Luận văn: XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE part 2

Chia sẻ: Pkjd Opiuj | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:10

Thêm vào BST

Báo xấu

108
lượt xem 15
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

2.1.5.Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài Các dòng cacao nghiên cứu trong đế tài thuộc những giống có năng suất cao, có giá trị thương mại nhờ được chọn lọc từ những cây bố, mẹ có đặc tính tốt trong quá trình lai tạo giống. 13 dòng cacao thương mại được nhập từ Malaysia có đời bố mẹ của một số dòng như sau: Tên dòng TD1 TD3 TD5 TD10 TD13 TD14 TD12 Đời bố mẹ PA 35 x NA 32 Con lai của Trinitario UAWA 18 x T.S.15/43.352 NA 31 x PA 15...

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Luận văn: XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP NHẬN DIỆN VÀ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA 21 DÒNG CACAO (THEOBROMA CACAO L.) BẰNG KỸ THUẬT MICROSATELLITE part 2

60 2.1.5.Đặc điểm chính của 21 dòng cacao nghiên cứu trong đề tài Các dòng cacao nghiên cứu trong đế tài thuộc những giống có năng suất cao, có giá trị thương mại nhờ được chọn lọc từ những cây bố, mẹ có đặc tính tốt trong quá trình lai tạo giống. 13 dòng cacao thương m ại được nhập từ Malaysia có đời bố mẹ của một số dòng như sau: Tên dòng Đời bố mẹ TD1 PA 35 x NA 32 TD3 Con lai của Trinitario TD5 UAWA 18 x T.S.15/43.352 TD10 NA 31 x PA 15 TD13 UIT 1 x NA 33 TD14 PA 173 x SCA 9 TD12 (PA 76 x SCA 20) x (UIT 1 x SCA 6) 2.2.Qui trình ly trích DNA ở tế bào thực vật Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh họ c phân tử đều bắt đ ầu bằng việc thu nhận một lượng lớn nucleic acid đủ lớn và đủ tinh sạch đ ể tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mố i quan tâm hàng đầu của các kỹ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận được các phân tử này ở trạng th ái nguyên vẹn tố i đa không bị phân hủ y b ởi các tác nhân cơ học (phân tử bị gẫy do nghiền, lắc mạnh) hay hó a học (phân tử bị thủ y giải bởi các enzyme nội b ào giải phóng ra môi trường khi tế bào b ị ph á vỡ). Các nucleic acid cần được tách chiết ở nhiệt độ th ấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội bào (Desoxyribonuclease-Dnase và Ribonuclease-Rnase) Một qui trình ly trích DNA ở tế bào th ực vật gồm 3 bước cơ bản: Bước 1 : Phá vỡ m àng tế bào. Thông thư ờng người ta nghiền tế b ào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịch đệm chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7.5), NaCl 5M, EDTA 0.5M, sodium dodecyl sulfat 10% (SDS). Hỗn hợp n ày sẽ ph á vỡ m àng tế bào và màng nh ân, giải phóng DNA ra môi trường đồng thời ph ân hủ y các protein liên kết với DNA.
61 Bước 2 : Loại bỏ các thành ph ần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là các protein. Có thể sử dụng CTAB/NaCl (CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide) tạo phức hợp với polysaccharide và protein rồi kết tủa chúng. Loại bỏ protein và phức hợp CTAB – polysaccharide – p rotein b ằng hỗn hợp phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1). Phenol và chloroform sẽ làm biến tính protein. Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nước và pha h ữu cơ dễ tách rời nhau. Isoamyl alcohol h ạn chế sự nổ i bọt trong suốt qu á trình ly trích. Mặc dù phenol làm biến tính protein nhưng nó có thể làm ức chế hình dạng của Rnase và làm dung môi cho phân tử Rnase có chứa những chuỗ i dài polyA (Brawerman và ctv,1972). Do đó, có th ể kh ắc phục nhược điểm này b ằng cách sử dụng thêm chloroform sẽ giúp lo ại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong nucleic acid. Protein bị biến tính sẽ không hò a tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nư ớc và pha hữu cơ. Pha nước có chứa nucleic acid được thu nh ận lại. Bước 3: Tủa nucleic acid trong isopropanol. Các DNA có trọng lư ợng phân tử thấp không bị tủa n ên có thể loại bỏ chúng bằng tủa trong isopropanol. Nucleic acid sẽ được thu nh ận lại b ằng ly tâm. Sau đó, cặn tủ a phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của isopropanol còn dính lại (Hồ Hu ỳnh Thù y Dương,1998).  Phân tích định tính và định lượng DNA bằng quang phổ kế. Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, chúng ta có thể tiến hành phân tích định tính và định lư ợng DNA bằng quang phổ kế. Phương pháp này cho phép ước lượng tương đố i nồng độ nucleic acid có trong mẫu sau khi ly trích được. Nguyên tắc của phương pháp này d ựa vào sự hấp thụ mạnh ánh sáng tử ngoại ở b ước sóng 260 nm của các base purine và pyrimidine. Giá trị mật độ quang (OD: optical density) ở bước sóng 260 nm của các mẫu đo cho phép xác đ ịnh nồng độ nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan: một đơn vị OD260nm tương ứng với n ồng độ 5 0ng/µl cho dung dịch chứa DNA mạch kép. Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với dung dịch chứa nucleic acid sạch. Để kiểm tra độ sạch của dung dịch, người ta đo th êm giá trị OD280nm. Tại bước sóng 280 nm,
62 protein có mức hấp thụ cao nhất, nhưng các protein cũng hấp thu bước sóng ở 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị th ật của nồng độ nucleic acid. Tỉ số OD260nm /OD280nm là tỉ số cho thấy độ nhiễm các chất như phenol hoặc protein. - Tỉ số OD260nm /OD280nm = 1.8 đối với DNA tinh khiết. - Tỉ số OD260nm /OD280nm = 2 đối với RNA tinh khiết (Quách Tuyết Oanh, 2003) 2.3.Giới thiệu về kỹ thuật PCR 2 .3.1.Nguyên tắc của kỹ thuật PCR PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ n ối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau : Bước 1: Biến tính Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao (94-95o C) trong vòng 30 giây đến 1 phú t, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 m ạch đ ơn. Ch ính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch bổ sung mới. Bước 2: Phản ứng của primer gắn vào đ ầu dây chuỗi mã đối xứng với chuỗi mã trên dây template để có phân tử DNA m ới. Ở giai đoạn này nhiệt độ được hạ thấp cho ph ép các primer bắt cặp với khuôn, nhiệt độ n ày dao động trong khoảng 30-70o C, kéo dài trong khoảng 30 giây đến 1 phút, tù y thuộc vào nhiệt độ nóng chảy Tm (melting temperature) của các primer sử dụng. Giai đo ạn này gọi là giai đoạn lai. Bước 3: Kéo dài dây mới nhờ primer Nhiệt độ được tăng lên 72 oC giúp cho DNA polymerase ho ạt động tốt nhất. Thời gian của giai đoạn này tù y thuộc vào độ dài của trình tự DNA khu ếch đại, thường kéo d ài từ 30 giây đến vài phút. Kết quả cuối cùng là một đoạn mã hóa di truyền đặc biệt n ào đó được khuếch đại lên rất nhiều lần. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2 n m : là số bản sao của chuỗi mã hó a. n : là số chu k ỳ.
63 H ình 2.2: Nguyên tắc phản ứng PCR Ba trình tự này xả y ra theo chu kỳ rất nhanh để khu ếch đại DNA. Trong chu kỳ thứ nh ất và thứ hai của phản ứng khuếch đại, chỉ có sản phẩm chuỗ i dài được hình thành, còn trong những chu kỳ tiếp theo khuếch đại cả nh ững sản phẩm chuỗi dài và chuỗi ngắn. Sản phẩm chuỗi d ài được tích tụ theo hướng tuyến tính, còn sản phẩm chuỗi ngắn tích tụ theo logarit. Do dó, ngư ời ta hy vọng có khoảng 105 lượng sản phẩm chuỗi ngắn sau khoảng 25 -30 chu kỳ. Theo nguyên tắc PCR được áp dụng để khuếch đại các đoạn DNA có chiều dài 200-2000bp. Nh ững phản ứng trên được thực hiện nhờ polymerase nh ư Taq polymerase, và sự thay đ ổi chu kỳ nhiệt một cách hợp lý, đặc biệt là nhiệt độ cho giai đo ạn biến tính và giai đoạn bắt cặp. Một polymerase của DNA và bốn deoxy (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) được dùng đ ể khuếch đại một đoạn chuyên tính nào đó của DNA. Khả năng “chọn lọ c” này được thực hiện thông qua sự h ợp lại của 2 oligonucleotide (F và R) trong phản
64 ứng. Nhiệm vụ của những oligonucleotide này là tác đ ộng làm cho DNA b ị biến ch ất (mở dây đ ôi thành dây đ ơn) và những phần cuối của đoạn nhằm tăng hoạt lên và cho n ó hoạt động như những primer trong sinh tổng hợp DNA. Primer bên trái tác động trên dây DNA 3’-5’ còn được gọi là forward primer, kí h iệu là F. Primer bên ph ải tác động trên dây 5’-3’ còn được gọ i là reverse primer, kí h iệu là R. Sự sắp xếp như vậy đảm bảo vùng b ị can thiệp được tăng cường hoạt động, theo 3 trình tự đã nó i ở trên. Tóm lại khi các primer kết hợp với sợi DNA đối lập của nó trong đ iều kiện một khoảng cách đã được kích hoạt, các đo ạn DNA này có thể sẽ được khuếch đại lên theo ph ản ứng dây chuyền với polymerase. 2 .3.2 .Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR 2.3.2.1.DNA mẫu Phản ứng khuếch đại tố i ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Tuy nhiên, những kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết qu ả tố t với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003) Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa việc giảm lượng mẫu ban đầu còn hạn chế các khuếch đại “kí sinh”, tạo những sản phẩm ph ụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2003). Thông thường, nhiễm protein trong mẫu DNA trong quá trình ly trích DNA sẽ không ảnh hư ởng xấu đến sự nh ân DNA. Tuy nhiên nhiễm DNA lạ sẽ dẫn đến kết quả PCR bị sai lệch. Đối với những DNA có kích thước quá lớn (>50kb), sự biến tính có thể không hữu hiệu và năng suất PCR thấp. Trong trư ờng hợp này, cần phải cắt DNA trước bằng enzyme cắt hạn chế mà enzyme đó không cắt trong chuỗi đích; ho ặc có thể tách DNA bằng cách dùng nhiệt độ tới 100oC trong 2 -5 phút. 2.3.2.2.Taq polmerase Taq polymerase là enzyme chịu nhiệt ly trích từ vi khuẩn suối nước nóng Thermus aquaticus. Với enzyme n ày, PCR cho hiệu qu ả cao nhất, Taq có thể xúc tác kéo d ài khoảng 35-100 nucleotide trong 4 giây ở nhiệt độ 70 -80oC, đ ây là giới
65 hạn nhiệt độ thích hợp nhất cho enzyme n ày hoạt động (C.R Newton và A.Graham, 1997). Nồng độ Taq polymerase đư ợc sử dụng thông thường là 0.5 -5 đơn vị/100 µl dung d ịch phản ứng. Nếu nồng độ Taq quá cao, những sản phẩm không chuyên tính có thể nh ảy vào làm sai lệch kết quả. Nếu nồng độ Taq quá thấp, chúng ta sẽ không có đủ số lượng men để xúc tác tạo ra sản phẩm PCR theo ý muốn. Trong ph ản ứng PCR thì Taq polymerase có khuynh hướng thêm một nucleotide lo ại “A” vào đầu tận cùng 3’ của sản phẩm PCR, điều này rất quan trong trong việc tạo dòng (TA- cloning) và nó sẽ bị loại thải đi nếu sự gắn kết xảy ra ở đầu tận cùng là đầu bằng (blunt end ligation). Ngo ài ra có th ể làm gia tăng hoạt tính của Taq polymerase b ằng cách sử dụng kết hợp với một số enzyme khác: Tli ho ặc Pfu. Use Tli, Pfu và một số enzyme polymerase khác. 2.3.2.3.Primer Primer là ch ỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đ ặc trưng và có hiệu quả cao. Việc chọn primer là giai đoạn quyết đ ịnh của phương pháp PCR, việc thiết kế primer phải tuân thủ một số chỉ tiêu cơ bản sau (Vincent R. Prezioso, 2004): 1- Chiều dài primer Đây là m ột chỉ tiêu quan trọng cho sự thành công của PCR, vì tính đặc hiệu và nhiệt độ bắt cặp của p rimer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer. Thông thường primer có chiều dài từ 18-24 base (theo nguyên tắc của Wallace) có tính đ ặc hiệu cao, và cho nhiệt độ bắt cặp tối ưu. Kích thước primer không nên quá ngắn, trừ trường hợp phục vụ cho mục đích đặc b iệt, và cũng không n ên quá dài vì sẽ làm giảm khả năng bắt cặp. 2- Nhiệt độ nóng chảy Tm Hai primer xuôi và ngược trong phản ứng PCR phải có nhiệt độ nóng ch ảy không cách biệt nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn th ì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA. 3- Độ đ ặc hiệu Độ đặc hiệu của primer phụ thuộc một phần vào chiều dài primer như đã nói ở trên. Để có độ đặc hiệu cao, primer phải được thiết kế sao cho chỉ khuếch đại
66 một trình tự đặc trưng duy nhất trên DNA h ay chỉ cho một sản phẩm chính, và không n ên có nhiều trình tự lặp lại trên primer, vì đ iều này sẽ dẫn đến sự xuất hiện các sản phẩm phụ. Nhiệt độ của giai đoạn kéo dài không được quá thấp so với nhiệt độ bắt cặp của primer để đảm b ảo tính đặc hiệu. 4- Trình tự bổ sung trên primer Trình tự primer phải được thiết kế sao cho có không quá 3 cặp base có trình tự bổ sung với nhau, vì điều n ày sẽ dẫn đến hiện tượng “kẹp tóc” d o sự b ắt cặp bổ sung giữa các phần khác nhau của một primer, làm n găn cản sự bắt cặp của primer với DNA. Hai primer xuôi và ngược phải không có trình tự bắt cặp bổ sung với nhau đ ể tránh hiện tượng “dimer primer”, vì điều n ày sẽ dẫn đến sự cạnh tranh bắt cặp với DNA và cản trở sự hình thành sản phẩm mong muốn. Ngoài ra, nồng độ quá thừa của primer cũng d ẫn đến sự hình thành “dimer primer” (Bùi Ch í Bửu,1999). Thông thường, primer xuôi và primer ngược thường có nồng độ bằng nhau, khoảng 0.1 µM tương đương với 2.5pmol trong 25 µl dung d ịch phản ứng. Trình tự DNA nằm giữa h ai mồi “xuôi” và “ngược” không được qu á lớn. Ph ản ứng sẽ tối ưu trên những trình tự DNA nhỏ hơn 1 kb (Hoàng Thị Liễu, 2004). 5- Hàm lượng GC và AG Thành ph ần nucleotide của các primer n ên cân b ằng, tránh cặp GC lặp lại nhiều lần. Hàm lượng GC của primer nên nằm trong khoảng 45% đến 50% (Kwork và ctv., 1990), trình tự primer lý tưởng nhất là có 50% GC (theo nguyên tắc của Wallace). Trình tự primer phải không có poly G hay poly C, poly A hay poly T, vì điều n ày sẽ làm cho sự bắt cặp không đặc hiệu. Trình tự polypyrimidine TC hay polypurine Agcũng cần phải tránh vì nó làm giảm hiệu quả khuếch đại. 6- Trình tự đầu 3’ Vị trí đầu 3’ của primer rất quan trọng trong việc kiểm soát hiện tượng “mismatch” - b ắt cặp không đặc hiệu. Cần tránh trình tự A hay T ở đầu 3’, mà thay vào đó là G hoặc C vì mối liên kết hydro giữa G-C mạnh hơn A-T sẽ bảo đảm cho sự bắt cặp đặc hiệu.
67 2.3.2.4.Nhiệt độ bắt cặp Kỹ thuật PCR rất m ẫn cảm với nhiệt độ. Vì thế b ất cứ sự thay đổi nhiệt độ nào của phản ứng cũng có thể ảnh hướng mạnh đến năng suất và độ chuyên biệt. Suggs và ctv.(1981) đã đề ngh ị một công thức để ước đoán nhiệt độ nóng ch ảy Tm của primer , m à ở nhiệt độ ấy, một nửa các primer sẽ lai với DNA m ục tiêu. Công thức được sử dụng trong điều kiện primer có khoảng 18 -24 base, trong đó hàm lư ợng GC chiếm khoảng 50%: Tm = 4 (G + C) + 2 (A + T) A, T, C, G là số lượng các base có trong oligonucleotide. Khi chiều dài primer từ 14 – 70 base Tms = 81.5 + 16.6(log10[J+]) + 0.41(%G+C) - (600/l) + [J+] : nồng độ mol các cation hoá trị I + (%G+C) : % nucleotide loại G và C Khi chiều dài primer từ 20 - 3 5 base Tmp = 22 + 1.46([2 x (G+C)] + (A+T)) Tuy nhiên, việc tính to án này chỉ có tính chất tạm thời, chúng ta ph ải điều ch ỉnh lại nhiệt độ này để có sự khuếch đại cao nhất và thu nh ận tần suất đa hình cao nhất. Bằng kinh nghiệm và thực hiện xét nghiệm nhiều lần, chúng ta m ới có thể có số liệu đúng về nhiệt độ bắt cặp. Số base càng ít nhiệt độ này càng thấp và ngược lại. Mối quan hệ giữa nhiệt độ bắt cặp Ta và đoán nhiệt độ nóng chảy Tm của primer là một trong những vấn đề vẫn đang được tìm hiểu. Thông thường, nhiệt độ bắt cặp thường thấp hơn nhiệt độ nóng chảy từ 2-5 oC. Nếu nhiệt độ bắt cặp qu á thấp dẫn đến sản phẩm được nhân lên qu á m ức do sự bắt cặp các primer không chuyên biệt có th ể xảy ra. Nếu nhiệt độ bắt cặp quá cao, n ăng su ất của sản phẩm mong muốn sẽ giảm. Nếu primer b ắt cặp một cách ch ính xác với đoạn DNA mẫu, nhiệt độ bắt cặp nên th ấp hơn nhiệt độ lý thuyết Tm k hoảng 5oC. Thông thường, với một oligonucleotide có 20 nucleotide có th ể dùng nhiệt độ bắt cặp 50-55 oC. Nếu chuỗ i
68 dài hơn (25 nucleotide hay nhiều hơn) ho ặc có thể nhiều base G, C, nhiệt độ bắt cặp có thể đến 55-65 oC. Trong vài phản ứng, oligonucleotide lớn (từ 30 bp trở lên), giai đoạn b ắt cặp và kéo d ài có th ể đư ợc kết hợp và thực hiện ở 68-72 oC (Hoàng Th ị Liễu, 2004 ). 2.3.2.5.Tỉ lệ primer/DNA khuôn mẫ u Một trong những yếu tố quan trọng nhất của PCR là tỉ lệ tố i hảo giữa primer DNA mẫu. Nếu tỉ lệ này quá cao, hiện tượng primer-dimer sẽ xuất hiện, giống như trường hợp DNA mẫu quá loãng. Nếu tỉ lệ này quá nhỏ , kết quả sản phẩm PCR sẽ không nhiều. Hầu h ết các trường hợp áp dụng PCR, đều dùng một nồng độ primer không quá 0.5 µM (12.5 pmol/25 µL phản ứng), không tính đ ến nồng độ DNA mẫu, để tránh hiện tượng primer-dimer. 2.3.2.6.Các thành phần khá c  Nồng độ dNTP (các deoxynucleotide triphotphat) Nồng độ d NTP thường được sử dụng là 20-200 µM. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đ ến sự khuếch đại “ký sinh". Bên cạnh đó, sự cân b ằng trong thành phần các dNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Sự mất cân b ằng trong thành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase. Nồng độ dNTP thích hợp nhất cho một phản ứng PCR còn phụ thuộc vào nồng độ Mg2+, nồng độ primer, số lượng chu kỳ của phản ứng và chiều d ài của sản phẩm được khuếch đại. Vì thế, nồng độ dNTP tối ưu cho từng ph ản ứng phải được xác định qua thự c nghiệm.  Nồng độ MgCl2 Nồng độ MgCl2 cũng là một nhân tố ảnh hưởng m ạnh đến phản ứng PCR. Mg2+ rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xú c tác cho enzyme Taq polymerase, làm tăng Tm của DNA mạch kép. Nồng đ ộ Mg2+ th ấp sẽ làm hạn chế quá trình kéo dài. Ngược lại nồng độ Mg2+ cao sẽ giúp ổn đ ịnh d ây đôi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hoàn to àn (do sự mở dây đ ôi DNA) của sản phẩm trong mỗi chu k ỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, có thể làm cho hiện tượng b ắt cặp
69 giả xảy ra ổ n đ ịnh hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mứ c độ chuyên biệt thấp.  Chất ổn định hoạt động enzyme Những ho ạt chất ổn đ ịnh hoạt động enzyme cũng được chú ý. Nhiều nhà sản xuất hoá ch ất đ ã xem xét gelatin hoặc Triston X-100 trong những buffer để tồn trữ enzyme. Có trường hợp người ta sử dụng cả h ai làm dung d ịch đệm. Nhằm bảo qu ản và ổn đ ịnh enzyme trong quá trình xử lý nhiệt của PCR, mỗi dung dịch đệm trong phản ứng đều có chứa gelatin ở nồng độ 0.01% và Triston X-100 ở nồng độ 0.1%.  Dung dịch đệm Một nồng độ cao của dung dịch đệm PCR được sử dụng để tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Sau đây là dung dịch đệm PCR được xem là tốt hơn đối với các đệm đang có mặt trên thị trường  16.6 mM ammoniumsulfate  67.7 mM TRIS-HCl, pH 8.89  10 mM beta-mercaptoethanol  170 microgams/ml BSA  1 .5-3mMMgCl2 2.3.2.7.Số lượng chu kỳ của phản ứng PCR Trong thực tế số chu kỳ cho một phản ứng PCR không nên vượt quá 40. Sở d ĩ như vậy vì p hản ứng PCR diễn tiến qua hai giai đoạn :  Giai đoạn đầu: Số lượng bản sao tăng lên theo cấp số nh ân, tỉ lệ với lượng mẫu ban đ ầu.  Giai đoạn sau: Hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do sự phân hủ y và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế ph ản ứng, hoặc các bản sao vừ a được tổng hợp không kết hợp với mồi m à b ắt cặp với nhau. Số chu kỳ cho một phản ứng PCR tù y thuộc số lượng mẫu DNA ban đ ầu. Nếu số lượng mẫu ban đầu là 105 thì cần 25-30 chu k ỳ . Nếu số lượng mẫu ban đầu là 102-10 3 thì số chu kỳ phải là 35-40 chu kỳ.