Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu
B - Khoa học Dược 39
KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SỐNG SÓT TRONG DỊCH TIÊU HÓA
CỦA MỘT SỐ CHỦNG PROBIOTIC PHÂN LẬP
TỪ CÁC CHẾ PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG
Dương Thị Trúc Ly
*
, Phạm Như Ngọc
*
, Trần Mộng Tố Tâm
*
, Lê Văn Thanh
**
, Vũ Thanh Thảo
***
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Hiện nay các chế phẩm probiotic thường được sử dụng trong hỗ trợ điều trị các rối loạn tiêu
hóa do mất cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột. Để có tác động, các vi khuẩn probiotic cần phải có khả năng sống sót
qua các dịch tiêu hóa.
Mục tiêu: Khảo sát khả năng chịu acid dạ dày, muối mật, pepsin và enzym tụy của các chủng probiotic phân
lập từ chế phẩm đang lưu hành trên thị trường.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 13 chủng vi khuẩn Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus,
Streptococcus và Enterococcus được phân lập từ chế phẩm probiotic. Tiến hành khảo sát khả năng chịu acid dạ
dày, muối mật, pepsin và enzym tụy bằng môi trường dịch nhân tạo thích hợp. Sau mỗi thời điểm nhất định, cấy
trải và đếm số khuẩn lạc để xác định tỉ lệ sống sót của các chủng thử nghiệm.
Kết quả: Trong thử nghiệm khả năng chịu pH thấp kết hợp pepsin, 13 chủng vi khuẩn đều sống sót ở pH
3,5; 11 chủng tồn tại được ở pH 2,5 và 2 chủng L. kefir và B. bifidum sống sót được ở pH 1,5 của dịch dạ dày
nhân tạo. Trong thử nghiệm khả năng chịu muối mật, có 12/13 chủng có khả năng chịu được nồng độ 0,5% và có
5 chủng tồn tại được ở nồng độ muối mật 2%. Trong thử nghiệm khả năng chịu enzym tụy, chủng B.
polyfermenticus không sống sót được trong môi trường chứa enzym tụy 0,1% sau 4 giờ.
Kết luận: Có 05/13 chủng có khả năng chịu pH, muối mật và enzym tiêu hóa tốt đạt tiêu chí sàng lọc
probiotic của FAO/WHO, 06/13 chủng có khả năng khả năng chịu đựng trung bình, 02/13 chủng không chịu
được tác động của dịch tiêu hóa. Cần có khuyến cáo về thời gian sử dụng và phương pháp bảo vệ với các chủng
chưa đạt tiêu chí chịu tác động của dịch tiêu hóa.
Từ khóa: probiotic, Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Enterococcus, dịch tiêu hóa
ABSTRACT
STUDYING OF SURVIVAL RATE IN GASTROINTESTINAL FLUIDS
OF SOME PROBIOTIC STRAINS ISOLATED FROM COMMERCIAL PRODUCTS
Duong Thi Truc Ly, Pham Nhu Ngoc, Tran Mong To Tam, Le Van Thanh, Vu Thanh Thao
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 2 - 2020: 39 - 46
Background: Probiotic products were usually used as adjunctive therapy for gastrointestinal disorders
cause by imbalance of gut microbiota. To be effective, probiotic microorganisms must have ability to survive
in gastrointestinal fluids.
Objectives: Investigating tolerance of bacterial strains isolated from commercial probiotic products to
gastric acid, bile salt, pepsin and pancreas enzymes.
Materials and methods: 13 strains of Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Streptococcus and
Enterococcus were isolated from probiotic products. These strains were examined ability of gastric acid, bile
*
Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ
**
Bệnh viện Chợ Rẫy
***
Khoa Dược, Đại Học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Vũ Thanh Thảo ĐT: 0985353384 Email: vuthanhthao@ump.edu.vn
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
B - Khoa học Dược
40
salt, pepsin and pancreas enzyme tolerance in suitable simulated juices. After certain times, using spread
plate technique and colony counting to determine survival percentage of tested strains.
Results: In simulated gastric juice combined with pepsin test, all of 13 strains survived at pH 3.5; 11
strains at pH 2.5; just 2 strains (L. kefir and B. bifidum) could survive at pH 1.5. In experiment for ability
of bile salt tolerance, there were 12 strains could resist 0.5% bile salt and 5 strain resisted 2% bile salt.
There only B. polyfermenticus strain was not surviving in juice containing pancreas enzyme after 4 hours.
Conclusions: 05/13 strains had good ability of low pH, bile salt and digestive enzyme tolerance,
comply with FAO/WHO criteria on probiotic selection, 06/13 strains had medium tolerance ability, 02/13
strains could not tolerate to gastrointestinal juice. There should be recommendation of using time and
protecting method for strains that do not comply with digestive juice tolerance criteria.
Key words: probiotic, Lactobacillus, Bifidobacterium, Bacillus, Enterococcus, gastrointestinal juice
ĐẶT VẤN ĐỀ
Probiotic là những vi sinh vật sống khi đưa
vào cơ thể với lượng vừa phải sẽ cho tác dụng có
lợi đối với vật chủ
(1,2)
. Probiotic có nhiều lợi ích
cho sức khỏe như ức chế các vi khuẩn có hại,
phục hồi cân bằng vi khuẩn đường ruột sau khi
dùng kháng sinh đường uống, giảm nhẹ tình
trạng viêm ruột, tăng cường miễn dịch, giảm
cholesterol huyết tương, giảm nguy cơ ung thư
ruột, tăng khả năng tiêu hóa lactose, giảm nhẹ
tình trạng dị ứng
(1,3)
. Các chủng probiotic tiềm
năng được phân lập từ người, động vật, thực vật
hay thực phẩm phải được định danh chính xác
và đạt các tiêu chuẩn an toàn theo quy định. Bên
cạnh đó, để probiotic phát huy được tiềm năng
chúng phải có khả năng sống sót qua đoạn đầu
của đường tiêu hóa gồm dạ dày và ruột non và
có khả năng phát triển trong ruột già
(
2
)
. Theo
FAO/WHO (2002), một trong những yêu cầu bắt
buộc đối với một chế phẩm probiotic dùng
đường uống là phải sống sót khi đến ruột già,
nghĩa là phải chịu được acid dịch vị và dịch
mật
(
2
)
. Đây được xem là yêu cầu quan trọng nhất
trong việc lựa chọn chủng probiotic bởi nó quyết
định vai trò và tác dụng của probiotic đối với cơ
thể
(1,3,4)
. Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi
tiến hành các thử nghiệm khảo sát đặc điểm có
lợi bao gồm khả năng chịu đựng pH, muối mật
và enzym tiêu hóa của một số chủng probiotic
được phân lập từ các chế phẩm đang lưu hành
trên thị trường.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Lactobacillus (L. acidophillus, L. casei,
L. kefir), Bifidobacterium (B. bifidum, B. breve),
Bacillus (B. clausii, B. coagulans, B. licheniformis, B.
polyfermenticus, B. subtilis), Streptococcus
thermophilus và Enterococcus (E. faecalis, E. faecium)
được phân lập từ chế phẩm trên môi trường
thích hợp cho mỗi loại được trình bày trong Bảng
1. Nuôi cấy tạo dòng thuần và định danh bằng
các phản ứng sinh hóa đặc trưng.
Các chủng vi khuẩn gốc được bảo quản ở
-80
o
C trong môi trường lỏng chứa 20% glycerol.
Bảng 1. Môi trường nuôi cấy phân lập các vi sinh vật thử nghiệm từ chế phẩm
Vi sinh vật Môi trường phân lập Điều kiện nuôi cấy TLTK
L. acidophilus
L. casei
L. kefir
MRSA - salicin 1%
MRSA - vancomycin 1 mg/l
MRSA pH 4,58
Vi hiếu khí, 37
o
C, 48 giờ
(5)
B. bifidum
B. breve
MRSA - L-cystein.HCl 1 g/l
MRSA - LiCl 3 g/l + xanh bromocresol Kỵ khí, 37
o
C, 48 giờ
(6)
Bacillus TSA Hiếu khí, 37 C, 24 giờ
(7)
S. thermophilus
Enterococcus TSA Hiếu khí, 37
o
C, 24 giờ
(6)
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu
B - Khoa học Dược 41
Phương pháp nghiên cứu
Chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn
Chủng vi khuẩn gốc được cấy vào môi
trường thạch thích hợp, ủ tăng sinh trong 24 giờ
với Bacillus, Streptococcus, Enterococcus và 48 giờ
với Lactobacillus và Bifidobacterium, ly tâm 3000
vòng/phút trong 5 phút, rửa sinh khối 2 lần với
dung dịch NaCl 0,85%, tạo huyền dịch với dung
dịch NaCl 0,85%. So sánh độ đục với ống chuẩn
McFarland và điều chỉnh đến 0,5 để được huyền
dịch có mật độ 10
8
CFU/ml.
Phương pháp tiến hành
Hút 0,5 ml huyền dịch vi khuẩn mật độ 10
8
CFU/ml cho vào 4,5 ml mỗi dịch khảo sát (Bảng 2).
Lắc trộn đều, để yên ở nhiệt độ 25
o
C. Sau những
thời điểm khảo sát thích hợp (Bảng 2), pha loãng
theo bậc 10 đến mật độ phù hợp
(3,8,9)
. Tiến hành ủ
với điều kiện thích hợp (Bảng 3) và đếm số
khuẩn lạc. Làm song song mẫu trắng chứa các
thành phần như mẫu thử ngoại trừ các dịch mô
phỏng. Thử nghiệm khả năng chịu pH thấp
được tiến hành kết hợp với pepsin.
Bảng 2. Thành phần dịch khảo sát trong các thử nghiệm và thời điểm khảo sát
Thử nghiệm Thành phần Thời điểm
Khả năng chịu pH thấp kế
t
hợp pepsin
Dịch dạ dày nhân tạo gồm NaCl 2 g/l, pepsin 3,2 g/l trong nước cất 2 lần. Dịch được
điều chỉnh pH 1,5; 2,5; 3,5 bằng HCl 0,1 N, lọc qua màng 0,22 µm
(3,8,10)
1 và 2 giờ
Khả năng chịu muối mật Dịch mật nhân tạo gồm KH
2
PO
4
6,81 g/l, NaOH 0,896 g/l được bổ sung muối mật
nồng độ 0,5%; 1% và 2%, pH 6,8, lọc qua màng 0,22 µm
(3)
2 và 4 giờ
Khả năng chịu pancreatin
Dịch pancreatin chứa NaCl 0,5%, pancreatin 0,1%, điều chỉnh đến pH 8,0 bằ
ng dung
dịch NaOH 0,1 N, lọc qua màng 0,22 µm
(3,8)
2 và 4 giờ
Bảng 3. Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng
probiotic
Chi vi khuẩn Môi trường
Nhiệt độ ủ
Điều kiện ủ
TLTK
Enterococcus,
Streptococcus,
Bacillus
TSB 37
o
C Hiếu khí
(5,6)
Lactobacillus MRSB 37
o
C Vi hiếu khí
(11)
Bifidobacterium
MRSB 37
o
C Kỵ khí
(7)
Phương pháp đếm số khuẩn lạc
Sau mỗi thời điểm khảo sát đem ly tâm 3000
vòng/phút trong 5 phút thu lấy sinh khối.
Rửa sinh khối bằng dung dịch NaCl 0,85%.
Tạo huyền dịch với dung dịch NaCl 0,85%,
so độ đục với ống chuẩn McFarland và điều
chỉnh đến 0,5 để được huyền dịch có mật độ 10
8
CFU/mL.
Tiến hành pha loãng theo cơ số 10 đến mật
độ thích hợp.
Hút 100 µL dịch pha loãng cuối cấy trải vào
môi trường thạch, đem ủ ở điều kiện và nhiệt độ
thích hợp theo Bảng 3 trong 24 giờ đối với chi
Bacillus, Streptococcus và Enterococcus và ủ trong
48 giờ với chi Lactobacillus và Bifidobacterium.
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 để
đếm và tính mật độ khuẩn lạc.
Tỷ lệ sống sót (%S) tính theo công thức:
KẾT QUẢ
Khả năng chịu pH thấp kết hợp pepsin
Thử nghiệm khả năng chịu pH thấp kết
hợp với pepsin của các chủng probiotic được
thực hiện ở khoảng pH 1,5 (khi đói); pH 2,5
(pH trung gian) và pH 3,5 (pH dạ dày khoảng
3 giờ sau khi ăn)(12). Theo kết quả được trình
bày trong Bảng 4.
Kết quả cho thấy ở pH 1,5 kết hợp với pepsin
chỉ có 5 chủng vi khuẩn probiotic có khả năng
sống sót trên 50% sau 1 giờ gồm L. casei, L. kefir,
B. breve và 2 chủng thuộc chi Bacillus là B.
coagulans và B. polyfermenticus. Tuy nhiên sau 2
giờ tiếp xúc với dịch vị nhân tạo, tỉ lệ sống
sót của các chủng này giảm chỉ còn duy nhất
chủng B. coagulans có tỉ lệ sống sót là 57%, 4
chủng còn lại tỉ lệ sống giảm xuống dưới 50%
trong khoảng 22-44%. Điều này cho thấy các
chủng vi khuẩn probiotic có khả năng chịu pH
1,5 thấp sau 2 giờ thử nghiệm.
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
B - Khoa học Dược
42
Đối với kết quả khảo sát ở pH 2,5 là pH
trung bình giữa trạng thái đói và trạng thái no,
có 9 chủng có khả năng chịu được pH 2,5 sau 1
giờ tiếp xúc, tuy nhiên sau 2 giờ tiếp xúc chỉ
còn 6 chủng có khả năng sống sót hơn 50%,
trong đó 2 chủng L. casei và B. polyfermenticus
là 2 chủng có khả năng sống sót cao nhất ở pH
2,5 sau 2 giờ.
Kết quả thử nghiệm ở pH 3,5, pH của dịch vị
sau khi ăn khoảng 160 phút
(
12
)
, cho thấy đa số
chủng vi khuẩn có khả năng chịu được pH này
với phần trăm sống sót của 10 trong số 13
chủng cao hơn 67% sau 2 giờ tiến hành thử
nghiệm. Trong đó các chủng L. casei, B.
breve, B. polyfermenticus, E. feacalis có tỉ lệ sống
sót cao nhất sau 2 giờ ở pH 3,5.
Bảng 4. Kết quả khảo sát khả năng chịu dịch vị nhân tạo có pepsin (n = 3)
Chủng Thời gian (giờ)
Mật độ (x 10
7
CFU/ml) sau thời gian tiếp xúc và tỷ lệ sống sót
Trắng
pH 3,5
%S
pH 2,5
%S
pH 1,5
%S
L. acidophilus 1
2
10
9,5
9,7
8,3
97
87
2
0,3
20
3
0,5
0
5
0
L. casei 1
2
9,8
9,1
9,7
8,9
99
98
8,3
8,7
85
96
8,9
2
91
22
L. kefir 1
2
9,5
10,2
7,1
4,8
75
47
6,0
3,3
63
32
5,2
4,3
55
42
B. bifidum 1
2
9,8
8,9
8,1
7,2
83
81
6,3
4,1
64
46
1,1
0,9
11
10
B. breve 1
2
8,5
8,1
8,1
7,2
95
89
5,8
2,1
72
25
8,7
1,9
102
23
B. clausii 1
2
5,8
4,4
1,5
1,1
26
25
5,1
1,6
88
36
0,2
0,1
3
2
B. coagulans 1
2
8,7
7,9
7,2
8,1
83
103
7,6
5,8
87
73
5,4
4,5
62
57
B. licheniformis 1
2
9,3
9,3
3,5
3,8
38
41
3,4
3,8
37
41
0,3
0
3
0
B. polyfermenticus 1
2
7,6
7,2
7,9
8,1
104
113
7,8
6,9
103
96
5,0
3,2
66
44
B. subtilis 1
2
3,0
3,6
2,3
3,1
77
86
2,8
2,4
93
67
0
0
0
0
S. thermophilus 1
2
10
10,2
8,3
6,8
83
67
7,4
5,2
74
51
0
0
0
0
E. faecalis 1
2
8,3
6,7
7,6
5,9
92
88
0
0
0
0
0
0
0
0
E. faecium 1
2
9,3
8,5
8,5
6,7
91
79
0
0
0
0
0
0
0
0
Khả năng chịu muối mật
Trong thử nghiệm với dịch mật nhân tạo, các
chủng vi khuẩn được thử nghiệm khả năng chịu
3 nồng độ muối mật khác nhau gồm 0,5%; 1% và
2 %. Kết quả được trình bày trong Bảng 5.
Đặc biệt chủng E. faecium không có khả năng
chịu muối mật ở bất kỳ nồng độ nào.
Khả năng chịu enzym tụy
Enzym tụy gồm amylase, protease và
lipase sẽ giúp tiêu hóa thức ăn, tuy nhiên các
enzym tụy này cũng tác động đến khả năng
sống sót của probiotic. Kết quả khảo sát khả
năng chịu enzym tụy được trình bày trong
Bảng 6.
Kết quả khảo sát cho thấy các chủng vi
khuẩn có khả năng chịu tác động của enzym
tụy, trong đó 8 chủng trên 13 chủng có khả
năng sống sót lớn hơn 50% sau 4 giờ tiếp xúc
với enzym tụy. Các chủng L. casei, B. bifidum,
B. breve và B. subtilis có tỉ lệ sống sót cao sau 2
giờ tiếp xúc với enzym, nhưng sau đó tỉ lệ
sống giảm nhanh sau 4 giờ tiếp xúc nằm
trong khoảng từ 24% đến 44%. Riêng với
chủng B. polyfermenticus không có khả năng
chịu tác động của enzym tụy.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu
B - Khoa học Dược 43
Bảng 5. Kết quả khảo sát khả năng chịu muối mật (n = 3)
Chủng Thời gian
(giờ)
Mật độ (x10
7
CFU/ml) sau thời gian tiếp xúc và tỷ lệ sống sót
Trắng 0,5% %S 1% %S 2% %S
L. acidophilus 2
4
9,5
9,8
9,5
8,7
100
89
8,5
9,1
89
93
8,5
6,2
89
63
L. casei 2
4
10
9,5
6,7
2,8
67
29
8,1
2
81
21
2,8
0
28
0
L. kefir 2
4
10,2
8,9
6,8
5,6
67
63
0
0
0
0
0
0
0
0
B. bifidum 2
4
10
9,5
8,3
7,9
83
83
3,4
1,8
34
19
0,7
0
7
0
B. breve 2
4
8,7
8,3
8,3
7,6
95
92
4,0
1,9
46
23
0,6
0,4
7
5
B. clausii 2
4
4,4
5,8
3,2
3,0
73
52
2,3
2,5
52
43
2,5
3
57
52
B. coagulans 2
4
3,5
4,8
1,5
1,8
43
38
1,7
1,8
49
38
3,5
4,8
100
100
B. licheniformis 2
4
9,3
10,2
8,7
0
94
0
5,0
0
54
0
2,0
0
22
0
B. polyfermenticus 2
4
7,6
7,2
6,0
2,7
79
38
6,0
0
79
0
5,0
0
66
0
B. subtilis 2
4
3,6
5,2
3,0
1,4
83
27
0
0
0
0
0
0
0
0
S. thermophilus 2
4
10,2
9,5
9,5
8,1
93
85
9,5
8,9
93
94
8,9
5,9
87
62
E. faecalis 2
4
6,8
6,8
6,0
7,5
88
110
9,1
5,4
134
79
8,5
6,2
125
91
E. faecium 2
4
8,5
8,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Bảng 6. Kết quả khảo sát khả năng chịu enzym tụy
Chủng Thời gian
(giờ)
Mật độ (x 10
7
CFU/ml) %S Chủng Thời gian
(giờ)
Mật độ
(x 10
7
CFU/ml) %S
Trắng
Pancreatin Trắng Pancreatin
L. acidophilus 2
4
9,5
9,8
8,5
9,5
89
97 B. coagulans 2
4
3,5
4,8
4,0
3,9
114
81
L. casei 2
4
10
9,5
8,5
4,2
85
44 B. licheniformis 2
4
9,3
10,2
10,2
7,6
110
75
L. kefir 2
4
10,2
8,9
7,9
5,1
77
57 B. polyfermenticus 2
4
7,6
7,2
0
0
0
0
B. bifidum 2
4
8,5
8,3
7,8
2,3
92
28 B. subtilis 2
4
3,6
5,2
3,1
2,1
86
40
B. breve 2
4
8,9
8,7
6,6
2,1
74
24 S. thermophilus 2
4
10,2
9,5
8,9
8,9
87
94
B. clausii 2
4
4,4
5,7
6,4
5,0
145
88 E. faecalis 2
4
5,6
5,8
6,7
6,7
120
116
E. faecium 2
4
8,5
8,5
8,9
7,9
105
93
Kết hợp khả năng chịu dịch vị nhân tạo và
dịch mật nhân tạo của các chủng vi khuẩn
probiotic ở pH 3,5 trong 2 giờ và nồng độ muối
mật 0,5 % trong 4 giờ (điều kiện mà các chủng
probiotic có khả năng sống sót cao nhất trong
nghiên cứu này), khả năng sống sót của các
chủng vi khuẩn dự đoán khi đi qua dịch tiêu hóa
được trình bày trong Bảng 7.