Động học ức chế thủy phân protein dự trữ, xúc tác bởi papain từ quả đu đủ xanh

T¹p chÝ Hãa häc, T. 41, sè 1, Tr. 14 - 18, 2003<br /> <br /> <br /> ®éng häc øc chÕ thñy ph©n protein dù tr÷, xóc t¸c<br /> bëi papain tõ nhùa qu¶ ®u ®ñ xanh<br /> §Õn Tßa so¹n 12-3-2002<br /> trÇn ®×nh to¹i1, trÇn trung hiÕu2<br /> 1<br /> ViÖn Hãa häc, Trung t©m KHTN&CNQG<br /> 2<br /> ViÖn Nghiªn cøu kiÕn tróc, Bé X©y dùng<br /> <br /> <br /> Summary<br /> The hydrolysis of reserve protein catalyzed by papain has been inhibited by Flavonoid. The<br /> inhibition was found competitive.<br /> Calculated constants of hydrolytic reaction have been estimated as following:<br /> VM = 0.67×10-3 M.sec-1; k2 = 33.5 sec-1; Ks = 0.55×10-5 M; Ki = 1.85×10-3 M<br /> <br /> <br /> <br /> I - Më ®Çu i«taxetamit, p-clomercuribenzoat, N-(N-axetyl-<br /> 1-phenylalanyl), cystamin, amino axetonitril v<br /> Trong nhùa ®u ®ñ cã chøa 4 lo¹i proteaza l c¸c hîp chÊt ®isunfua kh¸c. C¸c chÊt n y l<br /> papain, chymotpapain, peptidaza Av peptidaza chÊt øc chÕ kh«ng thuËn nghÞch. Nitril peptit l<br /> B. Trong ®ã, papain, cã ký hiÖu E.C.3.4.22.2, chÊt øc chÕ thuËn nghÞch ®èi víi papain [4].<br /> chiÕm h¬n 90% v l enzym cã ho¹t tÝnh thñy C¸c flavonoit còng cã ¶nh h4ëng øc chÕ<br /> ph©n m¹nh nhÊt [1, 2]. papain [5].<br /> Papain mang tÝnh chÊt nh4 mét Papain ®4îc øng dông trong nhiÒu lÜnh vùc<br /> endopeptidaza, ®ång thêi còng nh4 mét cña nÒn kinh tÕ quèc d©n: trong c«ng nghiÖp<br /> exopeptidaza, thñy ph©n protein th nh thùc phÈm, c«ng nghiÖp nhÑ v trong y, d4îc.<br /> polypeptit, oligopeptit v c¸c axit amin. TÝnh<br /> chÊt ®Æc hiÖu cña papain rÊt lín ®èi víi c¬ chÊt, Nghiªn cøu quy luËt ®éng häc cña ph¶n<br /> papain cã kh¶ n¨ng thñy ph©n tÊt c¶ c¸c liªn kÕt øng thñy ph©n protein dù tr÷, xóc t¸c bëi<br /> peptit, trõ c¸c liªn kÕt cña prolin v axit papain, trong ®ã bao gåm c¸c ¶nh h4ëng øc chÕ<br /> glutamic. Papain tõ nhùa qu¶ ®u ®ñ xanh cã cho phÐp hiÓu s©u b¶n chÊt cña qu¸ tr×nh ®Ó ®4a<br /> ho¹t lùc thñy ph©n m¹nh ngang víi chÕ phÈm v o øng dông thùc tiÔn mét c¸ch cã hiÖu qu¶<br /> subsdilizin Bungari v m¹nh h¬n chÕ phÈm t¹o ra nh÷ng s¶n phÈm cã gi¸ trÞ dinh d4ìng<br /> Neutrase cña hGng Novo, §an M¹ch [3]. cao.<br /> Papain tõ nhùa ®u ®ñ xanh cã ®é bÒn cao II - Ph ¬ng ph¸p nghiªn cøu<br /> (khi cßn ë trong nhùa sÊy kh« t¹i 100oC bÒn<br /> trong 3 giê), bÒn v÷ng l©u khi tiÕp xóc víi oxi 1. Nguyªn liÖu<br /> kh«ng khÝ, cã vïng ho¹t ®éng pH réng tõ 4,5<br /> ®Õn 8,5. Papain ®4îc chiÕt ra tõ nhùa qu¶ ®u ®ñ<br /> xanh theo quy tr×nh ®G c«ng bè tr4íc ®©y [6].<br /> C¸c chÊt øc chÕ papain l c¸c chÊt cã tÝnh<br /> oxi hãa nh4: oxi, ozon, hi®roperoxit, iotaxetat, 2. Ph ¬ng ph¸p<br /> 14<br />  Ho¹t tÝnh cña papain ®4îc x¸c ®Þnh theo dÞch enzym cÇn nghiªn cøu. Gi÷ ®óng 10 phót ë<br /> ph4¬ng ph¸p Anson c¶i tiÕn. 30oC råi ®em ly t©m 5 phót ë tèc ®é 12.000<br /> rpm. LÊy phÇn dÞch trong ë trªn ®Ó tiÕn h nh<br /> a) Nguyªn lý cña phG¬ng ph¸p<br /> ph¶n øng n u.<br /> Ho¹t tÝnh cña papain ®4îc x¸c ®Þnh b»ng TiÕn h nh ph¶n øng m u: lÊy 0,5 ml dÞch<br /> l4îng tyrozin-s¶n phÈm t¹o th nh trong ph¶n trong t4¬ng øng nªu trªn cho v o èng nghiÖm,<br /> øng thñy ph©n protein (cazein l c¬ chÊt) do sau ®ã thªm v o 2,5 ml Na2CO3 0,5 M v l¾c<br /> papain xóc t¸c. Ho¹t tÝnh cña enzym ®4îc biÓu ®Òu, ®Ó yªn 5 phót råi cho thªm 0,5 ml dung<br /> diÔn b»ng ®¬n vÞ ho¹t ®é Anson. dÞch thuèc thö folin-ciocalteux ®G pha loGng 5<br /> §¬n vÞ ho¹t ®é Anson l l4îng enzym m lÇn. L¾c ®Òu v ®Ó yªn 30 phót ë nhiÖt ®é<br /> trong 1 phót ë 30oC cã kh¶ n¨ng ph©n gi¶i phßng, sau ®ã ®o mËt ®é quang ë b4íc sãng<br /> protein t¹o th nh c¸c s¶n phÈm hßa tan trong 670 nm. Tõ c¸c kÕt qu¶ thu ®4îc ®èi víi c¸c<br /> axit tricloaxetic cho ph¶n øng m u víi thuèc mÉu thùc nghiÖm, dùa v o ®4êng chuÈn ®Ó x¸c<br /> thö poli-ciocalteux t4¬ng ®4¬ng víi 1 µM ®Þnh ho¹t ®é enzym cña c¸c mÉu nghiªn cøu<br /> tyrozin [3]. n y.<br /> b) Hãa chÊt<br /> III - kÕt qu¶ v& th¶o luËn<br /> Dung dÞch cazein 2%: 2 g cazein trong<br /> dung dÞch ®Öm photphat pH = 8, ®Þnh møc tíi 1. X¸c ®Þnh c¸c th«ng sè ®éng häc cña ph¶n<br /> 100 ml. øng thñy ph©n protein dù tr÷ (cazein),<br /> Dung dÞch ®Öm photphat pH = 8 (Na2HPO4 xóc t¸c bëi papain tõ nhùa qu¶ ®u ®ñ<br /> - NaH2PO4) 0,1 M. xanh<br /> Dung dÞch chuÈn 1 µM tyrozin/ml: 18,12 §Ó x¸c ®Þnh c¸c th«ng sè ®éng häc, tiÕn<br /> mg tyrozin tinh khiÕt hßa tan trong dung dÞch h nh ph¶n øng víi c¸c nång ®é c¬ chÊt (cazein)<br /> HCl 0,2 M ®Þnh møc ®Õn 100 ml. kh¸c nhau tõ 0,5.10-5 M ®Õn 10.10-5 M.<br /> Dung dÞch tyrozin pha loGng: pha loGng C¸c kÕt qu¶ thùc nghiÖm ®4îc tr×nh b y<br /> dung dÞch chuÈn b»ng HCl 0,2 M ®Ó thu ®4îc trong b¶ng 1. Tõ c¸c d÷ kiÖn trong b¶ng, lËp ®å<br /> c¸c dung dÞch cã c¸c nång ®é sau: 0,02, 0,04, thÞ theo ph4¬ng ph¸p Lainuiver Berk 1/V =<br /> 0,08, 0,1, 0,15, 0,2 v 0,3 µM tyrozin/ml. f(1/[S]) (®4êng 1, h×nh 1). Qua ®å thÞ x¸c ®Þnh<br /> Dung dÞch axtt tricloaxetit 0,3 M (TCA 0,3 ®4îc c¸c th«ng sè ®éng häc cña ph¶n øng VM,<br /> M). KS, k2:<br /> Dung dÞch Na2CO3 0,5 M. 1/VM = 1,5.103 M-1.sec VM = 0,67.10-3<br /> Dung dÞch thuèc thö pholin - ciocalceux 1 M.sec-1; -1/KS = -1,8.105 M-1 KS = 0,55.10-5<br /> M pha loGng b»ng n4íc cÊt 5 lÇn tr4íc khi M<br /> dïng. BiÕt nång ®é enzym [E] = 2.10-5 M, x¸c<br /> c) LËp ®å thÞ chuÈn ®Þnh ®4îc k2 = 33,5 sec-1.<br /> Tõ c¸c dung dÞch tyrozin cã nång ®é kh¸c 2. Nghiªn cøu ¶nh h ëng øc chÕ cña<br /> nhau l m ph¶n øng m u víi 0,5 ml dung dÞch flavonoit ([I]) tíi ph¶n øng thñy ph©n<br /> thuèc thö folin-ciocalteux ®G pha loGng 5 lÇn. protein dù tr÷ (cazein [S]), xóc t¸c bëi<br /> §o mËt ®é quang (so m u) ë b4íc sãng 670 papain tõ nhùa qu¶ ®u ®ñ xanh<br /> nm. Tõ c¸c kÕt qu¶ thu ®4îc lËp ®4êng chuÈn §Ó kh¶o s¸t ¶nh h4ëng øc chÕ cña flavonoit<br /> biÓu diÔn sù phô thuéc cña mËt ®é quang (E) ([I]) tíi ®éng häc cña ph¶n øng thñy ph©n, tiÕn<br /> v o nång ®é tyrozin (C). h nh ph¶n øng khi cã mÆt flavonoit víi c¸c<br /> d) TiÕn hQnh thÝ nghiÖm nång ®é kh¸c nhau tõ 1.10-2 M ®Õn 5.10-2 M khi<br /> Cho v o èng thÝ nghiÖm 0,3 ml dung dÞch cã papain, nång ®é 2.10-5 M.<br /> cazein 2% ®G æn nhiÖt ®Õn 30oC v 0,3 ml dung C¸c kÕt qu¶ thu ®4îc vÒ ¶nh h4ëng øc chÕ<br /> 15<br /> cña flavonoit ([I]) tíi tèc ®é ph¶n øng ®4îc tr×nh b y ë b¶ng 2.<br /> B¶ng 1: C¸c th«ng sè ®éng häc cña ph¶n øng thñy ph©n protein dù tr÷ (cazein)<br /> x¸c ®Þnh bëi papain tõ nhùa qu¶ ®u ®ñ xanh<br /> STT [S].105, M (1/[S]).10-5 M-1 V0.103, M.sec-1 (1/V0).10-3, M-1.sec<br /> 1 0,5 2,0 0,33 3,0<br /> 2 0,75 1,35 0,38 2,6<br /> 3 1,0 1,0 0,43 2,3<br /> 4 1,25 0,8 0,48 2,1<br /> 5 2,0 0,5 0,52 1,9<br /> 6 2,5 0,4 0,55 1,8<br /> 7 3,5 0,3 0,59 1,7<br /> 8 5,0 0,2 0,63 1,6<br /> 9 10 0,1 0,63 1,6<br /> <br /> B¶ng 2: ¶nh h4ëng øc chÕ cña flavonoit ([I]) tíi tèc ®é ph¶n øng thñy ph©n<br /> (Vi.103, M.sec-1) protein dù tr÷, xóc t¸c bëi papain<br /> C¬ chÊt Flavonoit ([I]).102 M<br /> [S].105 M 1 2 3 4 5<br /> 0,5 0,20 0,16 0,11 0,09 0,08<br /> 0,75 0,28 0,21 0,16 0,13 0,12<br /> 1,0 0,32 0,25 0,19 0,16 0,15<br /> 1,25 0,38 0,29 0,23 0,19 0,18<br /> 2,0 0,43 0,37 0,30 0,26 0,23<br /> 2,5 0,48 0,40 0,34 0,30 0,28<br /> 3,5 0,50 0,45 0,38 0,34 0,32<br /> 5,1 0,55 0,50 0,43 0,40 0,38<br /> 10 0,59 0,55 0,53 0,50 0,48<br /> <br /> Tõ c¸c d÷ kiÖn thùc nghiÖm trong b¶ng 2, Víi tèc ®é ph¶n øng<br /> lËp ®å thÞ theo ph4¬ng ph¸p Lainuived Berk cã k 2 [E0 ][S ]<br /> Vi = (1)<br /> tÝnh ®Õn ¶nh h4ëng cña chÊt øc chÕ 1/Vi =<br /> f(1/[S]) (h×nh 1, c¸c ®4êng ®å thÞ 2, 3, 4, 5, 6). KS 1+<br /> [I ] + [S ]<br /> Ki<br /> Trªn h×nh 1 thÊy r»ng, c¸c ®4êng ®å thÞ c¾t<br /> nhau t¹i mét ®iÓm trªn trôc tung. §iÒu ®ã VM [S ]<br /> hoÆc Vi = (2)<br /> K M i + [S ]<br /> chøng tá r»ng, chÊt øc chÕ kh«ng g©y ¶nh<br /> h4ëng tíi VM chØ g©y ¶nh h4ëng tíi KM. Nh4<br /> Trong khi ®ã K M i = K S (1+ [I ]/ K i )<br /> vËy, ®©y l hiÖn t4îng øc chÕ c¹nh tranh.<br /> Tr4êng hîp n y chÊt øc chÕ chØ kÕt hîp víi<br /> enzym, kh«ng kÕt hîp víi phøc enzym - c¬ Qua c«ng thøc tèc ®é (1) thÊy r»ng, nÕu [S]<br /> chÊt. HiÖn t4îng øc chÕ n y ®4îc m« t¶ theo s¬ lín th× Vi = k2 [E]0 = VM . Nh4 vËy, nÕu lÊy<br /> ®å (S§.1) [7]. nång ®é cazein thËt lín, cã thÓ lo¹i bá ¶nh<br /> KS k2 h4ëng øc chÕ cña flavonoit.<br /> E+S ES E+P (S§.1)<br /> BiÕn ®æi c«ng thøc (3) ®4îc: KMi/KS = 1 +<br /> Ki<br /> [I]/Ki.<br /> EI<br /> 16<br />  H×nh 1: ¶nh h4ëng øc chÕ cña flavonoit ([I]) tíi tèc ®é ph¶n øng thñy ph©n (V)<br /> protein dù tr÷ (cazein[S]), xóc t¸c bëi papain<br /> C¸c ®4êng ®å thÞ tõ d4íi lªn: 1. [I] = 0; 2. [I] = 1.10-2 M; 3. [I] = 2.10-2 M; 4. [I] = 3.10-2 M;<br /> 5. [I] = 4.10-2 M; 6. [I] = 5.10-2 M<br /> <br /> §Ó x¸c ®Þnh Ki, lËp ®å thÞ KMi /KS = f([I]) (b¶ng 3).<br /> (h×nh 2). §Ó lËp ®å thÞ n y, dùa v o c¸c ®4êng §å thÞ KMi/KS = f([I]) (h×nh 2) l ®4êng<br /> ®å thÞ trªn h×nh 1, tÝnh c¸c gi¸ trÞ KMi t4¬ng øng th¼ng c¾t trôc tung t¹i 1 v cã ®é nghiªng víi<br /> víi c¸c nång ®é kh¸c nhau cña flavonoit [I] tg = 1/Ki.<br /> <br /> B¶ng 3: ¶nh h4ëng øc chÕ cña flavonoit ([I]) tíi h»ng sè Michaelis (KM) cña<br /> ph¶n øng thñy ph©n protein dù tr÷ (cazein [S]), xóc t¸c bëi papain<br /> [I].102, M 0 1 2 3 4 5<br /> KMi.105, M 0,55 0,96 1,27 2,20 2,80 3,52<br /> KMi/KS 1,00 1,70 2,30 4,00 5,10 6,40<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> H×nh 2: ¶nh h4ëng øc chÕ flavonoit ([I]) tíi h»ng sè Michaelis (KM)<br /> cña ph¶n øng thñy ph©n protein dù tr÷, xóc t¸c bëi papain<br /> 17<br />  Tõ ®å thÞ KMi (KS = f([I]) (h×nh 2), x¸c ®Þnh 2. M. A. Noble, S. Gul, C. S. Verma, K.<br /> Ki: tg = 1/Ki = 5,4.10-2 M Ki = 1,85.10-3 M Brocklehurst. Biochem., J. Vol. 351, P. 723<br /> - 733 (200).<br /> III - kÕt luËn 3. TrÇn §×nh Thanh. LuËn ¸n tiÕn sÜ Hãa häc,<br /> H Néi (2002).<br /> §G nghiªn cøu ®éng häc qu¸ tr×nh øc chÕ 4. A. Watts, A. Hafeez, S. Gul, C. Verma, E.<br /> papain tõ nhùa qu¶ ®u ®ñ xanh, xóc t¸c ph¶n W. Thomas, K. Brocklehurst. Biochem.,<br /> øng thñy ph©n protein dù tr÷. Soc., Trans., 25, 84s (1997).<br /> - Flavonoit øc chÕ papain theo c¬ chÕ c¹nh 5. TrÇn §×nh Thanh, Ho ng Thanh H4¬ng,<br /> tranh NguyÔn V¨n ViÖt, TrÇn §×nh To¹i. T¹p chÝ<br /> - §G tÝnh to¸n ®4îc c¸c h»ng sè ®éng häc Hãa häc v C«ng nghÖ hãa chÊt, sè 2, P. 6 -<br /> cña ph¶n øng thñy ph©n: VM = 0,67.10-3 M.sec-1; 10 (2001).<br /> k2 = 33,5 sec-1; KS =0,55.10-5 M; Ki = 1,85.10-3 6. TrÇn §×nh To¹i, Lª §øc Ngäc, TrÇn §×nh<br /> M. Thanh. T¹p chÝ Hãa häc, T. 31, sè 4, Tr. 29<br /> - 31 (1993).<br /> T&i liÖu tham kh¶o 7. TrÇn §×nh To¹i. §éng häc c¸c qu¸ tr×nh<br /> xóc t¸c sinh häc. §¹i häc khoa häc tù<br /> 1. D. J. Buttle, et al. Biochem. J., Vol. 261, P. nhiªn, §¹i häc Quèc gia H Néi, 148 trang<br /> 469 - 476 (1994). (2002).<br /> <br /> <br /> <br /> <br /> 18<br />