Xây dựng quy trình PCRĐA mồi xác định sự methyl hóa promoter của gen EBNA1

Nguyễn Thị Hồng Gấm<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 115(01): 175 - 179<br /> <br /> XÂY DỰNG QUY TRÌNH PCR ĐA MỒI<br /> XÁC ĐỊNH SỰ METHYL HÓA PROMOTER CỦA GEN EBNA1<br /> Nguyễn Thị Hồng Gấm*<br /> Trường Đại học Y Dược - ĐH Thái Nguyên<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Mục đích: Protein EBNA1 của EBV đƣợc biểu lộ ở tất cả thể tiềm ẩn và sử dụng các promoter<br /> khác nhau, bao gồm Wp, Cp và Qp. Sự điều hòa biểu lộ gen EBNA1 do nhiều cơ chế, trong đó có<br /> sự methyl hóa cytosin của CpG ở vùng promoter. Mục tiêu nghiên cứu là thiết kế các cặp mồi để<br /> xác định mức độ methyl hóa các promoter của gen EBNA1. Phƣơng pháp: tiến hành xây dựng<br /> quy trình PCR đa mồi bằng sử dụng đối tƣợng là tế bào dòng Namawa, Raji . Kết quả: Hai cặp<br /> mồi xác định methyl hóa và không methyl hóa của Wp, Cp và Qp cho kết quả dƣơng tính tốt nhất<br /> ở nồng độ ADN tƣơng đƣơng 1000 tế bào Namalwa và Raji. Đối với Cp, hai cặp mồi xác định<br /> methyl hóa và không methyl hóa cho Raji đều cho kết quả âm tính. Kết luận: Điều kiện phản ứng<br /> PCR đa mồi và các cặp mồi tự thiết kế đặc hiệu với Namalwa và Raji, ngoại trừ Cp của Raji.<br /> Từ khóa: PCR đa mồi, methyl hóa, Wp, Cp và Qp<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ*<br /> EBNA1 (EBV nuclear antigen 1) có chiều dài<br /> 641 acid amin (B95.8) đƣợc biểu lộ hầu nhƣ<br /> tất cả tế bào nhiễm EBV và đóng một vai trò<br /> quan trọng trong việc duy trì episom (dạng<br /> vòng) của EBV trong nhân tế bào chủ, cũng<br /> nhƣ chức năng phiên mã của virut [1].<br /> EBNA1 cũng có thể liên kết với các intron<br /> đầu tiên xuôi chiều của promoter Qp để tự<br /> điều hòa biểu lộ protein EBNA1. Sự biểu lộ<br /> của EBNA1 dƣới sự điều hòa của các<br /> promoter Cp, Wp hoặc Qp, tùy theo các thể<br /> nhiễm tiềm ẩn khác nhau của EBV trong tế<br /> bào chủ [2, 3].<br /> Sự methyl hóa ADN diễn ra ở các vùng<br /> promoter này là một trong những yếu tố tác<br /> động lên điều hòa phiên mã dẫn đến ức chế<br /> hoặc tăng cƣờng biểu lộ gen [4]. Hiện tƣợng<br /> này xuất hiện do một gốc -CH3 liên kết đồng<br /> hóa trị với carbon số 5 của Cytosin nằm ở vị<br /> trí hai nucleotid Cytosin-Guanin theo chiều<br /> 5’, viết tắt là CpG (p là liên kết<br /> phosphodieste).<br /> CpG thƣờng tập trung ở các vùng promoter và<br /> hình thành nên các đảo CpG. Do đó, việc xác<br /> định mức độ methyl hóa của vùng này có thể<br /> góp phần tìm hiểu những cơ chế biểu lộ hoặc<br /> ức chế biểu lộ của gen EBV trong ung thƣ<br /> vòm mũi họng.<br /> *<br /> <br /> Tel:<br /> <br /> Ngày nay, nhờ những tiến bộ của sinh học<br /> phân tử ngƣời ta có thể xác định đƣợc mức độ<br /> methyl hóa của một gen đặc hiệu hay toàn bộ<br /> bộ gen. Các kỹ thuật này dựa vào những<br /> nguyên lý khác nhau, có những kỹ thuật rất<br /> phức tạp, nhƣng có những kỹ thuật đơn giản<br /> và thông dụng [5]. Đã có những công trình<br /> xác định mức độ methyl hóa các promoter của<br /> EBNA1 bằng phản ứng PCR đơn mồi [6],<br /> nhƣng chƣa có công trình nghiên cứu về PCR<br /> đa mồi đƣợc công bố. Vì vậy công trình này<br /> nhằm mục tiêu: xây dựng quy trình PCR đa<br /> mồi để xác định mức độ methyl hóa các<br /> promoter Wp, Cp và Qp của EBNA1 trên hai<br /> dòng tế bào Namalwa và Raji.<br /> ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP<br /> Đối tƣợng<br /> Tế bào dòng Namalwa, và Raji đƣợc cung cấp<br /> bởi Labo nghiên cứu ung thƣ vòm mũi họng,<br /> Khoa Vi sinh, Sinh học tế bào và Khối u<br /> (MTC), Viện Karolinska, Stockholm, Thụy<br /> Điển. Các dòng tế bào đƣợc nuôi cấy trong<br /> môi trƣờng RPMI 1640, 10% FCS và để tủ<br /> ấm 370 C. Tế bào đƣợc thu hoạch và chiết<br /> tách ADN theo quy trình dƣới đây.<br /> Phƣơng pháp<br /> - Thiết kế mồi: Để xác định mức độ methyl<br /> hóa, 2 cặp mồi cho mỗi promoter đƣợc thiết<br /> 175<br /> <br /> Nguyễn Thị Hồng Gấm<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> kế. Một cặp mồi dùng để xác định ADN bị<br /> methyl hóa (M) và một cặp mồi dùng để xác<br /> định ADN không bị methyl hóa (K). Sử dụng<br /> phần mềm chuyên dụng Methyl Primer<br /> Express Software v1.0. (Applied Biosystem,<br /> Hoa kỳ). Trình tự mồi đƣợc sử dụng dựa vào<br /> trình tự nucleotid các promoter của EBV<br /> thuộc tế bào dòng chuẩn của ngân hàng gen<br /> (V01555).<br /> - Chiết tách ADN<br /> Kỹ thuật chiết tách ADN đƣợc tiến hành bởi<br /> ―DNA extraction kit‖ (Qiagen, Đức), theo<br /> quy trình hƣớng dẫn bởi công ty. Chất lƣợng<br /> ADN, đƣợc kiểm tra bằng điện di sản phẩm<br /> trên gel agarose 0,8% trong TBE 1x ( kết quả<br /> ở hình 1), đo nồng độ sản phẩm bằng máy<br /> NanoDrop.<br /> - Xử lý ADN bằng Bisulfite<br /> Các bƣớc xử lý ADN đƣợctách từ mẫu sinh<br /> thiết ung thƣ vòm mũi họng bằng Bisulfite<br /> đƣợc tiến hành theo bộ kit Epitect Bisulfite<br /> (Qiagen, Đức).<br /> <br /> - Phản ứng PCR đa mồi<br /> Phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu sử dụng cặp<br /> mồi gen nội chuẩn actin và các cặp mồi đặc<br /> hiệu xác định mức độ methyl hóa trong phản<br /> ứng 25μl gồm: dung dịch đệm PCR, Mg2+,<br /> dNTPs, TaqGold polymerase và ADN khuôn<br /> mẫu. Chu kỳ nhiệt gồm: biến tính ADN và<br /> hoạt hóa TaqGold polymerase 950 Cx10’, 5<br /> chu kỳ nhiệt: 940 Cx45’’, 600 Cx30’’, 720<br /> Cx45’’. Và 35 chu kỳ 940 Cx45’’, 560 Cx30’’,<br /> 720 Cx45’’; 720 Cx7’. Điện di sản phẩm PCR,<br /> nhuộm ethidium bromide và chụp ảnh<br /> KẾT QUẢ<br /> Đánh giá chất lƣợng ADN chiết tách bằng<br /> điện di (Hình 1)<br /> Hình ảnh điện di cho thấy ADN đƣợc chiết<br /> tách có chất lƣợng tốt với trọng lƣợng phân tử<br /> có kích thƣớc lớn, đồng thời không có đứt<br /> gãy và không lẫn các thành phần khác nhƣ<br /> protein.<br /> <br /> Bảng 1. Các loại cặp mồi sử dụng trong phản ứng MMSP<br /> <br /> 176<br /> <br /> 115(01): 175 - 179<br /> <br /> Nguyễn Thị Hồng Gấm<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 115(01): 175 - 179<br /> <br /> đa mồi đối với dòng tế bào Raji, thực hiện<br /> đồng thời với dòng tế bào Namalwa. Cặp mồi<br /> dùng cho ADN không methyl hóa của Wp<br /> cho kết quả âm tính, trong khi đó cặp mồi<br /> dùng cho ADN methyl hóa có kết quả dƣơng<br /> tính mạnh ở hai dòng tế bào. Qp thì hoàn toàn<br /> ngƣợc lại, đối với mồi dùng cho ADN không<br /> methyl hóa thì dƣơng tính mạnh và mồi dùng<br /> cho ADN Qp methyl hóa lại âm tính ở cả hai<br /> dòng tế bào. Cặp mồi dùng cho ADN không<br /> methyl hóa của Cp dƣơng tính yếu ở<br /> Namalwa, còn lại đều âm tính (Hình 3).<br /> <br /> Xác định lƣợng ADN khuôn mẫu của phản<br /> ứng PCR đa mồi, sử dụng tế bào dòng<br /> Namalwa (Hình 2A và 2B).<br /> Tế bào dòng Namalwa là loại tế bào có EBV<br /> với số lƣợng từ 1-2 bản sao trong 01 tế bào.<br /> Do đó, ngƣời ta thƣờng dùng loại tế bào này<br /> để xác định độ nhạy của phản ứng PCR, với<br /> các nồng độ tế bào pha loãng khác nhau.<br /> Nghiên cứu sử dụng nồng độ ADN tƣơng<br /> đƣơng 1000 tế bào Namalwa và sau đó pha<br /> loãng bậc 10 thành 100, 10 và 1 tế bào (tƣơng<br /> ứng với mẫu 2, 3, 4, 5, Hình 2A và 2B). Kết<br /> quả cho thấy cặp mồi của gen nội chuẩn actin<br /> hoạt động tốt ở phản ứng PCR xác định<br /> methyl hóa và không methyl hóa, giảm dần<br /> theo độ pha loãng và ở nồng độ 01 tế bào vẫn<br /> dƣơng tính rõ rệt. Mồi Qp dùng cho ADN<br /> không methyl hóa dƣơng tính mạnh và giảm<br /> dần ở tất cả nồng độ, trong khi mồi Qp cho<br /> ADN methyl hóa có một băng yếu ở nồng độ<br /> ADN tƣơng đƣơng 1000 tế bào, các nồng độ<br /> khác không thấy băng. Ngƣợc lại, Wp không<br /> methyl hóa thì cho băng rất yếu, ngay cả ở nồng<br /> độ 1000 tế bào, và Wp methyl hóa cho băng rất<br /> đậm ở các nồng độ và kết quả giảm dần.<br /> Mức độ không methyl hóa và methyl hóa<br /> của các promoter ở hai dòng tế bào<br /> Namalwa và Raji<br /> Trên cơ sở độ nhạy của phản ứng ở dòng tế<br /> bào Namalwa, nồng độ ADN tƣơng đƣơng<br /> 1000 tế bào đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Kỹ thuật PCR đa mồi cũng dựa trên nguyên<br /> lý của PCR đơn mồi, nhƣng nó có ít nhất từ<br /> 02 cặp mồi trở lên đƣợc khuếch đại trong một<br /> ống nghiệm PCR [7]. Tuy nhiên, PCR đa mồi<br /> cũng có những đặc điểm riêng cần phải chú ý<br /> 177<br /> <br /> Nguyễn Thị Hồng Gấm<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> từ khâu thiết kế mồi nhƣ nhiệt độ gắn mồi<br /> tƣơng tự nhau, kích thƣớc sản phẩm khác<br /> nhau, và các thành phần khác của hỗn hợp<br /> PCR cũng phải tăng lên [8]. Việc xác định<br /> mức độ methyl hóa của vùng promoter bằng<br /> kỹ thuật PCR đơn mồi hay đa mồi đều tuân<br /> thủ những nguyên tắc trên, nhƣng cũng có<br /> thêm những khác biệt đặc trƣng do trình tự<br /> ADN đã đƣợc chuyển đổi bởi bisulfite [5].<br /> Chúng tôi tự thiết kế mồi bằng phần mềm<br /> chuyên dụng và tìm điều kiện tối ƣu cho phản<br /> ứng dựa trên các nghiên cứu của chúng tôi<br /> với các gen ức chế ung thƣ và gen EBV. Cặp<br /> mồi gen nội chuẩn là actin dùng cho ADN sau<br /> khi đã xử lý với bisulfite cũng đƣợc thiết kế<br /> và cho kết quả rất tốt ở các lần phân tích thể<br /> hiện trong các Hình 2 và 3. Theo nhiều tác giả<br /> và kinh nghiệm của chúng tôi, khi sử dụng<br /> một cặp mồi mới cho phản ứng PCR, các<br /> nồng độ Mg2+ khác nhau cần phải thử để tối<br /> ƣu hóa phản ứng. Đối với phản ứng PCR đa<br /> mồi đặc hiệu methyl hóa, các thành phần của<br /> phản ứng PCR đƣợc tăng lên, tuy nhiên sẽ<br /> không tăng theo tỷ lệ số cặp mồi sử dụng [7].<br /> Nồng độ Mg2+ đƣợc sử dụng là 4 mM và<br /> enzym đƣợc hoạt hóa ở nhiệt độ cao là<br /> AmpliTaq Gold cho các phản ứng PCR đa<br /> mồi đặc hiệu. Mặc dầu các băng đặc hiệu thể<br /> hiện rất rõ, tuy nhiên vẫn còn những băng<br /> không đặc hiệu trong sản phẩm PCR. Có thể<br /> do điều kiện phản ứng chƣa tối ƣu hoàn toàn,<br /> cần phải điều chỉnh các yếu tố tham gia phản<br /> ứng PCR đa mồi nhƣ nồng độ các mồi đƣa<br /> vào, nhiệt độ gắn mồi, nồng độ Mg2+ theo<br /> một tỷ lệ thích hơp hơn.<br /> Trong nghiên cứu này ADN của hai dòng tế<br /> bào Namalwa và Raji đƣợc xử lý và khuếch<br /> đại bởi các cặp mồi tự thiết kế vì chúng đã<br /> đƣợc xác định mức độ methyl hóa ở các vùng<br /> promoter theo phƣơng pháp giải trình tự gen,<br /> đây coi nhƣ là chuẩn vàng của kỹ thuật PCR<br /> (http://gbrowse.bioinfo.cnio.es/<br /> cgibin/VIRUS/HS4/). Tại vị trí gắn mồi của các<br /> cặp mồi Wp và Cp của EBV ở hai dòng tế bào<br /> 178<br /> <br /> 115(01): 175 - 179<br /> <br /> đều bị methyl hóa, trong khi đó, Qp hầu nhƣ<br /> không methyl hóa. Kết quả nghiên cứu thu<br /> đƣợc về các cặp mồi Wp và Qp phù hợp với<br /> chuẩn vàng của Namalwa và Raji và kết quả<br /> nghiên cứu bằng PCR đơn mồi [6, 9]. Đối với<br /> Qp cũng phù hợp với Tao. Q và cộng sự, Qp<br /> hầu nhƣ không bị methyl hóa ở Namalwa,<br /> Raji và cho thấy Qp chƣa bao giờ im lặng [3].<br /> Với cặp mồi xác định methyl hóa và không<br /> methyl hóa của Cp cho băng yếu hoặc âm tính<br /> ở Raji có thể do nhiều lý do bao gồm, độ nhạy<br /> của cặp mồi, nồng độ mồi đƣa vào phản ứng<br /> hoặc chất lƣợng mồi chƣa đủ tốt hoặc có thể<br /> do có đột biến trong trình tự ADN gắn mồi<br /> hoặc những lý do khác chƣa biết rõ [7, 8].<br /> Các promoter Wp, Cp và Qp có khác nhau về<br /> cấu trúc và mật độ CpG. Riêng Wp, trong cấu<br /> trúc có đến 12 promoter giống nhau lặp lại<br /> nên nồng độ mồi sử dụng cho nó bị giảm đi<br /> so với các nồng độ mồi Cp và Qp.<br /> KẾT LUẬN<br /> Các cặp mồi để xác định sự methyl hóa,<br /> không methyl hóa các promoter Wp, Qp của<br /> EBNA1 và cặp mồi nội chuẩn actin hoạt động<br /> rất tốt.Đối với Cp mồi xác định methyl hóa và<br /> không methyl hóa cho kết quả chƣa rõ ràng.<br /> KIẾN NGHỊ<br /> Cần phải điều chỉnh các thông số của PCR<br /> hoặc thiết kế mồi mới khác. Kết quả này có<br /> thể ứng dụng trong việc xác định mức độ<br /> methyl hóa các promoter của EBNA1 ở các<br /> bệnh lý hoặc tế bào khác nhau nhiễm EBV.<br /> TÀI LIỆU THAM KHẢO<br /> 1. Ceccarelli, D.F. and Frappier, L., (2000).<br /> Functional analyses of the EBNA1 origin DNA<br /> binding protein of Epstein-Barr virus. J Virol, 74<br /> (11): 4939 - 4948.<br /> 2. Yoshioka, M., Kikuta, H., Ishiguro, N., Ma, X.,<br /> et al., (2003). Unique Epstein-Barr virus (EBV)<br /> latent gene expression, EBNA promoter usage and<br /> EBNA promoter methylation status in chronic<br /> active EBV infection. J Gen Virol, 84 (5): 1133 1140.<br /> 3. Tao, Q., Robertson, K.D., Manns, A.,<br /> Hildesheim, A., et al., (1998). The Epstein-Barr<br /> virus major latent promoter Qp is constitutively<br /> <br /> Nguyễn Thị Hồng Gấm<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> active, hypomethylated, and methylation sensitive.<br /> J Virol, 72 (9): 7075 - 7083.<br /> 4. Salamon, D., Takacs, M., Ujvari, D., Uhlig, J.,<br /> et al., (2001). Protein-DNA binding and CpG<br /> methylation at nucleotide resolution of latencyassociated promoters Qp, Cp, and LMP1p of<br /> Epstein-Barr virus. J Virol, 75 (6): 2584 - 2596.<br /> 5. Dahl, C. and Guldberg, P., (2003). DNA<br /> methylation analysis techniques. Biogerontology,<br /> 4 (4): 233 - 250.<br /> 6. Paulson, E.J. and Speck, S.H., (1999).<br /> Differential methylation of Epstein- Barr virus<br /> latency promoters facilitates viral persistence in<br /> <br /> 115(01): 175 - 179<br /> <br /> healthy seropositive individuals. J Virol, 7 (12):<br /> 9959 - 9968.<br /> 7. Henegariu, O., Heerema, N.A., Dlouhy, S.R.,<br /> Vance, G.H., et al., (1997). Multiplex PCR:<br /> critical parameters and step-by-step protocol.<br /> Biotechniques, 23 (3): 504 - 511.<br /> 8. Markoulatos, P., Siafakas, N., and Moncany, M.,<br /> (2002). Multiplex polymerase chain reaction: a<br /> practical approach. J Clin Lab Anal, 16 (1): 47 - 51.<br /> 9. Park, J.H., Jeon, J.P., Shim, S.M., Nam, H.Y., et<br /> al., (2007). Wp specific methylation of highly<br /> proliferated LCLs. Biochem Biophys Res<br /> Commun,<br /> 358<br /> (2):<br /> 513<br /> –<br /> 520<br /> <br /> SUMMARY<br /> MULTIPLEX PCR FOR PROMOTER METHYLATION OF EBNA1 GENE<br /> Nguyen Thi Hong Gam*<br /> College of Medical and Pharmacy - TNU<br /> <br /> Object: EBNA1 protein is expressed in all latency program of infected cells using different<br /> promoters including the Wp, Cp and Qp. The EBNA1 expression is regulated by some different<br /> mechanisms and methylation of cytosine in CpG positions of promoter region is shown. The aim<br /> of the study is to design primer pairs to detect the methylation level of EBNA1. Method:<br /> promoters by the multiplex PCR using cell lines Namalwa Raji. Results: All unmethylation and<br /> methylation primer pairs of Wp, Cp and Qp work well with DNA of 1000 Namalwa and Raji cells,<br /> except the Cp is negative for both unmethylated and methylated primer pairs. Conclusion: Wp<br /> and Qp primer pairs and conditions for the multiplex PCR are specific with Namalwa and Raji<br /> lines, except Cp for Raji.<br /> Key words: multiplex PCR, methylation, Wp, Cp and Qp<br /> <br /> Ngày nhận bài:31/12/2013; Ngày phản biện:20/01/2014; Ngày duyệt đăng: 07/02/2014<br /> Phản biện khoa học: TS. Nguyễn Thị Ngọc Hà – Trường Đại học Y Dược – ĐHTN<br /> *<br /> <br /> Tel:<br /> <br /> 179<br /> <br />