KiÓm nghiÖm thuèc b»ng ph−¬ng ph¸p sinh häc
Môc tiªu häc tËp
1. ViÕt ®−îc nh÷ng ®Æc ®iÓm c¬ b¶n vÒ h×nh th¸i, tÝnh chÊt nu«i cÊy cña
vi khuÈn, nÊm mèc, nÊm men ®Ó ¸p dông trong thö nghiÖm vi sinh vËt.
2. BiÕt ph−¬ng ph¸p lµm mét m«i tr−êng nu«i cÊy vi sinh vËt vµ nªu
®−îc c¸c ph−¬ng ph¸p tiÖt trïng.
3. Tr×nh bµy ®−îc môc ®Ých, nguyªn t¾c, ph−¬ng ph¸p thö v« trïng vµ
®Õm sè l−îng vi sinh vËt trong 1 gam (1 ml) d−îc phÈm.
− Nªu ®−îc vai trß cña ph−¬ng ph¸p sinh häc trong kiÓm nghiÖm chÊt
kh¸ng sinh, vµ tr×nh bµy ®−îc thö nghiÖm ®Þnh l−îng chÊt kh¸ng
sinh b»ng ph−¬ng ph¸p khuÕch t¸n.
4.1. Më ®Çu
Trong ngµnh D−îc cã nhiÒu ph−¬ng ph¸p kh¸c nhau ®Ó kiÓm tra chÊt
l−îng cña thuèc nh− ph−¬ng ph¸p ho¸ häc, ph−¬ng ph¸p vËt lý, ph−¬ng ph¸p
sinh häc.
Ph−¬ng ph¸p ho¸, lý tiÕn hµnh nhanh chÝnh x¸c nh−ng chØ ¸p dông ®−îc
víi c¸c chÊt cã thµnh phÇn ho¸ häc ®· biÕt vµ kh«ng ®¸nh gi¸ ®−îc b¶n chÊt
sinh häc cña mét d−îc phÈm. §Ó x¸c ®Þnh c¸c ®Æc tÝnh sinh häc theo yªu cÇu
cña mét sè d−îc phÈm nh−: ho¹t lùc t¸c dông cña chÊt kh¸ng sinh, sù v« trïng,
®é nhiÔm khuÈn, ®éc tÝnh bÊt th−êng cña mét sè lo¹i thuèc, hay hiÖu lùc vµ tÝnh
an toµn cña c¸c vaccin ... ng−êi ta ph¶i dïng ph−¬ng ph¸p sinh häc.
4.1.1. Nguyªn t¾c
Ph−¬ng ph¸p sinh häc dùa trªn nguyªn t¾c:
So s¸nh hiÖu lùc t¸c dông hoÆc c¸c ®Æc tÝnh riªng cña chÊt thö víi chÊt
chuÈn t−¬ng øng trong cïng mét ®iÒu kiÖn vµ thêi gian thÝ nghiÖm.
Trong lÜnh vùc kiÓm nghiÖm thuèc, hai lo¹i thö nghiÖm sinh häc ®−îc ¸p
dông nhiÒu nhÊt lµ:
− KiÓm nghiÖm thuèc b»ng c¸c ph−¬ng ph¸p thö trªn ®éng vËt.
− KiÓm nghiÖm thuèc b»ng c¸c thö nghiÖm vi sinh vËt.
115
4.1.2. ChÊt chuÈn
Trong thö nghiÖm sinh häc chÊt chuÈn lµ mét yÕu tè quan träng ®Ó ®¸nh
gi¸ chÊt l−îng chÊt thö. ChÊt chuÈn ®−îc chia lµm hai lo¹i:
− ChÊt chuÈn gèc: lµ nh÷ng chÊt ®ång nhÊt cã ®é tinh khiÕt cao. ChÊt
chuÈn gèc th−êng ®−îc lµm ë c¸c viÖn nghiªn cøu quèc gia hoÆc quèc tÕ
riªng vÒ chÊt chuÈn sinh häc.
− ChÊt chuÈn thø cÊp: còng lµ chÊt cã ®é tinh khiÕt cao, cã ho¹t tÝnh sinh
häc ®−îc x¸c ®Þnh theo chÊt chuÈn gèc quèc tÕ t−¬ng øng.
ChÊt chuÈn ph¶i ®−îc b¶o qu¶n trong c¸c èng thuû tinh ë nhiÖt ®é thÝch hîp
tuú theo mÉu (th−êng ë nhiÖt ®é < 5oC) trong ®iÒu kiÖn kh«, tr¸nh ¸nh s¸ng.
4.1.3. §¸nh gi¸ kÕt qu¶
Thö nghiÖm sinh häc th−êng cã thêi gian thÝ nghiÖm kÐo dµi vµ phô
thuéc vµo nhiÒu yÕu tè nh− tÝnh chÊt ®¸p øng cña sinh vËt thÝ nghiÖm, ng−êi
lµm thÝ nghiÖm, c¸c ®iÒu kiÖn thö nghiÖm. C¸c yÕu tè nµy th−êng kh«ng æn
®Þnh. V× vËy kÕt qu¶ thö nghiÖm sinh häc ph¶i ®−îc ®¸nh gi¸ b»ng to¸n thèng
kª. §é chÝnh x¸c cña phÐp thö ®−îc thÓ hiÖn b»ng giíi h¹n tin cËy.
4.2. KiÓm nghiÖm thuèc b»ng ph−¬ng ph¸p thö trªn ®éng vËt
4.2.1. Nguyªn t¾c
KiÓm nghiÖm thuèc b»ng c¸c phÐp thö trªn ®éng vËt dùa trªn sù ®¸p øng
cña ®éng vËt thÝ nghiÖm ®èi víi c¸c chÕ phÈm ®−îc ®−a vµo c¬ thÓ mét liÒu
l−îng theo quy ®Þnh cña tõng thÝ nghiÖm ®Ó ®¸nh gi¸ chÊt l−îng cña chÕ phÈm
cÇn thö.
4.2.2. §éng vËt thÝ nghiÖm
§éng vËt dïng trong thÝ nghiÖm ph¶i ®ång ®Òu, thuÇn khiÕt vÒ nßi gièng,
khoÎ m¹nh kh«ng nhiÔm bÖnh, kh«ng cã thai vµ ®−îc nu«i d−ìng ®Çy ®ñ. Mçi
thÝ nghiÖm cã nhu cÇu kh¸c nhau vÒ gièng, träng l−îng, tuæi cña ®éng vËt.
ChÊt l−îng cña ®éng vËt quyÕt ®Þnh ®é chÝnh x¸c cña phÐp thö.
4.2.3. Thö in vivo vµ in vitro
− Thö nghiÖm ®−îc thùc hiÖn trªn c¬ thÓ ®éng vËt sèng gäi lµ thö in vivo.
Ng−êi ta dùa trªn c¸c th«ng sè nh− nhiÖt ®é c¬ thÓ, nhÞp tim, ®iÖn t©m
®å, ®iÖn n·o ®å, sù thay ®æi huyÕt ¸p, phn x¹ hÖ thÇn kinh hoÆc tû lÖ
sèng, chÕt cña ®éng vËt thÝ nghiÖm… ®Ó ®¸nh gi¸ t¸c dông vµ chÊt
l−îng cña thuèc.
− PhÐp thö cã thÓ ®−îc tiÕn hµnh trªn c¸c c¬ quan c« lËp cña ®éng vËt,
nh− tim, tö cung, ruét, m¸u… gäi lµ thö in vitro.
116
4.2.4. LiÒu (Dose)
LiÒu lµ l−îng chÕ phÈm thö ®−a vµo c¬ thÓ ®éng vËt mét lÇn cho tõng
môc ®Ých thÝ nghiÖm. VÝ dô: LiÒu LD0, LD50, LD100, MLD, liÒu thö chÊt h¹ ¸p,
liÒu thö chÊt g©y sèt.
4.2.5. C¸c thö nghiÖm trªn ®éng vËt ®−îc ¸p dông trong kiÓm nghiÖm thuèc
Trong c¸c d−îc ®iÓn th−êng cã c¸c thö nghiÖm sau ®©y ®−îc thùc hiÖn
b»ng c¸c phÐp thö trªn ®éng vËt nh−:
− Thö ®éc tÝnh bÊt th−êng
− Thö chÊt h¹ huyÕt ¸p
− Thö chÊt g©y sèt
− §Þnh l−îng c¸c hormon: gonadorelin, corticotrophin, insulin, oxytocin,
menotrophin, ...
− KiÓm tra tÝnh an toµn cña vaccin vµ sinh phÈm.
− X¸c ®Þnh hiÖu lùc cña c¸c vaccin vµ antitoxin.
4.3. KiÓm nghiÖm thuèc b»ng c¸c phÐp thö vi sinh vËt
4.3.1. §¹i c−¬ng vÒ vi sinh vËt
Vi sinh vËt lµ nh÷ng c¬ thÓ sèng cã kÝch th−íc rÊt nhá mµ m¾t th−êng
kh«ng thÓ nh×n thÊy ®−îc. NÕu cÇn quan s¸t h×nh d¹ng cña chóng ph¶i dïng
kÝnh hiÓn vi. Trong tù nhiªn, vi sinh vËt tån t¹i rÊt phong phó vµ ®a d¹ng,
chóng ®ãng vai trß tÝch cùc vµo vßng tuÇn hoµn vËt chÊt. NhiÒu lo¹i vi sinh
vËt ®−îc øng dông trong c¸c lÜnh vùc y tÕ, c«ng nghiÖp, n«ng nghiÖp nh− c¸c vi
sinh vËt cã kh¶ n¨ng lªn men r−îu, sinh tæng hîp kh¸ng sinh, vitamin, acid
amin, vi sinh vËt cè ®Þnh ®¹m ë thùc vËt…
Trong qu¸ tr×nh ho¹t ®éng sèng, bªn c¹nh nh÷ng ®Æc tÝnh cã Ých, vi sinh
vËt còng g©y nhiÒu t¸c h¹i cho ng−êi, ®éng vËt, thùc vËt nh−: lµm biÕn ®æi
chÊt l−îng thuèc, háng thùc phÈm, mét sè cã kh¶ n¨ng g©y bÖnh hoÆc sinh ®éc
tè cã h¹i.
§Ó phôc vô cho viÖc kiÓm nghiÖm thuèc b»ng c¸c thö nghiÖm vi sinh
vËt, ta cÇn t×m hiÓu mét sè ®Æc ®iÓm chÝnh cña hai nhãm vi sinh vËt lµ vi
khuÈn vµ vi nÊm.
4.3.1.1. Vi khuÈn (Bacteria)
• §Æc ®iÓm:
Vi khuÈn lµ nh÷ng vi sinh vËt ®¬n bµo cã cÊu t¹o tÕ bµo tiÒn nh©n
(Procaryote), cã kÝch th−íc rÊt nhá. §−êng kÝnh tÕ bµo phÇn lín thay ®æi trong
kho¶ng 0,2 → 2,0µm, chiÒu dµi tõ 2 - 8µm. Vi khuÈn cã nhiÒu h×nh d¹ng kh¸c
nhau, nh− h×nh cÇu, h×nh que, xo¾n, dÊu ph¶y. Vi khuÈn chØ sinh s¶n v« tÝnh,
117
mét sè t¹o bµo tö. Mçi tÕ bµo vi khuÈn chØ cã mét bµo tö. Mét sè vi khuÈn cã
kh¶ n¨ng di ®éng nhê sù cã mÆt cña mét hoÆc nhiÒu l«ng (flagella).
•
•
Ph©n lo¹i:
ViÖc ph©n lo¹i vi khuÈn rÊt phøc t¹p, ph¶i dùa vµo nhiÒu ®Æc ®iÓm, h×nh
th¸i, sinh lý, sinh ho¸ ®Ó chia vi khuÈn thµnh c¸c hä, chi, loµi kh¸c nhau. Víi
môc ®Ých phôc vô cho c«ng t¸c kiÓm nghiÖm thuèc, ta kh«ng ®i s©u vµo nghiªn
cøu ph©n lo¹i, nh−ng cÇn t×m hiÓu vi khuÈn, theo c¸c nhãm dùa trªn h×nh thÓ,
tÝnh chÊt b¾t mµu thuèc nhuém Gram vµ kh¶ n¨ng h« hÊp cña chóng.
− Theo h×nh thÓ:
+ CÇu khuÈn (Coccus): Vi khuÈn h×nh cÇu cã thÓ ®øng riªng rÏ
(Micrococcus), thµnh tõng ®¸m (Staphylococcus), hoÆc chuçi
(Streptococcus), hay xÕp thµnh tõng ®«i (Diplococcus).
+ Trùc khuÈn (Bacillus): Vi khuÈn h×nh que ng¾n ®øng riªng lÎ hay thµnh
chuçi (Bacillus anthracis) hoÆc h×nh que hai ®Çu trßn (Escherichia coli).
+ Xo¾n khuÈn (Spirillum): Vi khuÈn h×nh lß xo nh−: Treponema Pallidum.
+ PhÈy khuÈn (Vibrio): Vi khuÈn h×nh dÊu phÈy nh− Vibrio cholerae.
− Theo tÝnh chÊt b¾t mµu thuèc nhuém Gram.
+ Vi khuÈn cã mµu tÝm sau khi nhuém Gram: Vi khuÈn Gram +
+ Vi khuÈn cã mµu ®á sau khi nhuém Gram: Vi khuÈn Gram –
− Theo ®Æc tÝnh cña qu¸ tr×nh h« hÊp:
+ Sö dông oxy tù do trong qu¸ tr×nh h« hÊp: Vi khuÈn hiÕu khÝ.
+ Ph¸t triÓn ®−îc c¶ trong ®iÒu kiÖn hiÕu khÝ vµ kþ khÝ, cã qu¸ tr×nh h«
hÊp nitrat: vi khuÈn kþ khÝ kh«ng b¾t buéc.
+ ChØ sèng trong ®iÒu kiÖn kþ khÝ, cã qu¸ tr×nh h« hÊp sulfat: Vi khuÈn
kþ khÝ b¾t buéc.
Sinh s¶n cña vi khuÈn:
1
2
3
4
thêi gian
log N
H×nh 4.1: §−êng cong sinh tr−ëng cña vi khuÈn
118
− Vi khuÈn sinh s¶n b»ng c¸ch ph©n ®«i tÕ bµo. Sù ph©n chia tÕ bµo x¶y
ra rÊt nhanh. Trong ®iÒu kiÖn m«i tr−êng thÝch hîp vµ kh«ng cã c¸c
yÕu tè k×m h·m th× mét tÕ bµo vi khuÈn sau 6 giê cã thÓ sinh ra
250.000 tÕ bµo míi. Tuy nhiªn, sù nh©n lªn cña vi khuÈn kh«ng ph¶i lµ
v« tËn, nã cßn phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè. Trong m«i tr−êng nu«i cÊy,
sù sinh s¶n cña vi khuÈn sau mét thêi gian nhÊt ®Þnh sÏ bÞ ngõng l¹i v×
nhiÒu nguyªn nh©n nh−: thøc ¨n bÞ hÕt dÇn, hoÆc vi khuÈn cã thÓ tiÕt
ra nh÷ng chÊt k×m h·m sù ph¸t triÓn cña chóng.
− Tèc ®é ph¸t triÓn cña vi khuÈn trong m«i tr−êng nu«i cÊy tÜnh thay ®æi
theo thêi gian vµ tu©n theo mét quy luËt nhÊt ®Þnh bao gåm 4 pha: Pha
lag, pha logarit, pha æn ®Þnh vµ pha tö vong (H×nh 4.1).
− Sù ph¸t triÓn cña vi khuÈn trong m«i tr−êng láng cã thÓ quan s¸t sau
kho¶ng 18 - 24 giê nu«i cÊy. Chóng cã thÓ lµm ®ôc m«i tr−êng, t¹o v¸ng
trªn bÒ mÆt hoÆc l¾ng cÆn ë ®¸y èng nghiÖm.
− Trªn c¸c m«i tr−êng ®Æc, khuÈn l¹c cña c¸c vi khuÈn th−êng nhá h¬n
khuÈn l¹c cña vi nÊm, bÒ mÆt nh½n, bãng, −ít hoÆc nh¨n nheo, ... KhuÈn
l¹c cña vi khuÈn t¹o s¾c tè víi c¸c mµu nh−: tr¾ng (Staphylococcus
albus), vµng (Staphylococcus aureus), hång (Micrococcus), xanh
(Pseudomonas aeruginosa), ... Mçi vi khuÈn cã ®Æc tÝnh riªng vÒ h×nh
d¹ng, kÝch th−íc, mµu s¾c khuÈn l¹c. C¸c ®Æc tÝnh nµy gióp cho viÖc x¸c
®Þnh vi khuÈn trong qu¸ tr×nh kiÓm nghiÖm d−îc phÈm.
4.3.1.2. Vi nÊm (Microfungi)
•
•
§Æc ®iÓm:
Vi nÊm cã cÊu t¹o tÕ bµo nh©n thËt (Eucaryote). TÕ bµo vi nÊm rÊt nhá.
Muèn quan s¸t cÇn dïng kÝnh hiÓn vi. NÊm kh«ng cã chÊt diÖp lôc, sèng ho¹i
sinh hoÆc ký sinh, sinh s¶n v« tÝnh hoÆc h÷u tÝnh.
Vi nÊm bao gåm hai lo¹i lµ nÊm men vµ nÊm mèc. Trong kiÓm nghiÖm vi
sinh vËt, cÇn ph¸t hiÖn hai lo¹i nµy cã trong d−îc phÈm.
NÊm men (Yeast):
− NÊm men cã cÊu t¹o ®¬n bµo, sinh s¶n chñ yÕu b»ng nÈy chåi. TÕ bµo
nÊm men cã kÝch th−íc, h×nh d¹ng kh¸c nhau tuú loµi. Chóng cã thÓ
h×nh cÇu, bÇu dôc, h×nh qu¶ chanh, h×nh èng…
− KhuÈn l¹c nÊm men bao gåm nhiÒu c¸ thÓ th−êng thuéc mét loµi ph¸t
triÓn tõ mét c¸ thÓ mÑ t¹o thµnh mét khèi. KhuÈn l¹c nÊm men th−êng
to h¬n khuÈn l¹c vi khuÈn, bÒ mÆt cã nÕp nh¨n hoÆc tr¬n nh½n, kh«ng
t¹o sîi.
− NÊm men ®−îc sö dông nhiÒu trong c«ng nghiÖp thùc phÈm nh− lµm
b¸nh mú, bia, r−îu… Nh−ng nhiÒu nÊm men g©y bÖnh hoÆc lµm háng
thùc phÈm, thuèc.
119