Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021
B - Khoa học Dược
20
KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, MÃ VẠCH ADN VÀ SÀNG LỌC
MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY CAM SŨNG
(SAUROPUS SPATULIFOLIUS BEILLE, PHYLLANTHACEAE)
Nguyễn Anh Đào1,2, Phạm Thị Kim Trâm3, Trần Thị Vân Anh1
TÓM TẮT
Mở đầu: Cam sũng (Lưỡi nhân) là cây thuốc dân gian dùng để chữa ho, viêm phổi, chữa bệnh tim, kháng
khối u... nhưng có rất ít các nghiên cứu đã được công bố.
Mục tiêu: Khảo sát đặc điểm thực vật, vi học và mã vạch ADN để góp phần định dạng đúng loài Cam sũng.
Sàng lọc các tác dụng kháng khuẩn, chống oxi hóa, kháng viêm của các cao chiết từ lá Cam sũng.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Mẫu cây Cam sũng thu thập tại huyện Tịnh Biên, An Giang
(04/2019) được phân tích, mô tả, chụp ảnh các đặc điểm hình thái và giải phẫu và bột vi học và phân tích ADN
lục lạp vùng ITS1. Hoạt tính chống oxy hóa được khảo sát bằng mô hình DPPH, hoạt tính kháng khuẩn được
thực hiện bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch, hoạt tính kháng viêm được đánh giá qua tác dụng ức chế NO
trên tế bào RAW 264.7 được kích thích bởi LPS.
Kết quả: Loài Cam sũng (Lưỡi nhân) được định danh dựa trên hình thái và mã vạch ADN xác định tên
khoa học là Sauropus spatulifolius Beille. Cao cồn 50% của Cam sũng thể hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt nhất
với IC50 20,76 µg/ml; các phân đoạn EtOAc và nước từ cao cồn 50% có tác dụng kháng khuẩn yếu, phân đoạn
EtOAc từ cao cồn 50% có tác dụng kháng viêm tốt với IC50 là 12,05 µg/mL.
Kết luận: Nghiên cứu góp phần cung cấp dữ liệu định danh chính xác loài Cam sũng. Kết quả thử nghiệm
các tác dụng sinh học minh chứng và giải thích cho các công dụng dân gian.
Từ khóa: Cam sũng, Lưỡi nhân, Sauropus spatulifolius Beille, vi học, ADN, DPPH, kháng khuẩn, kháng viêm
ABSTRACT
BOTANICAL CHARACTERISTICS, DNA BARCODE AND PHARMACOLOGICAL
ACTIVITIES OF THE LEAVES OF SAUROPUS SPATULIFOLIUS BEILLE
Nguyen Anh Dao, Pham Thi Kim Tram, Tran Thi Van Anh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 4 - 2021: 20 - 28
Background: Cam Sũng (Lưỡi nhân) has been used in folk medicine for the treatment of acute bronchitis,
cough and sore throat, inflammatory symptoms and anticancer... but there have not many scientific reports.
Objectives: The aim of this study was to investigate the botanical characteristics, DNA barcodes of Cam sũng
for exact botanical identification and to evaluate of some pharmacological activities of the extract from the leaves.
Methods: The samples collected from Tinh Bien, An Giang province (04/2019) were described the
morphological and anatomical characteristics; analyzed the chloroplast DNA barcode on ITS region. Antioxidant
activity was evaluated by DPPH test, antibacterial test was evaluated on five pathogenic bacteria species using
agar well diffusion method; anti inflammatory activity was accessed by lipopolysaccharide-induced production of
Nitric oxide in RAW 264.7 macrophages method.
Results: Cam sũng (Lưỡi nhân) was identified as Sauropus spatulifolius Beille based on morphological
characteristics and DNA barcode. 50% ethanolic extract of the leaves presented the highest antioxidant activity
1Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh 2Khoa Y Dược, Trường Đại học Trà Vinh
3Phòng CNSH Y Dược, Trung tâm Công nghệ Sinh học Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: PGS.TS.DS. Trần Thị Vân Anh ĐT: 0918852989 Email: ttvananh@ump.edu.vn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021
Nghiên cứu
B - Khoa học Dược
21
with IC50 = 20.76 µg/ml. The EtOAc and water fractions from 50% ethanolic extract had mild antibacterial
activity, EtOAc fraction showed a good anti-inflammatory activity with IC50 = 12.05 µg/mL.
Conclusion: The study confirmed the scientific name of “Cam sũng” in Viet Nam is Sauropus spatulifolius
Beille (Euphorbiaceae). The result of bioactive testing rationalized the usages of this plant.
Keywords: Sauropus spatulifolius Beille, anatomy, DPPH, antibacterial, anti inflammatory
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cam sũng (Lưỡi hổ, Lưỡi hùm, tên dân
gian còn gọi là Lưỡi nhân) được sử dụng trong
y học dân gian để chữa ho, bổ phổi, chữa bệnh
tim, kháng khối u... Theo tài liệu của Đỗ Tất
Lợi, Võ Văn Chi và Viện Dược liệu, Cam sũng
có tên khoa học là Sauropus rostratus Miq., họ
Euphorbiaceae(1-3). Tuy nhiên, các đặc điểm
hình thái của Cam sũng so sánh với đặc điểm
được ghi nhận trong các tài liệu thực vật của
Phạm Hoàng Hộ(4) và tác giả nước ngoài(5) thì
Cam sũng giống với loài Sauropus spatulifolius
Beille. Vì thế, vấn đề đặt ra là cần định danh
chính xác cây thuốc Cam sũng đang được sử
dụng ở Việt Nam. Cam sũng là cây thuốc dân
gian hiện được chú ý và sử dụng rộng rãi
nhưng vẫn chưa có công trình nào công bố về
thực vật học, thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học. Nghiên cứu này được thực hiện với
mong muốn cung cấp các đặc điểm hình thái,
giải phẫu, bột dược liệu, phân tích ADN
barcode để định danh chính xác loài đồng thời
bước đầu khảo sát một số tác dụng sinh học
của Cam sũng làm tiền đề khoa học để phát
triển cây thuốc này trong tương lai.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu cây Cam sũng được thu hái tại huyện
Tịnh Biên, tỉnh An Giang vào tháng 04 năm 2019.
Hóa chất, vật liệu
1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (Sigma-
Aldrich, Mỹ), acid ascorbic (Viện kiểm
nghiệm), Muller Hinton Agar (Himedia),
Staphylococcus aureus nhạy cảm methicillin
(ATCC 29213), S.aureus đề kháng methicillin
(ATCC 33591), Streptococcus pneumoniae (ATCC
44619), Escherichia coli (ATCC 25922),
Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), nấm men
Candida albicans (ATCC 10231) (bộ môn Vi kí sinh
- Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh), tế bào RAW
264.7 (ATCC TIB 71), môi trường Môi trường
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (Himedia),
LPS (Sigma), Griess (Sigma), DMSO (Merck).
Thiết bị
Kính hiển vi (Olympus), Máy UV (Vilber
Lourmat CN-15-LC)
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát đặc điểm hình thái
Các đặc điểm hình thái được quan sát bằng
mắt thường, kính lúp hay kính hiển vi quang
học, mô tả và chụp hình các bộ phận khảo sát.
Xác định tên khoa học của loài dựa trên so sánh
các đặc điểm hình thái ghi nhận với tài liệu
tham khảo(1-5).
Khảo sát đặc điểm vi phẫu, vi học
Thân, phiến lá được cắt ngang thành lát
mỏng bằng dao lam. Cắt ngang phần thân
đường kính 5-6 mm. Cắt ngang đoạn 1/3 đáy
phiến lá, gồm gân giữa và một ít hai bên gân
chính. Vi phẫu được tẩy trắng bằng nước javel,
nhuộm bằng son phèn và lục iod. Quan sát vi
phẫu bằng kính hiển vi quang học, chụp ảnh và
mô tả cấu trúc. Thực hiện soi bột lá bằng cách
chia nhỏ dược liệu, sấy ở 60 oC đến khô, nghiền
nhỏ, rây qua rây 32 (đường kính lỗ rây 0,1 mm)
và quan sát các cấu tử bột dưới kính hiển vi
quang học.
Khảo sát đặc điểm mã vạch ADN
Mẫu lá Cam sũng được chiết tách, tinh chế
ADN toàn phần, sau đó được khuếch đại bằng
phản ứng PCR với đoạn mồi ITS. Sản phẩm PCR
được tinh sạch và giải trình tự bằng phương
pháp Sanger(6), sau đó được so sánh với trình tự
tương ứng được công bố trên GenBank bằng
phương pháp BLAST. Qui trình được thực hiện
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021
B - Khoa học Dược
22
tại công ty Phù sa Biochem, TP. Vĩnh Long, tỉnh
Vĩnh Long.
Chiết xuất cao thử nghiệm
Bột dược liệu được chiết với 3 dung môi
khác nhau (cồn 96%, cồn 50 % và nước)
bằng phương pháp chiết siêu âm ở 50 oC
trong 30 phút x 3 lần, mỗi lần 350 ml, lọc qua
giấy lọc thu dịch chiết. Gộp dịch chiết, cô
quay thu được cao. Các cao chiết được xác
định hàm ẩm trước khi thực hiện các thử
nghiệm đánh giá hoạt tính sinh học.
Cao chiết cồn 50% tiếp tục lắc phân bố lỏng-
lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần
thu được các cao dicloromethan (SP50.1), ethyl
acetat (SP50.2), n-butanol (SP50.3) và cao nước
(SP50.4).
Đánh giá tác dụng chống oxy hóa
Thử nghiệm được thực hiện theo mô tả của
Kulisic và cộng sự(7). Hoạt tính chống oxi hóa của
mẫu thử được đánh giá theo sự giảm cường độ
màu của DPPH và được xác định bằng cách đo
OD ở 517 nm, tiến hành trong cuvet. Thí
nghiệm được lặp lại 3 lần và tính giá trị trung
bình. Kết quả được tính theo công thức
HTCO(%) = [(ODchứng - ODthử)/ ODchứng] x 100.
Mẫu chứng (có DDPH không có mẫu thử) và
acid ascorbic được tiến hành song song. Xác
định EC50 (nồng độ có HTCO 50%) bằng phần
mềm Excel.
Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật
Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật bằng
phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Hòa tan cao
trong DMSO 10% thu được dung dịch có nồng
độ 100 mg/ml. Vi khuẩn được hoạt hóa và nuôi
cấy trong dung dịch TBS, ủ ở 37 oC trong 24 giờ.
Điều chỉnh dịch treo có giá trị 0,08-0,1 (tương
đương với nồng độ vi khuẩn 1-2 x 108 tế bào vi
khuẩn/ml) bằng quang phổ kế ở bước sóng 625
nm, sau đó rải huyền dịch vi sinh vật lên bề mặt
môi trường. Giếng có đường kính từ 6 - 8 mm
được đục vô trùng, 100 µl cao chiết trong DMSO
10% được thêm vào giếng. Dung môi DMSO
10% được sử dụng là mẫu trắng để đánh giá khả
năng ảnh hưởng của dung môi hòa tan trên
vòng kháng khuẩn. Hoạt tính ức chế vi sinh vật
được đánh giá qua vòng ức chế xung quanh
giếng có mẫu thử(8). Thử nghiệm được tiến hành
3 lần để ghi nhận kết quả.
Đánh giá hoạt tính kháng viêm
Đánh giá hoạt tính kháng viêm qua tác
dụng ức chế NO của tế bào RAW 264.7 khi bị
kích thích bởi LPS(9). Mẫu thử được pha
thành dung dịch gốc với nồng 100 mg/ml
trong DMSO, sau đó pha long ở các nồng
độ khác nhau. Tế bào RAW 264.7 được nuôi
cấy 48 giờ trong môi trường DMEM ở 37 oC,
5% CO2 với 10% FBS, 100 UI/ml penicillin và
100 μg/ml streptomycin. Sau đó tế bào được
chuyển nuôi cấy trong giếng 96 với mật độ
2,5 x 105 tế bào/giếng. Tế bào được kích thích
với LPS trong 24 giờ với sự có mặt của các
chất thử ở nhiều nồng độ khác nhau. Dịch
nổi của tế bào phản ứng với thuốc thử
Griess. NaNO2 ở các nồng độ khác nhau
được sử dụng để xây dựng đường chuẩn. Độ
hấp thu được đo ở 570 nm. Dexan 20 µM
được sử dụng làm mẫu đối chứng.
Để khảo sát các thành phần thử nghiệm
có ảnh hưởng đến sự sống chết của của tế
bào hay không, phần tế bào còn lại được bổ
sung dung dịch MTT (0,5 mg/ml pha trong
PBS), ủ 4 giờ ở 37 oC và 5% CO2. Sau đó hút
bỏ hết môi trường trên bề mặt, kết tủa
formazan được hòa tan trong isopropanol.
Độ hấp thu được đo ở 570 nm. Tỉ lệ tế bào
sống càng cao thì giá trị NO sinh ra mới thể
hiện đúng hoạt tính.
Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và tính giá trị
trung bình. Kết quả được tính theo công thức:
% NO = ([Xtb]mẫu thử - [Xtb]LPS)/([Xtb]Control-
[Xtb]LPS)*100 ([Xtb] là nồng độ NO trung bình
được tính toán dựa vào đường chuẩn NaNO2) .
Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp
hồi quy tuyến tính trên phần mềm Excel.
Mẫu được xem là có hoạt tính kháng viêm
khi có IC50 < 50 μg/mL.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021
Nghiên cứu
B - Khoa học Dược
23
KẾT QUẢ
Đặc điểm hình thái
Cây bụi nhỏ, cao 10-50 cm, lá hơi mọng
nước, xanh tốt quanh năm. Thân tròn, xù xì,
màu nâu, có nhiều đốt, mỗi đốt mang một sẹo
do lá rụng để lại. Lá mọc so le, phiến lá hình
trứng, dài 7-15 x 2-4 cm, đầu lá tròn, hai mặt
nhẵn, mặt trên màu lục đậm, có những vân
màu xám trắng, mặt dưới nhạt; cuống lá rất
ngắn, dài 1-4 mm; lá kèm hình tam giác nhọn,
2-3 x 2-3 mm. Hoa màu tím hoặc tím đỏ, chưa
thấy được quả (Hình 1).
Cấu tạo giải phẫu
Bóc tách biểu bì
Biểu bì mang lông che chở đơn bào ở cả mặt
trên và mặt dưới lá. Tế bào biểu bì hình đa giác,
vách uốn lượn, nhiều lỗ khí hỗn bào ở mặt dưới
lá. Biểu bì trên hầu như không có lỗ khí. Biểu bì
thân non mang nhiều lông che chở (Hình 2).
Cây Cam sũng
Lá kèm hình tam
giác
Mặt trên lá
Mặt dưới lá
Đặc điểm hình thái cây Cam sũng
Hình 1. Đặc điểm hình thái cây Cam sũng
Hình 2. Bóc tách biểu bì cây Cam sũng
Lá
Gân giữa
Hai mặt lồi, mặt dưới lồi nhiều hơn mặt trên.
Biểu bì là một lớp tế bào hình chữ nhật hoặc đa
giác có kích thước tương đối nhỏ, xếp đều đặn,
lớp cutin mỏng, có nhiều lông che chở đơn bào.
Phía dưới biểu bì là lớp mô dày tròn, gồm
3-4 lớp tế bào. Mô mềm đặc gồm 5-10 lớp tế
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 4 * 2021
B - Khoa học Dược
24
bào. Gân chính hình vòng cung liên tục gồm
có bó gỗ ở trên và libe ở dưới. Mạch gỗ hình
đa giác hay gần tròn xếp thành dãy xen kẽ với
1-3 dãy mô mềm gỗ vách tẩm chất gỗ hay
cellulose; libe tế bào hình đa giác xếp lộn xộn
quanh có mô cứng nâng đỡ. Phía ngoài gân
chính có rất nhiều tinh thể calci oxalat hình
cầu gai.
Phiến lá
Biểu bì trên và dưới giống nhau gồm các tế
bào hình chữ nhật, vách dày, kích thước không
đều, lớp cutin khá dày, lỗ khí có nhiều biểu bì
dưới. Mô mềm giậu gồm 1 lớp tế bào thuôn dài,
chứa nhiều lục lạp. Dưới lớp mô giậu là mô
mềm khuyết dày gấp 2 lần mô mềm giậu, tế bào
hình dạng thay đổi, có những khuyết rất to. Mặt
dưới có rất nhiều lông che chở đơn bào (Hình 3).
(a) Vi phẫu gân lá
(b) Vùng phiến lá
ấ ạ ả ẫu lá cây Cam sũng
Biểu bì trên
Mô giậu
Mô mềm khuyết
Hình 3. Cấu tạo giải phẫu lá cây Cam sũng
Thân
Vi phẫu tiết diện tròn, hơi tròn ở 4 góc.
Vùng vỏ chiếm khoảng 1/3 diện tích vi phẫu,
vùng trung trụ chiếm 2/3.
Vùng vỏ
Biểu bì gồm 1 lớp tế bào hình chữ nhật, kích
thước không đều; lớp cutin mỏng. Trên biểu bì
của thân non có lông che chở đơn bào. Mô mềm
vỏ gồm 6 -7 lớp tế bào thuôn dài, xếp chừa
những đạo nhỏ, có nhiều tinh thể calci oxalat
hình cầu gai nằm rải rác.
Vùng trung trụ
Trụ bì hóa mô cứng thành từng cụm úp lên
đầu bó libe gỗ, gồm các tế bào hình đa giác, vách
dày hóa mô cứng. Bó libe gỗ bao gồm: libe 1 là
những tế bào nhỏ, méo mó, bị ép dẹp, nằm ngay
dưới trụ bì hóa mô cứng; libe 2 và gỗ 2 xếp
xuyên tâm với nhau và tạo thành một vòng
quanh vi phẫu; gỗ cấp 2 với những mạch gỗ
không đều, hình đa giác, mô mềm gỗ gồm
những tế bào hình đa giác vách dày, xếp xuyên
tâm; ở mỗi bó libe gỗ có 2-3 bó gỗ cấp 1, xếp
song song với nhau, mỗi bó gồm 3 - 4 mạch gỗ
không đều, phân hóa ly tâm, được bao quanh
bởi những tế bào mô mềm hình đa giác, vách
cellulose, xếp khít nhau. Mô mềm tủy là những
tế bào hình đa giác, vách cellulose, kích thước
không đều, càng vào giữa tế bào càng to, xếp
chừa là các đạo nhỏ, có rất nhiều tinh thể calci
oxalat hình cầu gai nằm rải rác (Hình 4).
Đặc điểm bột lá Cam sũng
Bột lá Cam sũng có màu xanh đậm, mùi nhẹ,
sờ nhám tay. Trong bột có nhiều cấu tử ở lá,
thân: mảnh biểu bì mang lỗ khí, mạch gỗ, sợi có
vách dày, lông che chở đơn bào khá nhiều, rất
nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai (Hình 5).
Kết quả định danh ADN mã vạch
Kết quả giải trình tự đoạn gen ITS1-5,8S
rARN-ITS2-28S (618bp) của mẫu cây Cam sũng
và so sánh với dữ liệu của Sauropus spatulifolius
Beille trên GenBank (Mã số: EU623588.1)(10) cho
thấy mức độ tương đồng là 99,03%, trong đó chỉ
có 5 nucleotid không tương đồng vùng ITS1 và
ITS2. Mức độ tương đồng này cao nhất trong các
loài trong chi Sauropus có dữ liệu gen trên
GenBank (Hình 6).