70
Mycoplasma hominis Real-time PCR
I. MỤC ĐÍCH VÀ NGUYÊN LÝ
1. Mục đích
Xác định sự có m t DNA c a Mycoplasma hominis trong mẫu bệnh phẩm c a
người.
2. Nguyên lý
Dựa trên nguyên lý kỹ thuật Real-time PCR.
II. CHUẨN BỊ
1. Người thực hiện
- Người thực hiện: Nhân viên xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ
ho c chứng nhận v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
- Người nhận định và phê duyệt kết quả: Người thực hiện có trình độ đại
học ho c sau đại học v chuyên ngành Vi sinh (và/ho c sinh học phân tử/ sinh
học/công nghệ sinh học).
2. Phương tiện, hóa chất (Ví dụ hoặc tương đương)
2.1. Trang thiết bị
- T an toàn sinh học cấp 2
- Máy nhiệt
- Máy ly tâm > 12000 gpm/phút
- Máy ly tâm dùng cho tube 0,2 ml
- Máy vortex
- Máy Real-time PCR
- Ống Eppendorf 1,5 ml ho c 2 ml
- Các loại Micropipette đi u chỉnh được: 1000µl, 200µl, 100µl, 10µl
- Đầu côn có màng lọc 10 μl, 100 μl, 200 μl và 1000 μl
- T lạnh thường
- T âm sâu (200C) ho c (-700C) (nếu có)
2.2. Dụng cụ, hóa chất và vật tư tiêu hao (bao gồm nội kiểm, ngoại kiểm)
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
1
Giấy xét nghiệm
Tờ
2
Dụng cụ lấy bệnh phẩm
Que
71
STT
Chi phí hóa chất, vật tư tiêu hao
Đơn vị
3
Găng không có bột (DNase-RNase free)
Đôi
4
Khay đựng bệnh phẩm
Cái
5
Hộp vận chuyển bệnh phẩm
Test
6
Sinh phẩm chẩn đoán
Test
7
Khấu hao sinh phẩm cho chạy chứng, kiểm tra chất lượng
Test
8
Kit tách chiết DNA
Test
9
Ống Falcon 50 ml
Cái
10
Eppendorf 1,7 ml
Tube
11
Eppendorf 0,2 ml
Tube
12
Đầu côn 10 µl có lọc
Cái
13
Đầu côn 30 µl
Cái
14
Đầu côn 200 µl có lọc
Cái
15
Đầu côn 1ml có lọc
Cái
16
Water-DEPC treated
ml
17
Giấy thấm không bụi
Cuộn
18
Giấy xét nghiệm
Tờ
19
Sổ lưu kết quả xét nghiệm
Tờ
20
Bút viết kính
Cái
21
Bút bi
Cái
22
Mũ
Cái
23
Khẩu trang
Cái
24
Găng tay xử lý dụng cụ
Đôi
25
Quần áo bảo hộ
Bộ
26
Dung dịch xà phòng rửa tay
ml
27
Cồn sát trùng tay nhanh
ml
28
Dung dịch khử trùng
ml
29
Khăn lau tay
Cái
30
Ngoại kiểm (EQAS) (nếu thực hiện)*
* Ghi chú:
72
- Chi phí ngoại kiểm cho quy trình kỹ thuật được tính cụ thể theo Chương trình
ngoại kiểm (EQAS) là 1/200 tổng chi phí dụng cụ, hóa chất, vật tư tiêu hao (với
số lần ngoại kiểm trung bình 2 lần/1 năm).
3. Bệnh phẩm
Dịch cổ tử cung, dịch âm đạo, dịch niệu đạo và một số dịch cơ thể (dịch ngoáy
họng, dịch phết hậu môn) nghi ngờ có căn nguyên do Mycoplasma hominis gây
bệnh.
4. Phiếu xét nghiệm
Đi n đầy đ thông tin theo mẫu phiếu yêu cầu.
III. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Các bước tiến hành thực hiện theo phương tiện, hóa chất được ví dụ trên.
1. Lấy bệnh phẩm
Theo đúng quy định c a chuyên ngành Vi sinh (xem phụ lục).
2. Tiến hành kỹ thuật
2.1. Tách chiết DNA theo hướng dẫn sử dụng c a Kit tách chiết DNA
2.2. Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng PCR
2.3. Cho một lượng mẫu DNA tách chiết được vào các ống phản ứng PCR có
chứa các thành phần cần thiết c a kit
2.4. Chạy phản ứng Real-time PCR theo chu trình nhiệt thích hợp
2.4. Đọc kết quả
IV. NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Bước 1: Kiểm tra chứng âm: Chứng âm phải âm tính.
Bước 2: Kiểm tra chứng dương: Chứng dương phải dương tính.
Bước 3: Xác định mẫu dương tính với Mycoplasma hominis
Bước 4: Xác định mẫu âm tính với Mycoplasma hominis
V. NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
- Phản ứng dương tính giả: do tạp nhiễm từ môi trường
- Phản ứng âm tính giả: do phản ứng PCR bị ức chế
- Để hạn chế các hiện tượng trên phải tuân th ch t chẽ quy trình kỹ thuật.