Tạp chí khoa học: Tối ưu hóa sinh tổng hợp lactase từ Aspergillus oryzae sử dụng phương pháp đáp ứng bề mặt- phương án cấu trúc có tâm

Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 8-16<br /> <br /> T i ưu hóa sinh t ng h p lactase t Aspergillus oryzae s d ng phương pháp áp ng b m t- phương án c u trúc có tâm<br /> Nguy n Thúy Hương*, Mai Th c Di<br /> B môn Công ngh Sinh h c, trư ng i h c Bách Khoa Tp.HCM 268 Lý Thư ng Ki t, Phư ng 14, Qu n 10, Thành ph H Chí Minh<br /> Nh n ngày 11 tháng 12 năm 2012 Ch nh s a ngày 25 tháng 12 năm 2012; ch p nh n ăng ngày 15 tháng 4 năm 2013 Tóm t t. T 6 ch ng n m m c Aspergillus oryzae chúng tôi ã ch n ư c ch ng Aspergillus oryzae BK0 sinh lactase cao nh t. Lên men bán r n (SSF) v i cơ ch t là cám g o và tr u ư c s th c hi n quá trình lên men. Aspergillus oryzae BK0 ã ư c t i ưu hóa quá trình nuôi d ng c y thu ư c s n lư ng lactase c c i. Chúng tôi thi t k thí nghi m theo phương pháp b m t (RSM) – phương án c u trúc có tâm (CCD) ã th c hi n và tìm ra giá tr t i ưu c a 5 y u t lactose (13.3%), (NH4)2SO4 (1.7%), pH (5.94), m (61.04%), t l gi ng (1.05%) cho s n lư ng lactase c c i theo mô hình 4.120 U/g. Chúng tôi th nghi m nuôi c y v i i u ki n c a mô hình và k t qu thu ư c s n lư ng lactase là 3.947 U/g. T khóa: lactase, Aspergillus oryzae, RSM – CCD, solid state fermentation.<br /> <br /> 1. M<br /> <br /> u∗<br /> <br /> Lactase (EC 3.2.1.23) hay còn g i là lactase phlorizin hydrolase ho c lactose galactohydrolase, là m t lo i enzyme thu c h β – galactosidase. Lactase là enzyme xúc tác cho ph n ng th y phân lactose thành β – D – galactose và α - D – glucose và ph n ng galactosyl chuy n hóa các g c β – D – galactosyl c a lactose t o ra galactoseoligosaccharide (GOS). Vì v y, vi c ng d ng lactase là m t trong nh ng ng d ng h a h n nh t trong các enzyme ngành công nghi p th c ph m [1-3]. Trên th gi i ã s n xu t lactase và ng d ng r t r ng rãi trong th c ph m [4]. Tuy<br /> <br /> nhiên Vi t Nam, lactase v n chưa ư c s n xu t v i qui mô công nghi p, ch bư c u nghiên c u qui mô phòng thí nghi m. Lactase có th ư c t o ra t nhi u ch ng n m m c như A. oryzae, A. niger, Aspergillus fonsecaeus, Aspergillus alliaceus. Lactase còn có th t ng h p t các lo i n m men như Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Candida pseudotropicalis. Tuy nhiên lactase t n m m c r t n nh và không c n ion kim lo i (cofactor) cho ho t ng c a mình [5], ng th i n m m c s n xu t enzyme ngo i bào nên d dàng cho vi c thu nh n enzyme. Vì v y, trong nghiên c u này chúng tôi s d ng n m m c Aspergillus oryzae. gi m chi phí s n xu t enzyme thì vi c l c ch n cơ ch t r ti n và s n có cùng v i vi sinh v t s n xu t phù h p, 8<br /> <br /> _______<br /> ∗<br /> <br /> Tác gi liên h . T: 84-966008067. E-mail: nthuong13567@yahoo.com<br /> <br /> N.T. Hương, M.T. Di /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 8-16<br /> <br /> 9<br /> <br /> t i ưu hóa các i u ki n nuôi c y là r t c n thi t. T i ưu hóa quá trình lên men xây d ng mô hình nh m thu ư c s n lư ng l n và gia tăng quy mô s n xu t có m t ý nghĩa quan tr ng trong vi c ng d ng nh ng nghiên c u cơ b n lactase vào trong công nghi p. Các nghiên c u t i ưu hóa ư c th c hi n b ng phương pháp t i ưu ơn y u t không ph n ánh ư c s tương tác l n nhau gi a các y u t và phương pháp t i ưu này không hi n th nh hư ng th c c a các y u t lên ho t tính enzyme. kh c ph c v n này, chúng tôi s d ng phương pháp áp ng b m t RSM t i ưu hóa giá tr các y u t ang ư c nghiên c u. Phương pháp b m t áp ng (RSM) là m t phương pháp s d ng toán h c và th ng kê ư c áp d ng r ng rãi xác nh nh hư ng c a các y u t và t i ưu hóa quá trình lên men sinh h c [6, 7]. RSM ã ư c áp d ng r ng rãi t i ưu thông s quá trình nuôi c y s n xu t lipase [8], tannase [9], α-amylase [10], β-cyclodextrin glucanotransferase [11], lactase [6, 12].<br /> <br /> 2.2. Phương pháp Phương pháp vi sinh. Kh o sát các i u ki n nuôi c y nh hư ng n quá trình lên men b ng phương pháp t i ưu ơn y u t , các k t qu c a thí nghi m trư c là ti n cho thí nghi m ti p theo. Phương pháp hóa sinh Phương pháp thu enzyme thô. Dùng nư c c t pha tr n v i môi trư ng nuôi c y v i t l 1: 4 v th tích nhi t phòng. L c u (180rpm) trong 1h. em h n h p thu ư c l c qua 2 l p v i, ly tâm d ch sau l c 5000 vòng/phút trong 20 phút, ph n d ch thu ư c là enzyme thô [3]. Phương pháp xác nh ho t tính lactase. Ho t tính lactase ư c xác nh d a trên ph n ng v i cơ ch t ONPG, khi cơ ch t này b lactase th y phân s t o ra galactose và onitrophenol (màu vàng). Thành ph n oNP h p th bư c sóng 420nm. Ho t lactase ư c xác nh là lư ng enzyme th y phân 1micromol ONPG thành galactose và o-nitrophenol trong 1 phút 300C trong m t ơn v th tích (ho c 1 ơn v kh i lư ng cơ ch t) [13-15]. 2.3. B trí thí nghi m 2.3.1. Kh o sát kh năng sinh lactase c a 6 ch ng Aspergillus oryzae A.oryzae BK0, BK1, BK2, BK3, BK4, BK5 ư c nuôi trên môi trư ng cơ b n, t l cám/tr u là 3/1, hàm lư ng lactose 12.5%, hàm lư ng amonium sulphate 1.5%, pH 5.5, m 65%, t l gi ng 1%. Sau 5 ngày thu và xác nh ho t tính enzyme lactase. 2.3.2. Thi t k thí nghi m tìm y u t và phương pháp RSM-CCD tâm<br /> <br /> 2. Nguyên li u và phương pháp 2.1. Nguyên li u Ch ng vi sinh v t. 6 ch ng n m m c thu c loài Aspergillus oryzae c a b môn Công ngh Sinh h c – i h c Bách Khoa Thành ph H Chí Minh. Gi ng ư c nuôi trên môi trư ng PGA 300C trong 6 ngày và gi gi ng 40C. Môi trư ng nuôi c y. Môi trư ng gi gi ng PGA. Môi trư ng lên men: môi trư ng bán r n v i t l cám/tr u là 1/3, lactose, amonium sulphate. Hóa ch t ONPG(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) c a Duchefa, Hà Lan.<br /> <br /> thi t k thí nghi m t i ưu b ng mô hình CCD, trư c tiên ta tìm thí nghi m tâm c a 5<br /> <br /> 10<br /> <br /> N.T. Hương, M.T. Di /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 8-16<br /> <br /> y u t c n kh o sát là hàm lư ng lactose, hàm lư ng amonium sulphate, pH, m, t l gi ng theo b ng 2. i m tâm ư c ch n là i m mà ó cho ho t tính enzyme cao nh t khi ta kh o sát t ng y u t riêng l . Sau khi có các i m tâm, ta thi t k thí nghi m theo mô hình CCD, ch n nhân phương án là y u t t ng ph n 25-1 và ư c nghiên c u 5 m c (-α, -1, 0, +1, +α) (B ng 3), có 32 thí nghi m ư c ti n hành (V i α = (5 − 1) = 2 ) [7]. Hàm áp ng ư c ch n là ho t tính enzyme lactase (Y, U/g). Mô hình hóa ư c bi u di n b ng phương trình b c 2: Y = b0 +b1x1 + b2x2 + b3x3 + b4x4 + b5x5 + b12x1x2 + b13x1x3 + b14x1x4 + b15x1x5 + b23x2x3 + b24x2x4 + b25x2x5 + b34x3x4 +b35x3x5 + b45x4x5 + b1x12 + b2x22 + b3x32 + b4x42 + b5x52 Trong ó, Y là s n lư ng lactase (U/g); x1, x2, x3, x4, x5 l n lư t là hàm lư ng lactose, hàm m và t l gi ng; b1, lư ng (NH4)2SO4, pH, b2, b3, b4, b5 là các h s b c 1; b12, b13, b14, b15 , b23, b24, b25, b34, b35, b45 là các h s tương tác c a t ng c p y u t ; x1, x2, x3, x4, x5, x1x2, x1x3, x1x4, x1x5, x2x3, x2x4, x2x5, x3x4, x3x5, x4x5 là các bi n c l p. Tính toán, l p phương trình h i quy, ch n i m t i ưu c a các y u t cho s n lư ng lactase t c c i b ng chương trình<br /> <br /> Design-Expert 8.0.7, t nghi m [7].<br /> <br /> ó áp d ng vào th c<br /> <br /> 2.3.3. ánh giá mô hình th c nghi m Lên men th nghi m mô hình t i ưu và so sánh v i k t qu d oán c a mô hình.<br /> <br /> 3. K t qu 3.1. K t qu tuy n ch n ch ng n m m c t ng h p lactase m nh T 6 ch ng Aspergillus oryzae c a phòng thí nghi m b môn Công ngh Sinh h c i h c Bách khoa Thành ph H Chí Minh, ta thu ư c ch ng Aspergillus oryzae BK0 có kh năng sinh lactase m nh nh t (B ng 1).<br /> B ng 1. K t qu kh o sát kh năng sinh lactase c a 6 ch ng Aspergillus oryzae Ch ng Aspergillus oryzae BK0 BK1 BK2 BK3 BK4 BK5 Ho t tính enzyme lactase (U/g) 3.736 3.293 1.325 0.557 2.279 3.276<br /> <br /> B ng 2. M c kh o sát c a hàm lư ng lactose, nitơ, pH, Các m c M M M M M M c1 c2 c3 c4 c5 c6 Hàm lư ng lactose (% w/w) 7.5 10 12.5 15 17.5 20<br /> <br /> m và t l gi ng pH 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 55 60 65 70 75 80<br /> <br /> tìm thí nghi m t i tâm m T l gi ng (%w/w) 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 2<br /> <br /> Hàm lư ng (NH4)2SO4 (%w/w) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0<br /> <br /> N.T. Hương, M.T. Di /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 8-16<br /> <br /> 11<br /> <br /> B ng 3. N ng Bi n x1 x2 x3 x4 x5 Nhân t<br /> <br /> 5 y u t dùng trong RSM – CCD H s mã hóa và t nhiên tương ng -1 0 1 -α α 10 12.5 15 17.5 20 0,5 1 1,5 2 2,5 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 55 60 65 70 75 0,5 0,75 1,0 1,25 1,5 t i ưu hóa s n lư ng lactase Ho t tính lactase (U/g) – 5 ngày x5 1.25 0.75 0.75 1.25 0.75 1.25 1.25 0.75 0.75 1.25 1.25 0.75 1.25 0.75 0.75 1.25 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 0.50 1.50 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 Th c nghi m 0.662 0.127 0.129 0.951 3.927 0.803 3.879 0.694 0.856 0.934 0.261 0.24 1.936 3.825 1.134 0.515 1.489 0.635 2.607 0.44 0.396 2.76 2.098 1.04 0.511 0.953 3.796 3.779 3.721 3.727 3.798 3.716 Suy t mô hình 0.715 0.120 0.1100 0.915 3.880 0.780 3.798 0.625 0.803 0.925 0.277 0.204 1.899 3.789 1.099 0.431 1.513 0.707 2.666 0.514 0.480 2.810 2.160 1.112 0.532 0.987 3.721 3.721 3.721 3.721 3.721 3.721<br /> <br /> Hàm lư ng lactose (% w/w) Hàm lư ng (NH4)2SO4 (% w/w) pH m (%) T l gi ng (%)<br /> <br /> B ng 4. K ho ch th c hi n RSM – CCD Môi trư ng cơ b n x1 12.50 17.50 12.50 17.50 12.50 17.50 12.50 17.50 12.50 17.50 12.50 17.50 12.50 17.50 12.50 17.50 10.00 20.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 15.00 x2 1.00 1.00 2.00 2.00 1.00 1.00 2.00 2.00 1.00 1.00 2.00 2.00 1.00 1.00 2.00 2.00 1.50 1.50 0.50 2.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 x3 5.00 5.00 5.00 5.00 6.00 6.00 6.00 6.00 5.00 5.00 5.00 5.00 6.00 6.00 6.00 6.00 5.50 5.50 5.50 5.50 4.50 6.50 5.50 5.50 5.50 5.50 5.50 5.50 5.50 5.50 5.50 5.50 x4 60.00 60.00 60.00 60.00 60.00 60.00 60.00 60.00 70.00 70.00 70.00 70.00 70.00 70.00 70.00 70.00 65.00 65.00 65.00 65.00 65.00 65.00 55.00 75.00 65.00 65.00 65.00 65.00 65.00 65.00 65.00 65.00<br /> <br /> Thí nghi m 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32<br /> <br /> 12<br /> <br /> N.T. Hương, M.T. Di /Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, Tập 29, Số 3 (2013) 8-16<br /> <br /> 3.2. K t qu thí nghi m tâm c a mô hình CCD t i ưu hóa lư ng lactase Sau khi t i ưu t ng y u t riêng l b ng phương pháp c i n tìm i m t i tâm c a mô hình CCD, ta thu ư c k t qu như b ng 5. Các i m t i tâm là hàm lư ng lactose 15%, hàm lư ng amonium sulphate 1.5%, pH 5.5, m 65% và t l gi ng 1%. Theo S. Nizamuddin và c ng s (2008) thì hàm lư ng lactose b sung là 12.5%. Trong nghiên c u c a nhóm<br /> <br /> c ng s này, môi trư ng nuôi c y có b sung thêm glucose vì v y có s sai khác v i k t qu c a chúng tôi. K t qu pH 5.5. phù h p v i nghiên c u c a S.Mirdamadi và c ng s (1997), theo nhóm tác gi này pH t i ưu c a A. oryzae t 4.5 n 5.4. m c a môi trư ng nuôi c y theo nghiên c u c a S. Nizamuddin và c ng s (2008) là 90%, i u này có th gi i thích vì môi trư ng bán r n trong nghiên c u c a nhóm tác gi này t l cám g o và tr u là 1:1.<br /> <br /> B ng 5. K t qu kh o sát các i m t i tâm c a mô hình CCD Các m c Ho t tính Hàm lactase lư ng (U/g) lactose (% w/w) 7.5 0.821 10 12.5 15 17.5 20 1.760 3.717 3.794 2.795 1.740 Hàm lư ng ngu n nitơ (%w/w) 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Ho t tính pH Ho t tính lactase lactase (U/g) (U/g) 1.206 2.732 3.791 2.660 1.603 1.010 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 0.859 1.596 3.779 2.491 2.428 2.296 T l Ho t tính lactase gi ng (U/g) (% w/w) 1.830 2.792 3.793 2.469 1.589 1.101<br /> 0<br /> <br /> m<br /> <br /> M c1 M M M M M c2 c3 c4 c5 c6<br /> <br /> 55 60 65 70 75 80<br /> 6<br /> <br /> 0.5 0.75 1.0 1.25 1.5 2<br /> <br /> Ho t tính lactase (U/g) 1.830 2.792 3.793 2.469 1.589 1.101<br /> <br /> 3.3. T i ưu hóa giá tr các y u t nh hư ng n s n lư ng lactase b ng phương pháp RSM -CCD Sau khi có các i m tâm, th c hi n thí nghi m theo RSM – CCD, x lý b ng Design expert 8.0.7. Giá tr hàm áp ng theo th c nghi m và tiên oán theo mô hình ư c trình bày trong b ng 4. D a vào s li u th ng kê ta phân tích nh ng y u t nh hư ng n k t qu t i ưu so v i k t qu tâm phương án theo tiêu chu n Student.<br /> B ng 6. Phân tích thí nghi m N0 1 2 3 4 5 6 tâm phương án<br /> 0<br /> <br /> ∑(y<br /> 2 Sth = u =1<br /> <br /> − y )2 = 0.0015 ,<br /> <br /> 0<br /> <br /> N0 −1<br /> <br /> Sb j =<br /> <br /> 2 Sth = 0.0069 N<br /> <br /> V i N0 là s thí nghi m thí nghi m Tra b ng Student: t p ( f ) v i p = 0,05;<br /> <br /> tâm, N là t ng s<br /> <br /> y<br /> <br /> u 0<br /> <br /> y<br /> <br /> 0<br /> <br /> y −y<br /> <br /> 0<br /> <br /> (y − y )<br /> 0.0016 0.0005 0.0012 0.0009 0.0018 0.0016<br /> <br /> 0<br /> <br /> 0 2<br /> <br /> f = N 0 − 1 = 5 ; t0.05 (5) = 2.015<br /> Tính ý nghĩa ư c tính theo công th c<br /> <br /> 3.796 3.779 3.721 3.727 3.798 3.716<br /> <br /> 3.756<br /> <br /> 0.040 0.023 -0.035 -0.029 0.042 -0.040<br /> <br /> tj =<br /> <br /> bj Sbj<br /> <br />