T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
417
BƯỚC ĐẦU ÁP DỤNG KỸ THUẬT RQ-PCR ĐÁNH GIÁ TỒN LƯU TẾ BÀO
ÁC TÍNH BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY CÓ CHUYỂN VỊ CBFB/MYH11
Châu Thúy Hà1, Cao Văn Động1, Nguyễn Tấn Bỉnh1,
Phù Chí Dũng1, Phan Thị Xinh2
TÓM TẮT48
Mục tiêu: Triển khai kỹ thuật RQ-PCR định
lưng tổ hp gen CBFB/MYH11.
Đối tượng: Mẫu ngưi bệnh có mang tổ hp
gen CBFB/MYH11 type A đã xác định trước
bằng kỹ thuật RT-PCR.
Phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu triển
khai kỹ thuật mới.
Kết quả: Chúng tôi đã thành công ứng dụng
kỹ thuật RQ-PCR trong định lưng tổ hp gen
CBFB/MYH11. RQ-PCR định lưng tổ hp gen
CBFB/MYH11 đưc chuẩn hoá ở nghiên cứu
này đạt giới hạn phát hiện 10-5. Toàn bộ 6 ngưi
bệnh trong nghiên cứu của chúng tôi có bệnh tồn
lưu tối thiểu CBFB/MYH11 dương tnh sau giai
đoạn tấn công và 3/3 ngưi bệnh có bệnh tồn lưu
tối thiểu CBFB/MYH11 âm tính khi kết thúc
điều trị.
Kết luận: Đây là công cụ hữu ch nhằm đánh
giá bệnh tồn lưu tối thiểu, giúp định hướng điều
trị và tiên lưng cho ngưi bệnh bạch cầu cấp
dng tủy mang tổ hp gen CBFB/MYH11 lúc
chẩn đoán.
1Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học
2Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học,
Đại Học Y dược TPHCM
Chịu trách nhiệm chính: Phan Thị Xinh
SĐT: 0932728115
Email: bsphanthixinh@ump.edu.vn
Ngày nhận bài: 30/7/2024
Ngày phản biện khoa học: 01/8/2024
Ngày duyệt bài: 17/9/2024
Từ khóa: Bạch cầu cấp dòng tủy, RQ-PCR,
CBFB/MYH11.
SUMMARY
INITIALLY APPLYING RQ-PCR FOR
MINIMAL RESIDUAL DISEASE
EVALUATING IN CBFB/MYH11
ACUTE MYELOID LEUKEMIA
Objectives: To perform real-time
quantitative polymerase chain reaction (RQ-
PCR) technique in monitoring CBFB/MYH11
mutation.
Subjects: Patient samples with
CBFB/MYH11 type A mutation were diagnosed
by RT-PCR.
Method: Prospective case series.
Results: We have successfully applied RQ-
PCR technique in measuring CBFB/MYH11
fusion transcript expression. This technique
could quantify CBFB/MYH11 transcript level
with limit of detection as low as 10-5. In this
study, all of 6 CBFB/MYH11 acute myeloid
leukemia patients had positive minimal residual
disease after induction and 3/3 patients had
negative minimal residual disease at the end of
treatment.
Conclusion: This technique can be a useful
device in CBFB/MYH11 monitoring mesurable
residual disease postreatment, that guides
therapeutic interventions and prognosis in
CBFB/MYH11 acute myeloid leukemia patients.
Keywords: acute myeloid leukemia, RQ-
PCR, CBFB/MYH11.
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
418
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy (BCCDT) là
một thể bệnh không đồng nhất về diễn tiến,
đáp ứng điều trị và tỷ lệ sống còn của ngưi
bệnh (NB). Phương thức điều trị đưc lựa
chọn dựa trên phân nhóm nguy cơ trước điều
trị, với các yếu tố như tuổi, hình thái tế bào,
và quan trọng là các đặc điểm về di truyền tế
bào và sinh học phân tử [4].
BCCDT mang đột biến yếu tố liên kết lõi
(CBF: core binding factor) là một phân nhóm
của BCCDT với các bất thưng di truyền
thưng gặp theo phân loại của Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO: world health organization),
đưc đặc trưng bởi các bất thưng về nhiễm
sắc thể t(8;21) hoặc inv(16) / t(16;16) [5]. Ở
cấp độ phân tử, những thay đổi nhiễm sắc thể
này dẫn đến việc tạo ra các tổ hp gen
RUNX1/RUNX1T1 trong các trưng hp
với t (8;21) và CBFB/MYH11 ở những
ngưi có inv(16) / t(16;16). BCCDT mang
đột biến CBF chiếm 10-15% BCCDT ngưi
lớn và có xu hướng liên quan đến tuổi NB trẻ
hơn và độ nhạy cao hơn với hóa trị liệu tấn
công và củng cố. Mặc dcó tiên lưng tương
đối thuận li, có tới 40% NB BCCDT mang
đột biến CBF tái phát [2].
Bệnh tồn lưu tối thiểu hay có thể đo
lưng đưc (MRD: measurable residual
disease) cho phép đánh giá đáp ứng điều trị,
dự báo nguy cơ tái phát, từ đó có thể xác
định những NB cần tái điều trị sớm hay thay
đổi phác đồ điều trị. Theo hướng dẫn điều trị
của Mạng lưới ung thư quốc gia (NCCN:
National Comprehensive Cancer Network)
phiên bản 3.2022, NB BCCDT mang đột
biến CBF có thể đưc đánh giá tồn lưu bằng
kỹ thuật PCR định lưng (RQ-PCR) các tổ
hp gen CBFB/MYH11, RUNX1/RUNX1T1
[1]. Không giống với tổ hp gen
RUNX1/RUNX1T1, sự đứt gãy trên gen
MYH11 có thể xảy ra ở nhiều vị trí, dẫn đến
tạo thành nhiều kiểu tổ hp gen
CBFB/MYH11 khác nhau. Trong giới hạn
kiến thức của chúng tôi, có ít nhất 10 kiểu tổ
hp gen CBFB/MYH11 đã đưc báo cáo. Vì
vậy, việc thiết kế mồi và đoạn dò cho RQ-
PCR định lưng tổ hp gen khó khăn.
Tại Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học,
chúng tôi đã triển khai đưc kỹ thuật RQ-
PCR định lưng RUNX1/RUNX1T1 từ năm
2020. Cho đến hiện tại, NB BCCDT mang tổ
hp gen CBFB/MYH11 ở Bệnh viện Truyền
Máu Huyết Học chỉ đưc theo dõi tồn lưu
bằng kỹ thuật định tnh RT PCR, độ nhạy đạt
đưc khoảng 10-2 đến 10-3. Do đó, chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài này để triển khai
kỹ thuật RQ-PCR định lưng tổ hp gen
CBFB/MYH11 trong theo di sau điều trị.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mẫu:
Mưi mẫu NB mang tổ hp gen
CBFB/MYH11 type A lúc chẩn đoán đưc
thu thập để khảo sát. Nghiên cứu đưc thực
hiện tại Khoa Di truyền học phân tử, Bệnh
viện Truyền máu Huyết học từ tháng
10/2022 đến 6/2024.
Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu triển
khai kỹ thuật mới.
Nội dung thực hiện
Chúng tôi chọn ngẫu nhiên 1 mẫu NB có
mang tổ hp gen CBFB/MYH11 type A đã
xác định trước bằng RT-PCR, dng phương
pháp tạo dòng T-vector để tạo 2 dòng tế bào
mang tổ hp gen CBFB/MYH11 và dòng
wild type. Dòng tế bào mang tổ hp gen
CBFB/MYH11 đưc pha loãng với nước
thành các mức nồng độ từ 102 tế bào/µL đến
106/µL để chuẩn hóa điều kiện phản ứng RQ-
PCR và xây dựng đưng chuẩn. Chúng tôi
chọn kiểu tổ hp type A để triển khai thiết kế
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
419
trình tự mồi bởi vì type A chiếm đại đa số
các trưng hp NB có tổ hp gen
CBFB/MYH11.
Sau đó pha loãng dng tế bào mang tổ
hp gen CBFB/MYH11 và dòng wild type
theo bậc thang nồng độ từ 10-4 đến 10-6. Phản
ứng RQ-PCR sẽ thực hiện lặp lại 20 lần ở
mỗi mức nồng độ này, để khảo sát giới hạn
phát hiện của kỹ thuật. Nếu có từ 95% số lần
khảo sát trở lên cho kết quả dương tnh th
giới hạn phát hiện đó đưc xác nhận.
Ứng dụng kỹ thuật đã chuẩn hóa đánh giá
MRD sau tấn công và khi hoàn tất điều trị
cho NB mang tổ hp gen CBFB/MYH11 lúc
chẩn đoán trong thi gian nghiên cứu.
Cấu trúc đoạn mồi và đoạn ddng trong
nghiên cứu
Chúng tôi sử dụng các đoạn mồi tự thiết
kế như sau:
- Các đoạn mồi dùng cho RT-PCR (đã
chuẩn hóa)
CBFB-A:
5’-GCAGGCAAGGTATATTTGAAGG-3’
MYH11-B2:
5’-TCCTCTTCTCCTCATTCTGCTC-3’
- Các đoạn mồi dùng cho RQ-PCR
Q.CBFB-F1:
5’-CAGGAGGATGCATTAGCACAA-3’
Q.CBFB-F2:
5’-CTTTGAAGAGGCTCGGAGAA-3’
Q. MYH11.A-R1:
5’-TGCGTCTTCATCTCCTCCATCT-3’
Q. MYH11.A-R2:
5’-CTTGGACTTCTCCAGCTCAT-3’
- Đoạn dò dùng cho RQ-PCR
Q.CBFB-Probe:
5’-AGACAGGTCTCATCGGGAGGAAAT-
TAMRA-3’
Vị tr các đoạn mồi và đoạn dtương ứng
trên gen như hnh 2.
Hnh 1. Các đon mồi và đon dò dùng trong nghiên cứu
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Chuẩn hóa điều kiện phản ứng RQ-
PCR định lượng tổ hợp gen
CBFB/MYH11
Chúng tôi sử dụng chứng dương tổ hp
gen CBFB-MYH11 type A làm nguyên liệu
để thử nghiệm điều kiện phản ứng RQ-PCR.
Dựa trên nhiệt độ nóng chảy, các mồi và
đoạn dò mà chúng tôi thiết kế hoạt động tốt ở
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
420
nhiệt độ bắt cặp khoảng 60oC. Đầu tiên, phản
ứng PCR đưc thực hiện để khảo sát lựa
chọn cặp mồi phù hp cho RQ-PCR, đồng
thi khẳng định nhiệt độ bắt cặp lý tưởng.
Thành phần phản ứng và chương trnh luân
nhiệt như sau:
10X PCR buffer 2 uL
2,5mM dNTPs 2 uL
Mồi xuôi 1 uL
Mồi ngưc 1 uL
Takara Taq Hs 0,15 uL
cDNA 1 uL
H2O 12,85 uL
Chu trình nhiệt:
98oC x 3 phút
98oC x 10 giây
60oC x 20 giây x 45 chu kỳ
72oC x 20 giây
72oC x 3 phút
Giữ 16oC
Các mồi đưc sử dụng và phối hp cho
kch thước mục tiêu như bảng 1
Bảng 1. Các kiểu phối hợp mồi trong thử điều kin
STT
Mồi xuôi
Mồi ngược
Kch thước băng
1
Q.CBFB-F1
Q. MYH11.A-R1
Q. MYH11.A-R2
159 bp
121 bp
2
Q.CBFB-F2
Q. MYH11.A-R1
Q. MYH11.A-R2
132 bp
94 bp
Hình 2. Kết quả thử nghim các mồi khuếch đi gen CBFB-MYH11 ở 60oC
Giếng 1: Cặp mồi Q.CBFB-F2/ Q.
MYH11.A-R1 (132bp); Giếng 2: cặp mồi
Q.CBFB-F2/ Q. MYH11.A-R2 (94bp);
Giếng 3: cặp mồi Q.CBFB-F1/ Q.
MYH11.A-R1 (159bp); Giếng 4: cặp mồi
Q.CBFB-F1/ Q. MYH11.A-R2 (121bp);
Giếng 5: mẫu KHÔNG mang gen CBFB-
MYH11; Giếng 6: chứng âm.
Kết quả điện di cho thấy, ở nhiệt độ bắt
cặp 60oC có 02 cặp mồi cho sản phẩm là 1
băng duy nhất và trùng với kch thước băng
mục tiêu. Hơn nữa, cặp mồi Q.CBFB-F1/
Q.MYH11.A-R1 cho độ đậm băng r nét.
Kết quả giải trình tự từ băng điện di này cho
thấy sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi
Q.CBFB-F1/ Q.MYH11.A-R1 là trình tự gen
CBFB exon 5 ghép nối với trình tự gen
MYH11 exon 12, phù hp với tổ hp gen
CBFB-MYH11 type A. Như vậy, chúng tôi
chọn cặp mồi Q.CBFB-F1/ Q.MYH11.A-R1
và nhiệt độ bắt cặp mồi 60oC cho thử nghiệm
điều kiện phản ứng RQ-PCR.
Sau đó, chúng tôi tiến hành tạo dòng tổ
hp gen CBFB-MYH11 để dựng đưng
chuẩn tổ hp gen này (hình 3).
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
421
Hình 3. Kết quả to dòng tổ hợp gen CBFB-MYH11
Thực hiện thu nhận khuẩn lạc và tách
chiết DNA tạo dng để tính toán nồng độ
chính xác của sản phẩm DNA. Kết quả pha
loãng chúng tôi thu đưc các mẫu DNA ở
các mức nồng độ 102, 103, 104, 105, 106 bản
sao CBFB/MYH11/µL.
Thử nghiệm RQ-PCR gen
CBFB/MYH11 đưc thực hiện với cặp mồi
Q.CBFB-F1/ Q.MYH11.A-R1 và nhiệt độ
bắt cặp mồi 60oC đã thử nghiệm từ phản ứng
PCR ở trên. Chứng dương của tổ hp gen
này đưc chạy song song cùng các mức nồng
độ chuẩn đã pha loãng, với điều kiện về thi
gian bắt cặp mồi kéo dài lần lưt là A: 30
giây, B: 1 phút. Chúng tôi thu đưc kết quả
như hnh 4.
Hình 4. Kết quả thử điều kin phản ứng RQ-PCR tổ hợp gen CBFB-MYH11
A. Thi gian bắt cặp mồi kéo dài 30 giây
B. Thi gian bắt cặp mồi kéo dài 1 phút
Chúng tôi nhận thấy ở phản ứng RQ-
PCR với thi gian bắt cặp của mồi kéo dài 30
giây (hình 4 A) các mẫu đưng chuẩn không
đưc khuếch đại đầy đủ, hiệu suất của phản
ứng không đạt. Ngưc lại, ở phản ứng RQ-
PCR với thi gian bắt cặp của mồi kéo dài 1
phút (hình 4 B) các mẫu đưng chuẩn, chứng
dương đều đưc khuếch đại đầy đủ, hiệu suất
của phản ứng đạt tối ưu. Các phản ứng đã
đưc lặp lại 3 lần để khẳng định.
Tổng hp các dữ liệu thu đưc, chúng tôi
thu đưc kết quả khi nhiệt độ lai mồi ở 60oC,
thi gian bắt cặp kéo dài 1 phút, phản ứng
RQ-PCR có điều kiện tối ưu để khuếch đại tổ
hp gen mục tiêu CBFB-MYH11 với các
mức nồng độ chuẩn là 102, 103, 104, 105, 106,
ngưỡng cut off Ct = 39 (hình 5).