TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 478 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2019
73
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Trần Nguyễn Thu Thủy (2016), "Đánh giá thang
điểm TIMI và GRACE trong dự đoán mức độ bệnh
động mạch vành ở bệnh nhân nhồi máu cơ tim cấp
không ST chênh lên", Đại học Y học Phạm Ngọc
Thạch. Luận Văn Thạc Sỹ Y học.
2. Cakar M. A., Sahinkus S., Aydin E. et al.
(2014), "Relation between the GRACE score and
severity of atherosclerosis in acute coronary
syndrome", J Cardiol. 63 (1), pp. 24-28.
3. de Araujo Goncalves P., Ferreira J., Aguiar C.
et al. (2005), "TIMI, PURSUIT, and GRACE risk
scores: sustained prognostic value and interaction
with revascularization in NSTE-ACS", Eur Heart J.
26 (9), pp. 865-872.
4. Go A. S., Mozaffarian D., Roger V. L. et al.
(2013), "Heart disease and stroke statistics--2013
update: a report from the American Heart
Association", Circulation. 127 (1), pp. e6-e245.
5. Mahmood M., Achakzai A. S., Akhtar P. et al.
(2013), "Comparison of the TIMI and the GRACE
risk scores with the extent of coronary artery
disease in patients with non-ST-elevation acute
coronary syndrome", J Pak Med Assoc. 63 (6), pp.
691-695.
6. Neeland I. J., Patel R. S., Eshtehardi P. et al.
(2012), "Coronary angiographic scoring systems:
an evaluation of their equivalence and validity", Am
Heart J. 164 (4), pp. 547-552.e541.
7. Roffi M., Patrono C., Collet J. P. et al. (2016),
"2015 ESC Guidelines for the management of acute
coronary syndromes in patients presenting without
persistent ST-segment elevation: Task Force for
the Management of Acute Coronary Syndromes in
Patients Presenting without Persistent ST-Segment
Elevation of the European Society of Cardiology
(ESC)", Eur Heart J. 37 (3), pp. 267-315.
8. Barbosa C. E., Viana M., Brito M. et al. (2012),
"Accuracy of the GRACE and TIMI scores in
predicting the angiographic severity of acute
coronary syndrome", Arq Bras Cardiol. 99 (3), pp.
818-824.
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REALTIME-PCR XÁC ĐỊNH ĐỘT BIẾN GEN
BRAF V600E TỪ MẪU MÁU VÀ MẪU MÔ PHỦ PARAFIN
Ở BỆNH NHÂN UNG THƯ TUYẾN GIÁP
Bùi Thị Lành*, Nguyễn Thị Trang*
TÓM TẮT20
BRAF là gen tổng hợp protein B-raf chịu trách
nhiệm kiểm soát hoạt động phát triển và phân chia
của nhiều loại tế bào trong cơ thể. Đột biến gen BRAF
làm cho các tế bào bất thường này nhân lên một cách
không kiểm soát và hình thành ung thư. Theo nhiều
nghiên cứu, đột biến tại codon 600 của exon 15
(V600E) là đột biến phổ biến nhất trên gen BRAF. Đột
biến này là nguyên nhân dẫn đến nhiều bệnh ung thư
trong đó có ung thư tuyến giáp. Mục tiêu: Hoàn
thiện kỹ thuật realtime-PCR để xác định đột biến gen
BRAF V600E ở mẫu máu và mẫu mô phủ parafin của
bệnh nhân ung thư tuyến giáp. Đi tưng và
phương pháp nghiên cu: 50 mẫu máu và 21 mẫu
mô phủ parafin của bệnh nhân ung thư tuyến giáp, 21
mẫu chứng của người khỏe mạnh bình thường. Sử
dụng kỹ thuật REALTIME PCR để xác định đột biến
gen BRAF V600E từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin.
Kết quả: Tỷ lệ xuất hiện đột biến ở mẫu máu là 4%
(2 trường hợp dị có kết quả dị hợp tử); mẫu mô là
33,33% trong đó 4,76% là đồng hợp tử, 28,57% là dị
hợp tử. Trong khi đó ở nhóm chứng không ghi nhận
bất kỳ trường hợp nào mang alen đột biến. Kiểu gen
DHT+ĐHT có nguy cơ gây bệnh ung thư tuyến giáp
*Trường Đại học Y Hà Nội
Chịu trách nhiệm chính: Nguyn Thị Trang
Email: trangnguyen@hmu.edu.vn
Ngày nhận bài: 2.3.2019
Ngày phản biện khoa học: 18.4.2019
Ngày duyệt bài: 23.4.2019
cao gấp 22 lần so với kiểu gen bình thường. Kết
luận: Hoàn thiện thành công quy trình kỹ thuật
REALTIME-PCR để xác định đột biến gen BRAFV600E
từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh nhân ung
thư tuyến giáp.
Từ khóa:
Ung thư tuyến giáp, Realtime-PCR,
BRAF V600E
SUMMARY
REALTIME-PCR APPLICATION FOR
DETERMINING MUTATION V600E OF GENE
BRAF FROM BLOOD SAMPLE AND PARAFIN
EMBEDDED TISSUE SAMPLE IN THYROID CANCER
Background: BRAF gene is known as a tumor
suppressor gene in Thyroid cancer (TC), which plays a
role in DNA repair. The mutation in BRAF have been
associated with different types of cancer. The present
study was aimed at studying the association between
BRAF V600E mutation and TC. Material and
method: Peripheral blood was collected from 50
patients and 50 normal healthy controls into a test
tube containing EDTA were extracted by DNA-express
and 21 tissue samples were removed parafin by
xylene, extracted DNA by Qiagen kit. We analyzed
mutations V600E within BRAF gene in 71 patients with
TC and 21normal healthy controls according to
Realtime -PCR by BRAF V600E kit (Rusian). Results:
The prevalence of mutation V600E in BRAF was 4.0%
and 33,33%, from blood samples and tissue
respectively. In the control group, no mutation was
reported. The heterozygous and homozygous
vietnam medical journal n01 - MAY - 2019
74
genotypes is 22 times more likely to cause thyroid
cancer than a normal gene. Conclusion: Successful
completion of the Realtime-PCR technique to identify
mutation BRAF V600E in thyroid cancer patient.
Keywords:
Thyroid cancer, Realtime-PCR, BRAF
V600E.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư tuyến giáp là bệnh ác tính thường
gặp nhất trong số các bệnh nhân ung thư tuyến
nội tiết (90%) và khoảng 1% các loại ung thư
nói chung. BRAF là gen tiền ung thư nằm trên
nhánh dài nhim sắc thể số 7. Đột biến gen
BRAF tại codon 600 của exon 15 (V600E) được
phát hiện với tỷ lệ cao trong ung thư tuyến giáp
thể nhú, đột biến này làm tín hiệu nội bào theo
con đường MAPK/ERK được kích hoạt mạnh mẽ,
giúp tế bào ung thư tăng sinh, biệt hóa, kháng
chết theo chương trình [1]. Những bệnh nhân
ung thư tuyến giáp mang đột biến BRAF V600E
có tỷ lệ tái phát và di căn cao, tiên lượng kém
hơn, tỷ lệ sống còn thấp hơn [2].
Mục đích nghiên cứu:
Hoàn thiện kỹ thuật
Realtime-PCR xác định đột biến gen BRAF V600E
từ mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh
nhân ung thư tuyến giáp.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đi tưng nghiên cu
Nhóm bệnh:
là 71 bệnh nhân đã được chẩn
đoán ung thư tuyến giáp bằng xét nghiệm giải
phẫu bệnh, đồng ý tham gia nghiên cứu. Trong
đó 50 bệnh nhân lấy máu và 21 bệnh nhân lấy
mẫu mô sinh thiết làm xét nghiệm tìm đột biến.
Nhóm chứng: là 21 người khỏe mạnh không
mắc bất kì bệnh ung thư nào.
• Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2017 đến
tháng 4 /2019.
• Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm tư vấn di
truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội.
• Cỡ mẫu nghiên cứu: Công thức tính cỡ mẫu
cho một nghiên cứu mô tả tính theo công thức
của S.K.Luanga và Lemeshow:
Trong đó:
1- α/2 = 0.95; ε = 0.10; p = 95%
(độ chính xác của quy trình tham chiếu). n = số lần
thực nghiệm cần thực hiện, tính được bằng 21.
2.2. Phương pháp nghiên cu: Phương
pháp mô tả cắt ngang có đối chứng
2.2.1. Tách chiết DNA.
Mẫu mô: sử dụng xylen để loại bỏ parafin,
sau đó dùng kit Qiagen để tách chiết DNA.
Mẫu máu: tách bằng kit DNA-epress
DNA thu được với độ tinh sạch đạt chuẩn
được khuếch đại bằng máy CFX96 (BioRad, Mỹ)
với chu trình luân nhiệt: 95oC - 3 phút, 40 chu kì
(95oC-15s, 63oC-40s)
2.3. Đạo đc nghiên cu: Các số liệu và
thông tin nghiên cứu là hoàn toàn chính xác,
trung thực và khách quan đã được xác nhận và
chấp thuận bởi cơ sở nghiên cứu. Những thông
tin về bệnh nhân được giữ bí mật và chỉ phục vụ
công tác nghiên cứu.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả tách chiết DNA: 21 mẫu mô
nghiên cứu được loại bỏ parafin bằng xylen trước
khi tách DNA bằng phương pháp Qiagen (Đức)
và 50 mẫu máu được tách bằng phương pháp
DNA-express (Lytech, Nga). Tuy nhiên chúng tôi
có cải tiến trong bước loại bỏ parafin (bằng cách
dùng hóa chất là xylen) và chỉ dùng 200µl máu
ngoại vi và 200µl dung dịch tách DNA, thay vì
550µl máu ngoại vi và 550µl dung dịch tách DNA
như trong protocol DNA-express. Tiến hành kiểm
tra độ tinh sạch đạt chuẩn thu được kết quả sau:
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ tinh sạch
DNA theo phương pháp DNA-express
Nồng độ
DNA
Nồng độ DNA
(Ng/µl)
Độ tinh
sạch
Thấp nhất
203,7
1,81
Cao nhất
658,3
2,01
Trung bình
2,98±15,43
1,86±0,260
Nhận xét:
Lượng DNA thu được từ các mẫu
tương đối cao và ổn định với nồng độ cao nhất
đạt 658,3ng/µl, thấp nhất đạt 203,7ng/µl; độ
tinh sạch cao nhất là 2,01 thấp nhất là 1,81.
3.2 Kết quả REALTIME – PCR
Bảng 3.2: Kết quả REALTIME – PCR
Kiểu gen
Kit REALTIME-PCR
Bình
thường
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 478 - THÁNG 5 - SỐ 1 - 2019
75
Dị hp tử
đột biến
Đồng hp
tử đột biến
Ghi chú: - Hex (xanh lá cây): Alen bình thường
- Fam (xanh nước biển): Alen đột biến
Nhận xét:
Hình ảnh sau khi chạy bằng kỹ thuật REALTIME -PCR cho kết quả rõ nét, đảm bảo yêu
cầu, dù đã cải tiến ở bước xử lý mẫu mô và tách chiết DNA.
3.3. Xác định đột biến gen BRAF V600E bằng kĩ thuật REALTIME - PCR
Bảng 3.3. Kết quả xác định đột biến gen bằng kỹ thuật REALTIMER-PCR
Kiểu gen
Nhóm bệnh
N(%)
Nhóm chng
N(%)
OR (CI, 95%)
BT
14 (66,67)
21 (100%)
0,04 (0,00-0,85)
DHT+ĐHT
7 (33,33)
0 (0%)
22,24 (1,18-420,39)
Ghi chú:
BT – kiểu gen bình thường, DHT – dị hợp tử; ĐHT – đồng hợp tử đột biến.
Nhận xét:
Khảo sát kiểu gen c.1799T>A nhận
thấy ở nhóm bệnh, 50 mẫu máu có 2 trường hợp
dị hợp tử (chiếm 4%), không có trường hợp mang
kiểu gen đồng hợp tử đột biến; 21 mẫu mô có 6
trường hợp dị hợp tử (chiếm 28,57%) và 1 trường
hợp đồng hợp tử (chiếm 4,76%). Trong khi đó ở
nhóm chứng không ghi nhân bất kỳ trường hợp
nào mang alen đột biến. Kiểu gen DHT+ĐHT có
nguy cơ gây ung thư tuyến giáp cao gấp 22 lần so
với kiểu gen bình thường.
IV. BÀN LUẬN
4.1. Loại bỏ parafin bằng xylen sau đó
tách chiết DNA bằng bộ kit Quiagen cải
tiến. Tách chiết DNA là công đoạn rất quan
trọng trong hầu hết các kỹ thuật sinh học phân
tử. Để các phản ứng tiếp theo được tối ưu và
chính xác, mẫu DNA cần đảm bảo đủ nồng độ,
độ tinh sạch, không bị đứt gãy trong quá trình
tách chiết. Do các mẫu mô đã được xử lý bằng
formalin và bọc trong parafin nên việc làm sạch
parafin trước khi tách DNA là vô cùng quan
trọng. Nó ảnh hưởng lớn tới độ tinh sạch của
DNA. Nghiên cứu sử dụng xylen là hóa chất d
tìm, giá thành phù hợp để loại bỏ parafin, sau đó
tách DNA bằng kit Quiagen giúp tiết kiệm tối đa
lượng hóa chất tách chiết cần thiết, góp phần
giẩm giá thành dịch vụ. Kết quả thu được vẫn
đảm bảo nồng độ DNA với độ OD đạt tiêu chuẩn,
cho phép tiến hành Realtime-PCR.
4.2. Kết quả xác định kiểu gen đột biến
bằng phương pháp Realtime– PCR
Ung thư biểu mô tuyến giáp thể nhú (PTC)
chiếm 80%-90% ung thư tuyến giáp và là ung
thư có tiên lượng tốt [3,4]. Mặc dù được xem là
có tiên lượng tốt song tỷ lệ di căn hạch chiếm
50% và di căn xa chiếm 10% [5]. Tỷ lệ mắc ung
thư tuyến giáp tăng nhanh ở cả nữ giới và nam
giới [6]. Do đó các phương pháp điều trị mới nên
được nghiên cứu và phát hiện. Braf được biết
đến như một gen tiền ung thư, hoạt động như
serine/threonin kinase kích hoạt con đường
truyền tín hiệu nội bào MAPK [7]. Nhiều nghiên
cứu đã chứng minh rằng đột biến V600E nằm
trong vùng kích hoạt Braf (CR3) làm tăng cường
kích hoạt con đường MAPK một cách liên tục,
thúc đẩy các dòng tế bào ung thư phát triển. Tỷ
lệ đột biến BRAF V600E ở bệnh nhân ung thư
tuyến giáp được báo cáo từ 28-83% phụ thuộc
vào các yếu tố dịch t và chủng tộc [8]. Phát
hiện đột biến gen BRAF V600E là yêu cầu được
đặt ra nhằm phục vụ nhu cầu chẩn đoán và điều
vietnam medical journal n01 - MAY - 2019
76
trị ung thư tuyến giáp cũng như nhiều loại ung
thư khác liên quan đến đột biến này.
Nghiên cứu của chúng tôi tiến hành tìm đột
biến trên cả mẫu máu và mẫu mô. Kết quả ghi
nhận 2 trường hợp mang gen dị hợp tử trong 50
mẫu máu (chiếm tỷ lệ 4%), 6 trường hợp dị hợp
tử (chiếm tỷ lệ 28,57%) và 1 trường hợp đồng
hợp tử (chiếm 4,76%) trong 21 mẫu mô phủ
parafin của 71 bệnh nhân đã được chẩn đoán
ung thư tuyến giáp và không ghi nhận bất kỳ
trường hợp đột biến nào ở nhóm chứng. Kiểu
gen DHT+ĐHT có nguy cơ gây bệnh ung thư
tuyến giáp cao gấp 22 lần kiểu gen bình thường.
Mặc dù kĩ thuật đã được cải tiến để đơn giản,
thuận tiện, tiết kiệm chi phí hơn, bước đầu đã
thu được những kết quả đáng mong đợi. Chúng
tôi hy vọng rằng những kỹ thuật này sẽ được
kiểm chứng trên cỡ mẫu lớn hơn để có độ chính
xác cao hơn trước khi ứng dụng trong lâm sàng
chẩn đoán và điều trị ung thư tuyến giáp.
V. KẾT LUẬN
- Hoàn thiện thành công kỹ thuật Realtime -
PCR để xác định đột biến gen BRAF V600E từ
mẫu máu và mẫu mô phủ parafin ở bệnh nhân
ung thư tuyến giáp.
- Tỷ lệ xuất hiện đột biến gen ở mẫu máu là
4%(2 trong số 50 bệnh nhân có kiểu gen dị hợp
tử); ở mẫu mô là 33,33%, gồm 28,57% là kiểu
gen dị hợp tử và 4,76% là kiểu gen đồng hợp tử.
Trong khi đó ở nhóm chứng không phát hiên bất
kỳ trường hợp nào mang alen đột biến. Kiểu gen
DHT+ĐHT có nguy cơ gây bệnh ung thư tuyến
giáp cao gấp 22 lần so với kiểu gen bình thường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Agnieszka Czarniecka, Małgorzata Oczko-
Wojciechowska, Marcin Barczyński. BRAF
V600E mutation in prognostication of papillary
thyroid cancer (PTC) recurrence. Gland Surg. 2016
Oct; 5(5): 495–505. doi: 10.21037/gs.2016.09.09
2. Xing M et al (2005). BRAF mutation predicts a
poorer clinical prognosis for papillary thyroid
carcinôm. J Clin Endocrinol Metab, 90: 6373‐6379.
3. Rubinstein WS. Endocrine cancer predisposition
syndromes: hereditary paraganglioma, multiple
endocrine neoplasia type 1, multiple endocrine
neoplasia type 2, and hereditary thyroid
cancer. Hematol Oncol Clin North
Am. 2010;24:907–937.
4. Kushchayeva YS, Kushchayev SV, Wexler JA,
Carroll NM, Preul MC, Teytelboym OM,
Sonntag VK, Van ND, Burman KD, Boyle LM.
Current treatment modalities for spinal metastases
secondary to thyroid
carcinoma. Thyroid. 2014;24:1443–55.
5. Wang F, Yu X, Shen X, Zhu G, Huang Y, Liu R,
Viola D, Elisei R, Puxeddu E, Fugazzola L. The
prognostic value of tumor multifocality in clinical
outcomes of papillary thyroid cancer. J Clin
Endocrinol Metab. 2017;102:3241–3250.
6. Carhill AA, Litofsky DR, Ross DS, Jonklaas J,
Cooper DS, Brierley JD, Ladenson PW, Ain
KB, Fein HG, Haugen BR. Long-term outcomes
following therapy in differentiated thyroid
carcinoma: NTCTCS registry analysis 1987-2012. J
Clin Endocrinol Metab. 2015;100:3270–3279.
7. Kim KH, Kang DW, Kim SH, Seong IO, Kang
DY. Mutations of the BRAF gene in papillary
thyroid carcinoma in a Korean population. Yonsei
Med J. 2004;45:818–21.
8. Mercer KE, Pritchard CA. Raf proteins and
cancer: B-Raf is identified as a mutational
target. Biochim Biophys Acta. 2003;1653:25–40.
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM TRIỆU CHỨNG NGOÀI VẬN ĐỘNG
TRÊN BỆNH NHÂN PARKINSON
Nguyễn Văn Hướng*, Vũ Hồng Vân**
TÓM TẮT21
Mục tiêu: Nghiên cứu nhằm đánh giá và mô tả
một số đặc điểm triệu chứng ngoài vận động trên
bệnh nhân mắc bệnh Parkinson. Đi tưng và
phương pháp: Nghiên cứu trên 60 bệnh nhân được
chẩn đoán mắc Bệnh Parkinson theo tiêu chuẩn của
ngân hàng não hội Parkinson Vương quốc Anh. Chẩn
*Trường Đại học Y Hà nội,
**Bệnh viện Đại học Y Hà nội
Chịu trách nhiệm chính: Nguyn Văn Hướng
Email: vanhuong73@hotmail.com
Ngày nhận bài: 26.2.2019
Ngày phản biện khoa học: 2.4.2019
Ngày duyệt bài: 15.4.2019
đoán các triệu chứng ngoài vận động dựa vào các tiêu
chuẩn của các hiệp hội chuyên môn Y khoa Quốc tế.
Kết quả: Tỷ lệ các triệu chứng ngoài vận động: rối
loạn thần kinh thực vật chiếm 75%. rối loạn giấc ngủ
(63,3%), rối loạn đại tiểu tiện (60%), đau (51,6%),
hạ huyết áp tư thế (30%), rối loạn chức năng sinh dục
(41,6%). Sa sút trí tuệ, sút cân, loạn thần chỉ chiếm
18,3%. Rối loạn chức năng sinh dục ở nhóm bệnh
nhân nam giới cao gấp 18,2 lần so với nhóm bệnh
nhân nữ giới có ý nghĩa thống kê với p < 0,000. Các
triệu chứng ngoài vận động khác giữa hai giới không
thấy có sự khác biệt (p > 0,05). Không có sự khác biệt
về triệu chứng ngoài vận động giữa các nhóm tuổi có
ý nghĩa thống kê với p > 0,05. Kết luận: Triệu chứng
ngoài vận động trên Parkinson: Hay gặp là rối loạn
thần kinh thực vật, rối loạn giấc ngủ, rối loạn đại tiểu