Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang

Chia sẻ: Trần Thị Quyên | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

Thêm vào BST

Báo xấu

227
lượt xem 43
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang dùng để nghiên cứu các loại mẫu vật, ứng dụng quan trọng trong phương pháp huỳnh quang miễn dịch.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Kỹ thuật hiển vi huỳnh quang

Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang Khi các m u v t, s ng hay không s ng, h u cơ ho c vô cơ, h p th r i tái phát x ánh sáng, quá trình ư c g i là hi n tư ng phát sáng quang hóa. N u s phát x ánh sáng v n kéo dài t i vài giây sau khi năng lư ng (ánh sáng) kích thích thôi tác d ng, thì hi n tư ng ư c g i là lân quang. Còn hi n tư ng huỳnh quang mô t s phát x ánh sáng ch ti p t c di n ra khi ang h p th ánh sáng kích thích. Kho ng th i gian gi a lúc h p th ánh sáng kích thích và lúc tái phát x ánh sáng trong hi n tư ng huỳnh quang là c c kì ng n, thư ng dư i m t ph n tri u giây. Hình 1. Quan sát c a Stoke Hi n tư ng huỳnh quang ư c bi t n vào gi a th k 19. Nhà khoa h c ngư i Anh George G. Stoke l n u tiên quan sát th y khoáng v t fluorite bi u hi n huỳnh quang khi ư c r i b ng ánh sáng t ngo i, và ông ã t ra t “huỳnh quang”. Stoke nh n th y ánh sáng huỳnh quang có bư c sóng dài hơn ánh sáng kích thích, m t hi n tư ng tr nên n i ti ng dư i cái tên s l ch Stoke. Trong hình 1, m t photon b c x t ngo i (màu tím) va ch m v i m t electron trong m t nguyên t , kích thích và ưa electron lên m c năng lư ng cao hơn. Sau ó, electron kích thích rơi xu ng m c th p hơn và phát ra ánh sáng dư i d ng m t photon năng lư ng th p hơn (màu ) trong vùng ánh sáng kh ki n. Hình 2 là bi u bi u di n vùng ánh sáng kh ki n c a b c x i n t , v i bư c sóng tr i r ng t x p x 400 n 700 nanomét. Bao quanh vùng kh ki n là ánh sáng t ngo i có năng lư ng cao hơn và ánh sáng h ng ngo i có năng lư ng th p hơn. Hình 2. Ph ánh sáng “tr ng” Hi n vi huỳnh quang là m t phương pháp tiên ti n nghiên c u v t ch t có th làm cho phát huỳnh quang, ho c dư i d ng t nhiên (g i là s t phát huỳnh quang, ho c huỳnh quang sơ c p), ho c sau khi x lí v i các hóa ch t có kh năng huỳnh quang (g i là huỳnh quang th c p). Hi n vi huỳnh quang là sáng ch vào u th k 19 c a August Kor, Carl Reichert, và Heinrich Lehmann, và nhi u ngư i khác. Tuy nhiên, ti m năng c a thi t b này không ư c nh n ra trong nhi u th p k , và kính hi n vi huỳnh quang hi n nay là m t công c quan tr ng (có l là không th thi u) trong ngành sinh h c t bào. Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang | Trang 1/5
Nh ng nghiên c u ban u cho th y nhi u m u v t, g m các vi khoáng v t, tinh th , nh a thông, thu c thô, bơ, ch t di p l c, vitamin, và các h p ch t vô cơ, bi u hi n huỳnh quang t phát khi ư c chi u sáng b ng ánh sáng t ngo i. Tuy nhiên, mãi cho n nh ng năm 1930 thì nhà nghiên c u ngư i Áo Max Haitinger và các nhà khoa h c khác m i phát tri n ư c kĩ thu t huỳnh quang th c p, s d ng ph m màu fluorochrome nhu m các thành ph n mô c bi t, vi khu n, và nh ng m m b nh khác không th phát huỳnh quang t phát. Các ph m màu fluorochrome này, g n v i các m c tiêu hóa sinh c bi t, ã khích l vi c s d ng kính hi n vi huỳnh quang. Giá tr c a thi t b này ư c nâng cao áng k vào nh ng năm 1950 khi Albert Coons và Nathan Kaplan ch ng minh ư c s nh v c a kháng nguyên trong mô ph n ng v i kháng th g n fluorescein. Công vi c chính c a hi n vi huỳnh quang là cho phép ánh sáng kích thích chi u sáng m u v t, và r i tách ánh sáng huỳnh quang phát x y u hơn nhi u ra kh i ánh sáng kích thích m nh hơn. Như v y, ch có ánh sáng phát ra t m u v t i t i m t ho c m t máy dò khác nào ó (thư ng là m t camera kĩ thu t s ho c camera phim thông thư ng). Nh ng vùng huỳnh quang thu ư c chi u sáng r c r trên n n t iv i tương ph n phát hi n ư c. Phông n n phía sau ch t không huỳnh quang càng t i thì thi t b càng có hi u qu . Hình 3 bi u di n m t hình dung có tính hình h c v s ki n x y ra khi m t m u v t huỳnh quang ư c quan sát b ng m t kính hi n vi huỳnh quang. Ánh sáng t ngo i có bư c sóng ho c t p h p bư c sóng nh t nh ư c t o ra b ng cách cho ánh sáng phát ra t ngu n phát t ngo i i qua b l c kích thích. Ánh sáng t ngo i ư c l c s chi u sáng m u v t, trong trư ng h p này là tinh th fluorite, ch t s phát ra ánh sáng huỳnh quang khi ư c r i sáng b ng ánh sáng t ngo i. Ánh sáng kh ki n phát ra t m u v t, có màu trong hình 3, sau ó ư c l c qua m t t m l c ch n không cho ánh sáng t ngo i ph n x i qua. C n chú ý r ng ây là phương th c hi n vi duy nh t trong ó m u v t, sau khi b kích thích, t o ra ánh sáng riêng c a nó. Ánh sáng phát x t a ra theo m i hư ng (góc 360 ), không c n bi t n hư ng c a ánh sáng kích thích. Hình 3. Nguyên lí kích thích và phát x Hi n vi huỳnh quang là công c nghiên c u vô giá và ph bi n nhanh chóng. L i th c a nó d a trên nh ng thu c tính mà các công ngh hi n vi quang khác Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang | Trang 2/5
không d gì có ư c. Vi c s d ng fluorochrome khi n nó có th nh n d ng ư c các t bào và các thành ph n t bào h hi n vi và nh ng th c th khác có m c c trưng cao n m gi a v t ch t không huỳnh quang. Hơn n a, hi n vi huỳnh quang có th phát hi n s có m t c a ch t huỳnh quang v i nh y tinh vi. M t s lư ng r t nh phân t huỳnh quang (c 500 phân t trên micro mét kh i) có th ư c phát hi n. Trong m t m u v t cho trư c, qua vi c s d ng ph m nhu m b i, các u dò khác nhau s phát hi n s có m t c a t ng phân t m c tiêu m t. M c dù kính hi n vi huỳnh quang không cho phân gi i không gian dư i gi i h n nhi u x c a m u v t tương ng, nhưng s có m t c a các phân t huỳnh quang dư i gi i h n ó v n có th nhìn th y rõ r t. Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang có th áp d ng cho ch t h u cơ, ch t s ng (sinh v t) thu xưa, ho c cho các ch t s ng (v i vi c s d ng huỳnh quang trong ng nghi m ho c trong cơ th s ng) ho c cho ch t vô cơ ( c bi t trong vi c nghiên c u các ch t gây ô nhi m trong bánh x p bán d n). Cũng có m t s nghiên c u ang tăng tri n s d ng u dò huỳnh quang ghi l i s thay i nhanh chóng s t p trung ion sinh lí, như calcium và magnesium, và pH trong t bào s ng. Nhi u mô th c v t và ng v t, cũng như các m u v t ch t, v n ã huỳnh quang khi b r i sáng b ng ánh sáng bư c sóng ng n (huỳnh quang t phát hay sơ c p). S huỳnh quang t phát cũng tìm th y ng d ng trong nghiên c u th c v t, hóa th ch than á, th ch h c á tr m tích, và trong công nghi p bán d n. Trong nghiên c u mô ng v t ho c m m b nh, huỳnh quang t phát ít có tác d ng. Có ích l i nhi u hơn là các m u v t fluorochrome ngo i lai (còn g i là fluorophore) ư c kích thích b ng cách r i sáng, và lư ng ánh sáng phát ra có cư ng m nh hơn. S huỳnh quanh như v y g i là huỳnh quang th c p. Fluorochrome là ph m màu, t g n chúng v i v t ch t h u cơ nhìn th y ho c dư i ngư ng nhìn th y. Các ch t fluorochrome này, có kh năng h p th và r i tái phát x ánh sáng, thư ng có l i l n trong t s h p th - phát x (m t khái ni m ư c g i là l i lư ng t ). i u này khi n cho fluorochrome c c kì có giá tr trong các ng d ng sinh v t h c. Vi c tăng cư ng s d ng hi n vi huỳnh quang liên quan ch t ch v i s phát tri n hàng trăm ch t fluorochrome có ư ng cong cư ng kích thích (h p th ) và phát x ã bi t và các m c tiêu c u trúc sinh h c ã ư c hi u rõ. Minh h a trong hình 4 là hai lo i ch t fluorochrome ư c s d ng ph bi n nh t trong hi n vi huỳnh quang. Acid nucleic nhu m 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), phân t phía bên trái trong hình 4, là m t d n xu t indole có hai n a nucleophilic amidino cao, thư ng dùng ánh d u huỳnh quang cho acid nucleic, và ư c s d ng r ng rãi trong phép phân tích huỳnh quang nh m nh n d ng nhanh m m b nh. Ban u ư c t ng h p dư i d ng ch t ch ng trypanosomal ti m năng, DAPI thư ng thích g n nó v i các vùng c p bazơ adenosine và thymidine (A-T) trong DNA và ư c kích thích b ng ánh sáng t ngo i v i h p th c c i bư c sóng 355nm. Ph m nhu m này phát huỳnh quang trong vùng xanh lam c a ph ánh sáng kh ki n. Phân t DAPI phía bên ph i (hình 4) là m t lo i fluorochrome khác, Texas Red, có tính ch t huỳnh quang k t h p ã ư c nghiên c u kĩ lư ng. Lo i fluorochrome này ư c phát tri n cho vi c ánh d u kép trong m t ng d ng g i là dòng cytometry, nhưng ư c dùng r ng rãi nơi có rhodamine (m t lo i ch t fluorochrome khác) dò tìm kháng th trong hi n vi huỳnh quang. Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang | Trang 3/5
Trong nhi u trư ng h p, Texas Red ư c dùng chung v i DAPI và fluorescein isothiocyanate (FITC) nhu m các m u v t có th quan sát ư c do s phát huỳnh quang , lam và l c c a thu c nhu m. Khi quy t nh ch n lo i nhãn s d ng cho hi n vi huỳnh quang, c n ph i ghi nh r ng fluorochrome ư c ch n ph i r t có th h p th và kích thích ánh sáng và v n ph i g n v i phân t m c tiêu. Fluorochrome cũng ph i có kh năng cho lư ng ánh sáng huỳnh quang phát x th a áng. Hình 4. Các ch t fluorofore ph bi n M t trong nh ng ng d ng quan tr ng nh t c a hi n vi huỳnh quang là trong lĩnh v c huỳnh quang mi n d ch. M t sinh v t s ng t o ra vô s kháng th ư c s d ng cùng v i các t bào b ch c u làm trung hòa các cá th ngo i lai xâm nh p vào như virus, vi khu n, và các protein ngo i lai, ch a ho c sinh ra kháng nguyên. Ph n ng kháng nguyên - kháng th r t c trưng, thư ng có th hình dung như m i quan h gi a chìa khóa và khóa. Huỳnh quang mi n d ch có s thành công trong vi c k t h p hài hòa gi a nh y c a kính hi n vi quang h c và m c c trưng cao bi u hi n b i mi n d ch h c. Trong kĩ thu t huỳnh quang mi n d ch tr c ti p, m t kháng th nào ó ư c ánh d u b ng cách g n hóa ch t fluorochrome t o ra m t cái g i là m t ti p h p, sau ó ph t lên b n kính c a kính hi n vi nghi ng có m t m t kháng nguyên nào ó, g i là kích thích vi c s n sinh kháng th . N u kháng nguyên có m t, thì ti p h p kháng th ư c ánh d u s k t h p v i kháng nguyên và v n g n ch t trong m u v t sau khi r a s ch. S có m t c a ti p h p huỳnh quang ư c g n b ng hóa ch t và kháng nguyên ư c ch ng minh khi fluorochrome b kích thích t i c c i kích thích c a nó, và sau ó cư ng phát x các bư c sóng khác nhau có th quan sát ư c b ng m t ho c ghi l i b ng m t h máy dò (camera kĩ thu t s ho c camera truy n th ng). M t kĩ thu t cũng ư c s d ng ph bi n n a g i là huỳnh quang mi n d ch gián ti p, trong ó huy t thanh có kh năng ch a kháng th chưa ánh d u và kháng nguyên liên quan c a nó, nhưng chưa rõ, chung v i nhau. Cho fluorochrome ti p h p v i kháng th ch ng l i cơ th ngư i (n u s d ng m u v t c a con ngư i) r i t lên b n kính ch a kháng th - kháng nguyên chưa ư c ánh d u. N u th c là như v y thì s có ph n ng kháng nguyên – kh ng th , kháng th ch ng l i cơ th ngư i ư c ánh d u b ng fluorochrome t g n nó v i ph c h p hình thành b i kháng nguyên và kháng th . Sau ó, s t o nhóm c a kháng nguyên, kháng th ánh d u, và kháng th ch ng l i cơ th ngư i ư c ánh d u fluorochrome ư c kích thích bư c sóng c c i sao cho fluorochrome và b t c s phát x nào cũng u quan sát ư c. Kĩ thu t huỳnh quang mi n d ch gián ti p làm gi m nhu c u ph i Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang | Trang 4/5
gi trong kho d tr m t s lư ng l n kháng th ánh d u, và cũng thư ng thu ư c cư ng huỳnh quang m nh hơn. M t lĩnh v c nghiên c u huỳnh quang quan tr ng n a có liên quan t i vi c nhu m mô hóa h c và hóa h c t bào. Fluorochrome ư c dùng nh n d ng nhi m s c th , DNA, protein, c u trúc t bào, hóocmôn và vitamin. Hi n vi huỳnh quang là công c m nh m trong nh ng nghiên c u ó do nh y tinh vi c a ch t fluorochrome ư c ch n và nét c trưng c a chúng i v i nh ng i lư ng c c kì ng n trong m u v t. Th t v y, m c dù kính hi n vi huỳnh quang b gi i h n phân gi i trong không gian c a nó theo các quy lu t thông thư ng chi ph i b i gi i h n nhi u x và kh u , nhưng các u dò huỳnh quang có th , thông qua ánh sáng phát x , phát hi n s có m t c a ch t huỳnh quang b ng cách làm cho nh ng ch t ó tr nên nhìn th y ư c th m chí c khi chúng ch có m t dư i phân gi i c a kính (ch ng h n ch vài ba phân t ). M t nhóm ng d ng ang ư c tri n khai c a kĩ thu t hi n vi huỳnh quang là vi c s d ng các u dò huỳnh quang (fluorochrome) i v i v t ch t s ng, c trong ng nghi m và trong cơ th s ng. Khó khăn nhân lên i v i các u dò này là do chúng có th có tính c. Ngoài ra cũng ph i chú ý nhi u n các kho ng th i gian trôi qua do b n ch t thay i không ng ng c a các quá trình s ng và s di chuy n c u trúc n i bào. Nghiên c u huỳnh quang ư c ng d ng làm thay i s t p trung ion, liên k t và không liên k t, i v i các ion sinh h c quan tr ng như hydrogen (pH), calcium và magnesium. N i ti ng nh t là các nghiên c u v calcium n i bào s d ng u dò huỳnh quang ph bi n Fura-2. i v i ph m nhu m này, s kích thích kép bư c sóng kho ng 340 và 380 nanomét (b ng công t c ánh sáng và b l c kích thích kép) có th ghi l i m t bư c sóng phát x , bư c sóng này ư c o c l p i v i m i d i kích thích. M t máy tính ch i u khi n kính hi n vi ư c dùng tính toán t l gi i h n calcium n i bào t do qua s thay i cư ng phát x huỳnh quang. L i th c a phương pháp t l n m ch là v cơ b n t t c các y u t ư c gi không i, tr khi các bư c sóng kích thích kép t ngo i g n, m i bư c sóng t o ra s phát x trong ph n l c c a ph ánh sáng kh ki n. M t lo i ch p nh t s tương t ư c th c hi n v i u dò có tên là Indo-1. i v i ch t fluorochrome này, cũng dùng xác nh calcium liên k t ho c không liên k t n i bào, ngư i ta s d ng m t bư c sóng kích thích, nhưng s phát x o ư c có hai bư c sóng phân bi t calcium liên k t và calcium không liên k t. Tác gi : Mortimer Abramowitz, Michael W. Davidson (davidson@magnet.fsu.edu) hiepkhachquay d ch Kĩ thu t hi n vi huỳnh quang | Trang 5/5