh vớ i bả ng tiêu chuẩ n về mứ c độ nhạ y
vớ i kháng sinh. Các loạ i kháng sinh sử dụ ng thuộ c 3 nhóm: nhóm ứ c chế tổ ng hợ p vách tế bào
(Penicillin G, Co-amoxiclav, Cefaclor và Vancomycin), nhóm ứ c chế tổ ng hợ p protein (Erythromycin,
Amikacin, Gentamicin, Kanamycin và Streptomycin) và nhóm ứ c chế tổ ng hợ p axít nucleic (Co-
trimoxazol).
2.2.3.7. Khả năng khử cholesterol:
Các chủ ng Lactobacillus đư ợ c sinh trư ở ng trong môi trư ờ ng MRS pH 6 bổ sung 0,3% mậ t bò
(American Laboratories Inc.), 0,05% L-Cysteine-HCl và 100 –150 mg/l huyế t thanh bò. Sau 48 giờ
nuôi ủ ở 37oC và điề u kiệ n kỵ khí, dị ch nuôi không chứ a tế bào vi khuẩ n đư ợ c thu nhậ n bằ ng phư ơ ng
pháp ly tâm. Đo hàm lư ợ ng cholesterol trong dị ch thu nhậ n bằ ng phư ơ ng pháp so màu phụ thuộ c
enzyme (Enzymatic colorimetric method) và máy sinh hóa tự độ ng HITACHI 717.
2.2.4. Phư ơ ng pháp phân tích trình tự rDNA 16S:
Mẫ u DNA đư ợ c tách từ tế bào củ a các chủ ng Lactobacillus bằ ng DNAzol® Direct. Phả n ứ ng
khuế ch đạ i đoạ n rDNA 16S đư ợ c thự c hiệ n vớ i 2 mồ i Lac3 và Lac4 chuyên biệ t cho giố ng
Lactobacillus. Thiế t lậ p chư ơ ng trình phả n ứ ng PCR cho máy luân nhiệ t (Eppendorf – Gene Amp,
Biosystem, PCR system 9700) như sau: bư ớ c 1 – 95oC trong 5 phút; bư ớ c 2 – lặ p lạ i 30 chu kỳ (mỗ i
chu kỳ gồ m: 95oC trong 1 phút, 55 oC trong 1 phút, 72 oC trong 2 phút); bư ớ c 3 – 72oC trong 7 phút.
Sả n phẩ m PCR đư ợ c tinh sạ ch bằ ng GFX PCR and Gel Band Purification Kit (Amersham
Biosciences) và tiế n hành giả i trình tự . Các trình tự nucleotide hoàn chỉ nh đư ợ c so sánh vớ i ngân hàng
dữ liệ u gen củ a NCBI bằ ng cách sử dụ ng công cụ BLAST.
3. KẾ T QUẢ VÀ THẢ O LUẬ N:
3.1. Phân lậ p và xác đị nh giố ng Lactobacillus:
15 chủ ng Lactobacillus đãđư ợ c phân lậ p và xác đị nh từ các mẫ u phân trẻ em bú sữ a mẹ , gồ m: B1,
B3, B5, B6, B8a, B8b, B9a, B9b, B11, B12b, B15, B17, M3, M5 và T16. Các chủ ng này đề u có nhữ ng
đặ c điể m cầ n thiế t củ a giố ng Lactobacillus như : tế bào có dạ ng hình que, kỵ khí tùy ý, Gram +, có khả
năng tạ o axít lactic, Catalase –, có khả năng lên men glucose, tạ o sả n phẩ m PCR có kích thư ớ c 340 bp
trong phả n ứ ng PCR vớ i cặ p mồ i đặ c hiệ u cho giố ng Lactobacillus (hình 1).
Trong nghiên cứ u này, mộ t số mẫ u phân xu củ a nhữ ng trẻ em vừ a mớ i sinh đư ợ c sử dụ ng để kiể m
chứ ng phư ơ ng pháp phân lậ p. Kế t quả cho thấ y Lactobacillus không phân lậ p đư ợ c từ bấ t kỳ mẫ u
phân xu nào. Kế t quả này phù hợ p vớ i lý thuyế t về sự vô trùng củ a ruộ t bào thai [2].
So sánh 2 nhóm tuổ i khác nhau: nhóm 1 (các trẻ em dư ớ i 1 tuầ n tuổ i) và nhóm 2 (các trẻ em từ 1
tuầ n tuổ i trở lên) cho thấ y số mẫ u nhóm 1 phân lậ p đư ợ c Lactobacillus chiế m 3,57%, trong khi số mẫ u
nhóm 2 phân lậ p đư ợ c Lactobacillus chiế m 46,15%. Điề u này chứ ng tỏ khả năng phân lậ p đư ợ c
Lactobacillus ởcác mẫ u nhóm 2 cao hơ n ở các mẫ u nhóm 1. Sự khác biệ t này có thể do các trẻnhóm 2
tiế p xúc vớ i các vi sinh vậ t từ mẹ và môi trư ờ ng bên ngoài trong thờ i gian dài hơ n, nên hình thành mộ t
Hình 1. Kế t quả điệ n di trên gel agarose củ a các sả n phẩ m PCR vớ i cặ p mồ i đặ c hiệ u cho giố ng
Lactobacillus (T: thang DNA 50 –1000 bp, A: L. acidophilus NRRL B-2092, B: L. sakei NRRL B-
1917, C: E. coli ATTC 2592, 1: B1, 2: B3, 3: B5, 4: B6, 5: B8a, 6: B8b, 7: B9a, 8: B9b, 9: B11, 10:
B12a, 11: B12b, 12: B15, 13: B17, 14: M3, 15: M5, 16: T16).
1000 bp
750 bp
500 bp
300 bp
50 bp
150 bp
340 bp
T 12 13 14 15 16 A C
T B 6 7 8 9 10 11
4
hệ vi sinh vậ t đư ờ ng ruộ t ổ n đị nh hơ n các trẻ nhóm 1. Ngoài ra, theo mộ t số nghiên cứ u khác, mậ t độ
Lactobacillus trong các mẫ u phân củ a nhữ ng trẻ từ 1 tuầ n tuổ i trở lên thư ờ ng cao hơ n nhữ ng trẻ em dư ớ i
1 tuầ n tuổ i [2], do đó Lactobacillus sẽdễ dàng phân lậ p đư ợ c từcác mẫ u củ a nhóm 2 hơ n các mẫ u nhóm
1. Mặ t khác, sự khác biệ t này có thể liên quan đế n nơ i ở củ a nhữ ng trẻ em đư ợ c nghiên cứ u. Nhữ ng trẻ
nhóm 1 thư ờ ng ở các bệ nh việ n hoặ c vừ a mớ i xuấ t việ n; trong khi nhữ ng trẻ nhóm 2 thư ờ ng đang số ng ở
các gia đình, nơ i mà điề u kiệ n vệ sinh ít nghiêm ngặ t hơ n môi trư ờ ng bệ nh việ n, nên trẻ nhóm 2 có khả
năng tiế p nhậ n vô số vi sinh vậ t khác nhau.Đó cũng là nguyên nhân khiế n cho hệ vi sinh vậ t đư ờ ng ruộ t
củ a nhữ ng trẻ trên 1 tuầ n tuổ i trở nên ổ n đị nh hơ n và Lactobacillus cũng thư ờ ng xuyên hiệ n diệ n vớ i mậ t
độ cao hơ n.
3.2. Đặ c điể m probiotic củ a các chủ ng Lactobacillus:
3.2.1. Khả năng thích ứ ng pH thấ p:
Các probiotic sử dụ ng cho ngư ờ i hiệ n nay đề u đư ợ c nghiên cứ u đư a vào cơ thể con ngư ờ i qua
đư ờ ng tiêu hóa. Để có thể vư ợ t qua đư ợ c dạ dày, chủ ng probiotic phả i có khả năng kháng lạ i môi
trư ờ ng axít củ a dạ dày. Khả năng chị u đự ng pH 3 trong ít nhấ t 3 giờ là điề u kiệ n phù hợ p đố i vớ i
chủ ng probiotic cho ngư ờ i [6]. Kế t quả thí nghiệ m này cho thấ y tấ t cả 15 chủ ng Lactobacillus ở trên
đề u có khả năng chị u đự ng đư ợ c pH 3 đế n 3 giờ . Mộ t số chủ ng có thể chị u đự ng đư ợ c pH rấ t thấ p như
chị u đự ng đư ợ c pH 1 đế n 1 giờ (B8a, B8b, B9a và T16), đặ c biệ t chủ ng B12b có thể chị u đư ợ c pH 1
đế n 2 giờ . Chủ ng M5 có thể chị u đự ng đư ợ c pH 2 đế n 3 giờ , trong khi các chủ ng B6, B9b và B15 chỉ
chị u đự ng đư ợ c pH 2 đế n 1 giờ . Kế t quả này phù hợ p vớ i kế t quả đạ t đư ợ c bở i Matijašić và Rogelj
(2000) [6], Mishra và Prasad (2005) [7].
3.2.2. Khả năng kháng mậ t:
Mộ t thách thứ c khác đố i vớ i sự tồ n tạ i củ a vi sinh vậ t trong đư ờ ng dạ dày –ruộ t ngư ờ i là sự
hiệ n diệ n củ a mậ t ở ruộ t non. Mậ t có tác dụ ng tiêu diệ t vi sinh vậ t nhờ vào hoạ t độ ng phá hủ y màng tế
bào vi sinh vậ t. Kế t quả thí nghiệ m cho thấ y phầ n lớ n các chủ ng có khả năng chị u đự ng đế n nồ ng độ
mậ t 2% (B1, B3, B5, B6, B8a, B8b, B9a, B9b, B11, B15, B17, M5 và T16). Tuy nhiên, chủ ng M3 chỉ
chị u đự ng đư ợ c đế n nồ ng độ mậ t 1% và chủ ng B12b chỉ chị u đư ợ c đế n nồ ng độ mậ t 0,5%. Nồ ng độ
mậ t 0,3% thư ờ ng đư ợ c dùng để chọ n lọ c nhữ ng chủ ng probiotic kháng mậ t vì nồ ng độ này đư ợ c xem
là nồ ng độ mậ t trung bình trong ruộ t ngư ờ i [6]. Tấ t cả 15 chủ ng Lactobacillus thử nghiệ m ở đây đề u
có khả năng sinh trư ở ng ở nồ ng độ mậ t 0,3%. Kế t quảnày phù hợ p vớ i kế t quả đạ t đư ợ c bở i Jacobsen
et al. (1999) [4], Mishra và Prasad (2005) [7].
3.2.3. Tính kỵ nư ớ c củ a bề mặ t tế bào:
Khả năng đị nh cư củ a các probiotic trong ruộ t ngư ờ i có thể đư ợ c xác đị nh dự a trên khả năng
kế t bám củ a chúng vớ i biể u mô ruộ t. Các nhà nghiên cứ u nhậ n thấ y đặ c tính kế t bám vớ i biể u mô củ a
vi sinh vậ t liên quan đế n tính kỵ nư ớ c bề mặ t củ a chúng. Kế t quả về tính kỵ nư ớ c bề mặ t tế bào củ a
các chủ ng Lactobacillus đư ợ c thể hiệ n ở bả ng 1.
Bả ng 1. Kế t quả về tính kỵ nư ớ c bề mặ t tế bào củ a các chủ ng Lactobacillus (–: không biể u
hiệ n kế t bám)
Kí hiệ u
chủ ng
% kỵ nư ớ c (%)
n-hexadecane
Xylene
Toluene
B1
3,85
-
1,49
B3
0,51
-
-
B5
17,91
30,86
44,73
B6
34,49
22,47
22,95
B8a
84,23
75,79
65,10
B8b
25,51
38,69
55,14
B9a
40,45
52,07
55,53
B9b
49,18
51,19
45,55
B11
5,92
26,34
33,56
B12b
38,84
28,37
20,16
B15
0,51
-
-
B17
29,44
55,47
48,48
M3
51,00
45,55
38,3
M5
25,75
37,71
28,89
T16
16,20
30,83
55,62
5
Kế t quả thí nghiệ m này cho thấ y trong 15 chủ ng Lactobacillus thử nghiệ m, 12 chủ ng (B5, B6,
B8a, B8b, B9a, B9b, B11, B12b, B17, M3, M5 và T16) có khả năng kế t bám vớ i biể u mô ruộ t vì
chúng đề u có % kỵ nư ớ c đáng kể đố i vớ i cả 3 loạ i hydrocarbon. Trong đó, chủ ng B8a có % kỵ nư ớ c
cao nhấ t đố i vớ i cả 3 loạ i hydrocarbon (n-hexadecane: 84,23%, xylene: 75,79%, toluene: 65,10%).
Ngư ợ c lạ i, các chủ ng B1, B3 và B15 ít kế t bám vớ i biể u mô vì chúng chỉ thể hiệ n % kỵ nư ớ c bề mặ t tế
bào rấ t thấ p đố i vớ i 1 hoặ c 2 loạ i hydrocarbon thí nghiệ m. Chủ ng B3 và B15 có % kỵ nư ớ c rấ t thấ p
vớ i n-hexadecane (0,51%) và không có tính kỵ nư ớ c bề mặ t vớ i xylene và toluene; trong khi chủ ng B1
không biể u hiệ n tính kỵ nư ớ c bề mặ t tế bào vớ i xylene, mà chỉ có % kỵ nư ớ c rấ t thấ p vớ i 2 loạ i
hydrocarbone còn lạ i là n-hexadecane (3,85%) và toluene (1,49%). Kế t quả này phù hợ p vớ i kế t quả
đạ t đư ợ c bở i Mishra và Prasad (2005) [7].
3.2.4. Hoạ t tính kháng khuẩ n:
Mộ t trong nhữ ng đặ c điể m probiotic có lợ i đố i vớ i sứ c khỏ e con
ngư ờ i là khả năng kháng các vi khuẩ n gây bệ nh. Kế t quả hoạ t tính kháng
khuẩ n củ a các chủ ng Lactobacillus đư ợ c thể hiệ n ở bả ng 2. 12 chủ ng
Lactobacillus (B5, B6, B8a, B8b, B9a, B9b, B11, B12b, B17, M3, M5 và
T16) đề u có khả năng kháng lạ i 5 vi khuẩ n gây bệ nh gồ m: E. coli ATTC
25922, S. typhi, St. aureus ATCC 25923, Klebsiella sp. 371 và Shigella sp.
1640 (hình 2 thể hiệ n sự đố i kháng củ a chủ ng B9b đố i vớ i Shigella sp.
1640). Trong đó, chủ ng T16 kháng rấ t mạ nh đố i vớ i cả 5 vi khuẩ n gây
bệ nh này. Tuy nhiên, không có chủ ng Lactobacillus nào kháng lạ i L.
acidophilus NRRL B-2092. Điề u này chứng tỏ tấ t cả các chủ ng
Lactobacillus thí nghiệ m đề u có hoạ t tính kháng các vi khuẩ n gây bệ nh,
như ng không kháng lạ i vi khuẩ n cùng loạ i vớ i chúng. Khả năng kháng
khuẩ n củ a các chủ ng ở đây tư ơ ng tự vớ i các chủ ng Lactobacillus phân lậ p
đư ợ c từ phân trẻ em trong thí nghiệ m củ a Jacobsen et al. (1999), mặ c dù có sự khác nhau về phổ
kháng khuẩ n. Các chủ ng củ a Jacobsen et al. cũng kháng lạ i E. coli và S. typhimurium,như ng không
kháng lạ i St. aureus [4].
Bả ng 2. Hoạ t tính kháng khuẩ n củ a các chủ ng Lactobacillus ((–) = 0, (+) = 1 –2 mm, (++) =
2,1 –4 mm, (+++) = lớ n hơ n 4 mm)
Kí
hiệ u
chủ ng
Vùng ứ c chế sinh trư ở ng
E. coli
ATTC 25922
S. typhi
St. aureus
ATTC 25923
Klebsiella
sp. 371
Shigella
sp. 1640
L. acidophilus
NRRL B-2092
B5
++
+++
+
++
+++
-
B6
+++
+++
+
+++
+
-
B8a
+++
+++
+++
++
++
-
B8b
++
+++
++
+++
++
-
B9a
+++
+++
++
++
+++
-
B9b
+++
+++
++
++
+++
-
B11
++
+++
+
+++
++
-
B12b
+
+++
+++
+
+++
-
B17
+++
+++
+
++
++
-
M3
+++
+++
+
++
+++
-
M5
+++
+++
++
+++
+++
-
T16
+++
+++
+++
+++
+++
-
3.2.5. Khả năng tạ o bacteriocin và các chấ t kháng khuẩ n khác:
Nhiề u nghiên cứ u đã chứ ng tỏ các loài LAB có khả năng đố i kháng chố ng lạ i các tác nhân gây
bệ nh đư ờ ng ruộ t. Ngoài khả năng làm giả m pH môi trư ờ ng bên trong khoang ruộ t bằ ng cách tạ o ra các
axít hữ u cơ (như : axít lactic, axít acetic…) có tác dụ ng ứ c chế nhiề u loài vi khuẩ n Gram dư ơ ng và
Gram âm, các LAB còn có khả năng tạ o ra bacteriocin và các chấ t kháng khuẩ n khác (như : H2O2, CO2,
diacetyl…). Bacteriocin là chấ t kháng khuẩ n tạ o ra bở i nhiề u loài vi khuẩ n, có bả n chấ t protein và
thư ờ ng có phổ diệ t khuẩ n hẹ p, chỉ ứ c chế nhữ ng vi sinh vậ t có quan hệ gầ n gũi vớ i vi sinh vậ t sả n xuấ t
bacteriocin [9]. Kế t quả thí nghiệ m cho thấ y dị ch nuôi cấ y củ a 12 chủ ng Lactobacillus (B5, B6, B8a,
Hình 2. Sự đố i kháng
củ a chủ ng B9b đố i vớ i
Shigella sp. 1640