Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
154
ỨNG DỤNG GIẢI TRÌNH TỰ THẾ HỆ MỚI
TÌM PHỔ ĐỘT BIẾN GENE EGFR TRÊN MẪU SINH THIẾT LỎNG
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ PHỔI KHÁNG ERLOTINIB
Nguyễn Hưng Long*, Trần Phủ Mạnh Siêu**,****, Trương Thiên Phú***, Trần Vũ Uyên*, Lương Bắc An****,
Lê Gia Hoàng Linh****, Hồ Quốc Chương****, Nguyễn Thành Luân*, Nguyễn Văn Thiện Chí*, Võ Thanh Bình*,
Nguyễn Thị Quỳnh Thơ*, Đỗ Thị Thanh Thủy*, Trần Diệp Tuấn****, Giang Hoa*, Nguyễn Hoài Nghĩa****
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Điều trị trúng đích là lựa chọn hàng đầu nhằm tăng cường thời gian và chất lượng cuộc sống
cho bệnh nhân ung thư nói chung và bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn tiến triển nói riêng. Sử
dụng mô khối u để phân tích di truyền phục vụ cho điều trị bị hạn chế trong nhiều trường hợp, đặc biệt là ở giai
đoạn ung thư tiến triển, di căn. Sử dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới trên mẫu sinh thiết lỏng giúp tìm
ra phổ đột biến xảy ra ở bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ kháng Erlotinib (EGFR-TKI thế hệ 1) là một
bước tiến mới, góp phần trong việc theo dõi điều trị ung thư ở Việt Nam.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phương pháp giải trình tự thế hệ mới trên mẫu sinh thiết lỏng
được sử dụng để tìm phổ đột biến. Mẫu máu từ 60 bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ được xác định
kháng với Erlotinib được tuyển chọn từ 1/2019 đến 5/2020.
Kết quả: Kết quả phân tích gene EGFR cho thấy 34 trường hợp xuất hiện đột biến, chiếm 56,7% tổng số
trường hợp khảo sát. Trong đó, có 22 trường hợp xuất hiện 1 đột biến, 9 trường hợp có 2 đột biến, 3 trường hợp
xuất hiện đồng thời 3 đột biến. Đột biến kháng thuốc T790M có tần suất xuất hiện cao nhất chiếm tỉ lệ 22,5%.
Các đột biến kháng thuốc hiếm gặp khác cũng được phát hiện bao gồm E709K, A750P, S768I và G719C chiếm
tổng tỉ lệ 10,2%. Ngoài ra, các đột biến nhạy thuốc bao gồm mất đoạn exon 19 và đột biến điểm L858R cũng còn
tồn tại trong nhóm bệnh nhân kháng thuốc này.
Kết luận: T790M là đột biến phổ biến nhất trong việc kháng thuốc EGFR TKI thế hệ I. Sinh thiết lỏng có thể
được thực hiện trong quản lý lâm sàng như trong chẩn đoán, quá trình điều trị. Giải trình tự thế hệ mới giúp
phát hiện các dấu ấn sinh học phân tử tiềm năng giúp dự đoán chính xác hơn về phản ứng với TKI trong điều trị
đầu tay hoặc kết hợp với các thuốc khác.
Từ khoá: ctDNA, NGS, cfDNA
ABSTRACT
APPLICATION OF MASSIVELY PARALLEL SEQUENCING
FOR IDENTIFICATION OF EGFR GENE MUTATION SPECTRUM IN LIQUID BIOPSY SAMPLES
OF ERLOTINIB-RESISTANT LUNG CANCER PATIENTS
Nguyen Hung Long, Tran Phu Manh Sieu, Truong Thien Phu, Tran Vu Uyen, Luong Bac An,
Le Gia Hoang Linh, Ho Quoc Chuong, Nguyen Thanh Luan, Nguyen Van Thien Chi, Vo Thanh Binh,
Nguyen Thi Quynh Tho, Do Thi Thanh Thuy, Tran Diep Tuan, Giang Hoa, Nguyen Hoai Nghia
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 3 - 2020: 154 - 159
Background: For cancer patients in general and those with advanced non-small-cell lung cancer in
*Viện Di Truyền Y Học Thành phố Hồ Chí Minh **Bệnh viện Nguyễn Trãi Thành phố Hồ Chí Minh
***Bệnh viện Chợ Rẫy Thành phố Hồ Chí Minh ****Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Hoài Nghĩa ĐT: 0932390734 Email: nhnghia81@gmail.com
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
Nghiên cứu
B – Khoa học Dược
155
particular, targeted therapy is the first choice of treatment for improving their lifespan and quality of life. In many
cases, carrying out genetic analysis on tumor tissue for treatment has its limitations, especially for advanced,
metastatic cancer. Implementing massively parallel sequencing to determine the mutation spectrum in liquid
biopsy samples of non-small-cell lung cancer patients who are Erlotinib (first generation EGFR-TKI) resistant is
an advancement contributing to cancer treatment in Vietnam.
Methods and sample selection: Massively parallel sequencing was used to identify the mutation
spectrum. Blood samples from 60 non-small-cell lung cancer with confirmed Erlotinib resistance were chosen
from January 2019 to May 2020.
Results: Genetic analysis for EGFR gene showed 34 cases with mutations present, which accounted for
56.7% of cases examined. Amongst them, there were 22 cases with one mutation, 9 cases with two mutations and
3 cases with three mutations present at the same time. T790M-resistant mutation was present at the highest
frequency and was responsible for 22.5%. Other rare drug-resistant mutations were also identified, including
E709K, A750P, S768I and G719C, taking up 10.2%. Furthermore, drug-sensitive mutations including exon 19
deletion and L858R point mutation were still found in the above-mentioned drug-resistant patients.
Conclusion: T790M is the most common mutation in first-generation EGFR TKI resistance. Liquid biopsy
could be used in clinical management, such as during cancer diagnosis and treatment. Massively parallel
sequencing assists with the discovery of potential molecular biomarkers, which allows more accurate predictions
regarding reactions to TK1 during primary treatment or when used in conjunction with other medication.
Keywords: ctDNA (circulating tumor DNA), cfDNA (circulating free DNA), NGS
ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo GLOBOCAN 2018, ung thư phổi là loại
ung thư có tỉ lệ mắc mới và tỉ lệ tử vong hàng
đầu trên thế giới(1). Trong đó, ung thư phổi
không tế bào nhỏ (non-small-cell lung cancer -
NSCLC) chiếm tỉ lệ 80 - 85% các trường hợp ung
thư phổi. Trong chẩn đoán, theo dõi điều trị ung
thư, mô khối u vẫn là tiêu chuẩn vàng. Tuy
nhiên, việc phân tích di truyền từ mô u vẫn gặp
những thách thức: Sự không đồng nhất về di
truyền giữa các vùng khác nhau trong cùng khối
u, giữa khối u di căn và khối u nguyên phát
trong cùng bệnh nhân; Bị giới hạn khả năng tiếp
cận để sinh thiết trong chẩn đoán cũng như
trong quá trình điều trị; Tình trạng sức khoẻ
của bệnh nhân cũng có thể hạn chế sinh thiết
mô; Sinh thiết mô làm tăng chi phí chăm sóc
bệnh nhân.
Sinh thiết lỏng (Liquid Biopsy) là phương
pháp mới được sử dụng trong chẩn đoán,
theo dõi điều trị ung thư và khắc phục được
những yếu điểm của việc sinh thiết mô. Sinh
thiết lỏng được phát triển dựa trên nguyên
tắc phát hiện sự hiện diện của những phân
mảnh DNA ngoại bào (cell free DNA -
cfDNA) được phóng thích từ tế bào ung thư
vào máu ngoại biên. Thay vì dựa trên các
phương pháp sinh thiết mô u gây đau đớn
và ảnh hưởng đến sức khỏe bệnh nhân, việc
phát hiện các đột biến đặc hiệu của khối u có
thể được phát hiện dựa trên việc lấy 5-10 ml
máu ngoại biên của bệnh nhân. Sinh thiết
lỏng cho phép thu mẫu nhanh chóng, ít ảnh
hưởng đến sức khỏe của bệnh nhân. Nhờ đó
có thể phát hiện, theo dõi được sự xuất hiện
và phát triển của các loại đột biến xảy ra
trong quá trình điều trị của bệnh nhân.
Trong điều trị ung thư, hoá trị, xạ trị và phẫu
thuật là những phương pháp điều trị phổ biến.
Hiện nay, việc sử dụng EGFR-TKIs (EGFR
tyrosine kinase inhibitors) làm thuốc điều trị đầu
tay đã trở thành tiêu chuẩn trong điều trị đối với
bệnh nhân NSCLC có đột biến gene EGFR(2,3). Ở
những bệnh nhân NSCLC tiến triển có đột biến
EGFR, việc sử dụng Erlotinib sau đó là Cisplatin
- Gemcitabine đã cho thấy lợi ích sống còn tốt
hơn so với phương pháp hóa trị liệu sau đó mới
sử dụng Erlotinib(4).
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
156
Các thuốc EGFR-TKIs liên kết thuận nghịch
với vị trí gắn ATP của miền Tyrosin kinase nội
bào của EGFR, do đó cản trở quá trình tự
phosphoryl hóa của EGFR và kích hoạt các
đường dẫn tín hiệu xuôi dòng. Với đặc tính này,
EGFR-TKI thế hệ 1,2 trong vài năm là lựa chọn
tiêu chuẩn trong điều trị đối với bệnh nhân
NSCLC giai đoạn tiến triển có đột biến EGFR(5,6).
Phần lớn các khối u này ban đầu đáp ứng với các
thuốc EGFR-TKIs, nhưng sau đó đã phát triển và
đề kháng với trị liệu, với thời gian trung bình là
9 tháng(7).
Đã có những báo cáo trước đây, khoảng
60% các trường hợp kháng thuốc mắc phải với
TKIs thế hệ I (Erlotinib) là do đột biến trên
gene EGFR p.T790M ở exon 20(8,9). Vậy còn ở
Việt Nam thì như thế nào? Để trả lời câu hỏi
trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm phổ
đột biến gene EGFR ở bệnh nhân Việt Nam
mắc ung thư phổi không tế bào nhỏ có kháng
Erlotinib bằng phương pháp giải trình tự thế
hệ mới trên mẫu sinh thiết lỏng.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn các
bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ
(NSCLC) kháng Erlotinib sau ít nhất 6 tháng đáp
ứng điều trị với thuốc. Bệnh nhân tham gia
nghiên cứu thỏa mãn các điều kiện sau: (i) bệnh
nhân đồng ý tự nguyện tham gia nghiên cứu sau
khi được tư vấn rõ các điều kiện và nguy cơ khi
tham gia nghiên cứu; (ii) bệnh nhân được chẩn
đoán NSCLC giai đoạn III – IV; (iii) bệnh nhân
có xuất hiện kháng Erlotinib - dựa trên chẩn
đoán của bác sỹ điều trị; (iv) bệnh nhân không
truyền máu trong vòng 3 tháng trước khi tham
gia nghiên cứu. Tiêu chí loại ra khi bệnh nhân
không đáp ứng được tiêu chí chọn mẫu. Bệnh
nhân được tuyển chọn từ Bệnh viện ung thư
quốc gia và Bệnh viện quận Thủ Đức trong thời
gian từ 1/2019 đến 5/2020.
Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu loạt
trường hợp.
Các bước tiến hành
5-10 ml máu của bệnh nhân được thu giữ
trong ống Streck, sau đó được quay ly tâm 2 lần
(2000 x g trong 10 phút và 16.000 x g trong 10
phút). Huyết thanh thu được được bảo quản
ở -80 oC. cfDNA được tách chiết bằng bộ hoá chất
MagMAX Cell-Free DNA Isolation kit (Thermo
Fisher, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
cfDNA tách chiết được chuẩn bị thư viện bằng bộ
hoá chất Accel-NGS 2S DNA Library Kit (Swift
Biosciences, USA) theo hướng dẫn của nhà sản
xuất. Nồng độ của thư viện được định lượng
bằng hệ thống QuantiFluor dsDNA (Promega,
USA). 150 ng sản phẩm từ bước tạo thư viện của
mỗi mẫu sẽ được trộn lại và được tiến hành lai
với hỗn hợp mẫu dò đặc hiệu cho gene EGFR
mục tiêu - quy trình sử dụng theo bộ hoá chất
xGen Lockdown Reagents. Việc giải trình tự được
thực hiện trên hệ thống Illumina NextSeq 550 với
NextSeq 500/550 High output kits v2 (150 cycles),
có độ phủ trung bình 10,000 X.
Y đức
Được chấp thuận bởi hội đồng Y Đức Đại
học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh số
199/ĐHYD-HĐĐĐ ngày 17/4/2019 và có mã số
nghiên cứu 108.01-2017.306/ Nafosted) .
KẾT QUẢ
Trong nghiên cứu này, chúng tôi thu thập
mẫu từ 60 bệnh nhân mắc ung thư phổi không tế
bào nhỏ được chẩn đoán kháng erlotinib sau ít
nhất 6 tháng đáp ứng điều trị với thuốc. Trong
đó, tỉ lệ nam nữ là 1:1; có độ tuổi trung bình 58,9
và trung vị là 61. Phân loại theo chẩn đoán lâm
sàng thì ung thư phổi có 33 ca, ung thư phế quản
có 22 ca, chiếm tỉ lệ lần lượt 55%, 36,7% (Bảng 1).
Kết quả phân tích gene EGFR cho thấy 34
trường hợp xuất hiện đột biến, chiếm 56,7% tổng
số trường hợp khảo sát. Trong đó, có 22 trường
hợp xuất hiện 1 đột biến, 9 trường hợp có 2 đột
biến, 3 trường hợp xuất hiện đồng thời 3 đột
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
Nghiên cứu
B – Khoa học Dược
157
biến (Bảng 2). Trong tổng số 49 các đột biến trên
gene EGFR ở nghiên cứu này, các đột biến nhạy
với thuốc ức chế tyrosine kinase thế hệ I là mất
đoạn exon 19 (del19) và đột biến điểm L858R
được ghi nhận lần lượt là 21 và 12 trường hợp,
tương ứng với tần suất lần lượt là 43% và 24,5%
tổng số đột biến xuất hiện.
Đối với đột biến kháng thuốc, T790M vẫn là
đột biến phổ biến nhất, chiếm tỉ lệ 22,4% (11/49).
Thêm vào đó, bằng phương pháp giải trình tự
thế hệ mới, chúng tôi còn phát hiện được các đột
biến hiếm gặp khác bao gồm E709K, A750P,
S768I và G719C với tần suất đột biến lần lượt là
2%, 1%, 1% và 1% (Hình 1).
Bảng 1. Sự khác biệt trong phát hiện đột biến EGFR
theo tuổi, giới, hút thuốc, lâm sàng, giải phẫu bệnh
(n=60)
Thông tin lâm sàng
Tỉ lệ %
Tuổi TV (TPV)
Giới
Nam
46,7
Nữ
50,0
NA
3,3
Hút thuốc
Có
13,3
Không
36,7
NA
50
Chẩn đoán
Ung thư phổi
Ung thư phế quản
Ung thư phế quản – phổi
NA
55
36,7
1,7
6,6
Giải phẫu bệnh
ACC
SCC
NA
70
1,7
28,3
Bảng 2.Tỉ lệ đột biến gene EGFR (n = 60)
Tần số
Tỉ lệ (%)
EGFR
+
34
56,7
-
26
43,3
Số đột biến xuất hiện trên mỗi BN
1
22
36,7
2
9
15,0
3
3
5,0
[]
E709K
13%
A750P
6%
S768I
6%
G719C
6%
T790M
E709K
A750P
S768I
G719C
Hình 1. Phân bố tỉ lệ loại đột biến kháng chất ức chế tyrosine kinase (EGFR- TKI) (n=16)
BÀN LUẬN
Một số thử nghiệm lâm sàng đã chỉ ra rằng
bệnh nhân mắc ung thư phổi đột biến gene
EGFR có được các đáp ứng lâm sàng vượt trội
khi được điều trị bằng EGFR-TKIs so với hóa trị
liệu(10-12). Những nghiên cứu trước đây cho thấy,
đột biến mất đoạn ở exon 19 (Del 19) và đột biến
L858R ở exon 21 chiếm tỉ lệ 85% đến 90% của tất
Nghiên cứu
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 3 * 2020
158
cả các đột biến EGFR(13). Tần số của đột biến
T790M là 4,2% trong số 437 bệnh nhân được
khảo sát trong thử nghiệm ngẫu nhiên IPASS ở
người châu Á và ít hơn 3% ở người da trắng(10,13).
Ở bệnh nhân kháng EGFR-TKIs thế hệ I-II,
T790M là loại đột biến trên gene EGFR thường
gặp nhất. Gần đây, một nghiên cứu của Trung
Quốc và một nghiên cứu ở Ý đã xác định đột
biến mắc phải T790M lần lượt là 13,8%, và
6,8%(14,15). Trong nghiên cứu của Roberta Minari
và cộng sự, tỉ lệ đột biến T790M được phát hiện
là 25,8% (31/120) khi sử dụng phương pháp sinh
thiết lỏng(16).
Với độ nhạy và độ đặc hiệu >80% so với kết
quả phân tích trên mẫu mô u(17), sinh thiết lỏng
ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong chẩn
đoán và theo dõi điều trị ung thư, nhất là trong
những trường hợp không thể sinh thiết được
mô u. Trong công bố của Bing Wei và cộng sự
cho thấy sự tương đồng về tỷ lệ phát hiện đột
biến T790M khi sử dụng phương pháp sinh thiết
mô và sinh thiết lỏng là 53,1% (119/224) và 48,1%
(89/185) (Bảng 3)(18). Hiện nay, Cục Quản lý Thực
phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) và Hiệp hội
Y tế Châu Âu đã phê duyệt việc sử dụng và có
hướng dẫn về các phương thức phát hiện đột
biến gene EGFR, bao gồm các mẫu sinh thiết
lỏng, để theo dõi và quyết định sự phù hợp của
điều trị TKI cho bệnh nhân(19).
Bảng 3. Kết quả phát hiện T790M ở bệnh nhân NSCLC
Phương pháp
Số mẫu
T790M
dương tính
T790M
âm tính
P-value
Sinh thiết mô
224
119
105
0,312
Sinh thiết lỏng
185
89
96
Liên quan đến các đột biến trên gen EGFR ít
phổ biến hơn, có những nghiên cứu cho thấy
một số những đột biến này có thể có liên quan
đến kháng với TKI, những bệnh nhân ung thư
phổi không tế bào nhỏ có mang đột biến hiếm
gặp ở exon 18 G719X (G719C, G719S, G719A
hoặc G719D), đột biến S768I ở exon 20, hoặc
đột biến L861Q ở exon 21 (thường chiếm tỉ lệ
từ 1-8%) sẽ kháng hoặc phản ứng kém với
erlotinib; đồng thời ở những bệnh nhân mang
đột biến này còn cho thấy thời gian sống ngắn
hơn khi so sánh với các bệnh nhân mang đột
biến nhạy thuốc Del 19 hoặc L858R(20,21).
Hiện đã có bằng chứng thuyết phục cho việc
sử dụng DNA ngoại bào (cell free DNA- cfDNA)
được phân lập từ huyết tương để xác định kiểu
gene bằng kỹ thuật PCR hoặc giải trình tự thế hệ
mới (NGS). Đây là công cụ thích hợp để đánh
giá sự xuất hiện của đột biến kháng thuốc
T790M và các đột biến không đáp ứng TKI khác
ở giai đoạn đầu hay trong quá trình điều trị ở
bệnh nhân, có khối u không đồng nhất hoặc
không thể sinh thiết mô(19). Với việc giải trình tự
toàn bộ vùng mã hoá của gen cũng như giải
trình tự đồng loạt nhiều gen, công nghệ giải
trình tự thế hệ mới có ưu điểm rất lớn so với
PCR trong việc phát hiện những đột biến mới,
chưa biết. Các hướng dẫn quốc tế được cập nhật
hiện nay khuyến cáo rằng các bệnh nhân ung
thư phổi không tế bào nhỏ có mô học ung thư
biểu mô tuyến hoặc những người có mô học hỗn
hợp bao gồm một thành phần ung thư tuyến,
bệnh nhân trẻ tuổi và bệnh nhân không có tiền
sử hút thuốc lá, nên được xét nghiệm đột biến
gene EGFR, dung hợp gen ALK và ROS1 để
xác định các thuốc đặc hiệu TKIs trong điều trị
đầu tay(22,23).
KẾT LUẬN
Với công nghệ giải trình tự thế hệ mới
trên 60 mẫu sinh thiết lỏng của bệnh nhân
ung thư phổi kháng erlotinib, chúng tôi thấy
đột biến kháng thuốc T790M vẫn là đột biến
phổ biến nhất. Đồng thời, nghiên cứu cũng
phát hiện các đột biến kháng thuốc hiếm gặp
khác bao gồm E709K, A750P, S768I và
G719C. Điều này cho thấy ưu điểm của kỹ
thuật giải trình tự thế mới với khả năng khảo
sát toàn bộ các đột biến mới trên gen, cũng
như khả năng mở rộng khảo sát đồng thời
nhiều gen, mang đến giá trị lớn trong hỗ trợ
điều trị và phát hiện các đột biến kháng
thuốc. Nghiên cứu cũng cho thấy khả năng