Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột (Scylla)

Chia sẻ: Tần Mộc Phong | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:245

Thêm vào BST

Báo xấu

50
lượt xem 11
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án được thực hiện với mục tiêu nhằm nghiên cứu xác định được thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cua lột; xây dựng và tối ưu hóa quy trình công nghệ thủy phân cua lột bằng enzym, sấy phun để tạo sản phẩm bột cua lột thủy phân có tác dụng tăng cường sức khỏe; đánh giá hoạt tính của sản phẩm thủy phân cua lột và chế phẩm bảo vệ sức khỏe từ bột cua lột thủy phân;... Mời các bạn cùng tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Hóa học: Nghiên cứu thành phần hóa học và xây dựng quy trình chế biến sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột (Scylla)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------- NGUYỄN THỊ PHƢƠNG LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ BIẾN SẢN PHẨM CÓ TÁC DỤNG TĂNG CƢỜNG SỨC KHỎE TỪ CUA LỘT (SCYLLA) LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Hà Nội- 2021
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ---------- NGUYỄN THỊ PHƢƠNG LAN NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ BIẾN SẢN PHẨM CÓ TÁC DỤNG TĂNG CƢỜNG SỨC KHỎE TỪ CUA LỘT (SCYLLA) LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC Chuyên ngành: Kỹ thuật Hóa học Mã số: 9.52.03.01 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến 2. TS. Lê Tất Thành Hà Nội- 2021
i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam Ďoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS. TS. Nguyễn Quyết Chiến và TS. Lê Tất Thành. Các số liệu và kết quả thu Ďược trong luận án là hoàn toàn trung thực và chưa Ďược công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Nguyễn Thị Phương Lan
ii LỜI CẢM ƠN Với sự kính trọng, lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới PGS.TS. Nguyễn Quyết Chiến và TS. Lê Tất Thành là những người thầy Ďã hướng dẫn tận tình và tạo mọi Ďiều kiện giúp Ďỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án. Tôi xin Ďược cảm ơn sự giúp Ďỡ và tạo Ďiều kiện thuận lợi của Học Viện Khoa học và Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam trong suốt thời gian tôi thực hiện luận án. Tôi cũng xin Ďược cảm ơn sự quan tâm, giúp Ďỡ của GS.TS. Phạm Quốc Long, Ban Lãnh Ďạo Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Cục An toàn thực phẩm - Bộ Y tế, những người Ďã cùng tôi chia sẻ công việc cũng như Ďộng viên tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển sản phẩm thiên nhiên - Viện Hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Kiểm nghiệm An toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia Ďã giúp Ďỡ tôi nhiệt tình trong suốt thời gian thực hiện luận án. Đặc biệt, tôi xin Ďược bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới toàn thể những người thân trong gia Ďình tôi, bạn bè Ďã Ďộng viên Ďể tôi có thể hoàn thiện Ďược luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2021 Tác giả luận án Nguyễn Thị Phương Lan
iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................ iii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ viii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ xi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................... xiii MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN .....................................................................................2 1.1. Tổng quan về cua Scylla spp. ............................................................................2 1.1.1. Giới thiệu chung về cua..............................................................................2 1.1.2. Giới thiệu về chi cua bùn Scylla ................................................................2 1.1.3. Giới thiệu chung về cua lột và nghề nuôi cua lột .....................................6 1.1.4. Tình hình sử dụng, chế biến cua lột ..........................................................9 1.2. Các nghiên cứu hóa học về cua .........................................................................9 1.2.1. Nghiên cứu về thành phần hóa học các loài cua biển trên thế giới ........9 1.2.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài cua bùn Scylla ..........14 1.2.3. Nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học của các loài cua.............16 1.2.3.1. Hoạt tính chống oxy hóa ...................................................................17 1.2.3.2. Hoạt tính kháng vi sinh vật ...............................................................17 1.2.3.3. Các hoạt tính khác.............................................................................18 1.2.3.4. Hoạt tính của lipid và phospholipid ..................................................19 1.3. Công nghệ thuỷ phân protein trong chế biến thực phẩm ............................20 1.3.1. Giới thiệu chung .......................................................................................20 1.3.2 Tính chất hóa lý của protein thủy phân ...................................................21 1.3.3. Hoạt tính sinh học của protein thủy phân...............................................21 1.3.4. Ứng dụng của protein thủy phân .............................................................22 1.3.5. Các phương pháp thủy phân protein .......................................................22 1.4. Giới thiệu về quy hoạch thực nghiệm và tối ƣu hóa quy trình công nghệ hóa học ......................................................................................................................26
iv 1.4.1. Giới thiệu về quy hoạch thực nghiệm (Phương pháp bề mặt đáp ứng – RSM)....................................................................................................................26 1.4.2. Phần mềm quy hoạch thực nghiệm Design Expert 12.0 ........................28 1.5. Định hƣớng nghiên cứu ...................................................................................29 CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................32 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu.......................................................................................32 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................................33 2.2.1. Các phương pháp xác định thành phần hóa học ....................................33 2.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ..............................................34 2.2.3. Phương pháp thủy phân bằng công nghệ enzym ....................................35 2.2.4. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa quy trình công nghệ .....................................................................................................................36 CHƢƠNG 3. THỰC NGHIỆM .............................................................................37 3.1. Sơ chế và xử lý mẫu cua lột .............................................................................37 3.2. Sơ đồ nghiên cứu mẫu cua lột .........................................................................38 3.3. Phân tích các thành phần hóa học cơ bản .....................................................38 3.3.1. Xác định hàm lượng ẩm ...........................................................................38 3.3.2. Xác định hàm lượng tro ...........................................................................39 3.3.3. Xác định hàm lượng protein ....................................................................39 3.3.4. Xác định hàm lượng lipid t ng ................................................................40 3.3.5. Xác định các vitamin ................................................................................40 3.3.5.1. Vitamin A, D, E .................................................................................40 3.3.5.2. Xác định vitamin K ............................................................................41 3.3.5.3. Xác định vitamin B2, B3 .....................................................................42 3.3.6. Xác định khoáng chất ...............................................................................42 3.3.6.1. Xác định Ca, Mg, Na, K, P, Fe, Zn ...................................................42 3.3.6.2. Phương pháp xác định Cu, Mn .........................................................43 3.3.7. Xác định cholesterol, ecdysone ................................................................44 3.4. Phân tích thành phần và hàm lƣợng axit amin .............................................45 3.5. Xác định thành phần và hàm lƣợng các axit béo ..........................................46 3.6. Xác định thành phần và hàm lƣợng các lớp chất lipid trong lipid tổng .....47 3.7. Phân tích các dạng phân tử của lipid phân cực ............................................47
v 3.7.1. Xác định các nhóm chất trong từng phân lớp lipid phân cực ................48 3.7.2. Xác định các dạng phân tử của phân lớp phospholipid .........................49 3.8. Thử nghiệm hoạt tính sinh học .......................................................................57 3.8.1. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào ung thư ........................................57 3.8.2. Thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bằng phương pháp đo malondialdehyde (MDA) ....................................................................................58 3.8.3. Thử nghiệm hoạt tính kháng viêm ..........................................................58 3.8.4. Thử nghiệm hoạt tính chống loãng xương của sản phẩm thủy phân cua lột và sản phẩm thực phẩm chức năng từ bột cua lột thuỷ phân .....................60 3.9. Nghiên cứu và tối ƣu hóa quá trình thủy phân cua lột bằng enzym ...........62 3.9.1. Thiết bị và nguyên liệu .............................................................................63 3.9.2. Quy trình chung cho phản ứng thủy phân .............................................63 3.9.3. Xác định độ thủy phân (phương pháp OPA) và hàm lượng peptid .......64 3.9.4. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ................................................................66 3.9.5. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân ...........................................67 3.10. Nghiên cứu và tối ƣu hóa quá trình sấy phun .............................................67 3.10.1. Thiết bị và nguyên liệu ...........................................................................67 3.10.2. Quy trình chung ......................................................................................68 3.10.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sấy phun ......................68 3.10.4. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sấy phun ...........................................68 3.11. Sản xuất bột cua lột thủy phân ở qui mô pilot ............................................69 3.12. Sơ đồ định hƣớng nghiên cứu quy trình công nghệ tạo sản phẩm có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe quy mô phòng thí nghiệm .........................................69 CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................71 4.1 Thành phần hóa học của cua lột Scylla paramamosain .................................71 4.1.1. Các thành phần hóa học cơ bản ..............................................................71 4.1.1.1. Hàm lượng ẩm và tro của cua lột .....................................................71 4.1.1.2. Hàm lượng protein ............................................................................72 4.1.1.3. Hàm lượng lipid ................................................................................72 4.1.1.4. Hàm lượng vitamin ............................................................................73 4.1.1.5. Hàm lượng khoáng chất ....................................................................74 4.1.2. Thành phần và hàm lượng các axit amin ...............................................76
vi 4.1.3. Thành phần và hàm lượng các lớp chất lipid của cua lột ......................77 4.1.4. Thành phần và hàm lượng các axit béo ..................................................80 4.1.5. Xác định các dạng phân tử của lớp chất phospholipid ...........................83 4.1.6. Hàm lượng cholesterol và ecdysone trong quá trình lột xác của cua lột .............................................................................................................................96 4.2. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của các lớp chất lipid của cua lột ......98 4.2.1. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng viêm...................................................99 4.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hóa............................................101 4.2.3. Kết quả đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư ..............................101 4.3. Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình thủy phân cua lột bằng enzym ............103 4.3.1. Nghiên cứu lựa chọn enzym cho quá trình thủy phân .........................103 4.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của các đơn yếu tố đến hàm mục tiêu của quá trình ...................................................................................................................105 4.3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH ...............................................105 4.3.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ.......................................105 4.3.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nước bổ sung vào nguyên liệu ......................................................................................................................106 4.3.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzym/cơ chất (E/S) ............107 4.3.2.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân ....................108 4.3.3. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình thủy phân bằng phương pháp bề mặt đáp ứng ..............................................................................................................108 4.3.3.1. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm ......108 4.3.3.2. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình ..................................................111 4.3.3.3. Tối ưu hóa quy trình thủy phân ......................................................113 4.3.3.4. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa ......................................................114 4.4. Xây dựng và tối ƣu hóa quy trình sấy phun sản phẩm thủy phân cua lột115 4.4.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm của quá trình sấy phun ............................................................................................................115 4.4.1.1. Ảnh hưởng của tốc độ đầu phun đến chất lượng sản phẩm ............115 4.4.1.2. Thiết lập mô hình và xây dựng ma trận kế hoạch thực nghiệm ......116 4.4.1.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ khí sấy đầu vào đến chất lượng sản phẩm ......................................................................................................................117
vii 4.4.1.4. Ảnh hưởng của tốc độ bơm dịch đến chất lượng sản phẩm ............118 4.4.2. Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình sấy phun bằng phương pháp bề mặt đáp ứng ..............................................................................................................119 4.4.2.2. Kiểm tra sự có nghĩa của mô hình ..................................................119 4.4.2.3. Tối ưu hóa quy trình sấy phun ........................................................122 4.4.2.4. Kiểm tra lại mô hình tối ưu hóa ......................................................123 4.5. Sản xuất bột cua lột thủy phân ở quy mô pilot ...........................................123 4.5.1. Quy trình sản xuất ..................................................................................123 4.5.2. Thành phần hóa học của sản phẩm thủy phân cua lột ........................126 4.5.2.1. Thành phần và hàm lượng dinh dưỡng chính .................................126 4.5.2.2. Thành phần và hàm lượng khoáng chất ..........................................127 4.5.3. Hoạt tính chống loãng xương của sản phẩm thủy phân cua lột và sản phẩm thực phẩm chức năng Boness từ bột cua lột thuỷ phân .......................127 4.6. Bào chế sản phẩm có tác dụng tăng cƣờng sức khỏe từ bột cua lột thủy phân .................................................................................................................................130 4.6.1. Sản phẩm “Forté Kid” chống còi xương ở trẻ em ................................130 4.6.1.1. Các nguyên liệu chính sử dụng để bào chế sản phẩm Forté Kid....130 4.6.1.2. Quy trình bào chế bột dinh dưỡng Forté Kid .................................130 4.6.1.3. Đánh giá cảm quan kết quả của bột dinh dưỡng ............................132 4.6.1.4. Công thức sản phẩm Forté Kid .......................................................132 4.6.2. Sản phẩm “Boness” chống loãng xương ..............................................133 4.6.2.1. Các nguyên liệu chính sử dụng để bào chế sản phẩm Boness ........133 4.6.2.2. Xác định tá dược độn ......................................................................134 4.6.2.3. Quy trình bào chế sản phẩm chống loãng xương Boness ...............134 4.6.2.4. Công thức sản phẩm chống loãng xương Boness ...........................136 KẾT LUẬN ............................................................................................................137 KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................138 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN.....................................................139 CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ ...........................................140 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................141
viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Diễn giải AA Axit arachidonic ABTS Axit 2,2’- Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic ADN Axit deoxyribonucleic ALF Antilipopolysaccharide factor ALP Enzym alkaline phosphatase AMP Peptide kháng vi sinh vật AOAC Hiệp hội các nhà hóa học phân tích chính thống ARN Axit ribonucleic AU Anson unit CAT Enzym catalase CL Cardiolipin DH Độ thủy phân (Degree of hydrolysis) DHA Axit docosahexaenoic DMSO Dimethyl sulfoxide DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl EAA Axit amin thiết yếu (Essential amino acids) EI Ion hóa electron (electron ionization) EPA Axit eicosapentaenoic Phương pháp ion hóa phun mù Ďiện tử (ElectroSpray ESI Ionization) FAO Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp của Liên Hợp quốc FBS Huyết thanh phôi bò (fetal bovine serum) FFA Axit béo tự do (Free fatty acids) FMOC-Cl 9-fluorenylmethyl cloroformat GC Sắc ký khí (Gas chromatography) Sắc ký khí khối phổ (Gas chromatography–mass GC-MS spectrometry) GPx Enzym glutathione peroxidase GR Enzym glutathione reductase
ix HepG-2 Dòng tế bào ung thư gan HepG-2 (Human liver cancer cell line) HL-60 Dòng tế bào ung thư bạch cầu cấp HL-60 (Human promyelocytic leukemia cell line) Sắc kí lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid HPLC chromatography) Phố khối phân giải cao (High-resolution mass HRMS spectrometry) HT-29 Dòng tế bào ung thư Ďại tràng HT-29 (Human colorectal adenocarcinoma cell line) HUFA Axit béo không no, rất nhiều nối Ďôi (Highly unsaturated fatty acids) IC50 Nồng Ďộ ức chế 50% (Half maximal inhibitory Concentration) Quang phổ phát xạ plasma cảm ứng (Inductively ICP-OES coupled plasma - optical emission spectrometry) LAPU Leucine Amino Peptidase Units LC Sắc ký lỏng ( Liquid chromatography) LNCaP Dòng tế bào ung thư tiền liệt tuyến LNCaP (Human prostatic carcinoma cell line) LPC Lysophosphatidylcholine LPE Lysophosphatidylethanolamine LPS Lipopolysaccharides LU-1 Dòng tế bào ung thư phổi LU-1 (Human lung cancer cell line) MCF-7 Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 (Human breast cancer cell line) MS Khối phổ (Mass spectrometry) (3-(4,5-dimethyl-2- thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H- MTT tetrazolium bromide) MUFA Axit béo không no, một nối Ďôi (Monounsaturated fatty acids) NCI Viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ NEAA Axit amin không thiết yếu (Non-essential amino acids ) NL Lipid không phân cực (Non Polar Lipid) OD Mật Ďộ quang
x OPA ortho-phthalic aldehyde PC Phosphatidylcholine PDA Detector dãy diod quang PE Phosphatidylethanolamine PG Phosphatidylglycerol PI Phosphatidylinositol PL Phospholipid Pol Lipid phân cực (Polar lipid) PS Phosphatidylserine Axit béo không no Ďa nối Ďôi (Polyunsaturated fatty PUFA acids) ROS Loài oxi phản ứng (Reactive Oxygene Species) S. olivacea Scylla olivacea S. paramamosain Scylla paramamosain S. serrata Scylla serrata S. tranquebarica Scylla tranquebarica SAFA/SFA Axit béo no (Saturated fatty acids) SK-Mel 2 Dòng tế bào u ác tính SK-Mel 2 (Human Melanoma Cell Line) SOD Enzym superoxide dismutase SPH Sphingomyelin SRB Sulforhodamine B SW-480 Dòng tế bào ung thư trực tràng (Human colon adenocarcinoma) TCCS Tiêu chuẩn cơ sở TCVN Tiêu chuẩn quốc gia UI Đơn vị quốc tế (unit international) Quang phổ hấp thụ phân tử ngoại khả kiến (Ultraviolet- UV-VIS visible spectroscopy) VAST Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam WHO Tổ chức Y tế thế giới
xi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Đặc Ďiểm hình thái của 4 loài cua bùn Scylla [4] .......................................4 Bảng 1.2. Khu vực phân bố của các loài cua bùn Scylla [8] .......................................6 Bảng 1.3. Thành phần hóa học của một số loài cua biển ..........................................10 Bảng 1.4. Thành phần hóa học của một số loài cua bùn Scylla ................................14 Bảng 1.5. Các peptid kháng vi sinh vật (AMP) Ďược xác Ďịnh trong các loài cua thuộc chi Scylla [40]..................................................................................................18 Bảng 3.1. Khoảng thời gian lưu của các nhóm chất .................................................48 Bảng 3.2. Đường chuẩn xác Ďịnh nhóm amino bậc 1 với L-glutathion ....................64 Bảng 4.1. Hàm lượng ẩm và tro của cua lột ..............................................................72 Bảng 4.2. Hàm lượng các vitamin trong cua lột .......................................................73 Bảng 4.3. Hàm lượng khoáng chất trong các mẫu cua lột (trên khối lượng khô) .....75 Bảng 4.4. Hàm lượng các axit amin trong cua lột ....................................................76 Bảng 4.5. Hàm lượng các lớp chất lipid trong lipid tổng của cua lột (%) ................79 Bảng 4.6. Thành phần và hàm lượng axit béo trong lipid của các mẫu cua lột (%) .80 Bảng 4.7. Các dạng phân tử phosphatidylethanolamine Ďược xác Ďịnh ...................84 Bảng 4.8. Các dạng phân tử phosphatidylcholine Ďược xác Ďịnh .............................87 Bảng 4.9. Các dạng phân tử phosphatidylserine Ďược xác Ďịnh ...............................89 Bảng 4.10. Các dạng phân tử phosphatidylinositol Ďược xác Ďịnh ...........................91 Bảng 4.11. Các dạng phân tử lysophosphatidylethanolamine Ďược xác Ďịnh ..........93 Bảng 4.12. Các dạng phân tử lysophosphatidylcholine Ďược xác Ďịnh ....................94 Bảng 4.13. Hàm lượng cholesterol và ecdysone trong quá trình lột xác cua bùn.....96 Bảng 4.14. Khả năng ức chế sự sản sinh NO của các mẫu nghiên cứu ..................100 Bảng 4.15. Hoạt tính ức chế peroxy hóa lipid ........................................................101 Bảng 4.16. Khả năng ức chế 5 dòng tế bào ung thư của lipid từ cua lột ................102 Bảng 4.17. Hàm lượng khoáng của mai và vỏ mềm cua trước và sau khi thủy phân .................................................................................................................................104 Bảng 4.18. Giá trị ở các mức của các yếu tố ảnh hưởng.........................................109 Bảng 4.19. Ma trận kế hoạch hóa và kết quả thực nghiệm .....................................110 Bảng 4.20. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y ..................................111 Bảng 4.21. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ .................................................114
xii Bảng 4.22. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại Ďiều kiện tối ưu..........114 Bảng 4.23. Ảnh hưởng của tốc Ďộ Ďĩa phun Ďến hàm mục tiêu Y1 và Y2 .............115 Bảng 4.24. Các mức thí nghiệm của các biến công nghệ .......................................116 Bảng 4.25. Ma trận kế hoạch hóa thực nghiệm của quá trình sấy phun .................117 Bảng 4.26. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ khí sấy cấp vào Ďến hàm mục tiêu Y1 và Y2117 Bảng 4.27. Ảnh hưởng của tốc Ďộ bơm dịch Ďến hàm mục tiêu Y1 và Y2 ............118 Bảng 4.28. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y1, Y2 .........................119 Bảng 4.29. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ .................................................122 Bảng 4.30. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại Ďiều kiện tối ưu..........123 Bảng 4.31. Thành phần và hàm lượng axit amin trong bột cua lột thủy phân ........126 Bảng 4.32. Thành phần và hàm lượng khoáng chất trong bột cua lột thủy phân ...127 Bảng 4.33. Ảnh hưởng của mẫu Ďến sự phát triển của tế bào .................................128 Bảng 4.34. Tác Ďộng của mẫu nghiên cứu Ďến hoạt Ďộng của ALP .......................128 Bảng 4.35. Tác Ďộng của mẫu nghiên cứu Ďến sự tổng hợp collagen .....................129 Bảng 4.36. Tác Ďộng của mẫu nghiên cứu Ďến sự tạo khoáng ................................129 Bảng 4.37. Kết quả Ďánh giá cảm quan tỉ lệ bột dinh dưỡng ..................................132 Bảng 4.38. Chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của sản phẩm Forté Kid...........................133 Bảng 4.39. Thành phần hoạt chất chính và tá dược Ďộn .........................................134 Bảng 4.40. Chỉ tiêu chất lượng chủ yếu của sản phẩm Boness ..............................136
xiii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cua Scylla serata.........................................................................................4 Hình 1.2. Cua Scylla tranquebarica ............................................................................4 Hình 1.3. Cua Scylla paramamosain ..........................................................................5 Hình 1.4. Cua Scylla olivacea .....................................................................................5 Hình 2.1. Cua lột Scylla paramamosain ...................................................................32 Hình 3.1. Các bước sơ chế cua lột ............................................................................37 Hình 3.2. Sơ Ďồ nghiên cứu chung ............................................................................38 Hình 3.3. Khoảng thời gian lưu của các nhóm chất khi sử dụng cột Diol ................48 Hình 3.4. Đường chuẩn L-glutathion ........................................................................65 Hình 3.5. Sơ Ďồ Ďịnh hướng nghiên cứu tạo sản phẩm có tác dụng tăng cường sức khỏe từ cua lột ...........................................................................................................70 Hình 4.1. Bản mỏng và sắc kí Ďồ các lớp chất lipid của cua lột ...............................78 Hình 4.2. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PE 38:5 [C43H76NO7P] ...................84 Hình 4.3. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PE 38:6 [C43H74NO8P]. ..................85 Hình 4.4. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PC 34:1 [C42H82NO8P]. ...............88 Hình 4.5. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PS 38:5 [C44H76NO10P] ..................90 Hình 4.6. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của PI 38:5 [C47H81O13P] ......................92 Hình 4.7. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của LPE/20:5 [C25H42NO7P]. ................93 Hình 4.8. HPLC-HRMS và sự phân mảnh của LPC 20:5 [C28H48NO7P] .............95 Hình 4.9. Biểu Ďồ thể hiện mối tương quan giữa cholesterol và ecdysone...............97 Hình 4.10. Kết quả khảo sát chu kỳ lột xác của cua .................................................97 Hình 4.11. Ảnh hưởng của các enzym protease Ďến quá trình thủy phân cua lột ...104 Hình 4.12. Ảnh hưởng của pH Ďến Ďộ thủy phân ...................................................105 Hình 4.13. Ảnh hưởng của nhiệt Ďộ thủy phân Ďến Ďộ thủy phân ..........................106 Hình 4.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ nước/nguyên liệu Ďến Ďộ thủy phân ....................106 Hình 4.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym bromelain/nguyên liệu Ďến Ďộ thủy phân 107 Hình 4.16. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzym chitinase/nguyên liệu Ďến Ďộ thủy phân ..107 Hình 4.17. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân Ďến Ďộ thủy phân .........................108 Hình 4.18. Biểu Ďồ thực nghiệm và dự Ďoán phân bố ngẫu nhiên của hàm mục tiêu Y .................................................................................................................................112
xiv Hình 4.19. Bề mặt Ďáp ứng của hàm mục tiêu Y .......................................................113 Hình 4.20. Kết quả tối ưu các biến công nghệ của quá trình thủy phân cua lột ..........114 Hình 4.21. Biểu Ďồ thực nghiệm và dự Ďoán, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2 ........120 Hình 4.22. Bề mặt Ďáp ứng của protein tổng (a) và Ďộ ẩm (b) của sản phẩm sau sấy phun .........................................................................................................................121 Hình 4.23. Kết quả tối ưu các biến công nghệ của quá trình sấy phun ...................122 Hình 4.24. Quy trình sản xuất bột cua lột thủy phân bằng enzym ..........................125 Hình 4.25. Quy trình bào chế bột dinh dưỡng Forté Kid ........................................131 Hình 4.26. Thực phẩm bảo vệ sức khỏe Forté Kid .................................................133 Hình 4.27. Quy trình bào chế viên chống loãng xương Boness .............................135 Hình 4.28. Sản phẩm chống loãng xương Boness từ cua lột ..................................136
1 MỞ ĐẦU Ở nước ta, cua bùn (Scylla spp.) là một Ďối tượng nuôi thủy sản nước mặn-lợ truyền thống, có giá trị kinh tế-xã hội quan trọng trong cộng Ďồng ngư dân ven biển và là nguồn thực phẩm ưa thích của số Ďông người Việt. Nghề nuôi cua bùn thương phẩm phát triển kéo theo sự phát triển của nghề nuôi cua lột Ďã làm tăng lên giá trị kinh tế của Ďối tượng này và làm Ďa dạng hơn nghề nuôi thủy sản. Nuôi cua lột cũng là một nghề truyền thống mà sản phẩm là những con cua vỏ mềm (Ďược gọi là cua lột), sau khi Ďã lột bỏ lớp vỏ cứng thay bằng lớp màng chitin mềm mại bao bọc cơ thể. Cho Ďến nay, sản phẩm cua lột chỉ Ďược sử dụng như một thực phẩm “ăn liền”, nghĩa là chỉ dừng ở việc sơ chế, Ďóng gói, bảo quản cấp Ďông rồi tiêu thụ nội Ďịa hoặc xuất khẩu Ďể làm nguyên liệu cho các nhà hàng chế biến ra hàng loạt các món ăn. Các nghiên cứu về thành phần hóa học, hoạt tính sinh học của cua lột cũng như công nghệ chế biến làm tăng giá trị, bào chế các sản phẩm có chất lượng cao còn rất hạn chế. Trong những năm gần Ďây, người tiêu dùng Việt Nam ngày càng quan tâm nhiều hơn Ďến các thực phẩm chức năng an toàn, có lợi cho sức khỏe. Những minh chứng xác thực về vai trò quan trọng của thực phẩm chức năng trong việc giảm thiểu bệnh và cải thiện sức khỏe Ďã và Ďang là Ďộng lực cộng hưởng thúc Ďẩy công nghệ chế biến trong lĩnh vực này phát triển mạnh mẽ. Trong Ďó, công nghệ enzym Ďược xếp hạng là một trong những công nghệ “xanh-sạch”, giữ vị trí tiên quyết tạo ra các hợp chất có thành phần giàu dinh dưỡng, hoạt tính sinh học cao, bao gồm các protein và peptid, các axit béo không no bão hòa (PUFAs), các probiotic và prebiotic, các chất xơ, các chất khoáng, Ďược sử dụng có Ďịnh hướng trong sản xuất các sản phẩm bảo vệ sức khỏe chất lượng cao. Những năm qua, nhiều sản phẩm của công nghệ enzym Ďã Ďược sản xuất ở quy mô công nghiệp và Ďược thương mại hóa nhờ vào những ưu Ďiểm nổi trội của xúc tác enzym như tốc Ďộ phản ứng nhanh, có tính chuyên hóa cao, Ďiều kiện phản ứng Ďơn giản, không cần loại bỏ hóa chất dư thừa sau phản ứng ra khỏi sản phẩm cuối cùng và dễ dàng mở rộng quy mô sản xuất. Động vật thủy sản nói chung, các loài cua biển nói riêng là những thực phẩm có mùi vị, giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế cao, cần Ďược nghiên cứu sâu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Với hàm lượng protein cao, chúng có thể Ďược sử dụng như một nguồn nguyên liệu lý tưởng Ďể thu nhận các sản phẩm có hoạt tính sinh học Ďa dạng bằng công nghệ enzym nhằm phục vụ phát triển sản xuất các loại thực phẩm chức năng có giá trị gia tăng.
2 CHƢƠNG I. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cua Scylla spp. 1.1.1. Giới thiệu chung về cua Động vật dạng cua (Cua) hay còn gọi là Phân thứ bộ Cua (danh pháp khoa học: Brachyura) là nhóm các loài Ďộng vật giáp xác, thân rộng hơn bề dài, mười chân có khớp, hai chân trước tiến hóa trở thành hai càng, vỏ xương bọc ngoài thịt, phần bụng nằm bẹp dưới hoàn toàn Ďược che bởi phần ngực, Ďầu cua và thân Ďược nối liền nhau vào một khối có lớp mai bọc bên ngoài. Hiện nay, theo thống kê của Walters và Johnson trên thế giới Ďã phát hiện khoảng gần 6.800 loài [1]. Tên gọi phổ biến của chúng bằng tiếng Việt khá Ďa dạng như cua, cáy, còng, Ďam, rạm, dã tràng, ghẹ, cà ra,... Các tên gọi này chỉ Ďơn thuần dựa theo hình thái hoặc môi trường sống của chúng. Cua có nhiều tại tất cả các vùng biển, Ďại dương. Nhiều loài cua lại sống trong sông, suối, Ďồng ruộng, chẳng hạn như các loài trong họ Cua núi (Potamidae), hay họ Cua Ďồng (Parathelphusidae) và một số loài sống trên cạn (họ Gecarcinidae). Cua bùn (mud crabs), hay cua vùng ngập mặn (mangrove crabs), là tên thường gọi của một số loài cua sống trong bùn vùng ngập mặn, bao gồm các loài thuộc chi Scylla và một số loài cua thuộc họ Panopeidae và Xanthidae. 1.1.2. Giới thiệu về chi cua bùn Scylla Chi cua bùn Scylla là một chi (giống) cua biển thuộc họ Cua bơi (Portunidae), Liên họ Portunidae, Phân thứ bộ Brachyura, Phân bộ Pleocyemata, Bộ Decapoda, Lớp Malacostraca, Phân ngành Crustacea, Ngành Arthropoda, và Giới Animalia [2]. Trước Ďây, nhiều tác giả cho rằng giống cua Scylla chỉ có một loài S. serrata (Forskal, 1775) nhưng từ năm 1949, Estampador Ďã dựa trên tập tính Ďào bới bùn Ďất, màu sắc, các Ďặc trưng hình thái và cấu trúc nhiễm sắc thể Ďể công nhận 3 loài và 1 thứ trong chi Scylla có ở Philippines bao gồm: S. oceanica, S. tranquebarica, S. serrata và S. serrata var. paramamosain [3]. Năm 1952, Serene dựa vào mẫu thu Ďược ở miền Nam Việt Nam Ďã tách giống cua Scylla thành 4 loài: S. oceanica, S. tranquebarica, S. serrata và S. crassimana. Năm 1972, Starobogatov Y.I. cho rằng loài cua bùn ở Vịnh Bắc bộ là loài S. oceanica. Gần Ďây hơn, các nghiên cứu xác Ďịnh hình thái và allozym (dị enzym) Ďã chỉ ra sự hình
3 thành loài trong phạm vi chi này. Điều này Ďã Ďược xác nhận trong sửa Ďổi phân loại chi Scylla thành 4 loài: S. serrata, S. tranquebarica, S. olivacea và S. paramamosain dựa trên Ďiện di allozym, xác lập trình tự ADN ti thể và phân tích hình thái. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng kết luận rằng 4 loài có thể chia tách dựa trên cơ sở các Ďặc trưng hình thái, hình dạng của các răng cửa, sự phân bố gai trên khối xương cổ chân (carpus) và cẳng chân (propodus) của chân kẹp (càng) và màu sắc [4]. Đặc điểm hình thái Theo nhóm tác giả Nguyễn Cơ Thạch [5], cua bùn Scylla spp. có các Ďặc Ďiểm sau: - Màu sắc: mặt lưng cua có màu xanh của lá sú vẹt già hay gần giống với màu xanh bùn (nên còn gọi là cua bùn), mặt bụng có màu vàng trắng xen lẫn chấm xanh Ďen, Ďôi chân bò thứ nhất (Ďôi càng) có kích thước bằng nhau, mặt lưng của càng có màu xanh bùn. - Kích thước và trọng lượng: cua tham gia sinh sản thường có trọng lượng từ 250-600 g tương ứng với chiều rộng giáp Ďầu ngực từ 10-12,5 cm. - Hình thái và cấu tạo: cơ thể cua dẹp theo hướng lưng bụng, toàn bộ cơ thể Ďược bao bọc trong lớp vỏ chitin dày. Cơ thể cua gồm 2 phần. Phần Ďầu và ngực cua dính liền nhau, ranh giới giữa các Ďốt không rõ ràng, Ďầu gồm 5 Ďốt, ngực có 8 Ďốt. Mé trước của giáp Ďầu ngực chia thành 3 Ďoạn phân cách bởi hai hố mắt, hai Ďoạn mé bên có chiều dài bằng nhau, mỗi bên mé có 9 gai nhọn có kích thước lớn dần theo thứ tự từ hốc mắt, Ďoạn giữa hai hốc mắt có 6 gai nhọn Ďều nhau. Phần bụng dạng phiến mỏng có 7 Ďốt, gập vào phần giáp Ďầu ngực (yếm cua), chân bụng bị thoái hóa không làm chức năng bơi lội. Ở con Ďực Ďôi chân bụng Ďầu tiên thoái hóa biến thành Ďôi gai giao cấu hình mũi kiếm; riêng Ďối với con cái, chân bụng phân thành hai nhánh có nhiều lông tơ Ďể kết dính trứng sau khi Ďẻ. Keenan mô tả hình thái của 4 loài cua bùn Scylla như sau (Bảng 1.1 và các Hình 1.1 - 1.4) [4]:
4 Bảng 1.1. Đặc Ďiểm hình thái của 4 loài cua bùn Scylla [4] Tên loài Đặc điểm hình thái Gai thuỳ trán cao, nhọn, các cặp gai lớn rõ ràng trên cổ chân S. serrata và cẳng chân của chân kẹp (càng); hoa văn Ďa giác xuất hiện rõ ràng trên tất cả các phần phụ Gai thùy trán vừa phải, không nhọn; các cặp gai lớn rõ ràng trên cổ chân và cẳng chân của chân kẹp (càng); hoa văn Ďa S. tranquebarica giác xuất hiện ở hai cặp chân cuối cùng, hoa văn này mờ hoặc không có ở các phần phụ khác Gai ở thùy trán hình tam giác, cao vừa phải; Ďôi gai lớn rõ ràng trên cổ chân của càng, trên cẳng chân của chân kẹp S. paramamosain (càng): không có gai phía bên trong, bên ngoài ít gai; hoa (cua xanh, cua sen) văn Ďa giác xuất hiện trên hai cặp chân cuối cùng, hoa văn này mờ hoặc không có ở các phần phụ khác Gai thùy trán thấp và tròn; cặp gai giảm rõ rệt trên cổ chân S. olivacea của càng, trên cẳng chân của chân kẹp (càng): không có gai (cua lửa) phía bên trong và ít gai ở phía ngoài; hoa văn Ďa giác không xuất hiện ở các phần phụ Hình 1.1. Cua Scylla serata Hình 1.2. Cua Scylla tranquebarica