Luận án Tiến sĩ Y học: Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:176

Thêm vào BST

Báo xấu

14
lượt xem 6
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Luận án Tiến sĩ Y học "Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe" trình bày các nội dung chính sau: Xác định đột biến gen GLA, GAA trên người bệnh Fabry và Pompe; Phát hiện người lành mang gen bệnh trên các thành viên gia đình người bệnh; Mô tả biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc bệnh Pompe và Fabry.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận án Tiến sĩ Y học: Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC HÀ NỘI - 2023
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN GLA, GAA VÀ ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA BỆNH FABRY VÀ POMPE Chuyên ngành : Hóa sinh y học Mã số : 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC 1. GS.TS. Tạ Thành Văn 2. PGS.TS. Hoàng Thị Ngọc Lan HÀ NỘI - 2023
LỜI CẢM ƠN Với tình cảm chân thành và lòng biết ơn sâu sắc, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới: Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo sau đại học, Bộ môn Hóa sinh, Trung tâm gen - protein - Trường Đại học Y Hà Nội; Ban Giám đốc, Khoa Khám bệnh - Bệnh viện Tim Hà Nội; Ban Giám đốc, Trung tâm Nội tiết- Chuyển hóa - Di truyền và Liệu pháp phân tử - Bệnh viện Nhi Trung ương đã quan tâm, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình tôi học tập và tiến hành nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án này. Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới GS.TS. Tạ Thành Văn và PGS.TS. Hoàng Thị Ngọc Lan – những người thầy đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt tôi trong quá trình học tập, công tác chuyên môn nghề nghiệp và chỉ bảo giúp tôi giải quyết nhiều khó khăn, vướng mắc trong quá trình thực hiện nghiên cứu, giúp tôi hoàn thành luận án này. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng cơ sở. Các thầy cô đã cho tôi nhiều ý kiến đóng góp quý báu, nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô, các anh chị đi trước, bạn bè đồng nghiệp đã nhiệt tình chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Sau nữa, tôi xin dành tình yêu thương và lòng biết ơn đến những người thân trong gia đình, bạn bè đã chia sẻ, là chỗ dựa vững chắc để tôi thực hiện và hoàn thành luận án. Hà Nôi, ngày tháng năm 2023 Tác giả luận án Nguyễn Thị Phương Thảo
LỜI CAM ĐOAN Tôi là Nguyễn Thị Phương Thảo, nghiên cứu sinh khóa 33 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa sinh y học, xin cam đoan: 1. Đây là luận án do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng dẫn của các thầy GS.TS. Tạ Thành Văn và PGS.TS. Hoàng Thị Ngọc Lan. 2. Công trình này không trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã được công bố tại Việt Nam. 3. Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hoàn toàn chính xác, trung thực và khách quan, đã được xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên cứu. Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật về những cam kết này. Hà Nội, ngày tháng năm 2023 Người viết cam đoan Nguyễn Thị Phương Thảo
CÁC CHỮ VIẾT TẮT BNP B natriuretic peptide Bp Base pair Cặp base DBS Dried blood spot Giọt máu khô DNA Deoxyribonucleic acid Acid deoxyribonucleic ERT Enzyme replacement therapy Nghiệm pháp enzyme thay thế FD Fabry disease bệnh Fabry GAA Alpha-glucosidase A Gb3 Globotriaosylceramide GLA Alpha-galactosidase A HSCT Hematopoietic stem cell Ghép tế bào gốc tạo máu transplantation IOPD Infantile Onset Pompe Disease Bệnh Pompe khởi phát sớm IVS Intervening sequence Trình tự nối LOPD Late Onset Pompe Disease Bệnh Pompe khởi phát muộn LSD Lysosomal stogage diease Bệnh rối loạn tích đọng trong tiêu thể LVI Left ventricular index Chỉ số khối thất trái LVMI Left ventricular mass index Chỉ số khối cơ thất trái LVPWd Left ventricular posterior wall Độ dày thành sau thất trái tâm diastolic trương MLPA Multiplex ligation-dependent probe amplification MS Mass spectrometry Đo khối phổ NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi Polymerase SNP Single Nucleotide Đa hình đơn nucleotid Polymorphism VUS Variants uncertain signification Biến thể chưa rõ ý nghĩa
MỤC LỤC ĐẶT VÂN ĐỀ ............................................................................................... 1 ́ ̉ CHƯƠNG 1. TÔNG QUAN TÀ I LIỆU ...................................................... 3 1.1. Rố i loa ̣n dự trữ trong tiêu thể ................................................................ 3 1.1.1. Đa ̣i cương ....................................................................................... 3 1.1.2. Chẩn đoán LSDs............................................................................. 4 1.1.3. Điều trị LSDs ................................................................................. 5 1.1.4. Các phương pháp sàng lọc bệnh LSDs ........................................... 6 1.2. Bệnh Fabry ........................................................................................... 7 1.2.1. Biểu hiện lâm sàng của Fabry ......................................................... 8 1.2.2. Di truyền học phân tử của Fabry................................................... 11 1.2.3. Liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình ........................................... 18 1.2.4. Chẩn đoán và sàng lọc Fabry ........................................................ 21 1.3. Bệnh Pompe ....................................................................................... 26 1.3.1. Biểu hiện lâm sàng của Pompe ..................................................... 28 1.3.2. Di truyền học phân tử của Pompe ................................................. 28 1.3.3. Mối liên quan giữa kiểu gen và kiểu hình ..................................... 31 1.3.4. Chẩn đoán và sàng lọc Pompe ...................................................... 32 1.4. Các phương pháp sinh học phân tử trong xác định đột biến gen GLA, GAA. ......................................................................................................... 34 1.4.1. Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) ............................................... 35 1.4.2. Giải trình tự gen trực tiếp ............................................................. 36 1.4.3. Giải trình tự gen thế hệ mới NGS ................................................. 37 1.4.4. Dự đoán khả năng gây bệnh của các đột biến mới bằng các phần mềm tin sinh học .................................................................................... 37 CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 40 2.1. Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 40 2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu....................................................... 41 2.3. Phương pháp nghiên cứu .................................................................... 42
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................... 42 2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ...................................................................... 42 2.3.3. Phương pháp thu thập mẫu ........................................................... 42 2.3.4. Các biến số nghiên cứu ................................................................. 44 2.3.5. Sơ đồ nghiên cứu .......................................................................... 45 2.3.6. Phương tiện nghiên cứu ................................................................ 46 2.3.7. Quy trình kỹ thuật đo hoạt độ enzyme ......................................... 50 2.3.8. Quy trình giải trình tự trực tiếp tìm đột biến gen GLA và GAA ... 52 2.4. Thu thập và xử lý số liệu .................................................................... 58 2.4.1. Công cụ thu thập số liệu ............................................................... 58 2.4.2. Quy trình thu thập số liệu ............................................................. 58 2.4.3. Xử lý số liệu ................................................................................. 58 2.4.4. Khống chế sai số .......................................................................... 59 2.5. Đạo đức trong nghiên cứu .................................................................. 59 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .................................................. 60 3.1. Đặc điểm chung của các đối tượng tham gia nghiên cứu .................... 60 3.1.1. Bệnh Fabry ................................................................................... 60 3.1.2. Bệnh Pompe ................................................................................. 61 3.2. Kết quả đo hoạt độ enzyme ................................................................ 62 3.2.1. Hoạt độ enzyme GLA của các người bệnh nghi ngờ Fabry ........... 62 3.2.2. Kết quả hoạt độ enzyme GAA của các người bệnh nghi ngờ Pompe ... 63 3.3. Kết quả phân tích gen tìm đột biến ..................................................... 64 3.3.1. Kết quả phân tích gen GLA .......................................................... 64 3.3.2. Kết quả giải trình tự gen các người bệnh nghi ngờ Pompe ............ 71 3.4. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người bệnh.... 79 3.4.1. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người bệnh Fabry. .................................................................................. 79 3.4.2. Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người bệnh Pompe ........................................................................................... 83 3.5. Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Fabry và Pompe .......................... 93
3.5.1. Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Fabry .................................... 93 3.5.2. Đặc điểm lâm sàng của người bệnh Pompe .................................. 93 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN .......................................................................... 96 4.1. Đặc điểm chung của các đối tượng nghiên cứu ................................... 96 4.1.1. Đặc điểm chung về tuổi và giới của bệnh Fabry ........................... 96 4.1.2. Đặc điểm chung về tuổi và giới của bệnh Pompe ......................... 98 4.2. Biến đổi hoạt độ enzyme GLA, GAA của các người bệnh tham gia nghiên cứu................................................................................................. 98 4.2.1. Hoạt độ enzyme GLA ................................................................... 98 4.2.2. Hoạt độ enzyme GAA của các người bệnh nghi ngờ Pompe ...... 100 4.3. Các đột biến gen GLA, GAA ở người bệnh Fabry và Pompe ............. 100 4.3.1. Các đột biến gen GLA ................................................................ 100 4.3.2. Các đột biến gen GAA ............................................................... 103 4.4. Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người bệnh tham gia nghiên cứu ................................................................................ 113 4.4.1. Phát hiện người lành mang gen trên thành viên gia đình người bệnh Fabry ........................................................................................... 113 4.4.2. Phát hiện người lành mang gen trên các thành viên gia đình người bệnh Pompe ............................................................................... 114 4.5. Biểu hiện lâm sàng của người bệnh Fabry và Pompe ........................ 123 4.5.1. Biểu hiện lâm sàng của người bệnh Fabry .................................. 123 4.5.2. Đặc điểm lâm sàng của bệnh Pompe .......................................... 124 KẾT LUẬN ............................................................................................... 127 KHUYẾN NGHỊ....................................................................................... 128 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC
DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân bố các loại đột biến gen GLA........................................... 15 Bảng 1.2: Các SNP của gen GLA ............................................................. 17 Bảng 1.3. Phân bố các loại đột biến gen GAA .......................................... 30 Bảng 2.1. Trình tự mồi của gen GLA sử dụng trong nghiên cứu ............... 48 Bảng 2.2. Trình tự mồi để khuếch đại gen GAA ....................................... 49 Bảng 2.3: Thành phần của phản ứng PCR khuếch đại các exon gen GLA ... 53 Bảng 2.4: Chu trình nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại gen GLA .......... 54 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng PCR cho giải trình tự gen GLA.............. 55 Bảng 2.6. Chu trình nhiệt phản ứng PCR cho giải trình tự gen GLA ........ 55 Bảng 2.7: Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen GAA ..................... 56 Bảng 2.8: Chu trình nhiệt khuếch đại gen GAA ........................................ 56 Bảng 2.9: Thành phần phản ứng PCR giải trình tự gen GAA .................... 57 Bảng 2.10: Chu trình nhiệt PCR giải trình tự gen GAA .............................. 57 Bảng 3.1: Phân bố theo giới của nhóm người bệnh tham gia nghiên cứu .. 61 Bảng 3.2: Phân bố theo tuổi khởi phát của các người bệnh Pompe trong nghiên cứu ................................................................................ 61 Bảng 3.3: Phân bố theo giới của các người bệnh Pompe trong nghiên cứu ... 62 Bảng 3.4: Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA .............................................. 62 Bảng 3.5: Kết quả đo hoạt độ enzyme GAA ............................................. 64 Bảng 3.6: Kết quả giải trình tự gen GLA của 27 mẫu có hoạt độ enzyme thấp nhất ................................................................................... 66 Bảng 3.7. Dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến bằng các phầm mềm tin sinh học ............................................................................... 69 Bảng 3.8: Kết quả hoạt độ enzyme theo loại đột biến ............................... 70 Bảng 3.9: Kết quả giả trình tự gen GAA của các đối tượng nghiên cứu .... 73 Bảng 3.10. Tần suất xuất hiện các đột biến trong nghiên cứu ..................... 76
Bảng 3.11. Kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.625T>C bằng các phần mền tin sinh học ................................................ 77 Bảng 3.12: Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA từ mẫu máu toàn phần .......... 79 Bảng 3.13: Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA từ giấy thấm DBS................. 80 Bảng 3.14: Kết quả đo hoạt độ enzyme và kết quả giải trình tự exon 1 của gia đình người bệnh mã số VN.06. ........................................... 82 Bảng 3.15: Tỷ lệ các thành viên mang đột biến qua các thế hệ ................... 92 Bảng 3.16: Triệu chứng lâm sàng khởi phát của các người bệnh ................ 93 Bảng 3.17: Biến đổi chỉ số tim ngực và LVMI trên Xquang tim phổi và siêu âm tim ............................................................................... 94 Bảng 3.18: Kết quả hoạt độ enzyme CK, ALT của các người bệnh trong nghiên cứu. ............................................................................... 95
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Hình ảnh tế bào với tiêu thể bị tích đọng. ................................... 4 Hình 1.2: Hình ảnh tổn thương da do Fabry ............................................. 10 Hình 1.3: Cấu trúc alpha-galactosidase ở người ....................................... 11 Hình 1.4: Phân bố các đột biến điểm gây bệnh Fabry trên các exon của gen GLA (theo HGMD). ........................................................... 16 Hình 2.1: Các phản ứng enzyme trong đo khối phổ song song GLA ........ 51 Hình 3.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại gen GLA của mẫu BN mã số FB64 ........................................................................ 65 Hình 3.2: Hình ảnh biến thể 5’UTR -12G>A............................................ 68 Hình 3.3: Kết quả đột biến c.178C>T, (p.Pro60Ser) của người bệnh mã số FB64 .................................................................................... 68 Hình 3.4: Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ PolyPhen-2 để dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.178C>T ............................... 69 Hình 3.5: Hình ảnh minh họa sử dụng công cụ MutationTaster để dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.178C>T ....................... 70 Hình 3.6: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sau khi khuếch đại exon14 gen GAA .................................................................................. 72 Hình 3.7: Hình ảnh đột biến gen của người bệnh mã số Pom11.0 ............. 75 Hình 3.8: Hình ảnh kết đột biến c.1411-1414delGAGA ở người bệnh Pom20.4 và Pom20.7 ................................................................ 75 Hình 3.9: Hình ảnh đột biến chỗ nối trên intron 14 của người bệnh mã số Pom12.0 ............................................................................... 76 Hình 3.10: Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.625T>C bằng phần mềm PolyPhen2. ............................. 78 Hình 3.11: Hình ảnh minh họa kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của đột biến c.625T>C bằng phần mềm MutationTaster. ...................... 78
Hình 3.12: Phả hệ của gia đình mã số VN.06 ............................................. 81 Hình 3.13: Phả hệ gia đình mã số Pom16 ................................................... 83 Hình 3.14: Phả hệ gia đình mã số Pom17 ................................................... 85 Hình 3.15: Phả hệ gia đình mã số Pom18 ................................................... 86 Hình 3.16: Phả hệ gia đình mã số Pom19 ................................................... 87 Hình 3.17: Phả hệ gia đình mã số Pom20 ................................................... 88 Hình 3.18: Phả hệ gia đình mã số Pom21 ................................................... 89 Hình 3.19. Phả hệ gia đình mã số Pom22 ................................................... 90 Hình 3.20: Phả hệ gia đình mã số VN.0055 ................................................ 91
DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Phân bố theo nhóm tuổi của các BN nghi ngờ Fabry ............ 60 Biểu đồ 3.2: Kết quả đo hoạt độ enzyme GLA ......................................... 63 Biểu đồ 3.3: Đồ thị phân tích hoạt độ enzyme GLA theo kết quả giải trình tự gen ................................................................................... 71
1 ĐẶT VÂN ĐỀ ́ Fabry và Pompe là hai bệnh di truyền hiếm gặp thuộc nhóm bệnh liên quan tới rối loạn dự trữ các chất trong tiêu thể (lysosomal storage diseases- LSDs). Đây là một nhóm gồm trên 50 bệnh di truyền hiếm gặp do rối loạn chuyển hóa là hậu quả của sự suy giảm chức năng của tiêu thể. LSDs thường là hậu quả của sự thiếu hụt của một enzyme duy nhất cần thiết cho chuyển hóa lipid, glycoprotein hoặc mucopolysaccharides. Fabry là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X còn Pompe là bệnh di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường. Nguyên nhân của bệnh đã được xác định là do đột biến gen GLA, GAA dẫn đến sự thiếu hụt tương ứng acid alpha-galactosidase và acid alpha-glucosidase, là những enzyme tiêu hóa của tiêu thể.1,2 Sự thiếu hụt enzyme này dẫn đến sự tích tụ của glycerophospholipid và glycogen có cấu trúc bình thường trong tiêu thể và tế bào chất. Sự tích tụ quá mức các chất này trong tiêu thể sẽ làm gián đoạn hoạt động bình thường của các cơ quan khác trong tế bào và dẫn đến tổn thương tế bào.3,4 Rất nhiều đột biến gen GLA, GAA đã được ghi nhận là đột biến gây bệnh, các đột biến mới vẫn tiếp tục được nghiên cứu và báo cáo. Mặc dù tỉ lệ mắc bệnh là không cao khoảng 1 trường hợp cho 40.000 - 50.000 dân5 nhưng hầu hết bệnh gây tử vong sớm vì suy hô hấp và suy tim. Tỷ lệ này trên nhóm nguy cơ cao, người bệnh có gan to, lách to chưa rõ nguyên nhân, cao hơn rất nhiều, là khoảng 1/400. Tuy nhiên nếu được phát hiện sớm thì nguy cơ tử vong có thể được giảm đáng kể bởi liệu pháp thay thế enzyme (ERT) và các điều trị hỗ trợ khác. Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện một tỷ lệ đáng kể người bệnh Fabry với những triệu chứng không điển hình, khởi phát muộn (sau 40 tuổi), được coi là các biến thể của Fabry: thể tim và thể thận.
2 Fabry và Pompe đều là các bệnh di truyền, do đó việc sàng lọc và phát hiện sớm các thành viên gia đình của bệnh nhân mang đột biến gen GLA, GAA là rất cần thiết để đưa ra tư vấn di truyền phù hợp, hạn chế sinh ra những đứa trẻ bị bệnh. Tại Việt Nam, có rất ít các nghiên cứu về đột biến gen GLA, GAA ở các bệnh nhân Fabry và Pompe, cũng như xác định đột biến ở các thành viên gia đình. Với những lý do trên đề tài “Xác định đột biến gen GLA, GAA và đặc điểm di truyền của bệnh Fabry và Pompe” được tiến hành với ba mục tiêu sau: 1. Xác định đột biến gen GLA, GAA trên người bệnh Fabry và Pompe. 2. Phát hiện người lành mang gen bệnh trên các thành viên gia đình người bệnh. 3. Mô tả biểu hiện lâm sàng và cận lâm sàng của người bệnh mắc bệnh Pompe và Fabry.
3 CHƯƠNG 1 ̉ TÔNG QUAN TÀ I LIỆU 1.1. Rố i loa ̣n dự trữ trong tiêu thể 1.1.1. Đa ̣i cương Tiêu thể là một bào quan trong tế bào chất, chứa các enzyme thuỷ phân có tác dụng giáng hoá các đại phân tử như protein, phức hợp carbohydrate, acid nucleic, lipid, sulfate, và phosphate. Các sản phẩm giáng hoá cuối cùng có thể được tái sử dụng hoặc loại bỏ ra ngoài cơ thể. Sự không có hoặc mất chức năng của một enzyme, sau một thời gian, sẽ gây lên sự tích tụ các sản phẩm chuyển hoá trung gian. Bệnh liên quan đến rối loạn dự trữ trong tiêu thể (LSDs- Lysosome storage diseases) là một nhóm bệnh không đồng nhất gồm khoảng 50 các rối loạn về gen mã hoá các enzyme trong tiêu thể.3 Tuy nhiên, những protein quan trọng khác liên quan đến chuyển hoá và phóng thích các chất trong tiêu thể cũng được cho là nguồn gốc của một số bệnh LSDs. Những protein này bao gồm các enzyme đồng hoạt hoá (enzyme coactivators), protein màng, protein vận chuyển xuyên màng và các enzyme quan trọng khác liên quan tới quá trình xử lý các protein của tiêu thể. Về bệnh học, tất cả LSDs cùng chung một cơ chế bệnh sinh đó là sự tích tụ các sản phẩm chuyển hoá khác nhau trong tiêu thể. Quá trình tích tụ các sản phẩm này dẫn tới phá huỷ cấu trúc và chức năng tế bào.3,4 Sự chết một lượng lớn các tế bào gây lên mất chức năng cơ quan tổ chức trong cơ thể. Hầu hết các bệnh LSDs là do di truyền gen lặn trên nhiễm sắc thể thường, ngoại trừ một số bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể giới tính X như bệnh Fabry, bệnh Hunter (MPS III), và bệnh Danon.4,6 Nếu xét từng bệnh riêng lẻ, tỷ lệ mắc mới của các bệnh di truyền này là hiếm, dao động trong
4 khoảng 1/50.000 tới 1/4000.000. Tuy nhiên, khi tính tổng thể thì các bệnh LSDs là khá phổ biến, khoảng 1/7.000 đến 1/8.000 trẻ sống.7 Các bệnh LSDs được phân loại dựa trên các chất trong tiêu thể bị rối loạn, nhưng một số nhóm được phân loại dựa trên sự thiếu hụt protein.7 Các nhóm bệnh lớn bao gồm rối loạn chuyển hóa mucopolysaccharid (MPS - Mucopolysaccarid), GM2 gangliosidose, neutral glycosphingolipidose, glycoproteinose, mucolipidose, hội chứng loạn dưỡng chất trắng não, bệnh tích đọng glycogen, rối loạn mỡ trung tính, và rối loạn protein vận chuyển hoặc rối loạn phân bố protein trong tế bào.4 Hình 1.1: Hình ảnh tế bào với tiêu thể bị tích đọng. 1.1.2. Chẩn đoán LSDs Chẩn đoán LSDs tương đối khó vì biểu hiện triệu chứng lâm sàng rất đa dạng.8 Biểu hiện của bệnh có thể khác nhau về tuổi khởi phát, mức độ phức tạp của của các chất tích đọng trong tiêu thể, tỷ lệ các chất tích đọng, và sự phân bố các chất tích đọng trong các cơ quan tổ chức của cơ thể. Mỗi cơ quan, bộ phận của cơ thể có một ngưỡng hoạt động của enzyme khác nhau, phụ thuộc vào sự thay đổi liên tục của cơ chất, sự luân chuyển tế bào (cellular turnover) và các nhu cầu chuyển hoá. Chẩn đoán LSDs dựa trên các triệu chứng lâm sàng, xét nghiệm hóa sinh và các xét nghiệm phân tử. Các xét nghiệm hóa sinh được sử dụng trong chẩn đoán LSDs bao gồm các xét nghiệm định lượng cơ chất bị ứ đọng hoặc đo hoạt độ enzyme có thể được tiến hành từ các mẫu bệnh phẩm khác nhau như máu, nước tiểu, dịch ối, nguyên bào sợi da hay mẫu mô sinh thiết…9 Các xét
5 nghiệm phân tử được chỉ định để xác định đột biến gen mã hóa tổng hợp enzyme.10 Tất cả các gen được biết đến là liên quan đến LSDs đều đã được nhân dòng và xét nghiệm phân tử trở thành một phần không thể thiếu trong chẩn đoán LSDs, tuy nhiên, việc giải thích kết quả còn nhiều khó khăn do chưa hiểu hết được ý nghĩa lâm sàng của các biến thể và mối liên quan giữa chúng.11 Các triệu chứng và hội chứng lâm sàng sẽ định hướng cho việc lựa chọn xét nghiệm. Phân tích enzyme và các siêu cấu trúc của tế bào trong nước ối (amniocytes) hoặc tế bào màng rau thai (chorionic villus) được dùng để chẩn đoán trước sinh nhiều bệnh LSDs. 1.1.3. Điều trị LSDs Khi đã được chẩn đoán, người bệnh cần được cân nhắc điều trị đặc hiệu và điều trị hỗ trợ. Các liệu pháp điều trị được áp dụng trước khi có biểu hiện bệnh là lý tưởng nhất. Có thể xác định những người bệnh chưa có biểu hiện triệu chứng là phân tích gen cho những thành viên trong gia đình có người bệnh đã được chẩn đoán LSDs. Tới thời điểm này, có một số phương pháp mới đã và đang được nghiên cứu để điều trị bệnh LSDs nhằm giải quyết các sai sót trong tế bào do thiếu hụt enzyme gây ra. Các phương pháp đang được áp dụng như ghép tế bào gốc tạo máu, hệ thống 2 enzyme vận chuyển và truyền enzyme tái tổ hợp thay thế. 1.1.3.1. Ghép tế bào gốc tạo máu (HSCT) Khoảng 20 năm trở lại đây, HSCT cho thấy hiệu quả trên những người bệnh LSDs chưa có biểu hiện bệnh hoặc trên người bệnh LSDs có biểu hiện bệnh nhẹ.3 Tuỷ xương được lấy từ anh chị em ruột có cùng hệ HLA, hoặc từ những người tình nguyện có cùng hệ kháng nguyên bạch cầu. Tuỷ xương của người cho sẽ cung cấp các tế bào gốc khoẻ mạnh, có thể sản xuất các enzyme bù đắp cho lượng bị mất hoặc bị thiếu hụt ở người bệnh. Các thử nghiệm trên động vật cho thấy rằng các tế bào gốc được ghép đã giúp giải quyết việc thiếu
6 hụt enzyme và theo thời gian, các đại thực bào có nguồn gốc từ tế bào ghép sẽ thay thế các tế bào thần kinh đệm ở não. Trên người, HSCT được sử dụng với mức độ thành công khác nhau ở những người bệnh mắc MPS I (Hurler), MPS II (Hunter), MPS VI (Maroteaux-Lamy), Gaucher, Wolman, Metachromatic leukodystrophy, và bệnh Krable. Mỗi người bệnh LSDs đáp ứng khác nhau với HSCT và quyết định ghép HSCT ngay khi có các dấu hiệu khởi phát được xem là quan trọng trong việc điều trị bệnh. Các biến chứng của HSCT phần lớn là thải loại mảnh ghép, độc tố của chế độ trị liệu, và tỉ lệ ghép không thành công khá cao.4 1.1.3.2. Liệu pháp thay thế enzyme (ERT) Liệu pháp thay thế enzyme giúp bổ sung các enzyme bị thiếu hụt. Kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép sản suất một lượng lớn một số các enzyme của tiêu thể. Hiện nay, cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ đã xác nhận các sản phẩm enzyme thay thế dùng trong điều trị các bệnh Gaucher, Fabry, MPS I, MPS II, MPS VI và bệnh Pompe. Tuy nhiên hạn chế của ERT là qua không qua được hàng rào máu não, do đó không xử lý được các triệu chứng thần kinh trong LSDs. Ngoài ra, phản ứng miễn dịch chống lại enzyme được truyền vào và nhắm sai mục tiêu cũng là những trở ngại cho thành công của ERT.12 1.1.4. Các phương pháp sàng lọc bệnh LSDs Với những LSDs đã có liệu pháp điều trị hiệu quả, việc phát hiện sớm bệnh ngay từ giai đoạn sơ sinh và trẻ nhỏ có ý nghĩa đặc biệt. Hoạt độ enzyme là chỉ số được dùng nhiều trong sàng lọc LSDs. Có nhiều kỹ thuật được sử dụng để đo hoạt độ enzyme như phương pháp miễn dịch hoặc đo khối phổ song song, với bệnh phẩm là huyết thanh, bạch cầu hoặc mẫu máu khô bảo quản trên giấy (DBS – Dry blood spot). Một số kỹ thuật đang được phát triển và hoàn thiện để áp dụng cho chương trình sàng lọc sơ sinh sử dụng máu khô bảo quản trên giấy lọc (blood filter paper specimen).
7 Phương pháp định lượng các enzyme trong các bệnh LSDs như Pompe (GAA), Fabry (GLA), Sandhoff, Gaucher, Niemann-Pick và bệnh Tay-Sachs sử dụng mẫu máu khô trên giấy thấm đã được một số tác giả công bố. Ưu điểm của phương pháp này là hoạt độ enzyme tương đối ổn định trong vòng 6 tháng. Điểm hạn chế chính của mỗi xét nghiệm này là dùng cùng một chỉ số hoạt động của enzyme (ví dụ, 4-methylumbelliferone), do vậy việc phân tích đồng thời nhiều bệnh là không thể. Ví dụ, xét nghiệm đo hoạt độ GLA để chẩn đoán bệnh Fabry sử dụng cơ chất 4-methylumbelliferyl-α-D- galactopyranoside có sự phát huỳnh quang của hỗn hợp cơ chất-enzyme tương tự như trong xét nghiệp bệnh MPS I, nên hai phản ứng không thể phân tích đồng thời một lúc mà phải phân tích riêng rẽ.13 Các đột biến trong LSDs rất khác nhau, vì vậy phân tích đột biến không phù hợp cho việc sàng lọc một số lượng lớn. Tương tự như vậy, do thiếu cả protein thông thường, protein đặc hiệu, và các dấu ấn chuyển hoá trong máu của các người bệnh LSDs, làm hạn chế tác dụng chẩn đoán của các xét nghiệm hoá sinh lâm sàng. Bên cạnh đó, việc sử dụng kỹ thuật sinh thiết mô hay nuôi cấy nguyên bào sợi thì là những xét nghiệm có tính xâm nhập và khó áp dụng trên quy mô lớn. Tuy nhiên một số cách tiếp cận khả thi trong việc sàng lọc sơ sinh bệnh LSDs đã được công bố trong y văn.7 1.2. Bệnh Fabry Fabry là bệnh di truyền hiếm gặp, liên kết nhiễm sắc thể X gây ra bởi sự tích tụ quá mức sphingolipid trong tiêu thể, dẫn đến các triệu chứng ở các cơ quan khác nhau, thậm chí toàn thân. Sự thiếu hụt enzyme alpha galactosidase A (GLA) do đột biến gen GLA- gen mã hóa sản xuất enzyme GLA- gây ra, làm cho một loại glycolipid là globotriaosylceramide (viết tắt là Gb3, GL-3, hoặc ceramide trihexoside) tích lũy bên trong nội mô mạch máu, các tế bào cơ trơn, cầu thận và tế bào biểu