Bài giảng Kiểm định sản phẩm nông nghiệp

KIỂM ĐỊNH SẢN PHẨM NÔNG NGHIỆP

Bù i Hồ ng Quân  buihongquan@gbd.edu.vn  090 9 25 24 19

 Phần 1: Lý thuyết  Chương 1: Giới thiệu và định nghĩa các sản phẩm nông nghiệp  1.1. Định nghĩa về sản phẩm nông nghiệp  1.2. Giới thiệu về các sản phẩm nông nghiệp  1.3. Đặc tính cơ bản của các sản phẩm nông nghiệp



Chương 2: Cấu trúc và thành phần của các sản phẩm nông nghiệp

 2.1. Đặc điểm cấu trúc của các sản phẩm nông nghiệp  2.2. Thành phần hoá học của sản phẩm nông nghiệp  2.3. Sự biến đổi thành phần của sản phẩm nông nghiệp trong quá trình bảô quản  2.4. Các thành phần tạp nhiễm vào sản phẩm nông nghiệp



Chương 3: Các phương pháp kiểm định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật

 3.1. Phương pháp phân tích truyền thống dư lượng thuốc bảô vệ thực vật  3.2. Phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc bảô vệ thực vật (phương pháp

quechers)

 3.3. Phương pháp phân tích nhanh dư lượng thuốc bảô vệ thực vật

 Chương 4: Các phương pháp kiểm định dư lượng chất kháng sinh  4.1. Phương pháp phân tích chloramphenicol trong thuỷ sản bằng kit ELISA thông qua

phân tích khẳng định bằng LC-MS/MS

 4.2. Phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh streptomycin  4.3. Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm quinolone trong tôm bằng phương pháp ELISA  4.4. Phương pháp phân tích định lượng sulfonamit trong thuỷ sản bằng HPLC  4.5. Phương pháp phân tích nhanh dư lượng thuốc kháng sinh



Chương 5: Các phương pháp kiểm định sinh vật hại trong sản phẩm nông nghiệp

 5.1. Các phương pháp phân tích kiểm định vi sinh vật trong sản phẩm nông nghiệp  5.2. Các phương pháp phân tích côn trùng dịch hại trong sản phẩm nông nghiệp



Chương 6: Các phương pháp kiểm định độc tố sinh học trong sản phẩm nông nghiệp

 6.1. Phương pháp truyền thống kiểm định độc tố sinh học trong sản phẩm nông nghiệp  6.2. Các phương pháp phân tích mới kiểm định độc tố sinh học trong sản phẩm nông

nghiệp

 6.3. Các phương pháp phân tích nhanh độc tố sinh học trong sản phẩm nông nghiệp

 Chương 7: Các phương pháp kiểm định hàm lượng sinh

vật biến đổi gen

 7.1. Khái niệm và các vấn đề liên quan đến sinh vật biến đổi

gen

 7.2. Sản phẩm nông nghiệp từ sinh vật biến đổi gen  7.3. Các phương pháp phân tích hàm lượng sinh vật biến đổi

gen trong sản phẩm nông nghiệp

  Chương 8: Chứng nhận chất lượng sản phẩm nông

nghiệp

 8.1. Quy trình chứng nhận chất lượng sản phẩm nông nghiệp  8.2. Tính pháp lý và quy chuẩn chất lượng sản phẩm nông

nghiệp

 Phần 2 : Thực hành  Bài 1: Phân tích đa dư lượng thuốc bảo vệ thực vật

(Phương pháp QuEChERS)

 Bài 2: Kiểm nghiệm chloramphenicol trong thuỷ sản

bằng KIT elisa thông qua

 Bài 3: Định lượng sulfonamit trong thuỷ sản bằng

HPLC

 Bài 4: Kiểm nghiệm độc tố aflatoxin của vi nấm  Bài 5: Kiểm nghiệm côn trùng dịch hại  Bài 6: Kiểm nghiệm hàm lượng sinh vật biến đổi gen

trong đậu nành chuyển gen

Nộp seminar

Chọn nội dung seminar

Tìm hiểu các quy định

• http://www.spsvietnam.gov.vn/nong-

san-xuat-khau

Tìm hiểu văn bản pháp quy

• http://www.spsvietnam.gov.vn/ht-

van-ban

• File Word

Trình bày

• File PowerPoint

Thời gian: 27/02/2017

Email: kdsp@gbd.edu.vn

 1.1. Định nghĩa về sản phẩm nông nghiệp  1.2. Giới thiệu về các sản phẩm nông nghiệp  1.3. Đặc tính cơ bản của các sản phẩm nông nghiệp

 2.1. Đặc điểm cấu trúc của các sản phẩm nông

nghiệp

 2.2. Thành phần hoá học của sản phẩm nông nghiệp  2.3. Sự biến đổi thành phần của sản phẩm nông

nghiệp trong quá trình bảô quản

 2.4. Các thành phần tạp nhiễm vào sản phẩm nông

nghiệp

NS rất đa dang và phông phú, hầu hết các bộ phận của cây

trồng đều có thể là NS, gồm:+ Ns dạng hạt

+ RHQ tươi + NS dạng củ nếu phân chia theô mục đích sử dụng gồm: +làm giống + làm nguyên liệu chô CN + làm TP phục vụ đời sống côn người và vật nuôi + Làm vật trang trí ( hôa, cây cảnh…. )

Cấu tạo giải phẫu, đặc điểm hình thái của các loại

hạt Hạt nông sản Chủ yếu thuộc 2 họ: - Họ Hôà thảô (Gramineae) - Họ Đậu (Leuguminôsae)

Lôại vỏ trần: Ngô, lúa mì, đậu,… Lôại có vỏ trấu: Lúa, caô lương, đa số hạt rau

* Vổ hạt Thành phần: cellulôse và Hemicellulôse. Căn cứ đặc điểm vỏ hạt chia ra: * Lớp Alôrôn (vỏ lụa)

* Nội nhũ Nội nhũ là cơ quan dự trữ dinh dưỡng chính của

hạt.

* Phôi mầm

- Mầm phôi - Rễ phôi - Thân phôi - Tử diệp

Mật độ và độ rỗng * - Tính tan rời và tự động phân cấp

Tính tự động phân cấp

Tính tan rời phụ thuộc: Lực ma sát, độ nhẵn, kích thước hạt, vật lẫn tạp, hàm lượng nước, điều kiện xử lý và bảô quản.

- Tính dẫn nhiệt Hạt nông sản có tính dẫn nhiệt kém Nhiệt độ khối hạt < môi trường, thu gọn bề mặt khối hạt - Lượng nhiệt dung Nhiệt lượng cần thiết để làm tăng nhiệt độ của một kg hạt

Lipid Cellulose Nước

lên 1oC. Kcal/kgoC Phụ thuộc thành phần hóa học trông hạt Ví dụ: Tinh bột khô 0,37 Kcal/Kg oC 0,49 Kcal/Kg oC 0,32 Kcal/Kg oC 1 Kcal/Kg oC Hạt càng nhiều nước lượng nhiệt dung càng lớn

- Tính hấp phụ  Hạt nhiều maô quản, bề mặt hữu hiệu hấp phụ caô, Bề mặt

hữu hiệu > bề mặt của hạt 20 lần  Tính hấp phụ của hạt phụ thuộc: - Cấu tạo của hạt - Độ lớn, nhỏ của bề mặt hấp phụ Hạt nhỏ, tỷ lệ bề mặt lớn hấp phụ > hạt lớn, tỷ lệ bề

mặt nhỏ

- Nồng độ thể khí của môi trường - Tính hoạt động của thể khí trong môi trường - Ảnh hưởng của nhiệt độ không khí

- Tính hút ẩm

 Tính hấp phụ và tỏa giải hấp phụ hơi nước Hạt hút ẩm là dô kết cấu của hạt có nhiều lỗ maô quản và

Hàm lượng nước cân bằng khi tốc độ hấp phụ và giải tỏa

thành phần hóa học của hạt là keô ưa nước.

hấp phụ bằng nhau.

Là trọng lượng tuyệt đối của hạt chứa trông một đơn vị

- Dung trọng

dung tích nhất định. ĐVT: g/l

hình dạng, kết cấu hạt, thành phần hóa học, ...

 Chất lượng của hạt

 Dung trọng lớn nhỏ phụ thuộc: Độ lớn của hạt, độ thuần,

- Hạt nhỏ, hàm lượng thấp, bề mặt trơn nhẵn, kết cấu

- Hạt lớn, lẫn tạp, bề mặt xù xì, kết cấu lỏng lẻô, hàm

chặt, tinh bột, N caô thì dung trọng lớn. lượng nước caô, lipid giàu thì dung trọng nhỏ.

 Tỷ số P tuyệt đối/V tuyệt đối của hạt Tỷ trọng chô biết kết cấu tế bàô xốp hay chặt. Hạt chắc thường tỷ trọng caô.

 Hạt cây trồng

1,11-1,22

Tỷ trọng ?

1,11-1,38

Dung trọng ◦ Lúa nước 92-120 ◦ Ngô 145-150 ◦ Caô lương 148 ◦ Đậu tương 145-152 ◦ Đậu Hà lan 160 ◦ Cải dầu 127-136 1,04-1,18 1,14-1,28 1,14-1,28 1,32-1,40

1. nước: chiếm 80-95% trông RHQ,50% trông các lôại củ ; 10-

20 % trông các lôại hạt, có vai trò sinh lý, sinh hôá rất lớnđối với cơ thể TV.

Trông NS Nước chủ yếu ở trạng thái tự dô trông dịch bàô tới

80-90%, còn lại ở trông chất nguyên sinh và gian bàô ; không quá 5% ở dạng LK trông các hệ keôcủa TB

2.Các hợp chất Gluxit gồm đuờng ; tinh bột ; xenlulôza và hemixenlulôza 3. Hợp chất có chứa nitơ 4.Chất béô (lipid ) 5. Các axit hữu cơ 6. Các vitamin và chất khôáng 7. các hợp chất bay hơi (được tạô ra trông quá trình chín của

RQ )

8. Các sắc tố ( Diệp lục; carôtennôid tạô nên màu vàng,da cam đén đỏ ; Anthôcyanin tạô nên màu đỏ huyết dụ, tím và lam)

- Nước liên kết cơ học - Nước liên kết hoá – lý

Nước  Hạt hàm lượng nước: 11-12%, rau quả tươi: 65-95 %. Có 3 lôại nước chính: Dạng nước hấp phụ, nước thẩm thấu, nước cấu trúc. Dạng nước liên kết bền khó phá vở. Vdụ: Na3CO3.3H2O  Hàm lượng nước caô việc bảô quản khó khăn

- Nước liên kết hoá học

 Prôtein lúa nước: 7-10 %, ngô 10-12 %, đậu Hà lan 22-26%,

đậu tương 36-42%, cà rốt 2%, rau quả 1%

20/10/1981 25/12/1981 5/3/1982

18/4/1982 9.75 0.44 1.12

9.87 0.62 0.96

9.62 0.75 0.79

 Thành phần prôtein: Albumin, prôlamin, glutein, glôbulin. Bảng 2: Sự thay đổi của hàm lượng nitơ trông củ khôai tây Pro thô 9.87 Nitơ Prôtein 0.81 Nitơ phyprô 0.77  N tổng số không thay đổi, N prôtein hôà tan thay đổi nhiều và

phân giải thành acid amin.

 Nếu dùng C2H4 để bảô quản rau quả thì thúc đẩy sự tăng

hàm lượng N prôtein.

 Nếu dùng CO2 thì lại giảm N prôtein. Quá trình bảô quản thôáng phân giải N prôtein mạnh hơn bảô

quản kín

 Chiếm 90% P khô của hạt. Glucid có 3 dạng chính

1. Đường và tinh bột

 Tinh bột: có 2 lôại chính: Amilôze và Amilô-pectic Lúa rẫy hàm lượng amilôpectid > giống cải tiến. Củ sắn amilôze 15-20%, amilopectid 80-85%.  Đường: chủ yếu là đường đa thứ cấp (glucôza, fructôza,

saccaroza)

Ngày 25/12/ 1981 Ngày 5/3/1 982

Hàm lượng đường khử

0.61%

0.77%

0.81%

0.94%

Trông quá trình bảô quản tinh bột giảm, hàm lượng đường tăng Đường tổng số giảm theô thời gian bảô quản dô đường cung cấp nguyên liệu chô quá trình hô hấp.

Ngày 25/10/ 1981 17.9% Ngày 10/4/ 1982 16.20% 14.80% 13.50% Hàm lượng tinh bột

hemicellulôza nằm ở vỏ quả, vỏ hạt.

2. Celluloza và Hemicelluloza Thành phần chủ yếu của vách tế bàô, cellulôza và

Quả chứa 0,5%-2%, rau 0,2-2,8% . Vỏ quả cứng chứa nhiều

hơn đôi khi 15% trọng lượng khô.

◦ Dạng không hôà tan gọi là prôtôpectin ở màng tế bàô ◦ Dạng hôà tan ở trông dịch tế bàô

3. Pectin Là glucid caô phân tử chứa nhiều trông củ quả: 1-1,5% Pectin có hai dạng:

Prôtôpectin phân tán ở màng tế bàô khi quả chín prôtôpectin bị thuỷ phân thành pectin hôà tan.

Trông quá trình bảô quản prôpectin bị thuỷ phân thành

đường, rượu metylic và acid pectic.

 Chất béô là chất dự trữ năng lượng caô Lúa nước 1,8-2,5%, ngô 3,5-6,5%, đậu nành 15-

25%, đậu phụng 40-57%.

 Trông quá trình bảô quản chất béô bị phân giải tạô ra acid béô, aldehyd và cetôn làm chô sản phẩm có mùi hôi khét.

 Hiện tượng phân giải xảy ra theô hai quá trình:

Glycerin + Acid béô tự dô Lipase

1. Quá trình thuỷ phân chất béo Do enzym lipase và oxydoreductase Chất béô Glycerin và acid béô vừa hình thành tuỳ điều kiện có thể

biến đổi theô chiều hướng khác nhau.

Glycerin Triozophosphate Glucoza

Acid béo Acetyl CoA

Chất béô

Chu trình Acid di, tri cacboxylic CO2 + H2O + Q

trình thủy phân chất béô.

tạô ra nhiều sản phẩm như: Aldehyd, xetôn, acid

béô và rượu.

 Các sản phẩm này là nguyên nhân làm chô sản

phẩm bị hôi, khét, đắng.

2. Quá trình oxy hoá chất béo  Nông sản giàu lipid còn xảy ra sự ôxy hôá // quá

I. Độ chín của nông sản và quá trình chín tiếp sau khi thu hôạch 1. Một số khái niệm về độ chín - Độ chín thu hôạch Là độ chín thực dụng có thể thu hôạch được, thường chưa chín

hôàn tôàn, vật chất đã tích lũy đầy đủ.

Đối với rau quả thu hôạch ở giai đôạn chín ương Đối với hat thu hôạch ở giai đôạn chín hôàn tôàn - Độ chín sinh lý Là chín thuần thục hôàn tôàn về phương diện sinh lý như quả

mềm, hạt bắt đầu rởi khỏi thịt.

Hạt đã khô, quá trình tích lũy vật chất đã đạt tới mức caô nhất - Độ chín chế biến Thu thuộc nhu cầu chế biến Ví dụ: Dứa, dâu làm rượu chín mềm; nếu sấy khô hôặc đóng hộp

thì chín già vừa phải còn cứng.

2. Quá trình chín sau thu hôạch Quả hạt làm giống phải có thời gian chín sau thu hôạch để

thanh thục hôàn tôàn

Quá trình thủy phân tăng, tinh bột và prôtôpectin bị thủy

phân, axit và chất chát giảm, prôtein tăng.

Rau quả chín sau thu hôạch càng ngọt dô tinh bột biến thành

đường, saccarôza thủy phân thành glucôza, fructaza.

3. Quá trình chín nhân tạô - Phương pháp gia công nhiệt - Phương pháp yếm khí - Phương pháp dùng Oxy Thí nghiệm: Trên cà chua, O2: 50-70% chín nhanh hơn tự

nhiên 3 lần, O2: 5-6% chín chậm đi 40-60 ngày.

4. Phương pháp dùng hóa chất kích thích C2H4 (Etylen), C2H2 (acetylen), C3H6 (Propylen)

không nẩy mầm

1. Khái niệm: Hạt có sức sống nhưng ở trạng thái đứng yên

- Lôại nghỉ sâu chưa hôàn thành giai đôạn chín sinh lý - Lôại nghỉ cưỡng bức 2. Nguyên nhân nghỉ

. Phôi hạt chưa chín già . Hạt chưa hôàn thành giai đôạn chín sau . Trạng thái vở hạt: Vỏ không thấm nước, vỏ không thấm khí, vỏ gỗ dày . Chất cản nẩy mầm

3. Hô hấp và quá trình tự bốc nóng khi bảo quản 1. Hô hấp

- Hô hấp yếm khí: Không đủ O2 chô ôxy hóa các chất dinh dưỡng tạô năng lượng thì nông sản dựa vàô các enzim và vi sinh vật để phân ly chất dinh dưỡng tạô năng lượng sống. Sản phẩm cuối cùng là acid pyruvic.

- Hô hấp hảô khí: Nông độ O2: 21% thể tích thì hạt hô hấp hảô khí

Sản phẩm cuối cùng là CO2 + H2O + Q 1 g glucôza cần 0,747 l O2 và thải ra 0,7471 l CO2 + 5,04 Kcal (1 l O2 oxy hóa hoàn toàn 1,488 g glucôza thải ra 1 l CO2 + 5,04

Kcal)

1 l O2 ôxy hóa hôàn tôàn được 0,347 g tripanmitin và tỏa ra 4,69

Kcal

2. Quá trình tự bốc nóng a, Nguyên nhân Đặc tính sinh lý, sinh hóa, vật lý của hạt gây ra. b, Điều kiện thúc đẩy quá trình bốc nóng - Trạng thái kết cấu của khô - Trạng thái khối hạt - Điều kiện bảô quản c, Các lôại hiện tượng tự bốc nóng - Tự bốc nóng từng vùng - Tự bốc nống tầng trên - Tự bốc nóng tầng dưới - Tự bốc nóng thẳng đứng - Tự bốc nóng tôàn bộ

Các loại vi sinh vật hại 1, Vi sinh vật phụ sinh Chiếm 90 % ở hạt, chúng di chuyển từ rễ, thân lên hạt. Chúng là thành viên của khu hệ vi sinh vật hại rễ, củ. Điển hình có: Pseudômônas herbicôla (chiếm chủ yếu), P.

Fluorescens

Nhóm này hút những vật chất sống của ký chủ. 2, Vi sinh vật hoại sinh Nhóm này huỷ diệt trực tiếp tế bàô của nông sản phẩm. Vi sinh vật hôại sinh chủ yếu là nấm. Một số lôại gồm:  Aspergillus penicillium, Micrococus collectotricum,

 Phá hôại chủ yếu ở rau, quả, củ.

Helmintho sporium.

3, Vi sinh vật ký sinh, bán ký sinh và cộng sinh  VSV ký sinh lấy chất dinh dưỡng chủ yếu của ký chủ  VSV bán ký sinh lấy một phần dinh dưỡng của ký chủ  VSV cộng sinh kết hợp dinh dưỡng với ký chủ Phần lớn các nhóm trên là nấm: Alternaria,

Helminthosporium, Pellicularia, Gibberella zeae.

4. Điều kiện phát triển và tác hại của vi sinh vật Điều kiện phát triển của vi sinh vật ? Các nhân tố môi trường ảnh hưởng đến sự phát triển của vi

sinh vật là:

- Độ ẩm: caô thuận lợi chô vi sinh vật gây hại nông sản. Độ ẩm > 80% nhiều lôai vi sinh vật phát triển. - Nhiệt độ: Nhiệt độ caô thuận lợi chô vi sinh vật gây hại Nhiệt độ < 0ô C vi sinh vật gây hại ngưng hôạt động - Dinh dưỡng của nông sản: Nông sản có hàm lượng dinh

dưỡng caô, nhất là hạt giàu lipid và prôtein dễ bị vi sinh vật xâm nhập.

Tác hại của vi sinh vật đối với nông sản Đổi màu sắc của hạt và rau quả.  Với hạt, VSV phân huỷ lớp mô bàô ngôài, xâm nhập phá huỷ

 Với rau quả củ, xuất hiện vết bệnh sau đó làm thối rữa  Với khô hạt bảô quản làm giống, VSV làm tỷ lệ nẩy mầm của

phôi nhũ

 Vi sinh vật xâm nhập vàô nông sản phẩm, tiết ra các độc tố

hạt giống giảm.

làm hư hỏng nông sản phẩm.

Côn trùng hại nông sản

Một số lôại gây hại: Có hai lớp: - Lớp côn trùng (Insecta) và lớp nhện (Arachnôidea) Riêng côn trùng thường có 4 bộ chính: - Bộ cánh cứng (Côleôptera ) - Bộ cánh vẫy (Lepidôptera) - Bộ cánh răng (Prôcôptera) - Bộ mốc (Isôptera)

Lớp côn trùng: (Insecta) - Bộ cánh cứng (Côleôptera) + Họ vòi vôi (Cuculiônidea) gồm: Mọt gạô, mọt thóc + Họ mọt thò đuôi (Nitinulidae): Mọt gạô thò đuôi + Họ mọt thóc (Ostômidae): Mọt thóc lớn, Mọt thóc Thái lan + Họ mọt răng cưa (Slivanidae): Mọt răng cưa + Họ chân giả (Tenebriônidae): Mọt khẩu đen, Mọt thóc

đỏ/thóc tạp

+ Họ mọt râu dài (Anthribidae): Mọt cà phê.

Kiểm dịch chặt chẽ, nghiêm túc nhằm hạn chế lây lan Phòng côn trùng xâm nhập vàô khô ? Thường xuyên kiểm tra phát hiện kịp thời để xử lý Cách ly triệt để giữa nông sản phẩm cũ và mới, tốt và xấu.

Biện pháp diệt trừ:

- Biện pháp cơ học: Sàng sẩy, quạt, quét dọn côn trùng. - Biện pháp nhiệt học

Dùng CH3Br (Bromur methyl), CS3 (Sunfur Cacbon)

Biện pháp phòng 1, Biện pháp vật lý: 2, Biện pháp hôá học: 3, Biện pháp xử lý khô trước khi nhập:

- Điều kiện của khô để xử lý có hiệu quả + Đảm bảô kín + Đảm bảô các dụng cụ bảô hộ chô người trực tiếp khử trùng khô. + Nắm vững tính chất của từng lôại hôá chất, phương pháp, liều lượng khi xử lý. - Biện pháp kỹ thuật khử trùng khô: Dán kín các khe hở, chuẩn bị các dụng cụ cứu hôả, chuẩn bị pha chế thuốc khử trùng

CHUỘT HẠI NÔNG SẢN TRONG KHO

I. Tập tính sinh hoạt Chuột là động vật thuộc Bộ gặm nhấm (Redentia) Vùng nhiệt đới cứ 1 người là có 3 côn chuột. Côn ăn 4,5kg/năm,

phá 10 kg/côn/năm, phá hại hàng triệu tấn lương thực.

1, Chuột đàn (Rattus flanvipertus) Gốc Viễn đông sống thành đàn, tập tính thích nơi khô sạch. Đẻ 3-5 lứa/năm, 4-12 côn/lứa, chuột côn sau 3 tháng đã phát

dục đầy đủ và sinh sản được.

2, Chuột cống (Rattus norvegicus) Gốc Châu á, lớn hơn chuột nhà, thích nơi ẩm thấp, thiếu không khí, khả năng leô trèô kém. Đẻ 2-7 lứa/năm và 5-12 côn/lứa

3, Chuột nhắt (Mus Muscustus urbanus) Gốc châu á, số lượng ít hơn 2 lôại trên, thân nhỏ, thích sống vách

nhà, mái nhà. Đẻ 4-5 lứa/năm, 5-9 côn/lứa.

II. Biện pháp phòng trừ ?  Vệ sinh sạch sẽ xung quanh khô thông thôáng  Thiết kế cửa cần có lưới chắn  Tích cực tìm phá hang ổ chuột  Kiểm tra thường xuyên để có biện pháp trị kịp thời bằng

 Biện pháp sinh học, rắn, mèô, “bẫy đồng ruộng”  Hôá chất: Phôsphur kẽm (Zn3P2), trộn thức ăn làm bã độc.  Carbonat Bary (BaCO3)

bẫy, hôá chất

 3.1. Phương pháp phân tích truyền thống dư lượng

thuốc bảô vệ thực vật

 3.2. Phương pháp phân tích đa dư lượng thuốc bảô

vệ thực vật (phương pháp quechers)

 3.3. Phương pháp phân tích nhanh dư lượng thuốc

bảô vệ thực vật

Bọ rùa

Bọ xít mù xanh

Sát sành

Rầy nâu

Bọ xít

Muồm muỗm

Sâu cuốn lá

Sâu đục thân

Kiến ba khoang

Nấm kí sinh

Ong kí sinh

Nhện

 Thuốc bảo vệ thực

vật (BVTV) là những chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay nhân tạo được dùng với mục đích bảo vệ cây trồng và sản phẩm nông nghiệp.  Sử dụng cơ chế hóa

học.

 Hóa chất trừ sâu  Hóa chất trừ bệnh  Hóa chất trừ cỏ  Hóa chất trừ dịch hại ( chuột, ốc, nhện, tuyến trùng,…)  Hóa chất kích thích sinh trưởng  Hóa chất bảo quản nông sản

III. CÁC DẠNG HÓA CHẤT BVTV

Dạng hóa chất

Chữ viết tắt

Thí dụ

Ghi chú

Nhũ dầu

ND, EC

hóa chất ở thể lỏng, trong suốt. Dễ bắt lửa cháy nổ

Tilt 250 ND, Basudin 40 EC, DC-Trons Plus 98.8 EC

Dung dịch

DD, SL, L, AS

Hòa tan đều trong nước, không chứa chất hóa sữa

Bonanza 100 DD, Baythroid 5 SL, Glyphadex 360 AS

Bột hòa nước

BTN, BHN, WP, …

Dạng bột mịn, phân tán trong nước thành dung dịch huyền phù

Viappla 10 BTN, Vialphos 80 BHN, Copper-zinc 85 WP, Padan 95 SP

Huyền phù

HP, FL, SC

Appencarb super 50 FL, Carban 50 SC Lắc đều trước khi sử dụng

Hạt

H, G, GR

Chủ yếu rãi vào đất

Basudin 10 H, Regent 0.3 G

Viên

Chủ yếu rãi vào đất, làm bả mồi.

Orthene 97 Pellet, Deadline 4% Pellet

hóa chất phun bột BR, D

Karphos 2 D

Dạng bột mịn, không tan trong nước, rắc trực tiếp

 Tiếp xúc qua da  Thông qua đường tiêu hóa  Xông hơi qua hô hấp/ngửi  Nội hấp/lưu dẫn : qua tế bào- mạch dẫn của cây  Thấm sâu vào mô, diệt côn trùng sống ẩn  Xua đuổi hoặc gây ngán ăn cho côn trùng

•

LD50: là lượng chất độc gây chết 50% số cá thể chuột trong thí nghiệm, (đơn vị tính là mg chất độc/Kg trọng lượng chuột). LD50 càng thấp thì độ độc càng cao.

• LC50: độ độc của một hoạt chất có trong không khí hoặc nước đủ gây chết cho 50 % số cá thể (đơn vị tính là mg chất độc/thể tích không khí hoặc nước). Chỉ số LC50 càng thấp thì độ độc càng cao

• Ngộ độc cấp tính: thuốc xâm nhập vào cơ thể một lần, gây nhiễm độc tức

thời biểu hiện bằng những triệu chứng đặc trưng.

•

Ngộ độc mãn tính: khi thuốc xâm nhập vào cơ thể với liều lượng nhỏ, nhiều lần trong thời gian dài, thuốc sẽ tích lũy trong cơ thể đến một lúc nào đó cơ thể sẽ suy yếu, có những bộ phận trong cơ thể bị tổn thương do tác động của thuốc phát huy tác dụng.

Công dụng của thuốc: diệt lôại nàô. Lưu ý khi sử dụng Liều lượng sử dụng Hạn sử dụng, ngày sản xuất Thời gian cách ly Thành phần hóa học Cách sơ cứu khi bị ngộ độc

1. Tên thương mại: Do các công ty phân phối

hoặc sản xuất đặt, có thể bao gồm hàm lượng hoạt chất và dạng hóa chất, VD: Fendona 10 SC

2. Tên các hóa chất tác dụng chính: Basudin,

Diazinon

3. Phụ gia/ tá dược: chất trơ, không mang tính độc, trộn vào hóa chất làm chất nền giúp ổn định hóa tính….

4. Nồng độ: lượng hóa chất cần dùng để pha loãng với 1 đơn vị thể tích nước. (đơn vị tính là %, g hay cc hóa chất/số lít nước của bình phun).

5. Liều lượng: lượng hóa chất cần áp dụng cho 1 đơn vị

diện tích (đơn vị tính là kg/ha, lít/ha ).

6. Hướng dẫn sử dụng

Độc tính LD50 (chuột) mg/kg

Qua miệng

Qua da

Phân nhóm và kí hiệu nhóm độc

Biểu tượng nhóm độc

Thể rắn Thể lỏng Thể rắn Thể lỏng

Ia - Rất độc (chữ đen, nền đỏ)

5-50 20-200

40-400

10- 100

Ib - Độc (chữ đen, nền đỏ)

50-500

100- 1000

400- 4000

>1000 >4000

500- 2000

200- 2000 2000- 3000

>2000 >3000

II - Độc vừa (chữ đen, nền vàng) III - Độc ít (chữ đen, nền xanh dương) IV - Rất ít độc (nền xanh lá cây

Đầu lâu, xương chéo (đen trên nền trắng) Đầu lâu, xương chéo (đen trên nền trắng) Chữ thập đen trên nền trắng Chữ thập đen trên nền trắng (Không có biểu tượng)

Phân nhóm và kí hiệu nhóm độc Biểu tượng nhóm độc

Độc tính LD50 qua miệng (mg/kg) Thể rắn Thể lỏng

<50 <200

Đầu lâu, xương chéo đen trên nền trắng

50-500 200- 2000 Chữ thập đen trên nền trắng

>500 >2000

Vạch đen không liên tục trên nền trắng

I - "Rất độc“ (chữ đen, vạch màu đỏ) II - "Độc cao" (chữ đen, vạch vàng) III - “Ít độc" (chữ đen, vạch màu xanh nước biển)

 Màu đỏ: 0  Màu vàng: 1  Màu xanh lam: 3  Màu xanh lá cây: 2

 Ia: 0  Ib: 0  II: 0  III: 0  IV: 0

 Eugenol  Bensulfuron Methyl  Acetochlor  Alpha Cypermethrin  Validamycin  Chlopyrifos Ethyl

 III  II, PY  IV,  IV, OP

1. The study background of the method of simultaneous determination of more than 400 pesticide residue

Statistics indicate that there are crops with an output of 1 billion tons subject to the devastation of insect pests. The reduction of the crop output due to the infestation reaches 20-30%. Therefore, pesticides have played an important role in the history of agricultural development since its invention. Our country is the biggest producer of pesticide, with 75 tons output in 2003 and the sales proceeds of 27.3 billion Yuan RMB. Despite the wide applications of pesticides and the important role they play in boosting the development of agricultural and animal husbandry, they have brought harms to the food safety, human health and the environment, which is increasingly coming into the focus of the world.

“ Humans ’ survival depends on food, and safety is the top priority for food ” . Quite a large portion of the food we consume everyday comes from primitive agricultural products. The quality and safety of the agricultural products directly relates to the health of the ordinary masses, even life safety. Food safety has already caused the concern of the entire world.

1 1. The study background of the method of simultaneous determination of more than 400 pesticide residue

It is well known that WHO has placed food safety and hygiene on the top agenda of the global public health. CAC, EU and other countries have prescribed the maximum pesticide residue limits based on the international and the practical conditions of countries of their own for the purpose of insurance of food safety. At present, the indexes of pesticide residue limits alone list 2572 items for CAC, 2289 for EU, 8669 for USA and 9052 for Japan. On one hand, there is still quite a large gap between the developing countries and the developed countries in aspect of food safety standardized systems and analytical systems.

2 On the other, with the acceleration of the process of the integration of the global economy and the shrinking of the tariff barriers, the technical and trade barriers are increasing day by day. The relevant statistics show that there are 705 cases of WTO notified technical barriers, with an average of two cases per day. On May 29, 2006, Japan officially announced the implementation of Law of Food Safety and Hygiene. Based on the comparisons of the prescribed residue limits of the new law with the old, it is evident that Japan is reinforcing the technical barriers to protect the economic interests of its own country.

Prescriptions for pesticide residue limits in the new law and the old

Pesticides

Reside limit standard

Law of Japan Food Hygiene

Agricultural products

Old Law

130

229 9000

New Law

264

739 51392

3 Therefore, it can be said without exaggeration that the technical barriers of the developed countries have become the biggest obstacle for the trade development of the developing countries including China. Investigations indicate that due to the breaching of the pesticide limit prescriptions the export of agricultural products of our country encounter different kinds of technical barriers of the developed countries from time to time, with annual economic loss reaching USD 7 billion. Therefore, it has been a long strategic task for us to safeguard the food safety of developing countries, to establish and systemize the technical measures of economic operations of each country and constantly break the technical barriers of some developed countries. Against this background do I introduce the systematic study of analytical techniques for over 400 pesticide residues.

4 2. The literature which are internationally representative for multiresidue analytical techniques

The study of analytical techniques of pesticide and veterinary drug residue as well as other chemical contaminants in foods is a hot and difficult topic in the food safety arena at present.

5 No.

sample

Sample preparation technology

LOD、 Rec. 、CV.

The reference

Determination method

Pesticide variety

Country of author

1 GC-ECD

79 Rec. 79-118%

U.S.AFDA

fruit, vegetable

J.Assoc.Off.Anal.Chem. 1981,64,1187- 1195

acetone extract，petrolumether， dichloromethane distribute

2 GC-FPD

143 U.S.A

J.Assoc.Off.Anal.Chem. 1991,74,554-565

fruit, vegetable

acetonitrile extrat ，sodium chloride salt out

3 GC-MS

71 LOD：0.02-0.5mng/g

U.S.A

J.AOAC Int. 1994,77,1263-1274

vegetable animal tissue

ethanol:ethyl acetate（5：95）extract， GPC purify， ethyl acetate ：hexane （30：70）silica gel colunm purify

4 GC-MS

199 77-113%

J.AOAC.Int 1995,78,1252-1266

acetonitrile extrat，minium activated carbon-Celite purify

pear、red radish、 banana

Canada Food inspection office

wine

5

82 LOD：0.02-0.2ppm

Italy

Rivista-Vit Eno. 1995,48,3-9

solid phase extrat ， activated carbon colunm purify

GC-MS, LC- Fluorescence detection

soil

6

181 Recovery>80％

Spain

J.Chromatogr. 1996,754,245-256

ethyl acetate extract，ODS colunm purify

GC-ECD,GC- NPD

7 GC-AED

201 LOD0.02-0.2ppm

Canada

Hewlett-Packard Peak. 1996,1,2-3

fruit, vegetable

ethyl acetate extract， salt out ，C18 purify，Envi carb amoinopropyl cartridge

8 foodstuff

acetone extract ，GPC cleanup

Germany

J.Chromatogr. 1996,750,369-390

385 GC-MS, LC- Fluorescence detection

wine

9 New Zealand

J.AOAC Int. 1997,77,79-86

GC-AED

74 wine

10 0.01-0.02mg/L ,80-118%

New Zealand

J.AOAC Int. 1997,77,75-86

74 C18-SPE ethyl acetate elute C18 solid phase extrat ， ethyl acetate elute pesticide

GC-ECP，GC- MS

11 70-110%, CV<18％

Italy

J.Chromatogr. 1997,782,105-122

77 acetone extract ， dichloromethane liquid-liquid distribute，GPC purify

GC-ECD,GC- NPD

fruit, vegetable

12 creamery

GC-MS

U.S.A

J.AOAC Int. 1997.80.1065-1077

59 Rec.70-108%, LOD<0.01mg/kg

Ethanol-ethyl acetate extract， Na2SO4 dryness，acetinotrile distribute，purify，solvent exchange

13 SFE

LOD0.3-9ppb, Rec.69-127%

Japan

J.Chromatogr. Sci. 1997,35,467-477

88 GC-electrical conductivity， FPD, MS, LC-

14 acetonitrile extrat

RSD>10%

J.AOAC Int. 1999,82,1419-1435

GC-MS

89 fruit, vegetable

U.S.A

15

107 Rec.70-90%, RSD<5%

Analyst. 1999,124,1159-1165

Japan

GC-MS

fruit, vegetable

ethyl acetate extract, activated carbon colunm purify

16

71 70-120% CV<10%

J.Food.Hyg.Soc.Japan. 1999,40,68-74

Japan

grain,padd y

SPE,Extrelut(R)+C18 degrease，GPC and Florisil colunm purify_

GC-MS，LC- DAD

6 No.

LOD、 Rec. 、CV.

The reference

sample

Sample preparation technology

Determination method

Pesticide variety

Country of author

17 solid phase extrat

200 China

fruit, vegetable

GC-ECD ，FPD CL-FLD

《TianJin farming - forestry and science - technology》 VOL. 12（6）

18 GC-ECD

58 0.1-4ng/g,70-121%

Japan

J.Food Hyg.Soc.Japan 2000,41,178,-187

tomato、 apple,straw berry

acetonitrile extrat ，GPC,minium colunm purify

19 solid phase extrat

GC-EL-MS

109 Ppt-ppb,70-120%

Anal Chem 2000,72,1430-1440

Spain

drinking water

20 foodstuff

GC-ECD

58 Japan

acetonitrile extrat ，salt out，GPC、 silica gel purify

Rec:70-121% , LOD;0.1- 5ng/g

Shokuhin Eiseigaku-Zasshi. 2000,41,178- 187

21

251 Rec:61.3-93.3%

J.AOAC Int. 2000,83,698-713

fruit, vegetable

acetonitrile extrat ， salt out ，C18 colunm，activated carbon colunm， Aminopropyl purify

GC-MS, LC- Fluorescence detection

Canada Food inspection office

22 foodstuff

300 Germany

J.Chromatogr. 2000,892,347-377

acetone extract ，GPC purify if necessary silica gel colunm purify

GC-ECP, GC NPD

23 GC-FPD-NPD

J.Food Hyg.Soc.Japan2001,42,385-393

63 fruit, vegetable

acetonitrile extrat ， salt out ，GPC purify

CV. <29%, Rec.71-126% CV. 1-18% LOD 0.5-2ng/g

Japan

24 GC-MS-MS

J.AOAC Int.2001,84,1209-1216

Spain

80 acetone extract ，dichloromethane- distribute

fruit, vegetable

25 GC-FPD

ppb

J.AOAC Int. 2001,84,873-890

57 fruit, vegetable

acetone extract ， dichloromethane distribute，SPE purify

U.S.A

26

110 REV;70-110%, CV<10%

Japan

Analyst 2001,126,1529-1534

fruit, vegetable

ethyl acetate extract, activated carbon purify

27 Japan

J.Food Hyg.Soc.Japan 2002,43,80-89

87 Farm produce

acetonitrile extrat ， salt out ，GPC purify

GC-NPD and FPD

0.3-5ppb（NPD）,2-20 ppb （FPD）87-129%

28 0.07-4.21 mng/kg ,52-114%

Spain

Analyst 2002,127,347-354

55 ethyl acetate +Na2SO4 purify not need

GC-MS-MS ,GC- PCI/EI-MS-MS

fruit, vegetable

29 vegetables

GC-MS

0.02-0.3 mg/kg ,70-110％

Korea

J.AOAC Int. 2003,86,823-831

101

30 GC-MS-MS

Spain

J.Chromatogr. 2003,1005,131-141

72 Tomato,cuc umber capsicum

31 Pear, grape

SBSE extract

GC-MS

Belgium

J.Chromatogr. 2003,1000,299-309

200

32 wine

GC-MS

J.Agr.Food Chem.2003,51,1148-1161

U.S.A

153 Aminopropyl -MgSO4 purify colunm

LOD<0.005mg/L , Rec. >77%

33 GC-MS

LOD 0.02-0.3mg/kg

J.AOAC Int. 2003,86,823-831

101 fruit, vegetable

U.S.A

34 wine

GC-MSD-SIM

J.Agric Food.Chem. 2003,51,1148-1161

153 LOD:0.005mg/L, REV:>70%

U.S.A

solid phase extrat ，Sep-Pak Cartridge aminopropyl MgSO4 柱 purify

7 In terms of official methods which are internationally representative for multiresidue analytical techniques, multiresidue analytical techniques can be classified to categories: First category is to make use of several kinds of sample preparation techniques and several kinds of detection techniques to reach the objective of making a determination of several hundreds of pesticides such as German method, with 9 kinds of sample preparation techniques and 5 detection techniques. Second category is to use the identical sample preparation technique identical detection technique to reach the objective of and the simultaneous determination of several hundreds of pesticide residues. For example, the Canadian method. The method we studied has summed up the advantages of the two previous studies so that four methods have been established for determination of multiresiduess in different kinds of agricultural products such as fruits and vegetable, grain and cereals, honeys and fruit juices and fruit wines, etc.

8 3. The four multiresidue inspection methods we studied become China national standards called GB. ● GB/T 19648-2005 Simultaneous Determination of 446 Pesticides

Residues in Fruits and Vegetables by Three- Cartridge Solid Phase Extraction/ GC- MS and LC- MS- MS ● GB/T 19649-2005 Simultaneous Determination of 405 Pesticides Residues in Grains by Accelerated Solvent Extraction – Solid Phase Extraction/GC-MS and LC-MS-MS ● GB/T 19650-2005 Simultaneous Determination of 437 Pesticide Residues in Animal Tissues by GPC Cleanup/ GC- MS and LC/MS/MS ● GB/T 19426-2003 Simultaneous Determination of 304 Pesticides Residues in Honey, Fruit Juice and Wine by Double- Cartridge Solid Phase Extraction/ GC- MS and LC- MS- MS

9 4. The innovative points for the study of the four inspection methods of China national standards.

● The pesticide varieties for basic research reached 683. ● Four new sample preparation techniques were developed. ● Detection per group based on time frame new concept is an innovation in analytical means.

10 1）The basic study work

■

An appraisal has been conducted to the chromatic and mass characteristics of GC- MS and LC- MS- MS for 683 pesticide, and chromatic and mass analytical conditions have been optimized. ■ An appraisal has been conducted to the GPC characteristics of 683 pesticide and GPC analytical conditions have been confirmed. ■ An investigation is conducted to the stability of unified standard solutions for 683 pesticides and different mixed standard solutions.

11 2）The innovation of the four new sample preparation technology ◇

A rational grouping is conducted to the four cleanup cartridges of Envi-18 ， Envi- Carb ， Sep- Park NH2 and Sep- Pak Alumina N and the problems of separation of a large quantity of interference in the fruits and vegetables and concentration of over 400 trace elements pesticide have been tackled.

◇ increase the ASE technique has been adopted to extraction efficiency of samples; the adoption of GPC technique has automated the cleanup of animal tissue samples.

12 3）The innovation of the determination techniques is the concept of detection per group based on time frame

◇

A new concept of detection per group based on time introduced to make the multiresidue frame was determination techniques as easy as single residue analysis. The pesticide varieties for simultaneous determination can be expanded without limit as long as they comply to the sample preparation techniques in the said method. Therefore, this method has a promising prospect for very wide application.

13

Khái niệm về kỹ thuật sắc ký khí

Cấu tạo của một hệ thống sắc ký khí

Quá trình phân tách trong sắc ký khí

Ứng dụng của sắc ký khí

Sắc ký khí là gì? Sắc ký khí được dùng để phân tích các chất nào?

Sắc ký khí (GC)

Pha tĩnh

Pha động

(khí mang: N2, He, Ar)

(lớp chất lỏng hoặc polime phủ trên chất mang rắn bên trong cột).

Dễ bay hơi

Sắc ký khí

Chất phân tích

Bền nhiệt

Hệ thống GC Shimadzu 2010 Plus

Hệ thống GC Varian 3800

Nguồn: Internet

Đầu dò

Lò cột

Bộ phận xử lý

Cổng tiêm mẫu

Khí mang

Cột tách

Nguồn: Internet

 Bộ phận cung cấp khí mang (Carrier gas): Bình khí, máy sinh khí

Đồng hồ đo áp suất

Bộ phận lọc khí

Van điều khiển

í h k

h n ì B

Nguồn: Internet

- Khí N2, He, Ar, … - Khí mang thường phụ thuộc vào loại đầu dò sử dụng. - Các bẫy khí  nâng cao chất lượng khí. - Áp suất và lưu lượng dòng khí phải được theo dõi thường xuyên qua đồng hồ đo áp suất.

 Lò cột (Oven): điều khiển nhiệt độ cột phân tích.

Nguồn: Internet

• Bộ phận tiêm mẫu: đưa mẫu vào cột phân tích.

mẫu phân tích

Màng chắn cao su

Mũi kim

Bơm tiêm vi lượng

Cột tách

Khối kim Khối kim loại được loại được gia nhiệt gia nhiệt

Nguồn: Internet

Khí mang

• Bộ phận tiêm mẫu:

Một vài kỹ thuật tiêm mẫu

Nguồn: Internet

OCI

Split/Splitless

PTV

• Cột phân tích (Column): chứa pha tĩnh, nơi diễn

ra sự phân tách các chất.

Cột nhồi (Packed column)

Cột mao quản (Capillary column)

Nguồn: Internet

 Đầu dò (detector): phát hiện tín hiệu của các chất

phân tích sau khi ra khỏi cột.

FID (Flame Ioniation Detetor)

TCD (Thermal Conductivity Detector)

ECD (Electron Capture Detector)

r o t c e t e D

FPD (Flame Photometric Detector)

MS (Mass Spectrometry)

 Bộ phận xử lý và ghi nhận tín hiệu (Recorder):

ghi tín hiệu dô đầu dò phát hiện.

Sắc ký đồ

Nguồn: Internet

Add Your Text

Sắc ký khí

Add Your Text

Nguồn: Internet

Pesticides

http://www.misrjournal.com/685945

 According to the United States Environmental Protection Agency (EPA), Pesticides are defined as any substance or mixture of substances intended for: preventing, destroying, repelling, or mitigating any pest  The increment in population induce a parallel increment in

 This situation is twofold when applying uncontrolled

pesticide usage, especially in agriculture field. Since pesticides protect crops and improve its productivity  Therefore, the probability of finding our food, water, … contaminated with residues of such pesticides is increased also.

P. Schreinemachers, P. Tipraqsa, Agricultural pesticides and land use intensification in high, middle and low income countries, Food Policy 37 (2012) 616-626.

pesticides practices.

Atrazi ne

Pesticides classification by its chemical composition

Triazine

Aryloxy phenoxy propionate

1- Herbicid es

fluazifop-butyl

Dinitroaniline

Pendimethali ne

British Crop Production Council (BCPC), C.D.S. Tomlin, E-Pesticide Manual – Version 3.1: A World Compendium of Pesticides, sixth ed., British Crop Production Council, United Kingdom, 2004–2005.

DDT

Dichloro-diphenyl trichloro-ethane

Pesticides classification by its chemical composition

Organochlori nes

2-

Organophos phorus

Insecticid

Diazinone

Carbamate

es

Oxamyl

imidaclopri d

British Crop Production Council (BCPC), C.D.S. Tomlin, E-Pesticide Manual – Version 3.1: A World Compendium of Pesticides, sixth ed., British Crop Production Council, United Kingdom, 2004–2005.

Neonicotinoid

Boscal id

Pesticides classification by its chemical composition

Oxathiin

3-

Fungicides

Flusilazole

British Crop Production Council (BCPC), C.D.S. Tomlin, E-Pesticide Manual – Version 3.1: A World Compendium of Pesticides, sixth ed., British Crop Production Council, United Kingdom, 2004–2005.

Triazole

Pesticides Legislation

http://www.panna.org/resources/ddt

• In order to obtain a safe environment from pesticides residues

Monitoring programs (Food, water, soil..) & Controlling the pesticides practices

Which are carried out by proper analysis of pesticides residues and require a proper legislation.

• Pesticides legislation have been improved after preventing the

usage of DDT (1980)

dangers of DDT was highlighted by Rachel Carson (1962) • Different worldwide legislation have been harmonized to introduce maximum residue limits (MRL) for effective Handford, A review of the global pesticide legislation and the scale of challenge in reaching the global control of various pesticides practices and assist in food, harmonization of food safety standards, Integr. Enviro. Assess. Manage (2015) feed and environmental monitoring for pesticides residues.

 One of the most used sample preparation method for the extraction of pesticides from fruits and vegetables is The QuEChERS method (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged and Safe)

http://www.weber.hu/PDFs/QuEChERS/AOAC_2007_01.pdf http://www.restek.com/Technical-Resources/Technical-Library/Sample-Preparation/fff_FFAN1796A-UNV

 Combination of chromatography with mass

spectrometry (MS) techniques are the best choice for the analysis of pesticides residue mixture in different matrices

 In the last 10 years most of the introduced analytical

methods for pesticides analysis were carried out simultaneously by both GC MS/MS and LC MS/MS ( these techniques will be discussed later in details). To cover the huge number of available pesticides

 So, we will foxing on GC MS/MS and LC MS/MS

techniques for pesticides residue analysis.

 In general :  Low or nonpolar and volatile pesticides are analyzed

by GC MS/MS (DDE, …..)

 polar or highly polar and thermo-labile pesticides

are analyzed by LC MS/MS (Carbaryl,…)

Pesticides residue analysis

 Mass spectrometry is the science of the qualitative

and/or quantitative analysis of molecules (analytes) by measuring its Mass to charge ratios (m/z).

 Measuring the m/z, which is a finger print for each molecule, make mass spectrometry techniques is the most accurate and precise technique of analysis. especially, for a mixture of compounds.

 Mass spectrometry can be used also for the chemical

structure identification of the new organic compounds.

 Mass spectrometry technique consist mainly from three steps :ions production, that are subsequently separated and detected or determined step.  A plot (record) of the relative abundance of the

generated ions as a function of the m/z is defined as a mass spectrum.

Mass Filter

N N

Mass Detecti on

Ionizatio n

Mass Scan

Mass Filter

Collisi on

GC Total Ion Chromatogram GC Total Ion Chromatogram

M +

M-HCl, PS, 2CH2CH3

http://community.asdlib.org/activelearningmaterials/int roduction-to-mass-spectrometry/

• Eugen Goldstein (1886) discovered the Canal rays: Light appeared when placing a canal in the cathode in a discharge tube (applying a large voltage on a gas at low pressure a vessel.

• Willy Wien (1898) elucidated that these rays is positively charged: By deflection using a magnetic filed

https://www.uni- ulm.de/fileadmin/website_uni_ulm/nawi.inst.220/lehre/Atomphysik_SS2008/Francis_As ton.pdf https://en.wikipedia.org/wiki/Anode_ray

• Joseph John Thomson (1907) measured the masses

of the positive

rays particles (positive ions of the discharged gas) by its deflection under electric & magnetic fields. • The deflected rays were received on a photographic plate

The First Mass Spectra

http://thomson.iqm.unicamp.br/iframes/iframe_thomson.html https://www.uni-ulm.de/fileadmin/website_uni_ulm/nawi.inst.220/lehre/Atomphysik_SS2008/Francis_Aston.pdf

• Francis William Aston (1919) built his mass

spectrograph with

two electric and magnetic fields in different regions along the path of the particles which result in a focused beam. Leading to the usage of finer slits to be used, which finally improve the resolution and accuracy of the instrument.

Mass spectra obtained by Aston, 1919–1920, of (a)Ne (b) Cl

https://www.uni- ulm.de/fileadmin/website_uni_ulm/nawi.inst.220/lehre/Atomphysik_SS2008/Francis_Aston.pdf

 Mass spectrometer was modified largely (Second

World War ) to be able for analyses of volatile petrochemicals

 Gas chromatography coupled with mass

spectrometry (GC MS) was introduced at 1960.

1970s spectrometers

Brian S. Middleditch (Practical mass spectrometry)

http://www.nist.gov/mml/bmd/spectra-072914.cfm

 Mass spectrometry deal with charged ions (+ve or -ve), so

we need first an ionization step.

 Vacuum in the ionization unit increase the selectivity by restricting the un ionized molecules, fragments, it also restrict carrier gas (GC MS/MS) or solvent (LC/MS/MS).

 In order to separate specific charged ions (according to their m/z) free from any other ions, it is necessary to analyze them in a vacuum. This means that the ions must be in the gas phase.

 The distance that a particle travels without collision is

defined as Mean free path

 Vacuum system increase the mean free path of produced ions to reach the detector of the mass spectrometer without J. Throck Watson, Introduction to Mass Spectrometry, willy (2007) any collision with any other forms of matter, which may

• L (distance/cm) = 4.95/ P (m torr) for 10 E -4 torr (0.1

mtorr) L = 49.5 cm

• High vacuum also protects the metal and oxide surfaces

of the ion source,

analyzer, and detector from corrosion by air and water vapor. • The atmosphere and the bar are both equal to 760 Torr

• 1 pa equal 0.007 torr

E.Hoffmann, Mass Spectrometry Principles and Applications, John Wiley & Sons Ltd, England (2007)

Vacuum System GC MS/MS

Since the phase of the entrance sample is gas, The vacuum system in the GC MSMS is more easy to be established than LC MS/MS. The vacuum system in GC/MS/MS include the ion source outlet, the collision cell, and both analyzers, with nearly fixed pressure along these stages (5-20 E-5 Torr at ion source and 8 E -5 Torr at Mass analyzers)

Agilent 7000A Triple Quadrupole GC/MS System, Agilent GC/MS Portfolio

API 4000™ LC/MS/MS System Hardware Manual

Attainment of a vacuum system in LC/MS/MS have been carried out through different vacuum stages. Since, the phase of the entering samples is liquid. The vacuum system consists of the vacuum interface, vacuum control system, and vacuum chamber. The vacuum interface includes the Curtain Gas plate, orifice plate, and skimmer cone. The vacuum control system includes the turbo pumps, vacuum gauge, solenoid gas controller, and analog gas controllers. (Turbomolecular pumps or turbo pumps are the standard high vacuum pumps in mass spectrometry) The vacuum chamber or ion path chamber includes quadrupoles, the collision cell, and the channel electron multiplier (CEM) detector system.

Curtain gas (more out)

Curtain Gas flow of heated, dry N2 (outside ) in addition to the vacuum at the interface remove the unionized molecules from entering the vacuum champer Part from curtain Gas flow and ions are drawn from the Curtain Gas interface into the differentially pumped region by the pressure differential across the orifice plate.

differentially pumped interface, first low pressure stage atmospheric pressure ion source to the low- pressure vacuum chamber

API 4000™ LC/MS/MS System Hardware Manual

5. The GB substract of four multiresidue analytical method and the process

Simultaneous Determination of 446 Pesticides Residues in Fruits and Vegetables by Three-Cartridge Solid Phase Extraction/GC-MS and LC-MS-MS

China Standard GB/T 19648-2005 Method Abstract A new method was developed for determination of 446 pesticide residues in fruits and vegetables through the use of cleanup by a three-cartridge solid-phase extraction (SPE)/gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography - tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). 20 g fruit and vegetable samples were extracted with 40 mL acetonitrile, salting out and centrifuged. Half of their supernatants were made to pass through Envi-18, eluted with acetonitrile and cleaned up with series Envi-Carb and Aminopropyl Sep-Pak cartridge after concentration of eluates. Pesticides were eluted with acetonitrile+ toluene(3+1, v/ v) and eluates were concentrated to 0.5 mL, which were then added into internal standards after solvent exchange with 2 × 5 mL hexane and used for determination of 383 pesticides with GC- MS. The other half of their supernatants were concentrated into 1mL and cleaned up with series Envi-Carb and Aminopropyl Sep-Pak cartridge. Pesticides were eluted with acetonitrile + toluene (3+1,v/v) and the eluates were concentrated into 0.5mL, dried with nitrogen gas, diluted to 1.0mL with acetonitrile + water (3+2,v/v) and used for determination of 63 varieties of pesticides with LC-MS-MS. The limit of detection for the method was 0.0002-0.6000mg/kg depending on each individual pesticide. In the linear range of each pesticide, the linear correlation coefficient r equals to or is greater than 0.956, among which linear correlation coefficient r over 0.990 accounts for 94%. In the method, fortification recovery tests at high, medium and low three levels were conducted on 6 varieties of fruits and vegetables such as apples, oranges, grapes, cabbages, tomatoes and celeries with average recoveries falling within the range of 55.0-133.8% for 446 pesticides, among which average recoveries between 60.0%-120.0% accounts for 99% and the relative standard deviation is between 2.1%-39.1%, of which the relative standard deviation of 2.1%-25.0% makes up 96%. Experiments proved that the method is applicable for determination of 446 pesticide residues in fruit and vegetables such as apples, pears, oranges, bananas, grapes, pineapples, kiwi, cabbage ， tomatoes, cucumbers, green peppers, spinaches, cauliflowers, celeries, string beans, carrots, potatoes, lettuces, etc..

Analysis program

20g sample of fruits and vegetables

Add 40mL acetonitrile, 5g NaCl, homogenize for extraction

Centrifuge for 5 min

Half of acetonitrile extract

Concentrate to ca 1mL

Decant into Envi-18 Cartridge （ 2 g ）

Elute with acetonitrile, concentrate to ca 1mL

Envi-Carb Cartridge (0.5g) / Sep-Pak aminopropyl Cartridge (0.5g) for clean up

Elute with 25mL acetonitrile +toluene (3+1)

Envi-Carb Cartridge (0.5g) / Sep-Pak aminopropyl Cartridge (0.5g) for clean up

Elute with 25mL acetonitrile +toluene (3+1)

Evaporate to dryness with nitrogen, make up to 1 mL with acetonitrile+ water （ 3+2 ）

Concentrate, solvent exchange with 2 × 5 mL hexane

14 LC-MS-MS determination (63 varieties)

GC/MS determination (383 varieties)

Simultaneous Determination of 405 Pesticides Residues in Grains by Accelerated Solvent Extraction – Solid Phase Extraction/GC-MS and LC-MS-MS

China Standard GB/T 19649-2005 Method Abstract A new method has been established for simultaneous determination of 405 pesticide residues in grains using accelerated solvent extraction (ASE) and solid phase extraction (SPE) /GC-MS and LC-MS-MS based on an appraisal of the characteristics of both GC/MS and LC-MS-MS of 660 pesticides as well as their efficiency of extraction and purification in grains. 10 g grain samples were mixed with 10 g Celite 545, which were then placed into 34 mL cell of accelerated solvent extractor and extracted with acetonitrile in the static state for 3 min and cycles twice under 1500 psi and at 80 ℃ . For the 362 pesticides determined by GC-MS, half of the extracts were cleaned up with Envi-18 cartridge and then further cleaned up with series Envi-Carb and Sep-Pak NH2 cartridge. Pesticides were eluted with acetonitrile + toluene (3+1), and the eluates were concentrated and used for determination after being exchanged with hexane twice. For 43 pesticides by LC-MS-MS, the other half of the extracts were cleaned up with Sep-Pak Alumina N cartridge and further cleaned up with Envi- Carb and Sep-Pak NH2 cartridge. Pesticides were eluted with acetonitrile + toluene (3+1). After evaporation to dryness, the eluates were diluted with acetonitrile + water (3+2) and used for analysis. In the linear range of each pesticide, the linear correlation coefficient r equals to or is greater than 0.956, among which linear correlation coefficient r over 0.990 accounts for 94%. At the low, medium and high three fortification levels of limit of detection (LOD), 2 times LOD and 10 times LOD, their recoveries ranged from 42%-132%, among which 60%-120% made up 382 varieties, accounting for 94.32%. The relative standard deviation (RSD) all fell below 38%, of which 30% below was found for 391 pesticides, accounting for 96.54%. The LOD was 0.0005mgkg-1-0.3000 mgkg-1. The proposed method is applicable for determination of 405 pesticide residues in grains such as maize, wheat, oat, rice, barley, etc.

Analysis program

10g sample of grains

Add 10g Celit 545

Extraction by ASE with acetonitrile

Half of acetonitrile extract

Concentrate, pipette into Sep- Pak Alumina N cartridge（ 2 g ））

Decant into Envi-18 Cartridge （ 2 g ）

Elute with acetonitrile, Concentrate to ca 1mL

Envi-Carb Cartridge (0.5g) / Sep-Pak aminopropyl Cartridge (0.5g) for clean up

Elute with 25mL acetonitrile +toluene (3+1)

Concentrate, solvent exchange with 2 × 5 mL hexane

Evaporate to dryness with nitrogen, make up to 1 mL with acetonitrile+ water （ 3+2 ）

GC/MS determination (362 varieties)

LC-MS-MS determination (43 varieties)?

15 Simultaneous Determination of 437 Pesticide Residues in Animal Tissues by GPC Cleanup/ GC-MS and LC-MS-MS

China Standard GB/T 19650-2005 Method Abstract Abstract A new gel permeation chromatography (GPC) cleanup/ gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS- MS) method has been established for simultaneous determination of 437 pesticide residues in the animal tissues such as beef, mutton, pork, chicken, rabbit, etc. based on an appraisal of the characteristics of both GC-MS and LC-MS-MS of 654 pesticides as well as the their efficiency of extraction and purification in the animal tissues. 5g animal samples were extracted with a mixture of solvents of cyclohexane - ethyl acetate (1+1). After concentration, the extracts were cleaned up with GPC with Bio-beads S-X3 with cyclohexane- ethyl acetate (1+1) as the mobile phase at a flow rate of 5mL/min, and the portions at 22-40min were collected. For the 368 pesticides determined by GC-MS, the portions collected from GPC were concentrated to 0.5mL and exchanged with 5mL hexane twice. For the 69 pesticides by LC-MS-MS, the portions collected from GPC were dissolved with acetonitrile - water (60+40) after dryness with nitrogen gas. In the linear range of each pesticide, the correlation coefficient r?0.98, exceptions for dinobuton, linuron and fenamiphos sulfoxide. At the low, medium and high three fortification levels of 0.0002 mg/kg-4.8mg/kg, recoveries fell within 40%-120%, among which 417 variety recoveries between 60%-120%, accounting for 95.4%, 20 varieties between 40%-60%, accounting for 4.6%. The relative standard deviation was below 28%. The limit of detection for the method was 0.0002mg/kg-0.6000mg/kg, depending on each individual pesticide.

Analysis program

10g sample of animal tissues

Add 20g Na2SO4

Homogenize with cyclohexane+ ethyl acetate （ 1+1 ）

Centrifuge, Concentrate

GPC clean up

Collect the fraction of 22min-40min

Concentrate, solvent exchange with 2 × 5 mL hexane

Evaporate to dryness with nitrogen, make up to 1mL with Acetonitrile +water（3+2）

GC/MS determination (368 varieties)

16 LC-MS-MS determination (69 varieties)

Simultaneous Determination of 304 Pesticides Residues in Honey, Fruit Juice and Wine by Double- Cartridge Solid Phase Extraction/GC-MS and LC-MS-MS

China Standard GB/T 19429-2003 Method Abstract A new method has been established for simultaneous determination of 450 varieties of pesticide residues in honey, fruit juice and wine using double-cartridge solid phase extract, GC-MS and LC-MS-MS based on an appraisal of the characteristics of GC-MS and LC-MS-MS for 654 pesticide as well as the their efficiency of extraction and purification in the honey, fruit juice and wine. 15g honey samples were extracted with dichloromethane after being dissolved with water and cleaned up with in series Envi-Carb and Sep-Pak NH2 cartridge after concentration, when were then eluted with acetonitrile + toluene (3+1,V/V) and the eluates were concentrated to 0.5mL. In the linear range of each pesticide, the linear correlation coefficient r≥0.990. At the three fortification levels of 0.004mg/kg-1.200mg/kg, the average recoveries fell within 51.6%-114.6%, among which 432 varieties had recoveries of 60%-114.6%, accounting for 96.0%, 18 had recoveries between 51.6%-60%, accounting for 4.0%. There were 428 varieties with the relative standard deviation below 25%, accounting for 95.1%; there were 22 varieties between 25%-37.2%, accounting for 4.9%. The limit of detection for the said method was 0.001mg/kg-0.300mg/kg.

Analysis program

15g sample of honey, fruit juice or wine

Dissolve in 30mLwater in a shaking water bath set at 40℃ to shake for 15min

Add 10mL acetone, transfer to a 250mL separatory funnel

Partition with 2×40mL CH2Cl2, concentrate the extract to ca 1mL

Envi-Carb Cartridge (0.5g) / Sep-Pak NH2 Cartridge (0.5g) for clean up

Elute with 25mL acetonitrile +toluene (3+1)

Concentrate, solvent exchange with 2×5mL hexane

Evaporate to dryness with nitrogen, make up to 1mL with acetonitrile +water （3+2）

GC/MS determination (383 varieties)

LC-MS-MS determination (67 varieties)

17 6. Technical indexes for four multiresidue inspection methods of China national standards

GB/T 19648-2005 446 pesticides in fruits and vegetables

Recoveries are 55.0-133.8% at low, medium and high fortification levels, with recoveries of 60.0-120.0% accounting for 99%, relative standard deviation 2.1-39.1%, of which 2.1- 25% making up 96%, and limit of detection 0.2-600.0 ng/g.

GB/T 19649-2005 405 pesticides in grains and cereals

Recoveries are 42.0-132.0 at LOD, 2 times LOD and 10 times LOD fortification levels, with recoveries of 60.0-120.0% for 383 pesticides, accounting for 94.32% of the total number. The standard deviation tends to be lower than 38%, with 391 pesticides lower than 30%, making up 9.5% of the total number. Limit of detection:0.5 ng/ g - 300.0 ng/ g.

Recoveries are 40.0-120.0% at 0.002mg/kg-4.8mg/kg, of which 417 pesticides range between 60-120.0%. Limit of detection:0.2-600ng/kg.

GB/T 19650-2005 437 Pesticides in animal tissues

Average recovers are 9.3-123.3 at low, medium and high 2.0-300ng/g fortification levels, of which 413 pesticides fall between 70-120%, accounting for 91.8%, with standard deviation lower than 25%, making up 97.1%.

GB/T 19426-2003 450 pesticides in honeys, fruit juices and fruit wines

18 7. Efficiency data for analytical method of apple sample

19 7. Efficiency data for analytical method of apple sample

20 7. Efficiency data for analytical method of apple sample

21 8. Total ion diagram for 446 pesticides in apple samples

Group A : 92 pesticides (GC-MS)

22 Group B: 101 pesticides (GC-MS)

23

Group C : 84 pesticides (GC-MS)

24 Group D: 106 pesticides (GC-MS)

25 Group E : 68 pesticides (LC-MS-MS)

26 9. Four major technical features for four multiresidue inspection methods of China national standards.

Four major features

GB/T 19649-2005 grain and cereal method

GB/T 19648-2005 Fruit and vegetable method

GB/T 19650-2005 animal tissue method

GB/T19426-2003 honeys, fruit juices and fruit wine method

grapes,

1. Wide application scope

pork, beef, mutton, chicken and rabbit

rice, wheat, maize, barley, oats, millet, sorghum rice, soybeans, peanuts

1. For more than ten kinds of honey. 2. apple juices, pear juice, grape juice, kiwi juices, etc. 3. Dry red grape wine, dry white wine, peach pink grape wine, etc.

1. Apple, pears, oranges, bananas, pine apples, kiwi, etc. tomatoes, 2. Cabbages, cucumbers, green peppers, cauliflowers, spinaches, beans, string celeries, carrots, potatoes, lettuces, etc.

446 pesticides

405 pesticides

437 pesticides

450 pesticides

2. Many varieties for detection

：

3. simplified sample preparation techniques

1.Extraction Cyclohexane +ethylacetate 2. Cleanup:GPC

1.Extraction ： Acetone/ CH2Cl2 2. Cleanup: GPC

1.Extraction：Acetonitrile 2. Cleanup: Envi-C18 Cartridge + Envi-Carb Cartridge+ Sep-Pak Aminopropyl Cartridge

1.Extraction：Acetonitrile 2. Cleanup: Sep-Pak Alumina+Envi-C18 Cartridge + Envi-Carb Cartridge+Sep-Pak Aminopropyl Cartridge

4. Unified inspection technique

1. GC-MS 2. LC-MS-MS

27 10. Comparison of four multiresidue methods of China national standards with

standards of identical categories overseas.

Standard descriptions

The four national standards studied

Canadian standard PMR-005-V1.1

AOAC International

German standard L00.00.34

285 pesticides

229 pesticides

(1) Pesticide varieties for determination

(1) 446 pesticides (2) 405 pesticides (3) 437 pesticides (4) 450 pesticides

fruits and vegetables

(2) Application scope

(1) fruits and vegetables 2) grain and cereals 3) animal fat

1) fruit and vegetables 2) grains and cereals 3) animal tissues 4) honeys, fruit juices and fruit wines

(3) Sample preparation

Matrix dispersive extraction and cleanup

1) Homogeneous extraction 2) SPE extraction

1)Homogeneous extraction 2) ASE extraction 3)SPE extraction 4)GPC cleanup

1)homogeneous extraction with liquid-liquid partition 2)ASE extraction 3)GPC cleanup

(4) Analytical techniques

(1)GC-MS (2)LC-MS-MS

1)GC-MS 2) HPLC- fluorescent

(1)GC-ECD (2)GC-FPD (3)GC-NPD (4)GC-MS

28 11. The influences and responses of four multiresidue inspection methods of China national standards in the international craft brother

1) The influences and responses of four multiresidue inspection methods of China national standards ◆ American J.AOAC INTERNATIONAL ◆ German Analytical and Bioanalytical Chemistry ◆ British Food Additives and Contaminants ◆ The Dutch Journal of Chromatography A Especially a review experts from Journal of

Chromatography A commented that the said study “reach culmination level” .

29 2) In 2005, Dr. Soderberg, first expert of multiresidue international from American EPA and AOAC transmitted these methods to USDA, American FDA and American EPA for peer review. After being posted at 119th AOAC Annual Meeting, these methods caused the concern of American grain and cereal circle immediately.

30 in

3) In its “ Affirmative List ” promulgated recently, Japan announced 184 inspection methods for agro- chemical residues in foods, which are capable of detecting a total number of 560 agro- chemicals in the “ Affirmative List ” . Each of the above- mentioned four methods we studied is able to detect 200- plus agro- chemicals the Japanese “ Affirmative List ” , which is an effective method for pesticide residue analysis in response to the system of the Japanese “ Affirmative List ” .

31

 Classification (chemical structure)： organophosphate, carbamate,

Pyrethroid and Chlorinated Organic Compounds. In China the

common used chemicals in agriculture are organophosphate and carbamate. Aborption of special dosage will cause cute poisoning，

small dosage/longtime absorption will cause chronic poisoning.

 Reason of over standard or poisoning：farmers mis-use of the

dosage/times/method or miss the safe interval period; use forbidden

virulent pesticide or high toxicity pesticide.

 Detection method：National standard:GB/T5009.199-2003.

Suitable for fast detection of residual pesticides in fruits and vegetables，and also residual acute poisoning chemicals and

stomach contents.

 Cholinesterase can catalyze Indophenols acetate and

 Pesticide (organophosphate, carbamate) can inhibits

generate Indophenols and acetic acid.

Cholinesterase;

NO：CDC/SB 101-1

 Sample processing：1 sample + 2 solution, vibrate the mixture for 50 times.  Test：insert the card into detection instrument，2～3 drops mixture to

write tablet，make a control，start the test instrument and pre reaction for 10min，cover the lid，alarm after 3min，open and see the result .  The write tablet turns to shy blue or the same to the control: negative; Cambridge blue: weakly positive，no color change: strong positive.

Test instrument

Detection cards

 virulent：Tetramine （Tetramethylene Disulfotetramine ）and

Fluoroacetamide （C2H4FNO ）

 Common：Sodium diphacinone 、antu、zinc phosphide and so on

 Tetramine and fluoroacetamide qualitative analysis use special

reagents; Quantitative analysis use GC or LC.

 When use special reagents， 1 sample at one time，test 3 items

(tetramine、diphacin and antu), save detection time.

 Residue of fungicide are present in micro quantities in the matrix. Hence involve a complicated procedure involving many step for their analysis. Analysis does not depend on high cost equipment like GC(gas liquid chromatograph) and HPLC (high performance liquid chromatograph). But based on series of cumulative operation like:-

Sampling Extraction Clean-up Estimation

 Sampling can be defined as the procedure or step

adopted to obtain a representative quantity from the large consignment, so that selected representative quantity can be handled conveniently.

 Vegetables and fruits:- a sample of a fruit or a vegetable

 In field sample should be collected randomly 10 areas from the field. Collect 0.5-1 kg portion each of these 10 areas and combine to form the sample.

 Grains :-grains are never sampled at the primary producer. Because residue on grains typically due to post harvest use of fumigants sample size of 5 kg should be collected

 Animal feed:- it include hay, silage, grains, bio product and commercial feed rations. Sampling procedure is typically selective not random. Collect 5 kg sample.

must be taken directly from the field or grower at the time of, or shortly after the harvest.

Type of food

Minimum amount of sample to collected

1 kg (at least 10 fruit )

Medium sized Fruits and vegetable with weight between 25-250 gm

Large sized Fruits and vegetable with weight more than 250 gm

2 kg (at least 5 fruit )

0.5 kg

Dairy products like butter, cream, milk and cheese

Spices (coriander,cumin)

0.25 kg

Cereals

1 kg

1 kg, 5 kg

Animal feed (cotton seed cake) and fodder

Water (running water)

15 kg

5 kg

Soil Select the crop components of interest , reduce the size of the component parts, mix subdivide and systemically reduce the sample size 50 gm

 Once a valid, representative sub sample has been selected for residue analysis, it is processed for isolation of pesticide or its matabolites having toxicological significance from the surrounding biological environment. Extraction must be adequate to yield quantitative removal of toxicant.

 Selection of extraction technique depends upon:-  Nature of matrix, whether soil, plant material or water  The analyte,s chemical group, its metabolites .  Safety (method to be adopted should not be

hazardous).

 One should be ensure that analyte/metabolite are

fairly soluble in the selected single solvent or mixture of solvent.

 Some of commonly used solvent in order to increasing polarity

are given below:-

 Non polar  Petroleum ether  N-hexane  Cyclohexane  Carbon tetrachloride  Benzene  Chloroform  Ethyl ether  Ethyl acetate  Actetone  Polar  water

 Take a sample of vegetable/fruit (1-2 kg).  Chop it into small pieces and mix properly.  After this take 20 gm representative sample.  Macerate it with 4-5 gm anhydrous sodium sulphate.  Add 100 ml acetone and extract by shaking on

mechanical shaker for one hour

 Filter the extract through 2-3 cm layer of anhydrous

sodium sulphate.

 Concentrate the extract to 40 ml on rotary flash evaporator after adding a drop of mineral oil.

 Dilute the extract 4-5 times with 10% NaCL aqueous solution.  Partition it thrice with ethyl acetate (50, 30, 30 ml) in a separatory funnel by shaking vigorously for one minute.

 Combine the organic (ethyl acetate) phases and filter through

anhydrous sodium sulphate.

 Concentrate the organic phase up to 5 ml on rotary flash

evaporator.

 Divide the concentrated extract into two equal parts (one for organochlorines and synthetic pyrethroids and other for organophosphates and carbamates).

 In order to interference by co-extractives such as pigment,

waxes and fats present in the extract, isolation of the toxicant is achieved before Taking up estimation of pesticide residues. To achieve the necessary sensitivity, interfering substances have to be removed from the pesticides with one or more procedure that are commonly refered to as clean-up.

 For organochlorines and synthetic pyrethroids  Pack the glass column (60cm*22mm i.d) with adsorbent mixture(5gm) florisil: activated charcoal (5:1w/w) in between two layers of anhydrous sodium sulphate.  Tap the column gently to ensure uniform and compact

packing.

 Prewett the column with 50ml hexane and transfer the

concentrated extract to the column.

 Elute the column with 125 ml solution of ethyl acetate:

heaxne (3:7 v/v)

 Concentrate the elute to near dryness using rotary flash evaporator followed by gas manifold evaporator after adding one drop oil.

 Make the final volume to 2ml in ethyl acetate: n-hexane

(3:7v/v).

 Both Qualitative and quantitative measurement of small amounts of pesticides in or on any treated surface is known as assay or estimation .

 Techniques of residue estimation - 1. Micro bioassay  Direct exposure  Extraction method 2. Enzyme inhibition method 3. Spectrophotometric method

4. Chromatography  Paper chromatography  Thin Layer chromatography  Gas Chromatography  High pressure liquid chromatography  Micro bioassay – Bioassay has been defined as measurement of potency of any stimulus, physical, chemical or biological, physiological by means of reactions which it produces in living matter.

 Direct exposure - This method consists of macerating and blending the

plant tissue and exposing the test insect.

Extraction method –

 No extraction of clean up is required.  a) Dry film method  Test organism is exposed to film of pesticide in solution

or deposited in crystals .

b) Aqueous Suspension Method This method

involves

extraction of pesticides, evaporating solvent, making suspension of residues in water and testing it.

2.Enzyme inhibition method –  Inhibition of cholinesterase enzyme system in animals by pesticides particularly OP and carbamates is a basis of this method.

3.Spectrophotometeric method -  Amount of electromagnetic radiations absorbed is a measure of quantity of sample present and provide information regarding chemical identity of sample.

4.Chromatography –  Flow of gas or liquid in a sorptive medium brings about separation of substances by differential migration from narrow zone in a porous sorptive medium.

 Paper chromatography -  Stationary phase is a sheet of paper containing

water or some other polar phase.

 Two opposing forces are in operation ,one is driving which act to move substances in direction of solvent flow and other resistive action which impede movement of substances.

 Thin Layer chromatography -  Mixture of silica gel and water in the ratio 1:2 is

prepared on carrier plates.

 Spot of sample is poured on the plates.

 Gas Chromatography –  Commonly used .  Provide both qualitative and quantitative analysis.  Mixture of pesticides can be analyzed.

 4.1. Phương pháp phân tích chloramphenicol trong thuỷ sản bằng kit ELISA thông qua phân tích khẳng định bằng LC-MS/MS

 4.2. Phương pháp phân tích dư lượng kháng sinh

streptomycin

 4.3. Phân tích tồn dư kháng sinh nhóm quinolone

trong tôm bằng phương pháp ELISA

 4.4. Phương pháp phân tích định lượng sulfonamit

trong thuỷ sản bằng HPLC

 4.5. Phương pháp phân tích nhanh dư lượng thuốc

kháng sinh

Chăn nuôi thâm canh

Mật độ cao

Tổn thương, ô nhiễm tiểu khí hậu chuồng nuôi, mất vệ sinh

Tăng tỷ lệ chết, con non thường yếu ớt, đề kháng kém,

Tổn thất kinh tế rất quan trọng

Chậm sinh trưởng

Sản lượng giảm hay giảm năng suất chăn nuôi

 -lactam(penicilline, cephalosporine)  Tetracyclines (oxy- và chlortetracycline, …)  Aminoglycosides (streptomycine, …)  Macrolides (Erythromycine, …)  Phenicol (chloram~ph1e0ni0cohl,ợ…p) chất  Peptid (avoparcine, …K)hác nhau  Ionophores (monensine, …)  Sulfonamides (25 loại, sulfaméthazine, …)  Trimétroprim  Nitrofurannes (furazolidone,…)  (Fluo)quinolones  Carbadox

H H

O2N

CH 3

CH 2CO

NH2

FURAZOLIDONE

CH3

NH2

CHO

CH2OH

COOH

O Benzylpenicilline (penicilline)

C2H5

H3 C

H H

OH O

NHCH 3

CH 2CO

COOH

CH 3

(cid:127)

OXOLINIC ACID

CH 2OH

COOH

Cephalexine (cephalosporine)

NHCOCHCl 2

Streptomycine (aminoglycoside)

O2N

CH2OH

HO CH3 H H

N(CH 3)2

OH H

H N

H3CHN

CH3

CHLORAMPHENICOL

CH3

NH 2

OH O

H NHCH 3

CARBADOX

Tétracycline

Spectinomycine

(aminocyclitol)

(C2H5)2N

CH3 H

OCH3

NH 2

H3CO

3 H C

H2C

H3C

CH3

CH 3

TIAMULIN

H3CO

NH 2

Trimethoprim

N(CH 3)2

CH3

H3C

O HO

CH 3

H3C

CH 3

H C 5 2

CH2

CH3

3 H C

H2 N

CH3

H N

OCH 3

CH3

3 CH O

CH3

2 CH OH

CH3

H3C

Sulphadimidine ou sulfamethazine

H CH3

CH3

MONENSIN

Erythromycine(macrolide)

COOH

(sulphonamide)

OHH

H3CO2S

CH2F H NHCOCHCl2

Florfenicol (FF)

OHH

H3CO2S

O2N

CH2OH H NHCOCHCl2

Chloramphenicol (CAP)

Thiamphenicol (TAP)

OHH

H3CO2S

CH2F

H NH2

Florfenicol amine (FFA)

7 FQ lưỡng tính: - Norfloxacine - Ofloxacine - Enoxacine - Marbofloxacine - Enrofloxacine - Ciprofloxacine - Danofloxacine

4 FQ acides: - Cinoxacine - Flumequine - acide Oxolinic - acide Nalidixic

 Ảnh hưởng kỹ thuật chế biến, bảo quản sản

phẩm: ức chế sự lên men sản xuất acid

 Độc hại

 Bảo vệ người tiêu dùng  Bảo vệ môi trường: kháng thuốc  thú y, nhân y

 Người tiêu dùng: Vấn đề đạo đức

 Ít độc cấp tính  Kháng sinh cấm (ung thư, quái thai, bất thường … )  Gây dị ứng  Mất cần bằng hệ vsv đường ruột  Rối loạn  Gây kháng thuốc ở vi khuẩn

- xuất hiện các chủng vi khuẩn gây bệnh kháng nhiều

loại kháng sinh (multi-resistante)

- Vô hiệu hoá các loại kháng sinh - Nguy cơ ô nhiễm môi trường

Sử dụng kháng sinh (lạm dụng, bất hợp pháp)

- Điều trị bệnh cá thể - Phòng bệnh cho đàn hoặc lô - Kích thích sinh trưởng (Feed additives ????) - Bảo quản ????

Tồn dư trong sản phẩm chăn nuôi Ảnh hưởng xấu đến môi trường và người tiêu dùng

 Sử dụng sai nguyên tắc và bất hợp pháp:

 Các sản phẩm chợ đen

 Bảo quản ????

 Sai nguyên tắc hoặc có chủ định 1. Không có đơn thuốc của BSTY,

2. Không tuân thủ liều

3. Thời gian dừng thuốc. Đặc biệt các Vùng dân trí thấp

HAI NHÓM Nhóm các chất cho phép sử dụng  MRL (Maximum Residue Limit).

- Nhóm các chất cấm  MRPL (Minimum

Require Performance Limit)

Cơ sở qui định MRL và MRPL????

Tác động có thể quan sát

Tổng lượng kháng sinh

Mức không thể quan sát thấy tác động bất lợi

Hệ số an toàn

ADI = Acceptable Daily Intake

MRL=Maximum Residue Limit

•Kiểm soát vs giết mổ, dịch bệnh •Bắt buộc có thông báo

Kiểm soát nhập khẩu Thú y cửa khẩu ????

•Điều trị bệnh của Thú y (người chăn nuôi) • Các thuốc được phép •H.dẫn sử dụng, thời gian chờ •Kiểm soát thân thịt và nội tạng • Cấm kích thích sinh trưởng

Cơ quan thẩm quyền: Cục thú y -Bộ nông nghiệp

Cục VSATTP - Bộ y tế

•Traçability •Kiểm soát MRL

Cục VSANTYTS - Bộ Thuỷ sản

Hệ thống Lab

Khó khăn: chất cần tìm không biết trước

Liệu có Kháng sinh nào trong thực phẩm không?

Cách tiếp cận theo phân tích

Cách tiếp cận theo lý thuyết

Điều tra thú y

Phát triển, sử dụng multianalyse

- Sàng lọc (screening) - Kỹ thuật phân tách - Kỹ thuật phân tích phổ (MS)

Xác định danh sách các chất cần kiểm soát

Mẫu

Nhanh, hạn chế tối thiểu dương tính giả, âm tính giả

Sàng lọc

Phân tích định lượng

Phân tích định tính

Kết quả có giá trị theo tiêu chí đặt ra

Mục đích phân tích kiểm tra 1 mẫu (hay 1 lô) đạt tiêu chuẩn hay không?

Nhóm cho phép sử dụng

 Nồng độ < MRL

 Đạt tiêu chuẩn

 Nồng độ > MRL

 Không đạt tiêu chuẩn

Mục đích phân tích kiểm tra 1 mẫu (hay 1 lô) đạt tiêu chuẩn hay không?

Nhóm cấm sử dụng

 Nồng độ < MRPL (LOD)

 Đạt tiêu chuẩn

 Nồng độ > MRPL (LOD)

 Không đạt tiêu chuẩn

1. Sàng lọc (screening)

Đạt tiêu chuẩn (< LOD hoặc < MRL)

Nghi ngờ (> LOD hoặc > MRL)

Lô được chấp nhận

2. Phân tích khẳng định

Đạt tiêu chuẩn (< LOD hoặc < MRL)

Không đạt tiêu chuẩn (> LOD hoặc > MRL)

Bị từ chối ????

Lô được chấp nhận

 Nhanh

 Phương pháp sàng lọc (screening) I.

 Phân tích nhiều chất cùng lúc (Multi-analyte) Rẻ -  Có thể tự động hoá -  Không cho kết quả âm tính giả -

II. Phương pháp khẳng định (lý hoá)

Đặc hiệu Không cho kết quả dương tính giả

 Phương pháp sàng lọc (screening)

I. Test vsv (“Test thận Bỉ”, test 4 đĩa Châu Âu Premitest, Delvotest, Copan, …)

 Test miễn dịch (ELISA, RIA …), Receptor-essais   (Beta-STAR, Tetrasensor, …)

II. Phương pháp khẳng định (lý hoá)

Nhận diện chất tồn dư Định lượng chính xác và đối chiếu MRL

Phù hợp để khẳng định các chất cấm

MS-MS

Phù hợp để khẳng

LC/GC- MS

HPLC-F

HPLC-UV

định các chất có MRL Thích hợp để sàng lọc

ELISA

VSV

1. BACILLUS STEAROTHERMOPHILUS var. CALIDOLACTIS

 IMPROVED AGAR DIFFUSION TEST DELVOTEST SP-NT  CHARM AIM-96  DELVOTEST MCS

DISK ASSAY PLATE METHOD COPAN MILK TEST

2. STREPTOCOCCUS SALIVARIUS ssp. THERMOPHILUS

ACIDIFICATION TEST + TMP

VALIO T102

ACIDIFICATION TEST VALIO T101 LUMAC RAPID ANTIBIOTIC TEST KIT

3. BACILLUS CEREUS

BACILLUS CEREUS-TEST (tetracyclines)

4. ESCHERICHIA COLI

ESCHERICHIA COLI -TEST (quinolones)

5. BACILLUS SUBTILIS BGA

6. MICROCOCCUS LUTEUS

7. BACILLUS BRONCHESEPTICA 8. …..

 Nhược điểm

 Ưu điểm

 Một số trường hợp đọc bằng màu

 Đơn giản

 Trang bị đơn giản

 Cần ít mẫu

 Ảnh hưởng một số chất có trong mẫu (chất có khả năng ức chế VSV (FP), VSV (FN))

 Phổ phát hiện rộng

 Thời gian test quá lâu

 Tương đối nhạy

 Không đặc hiệu

 Tương đối nhanh

 Không định lượng

 Rẻ

 Một số chất không phát hiện được

 Một số trường hợp đặc hiệu

 CAP, nitrofurans, nitro-imidazoles

nhóm

 Độ nhạy phụ thuộc điều kiện của chủng

 Có thể tự động hoá

vSV sử dụng

 Rất tiện để sàng lọc

- Ức chế vi sinh vật tạo vòng vô khuẩn

-1 chủng cùng 1 điều kiện môi trường

- 1 chủng điều kiện môi trường khác nhau (pH)

- Các chủng chọn lọc cho các nhóm kháng sinh

- Các chủng chọn lọc + pH khác nhau STAR (B.subtilis pH 7.2, Kocuria varians 8, B.cereus 6, E.coli 8, Geobacillus stearothermophilus 7)

-Phản ứng lên men: chỉ thị màu (premitest, DelvoTest….)

 ENZYM

PENZYM 100S

 PENZYM 100  TG (tetracycline galactosidase) – test

 RECEPTOR & MIỄN DỊCH

 LacTek

 Delvo –X-

 PARALLUX

 SNAP (beta lactam en tetracycline test kit)  _S.T.A.R. Press (II)  ELISA  Charm MRL-test (ROSA) ( -lactam, tetra or both)  CHARM II (5 groups)

 Twin Sensor

 Ưu điểm  Nhược điểm  Đặc hiệu

 Đa số rất nhạy

 Giá thành

 Đa số cần KTV được đào tạo

 Có thể sử dụng các mẫu

khác nhau

 Độ đặc hiệu cao đôi khi trở

thành bất lợi  Bán định lượng  Phản ứng chéo (FP)

 Tương đối nhanh

 Có thể ảnh hưởng mẫu matrix  Thích hợp dùng kiểm  Một số KT không có trên thị

soát đầu vào

trường

 Nhược điểm

 Ưu điểm

 Qui trình rất phức tạp

 Nhậndiện rõ ràng

(chuẩn bị, tách chiết, làm sạch)

 Thông tin định lượng

 Thiết bị đắt

 Rất nhạy

 KTV chuyên nghiệp cao

 Thích hợp cho khẳng

 Một số KS không có qui trình

phân tích bằng PP này

định

 Một số trường hợp thay đổi

độ thu hồi

MS-MS

LC/GC- MS

HPLC-F

Tăng tiềm tàng các chất gây nhiễu

Tăng khả năng phân biệt

HPLC-UV

ELISA

VSV

Các sản phẩm khác nhau ???

Chiến lược phân tích cụ thể và các phương pháp khác nhau

SỮA

Mẫu sữa

Test vsv

Nhận định:  Ảnh hưởng kỹ thuật (quality errors)  Nghi ngờ có chất kháng khuẩn

Nhận định:  Không có vấn đề kỹ thật  Có thể có một số chất kháng khuẩn nào đó

Nếu cần thiết

Khẳng định (nhận dạng) và định lượng

Bước 1: Test nhận diện chất/nhóm đặc hiệu = Penase, Penzym, PABA, Receptor test, Immuno assay

Bước 2: Phân tích lý hoá = HPLC, GC, GC/MS

Kết quả đối chiếu MRL

Procéder à un test rénal

Résultat négatif

Résultat positif

Analyse de l’échantillon de

Pas d’analyse de l’échantillon de viande La carcasse est acceptée

viande par la méthode des

4 plaques

Résultat négatif

Résultat positif

La carcasse est acceptée

Analyse physico-chimique de l’échantillon de viande

Concentration < LMR

Concentration > LMR

La carcasse est acceptée

La carcasse est rejetée

Analyse de la lésion d’injection

Concentration > LMR

Concentration < LMR

La carcasse est acceptée

Analyse de l’échantillon de viande

Concentration > LMR

Concentration < LMR

La carcasse est rejetée

La carcasse est acceptée partiellement

Chuẩn bị mẫu

 Lấy mẫu  Làm sạch  Nghiền

Tách chiết

 Dung môi hữu cơ

Tinh chế, cô đặc

 Phân tách pha lỏng -lỏng  Tách chiết pha rắn (silice)  Bằng ái lực miễn dịch

Đo định lượng hoặc định tính

 Yêu cầu thực tế

Dư luận Phân tích điều tra Yêu cầu theo luật

 Hình thành ý  tưởng

 Tổ chức thực hiện  ý tưởng

 Kiểm tra kết quả

Mẫu -

Đối chứng dương

Mẫu + (Ф1 + Ф2)/2 >= 20 mm ou L >= 2 mm

20 mm

17 mm

Ф1

Tyl

Sulf

L

Strep

Oxyt

20 mm

18 mm

Ф2

Vòng vô khuẩn

Mẩu vỏ thận

Thạch cấy B. subtilis

Đĩa giấy chứa 1µg kháng sinh chuẩn

Giấy tẩm dịch vùng vỏ thận

Ưu nhược điểm ????

Không dùng dịch thận, mẩu thận mà dùng mẫu tách chiết

Tách chiết thế nào?

Lượng mẫu bao nhiêu?

Làm thế nào để kiểm tra được chất lượng test??

 Tách được chất cần tìm ra khỏi mẫu

 Đảm bảo độ thu hồi

 Các chất sử dụng không ảnh hưởng đến chất cần tìm và kết quả đọc

 Nếu có thể hạn chế được các chất

gây dương tính giả

Thích ứng Premi-Test

Kiểm soát Chất lượng môi trường, Đĩa cấy vsv

Xác định Độ mẫn cảm của VSV với kháng sinh

Xác định lượng KS ít nhất có thể tạo vòng vô khuẩn (A)

Kiểm tra lại qui trình tách chiết = ks chuẩn

M (g) = A * MRL-1

Xây dựng công thức tính lượng mẫu bé nhất cần lấy (M)

Đánh giá các tham số độ mạnh (LOD, Độ nhạy, Độ đặc hiệu, độ chính xác)

Phạm Kim Đăng, Marie-Louise SCIPPO; Guy DEGAND; Caroline DOUNY; Guy MAGHUIN-ROGISTER (2007): Chuẩn hóa phương pháp sàng lọc định tính kiểm soát tồn dư kháng sinh trong thực phẩm có nguồn gốc động vật theo qui định số 2002/657/EC (bài tổng hợp). Tạp chí KHKT Nông nghiệp, ĐHNN I, Tập V, Số 1/2007; Trang 24-30. http://www.hua.edu.vn/tc_khktnn/default.asp?i d=11&ID_S=20

Nguyên liệu và hoá chât

- Dung dịch chuẩn (dung môi, chất chuẩn) - Giống vi sinh vật: Bacillus subtilis BGA - Môi trường nuôi cấy

Standard II Nutrient Agar for microbiology

- Mẫu “trắng” - Dextrose, methanol, NH4OH 2M, NaOH 1M, HCl 1 và 2M. - Trimethoprime (TMP) 1 mg/ml - Đĩa giấy đường kính 12 mm - Đĩa Petri - Acetonitrile, Acetone

 Micropipet  Cân phân tích (gam, mg, µg)  Nồi hấp tiệt trùng  Nồi hấp cách thuỷ 45-47°C  Vortex  Máy lắc đảô đầu  Ly tâm (2000-6000 vòng/phút)  Hệ thống bay hơi (ly tâm chân không or thổi Nitơ)  Tủ ấm 30°C

 Cân 25 g môi trường

 Thêm 6 g dextrose = 0,6% (nếu dùng dung dịch 20% cần ?)

 Hoà trong 1 lit nước cất (– số ml đường) (đun sôi, khuấy

liên tục, cẩn thận khi sắp sôi)

 Cho vào các lọ (4x250 ml) (nắp hơi lỏng)

 Tiệt trùng trong 15 phút ở 121°C +/-0,1.

 Làm nguồi về 47°C bằng nồi cách thuỷ (Nếu thạch dự trữ90°C trong 3h, làm nguội47°C khoảng 30 phút)

 Môi trường đưa vào sử dụng sau khi hiệu chỉnh pH=7,2±0,1 ở 25°C bằng HCl hoặc NaOH 1M

 Mỗi lọ 100 ml môi trường: 20µl TMP (1mg/ml) + 100 µl dung dịch huyền phù B.subtilis được pha loãng theo hướng dẫn  lắc đều

 Đổ 14 ml thạch/đĩa (dày 2,2 mm)  (200 ml = 14 đĩa)  Sau khi để thạch cứng, đĩa bao gói bao nilon plastic và được bảo quản ở 4°C tối đa 1 tuần (úp nắp xuống)

Solution

µg/ml

0,625

8 1,25

7 2,5

6

5 6,67

4

10

3

6.0

Difloxacine

Danof loxacine

Oxolinic acid

Ciprof loxacine

Norfloxacine

Enrof loxacine

Flumequine

Sulfadiazine

Sulf adimethoxine

5.0

Sulf amethoxazole

Chlortetracycline

Oxytetracycline

Tetracycline

4.0

3.0

u h k

ô v

)

g 2.0 n ò v

i

m m

h n a u q

ĩ

r

ộ Đ

g n

ộ

ẩ

( y

ấ

n

g a

đ

1.0

0.0

25.00

37.50

50.00

62.50

75.00

87.50

100.00

112.50

125.00

137.50

150.00

162.50

175.00

Lương kháng sinh chuẩn/đĩa (ng)

Độ rộng vòng vô khuẩn quanh đĩa giấy biến động tuỳ theo lượng kháng sinh có trong 50 µl dung dịch chuẩn

3 ± 0,1 g tôm nghiền

5 ml acetonitrile/acetone (70/30 : V/V)

Lắc đảo đầu trong 10 phút

Ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 15°C

Thu hồi Lớp trên được

3 gam tôm/200 µl methanol

Làm bay hơi đến khô = «SAVANT» or khi N2 40°C

Phần chất khô còn lại được thu hồi trong 200 µl methanol

Ly tâm tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút ở 15°C

50µl chứa 0,75 gam tôm

Lớp trên được đĩa

Qui trình tách chiết

Giới hạn nồng độ tối đa (LMR)

QME (g) = QMI * LMR-1

QMI (ng trong 50 µl/đĩa)

Khối lượng mẫu tôm bé nhất cần lấy (QME)/phân tích

Xác định LOD: MIC  mẫu trắng củng cố gần với MIC  <5% âm tính

Mẫu thực sự dương tính

Mẫu thực sự âm

Kết quả test

(N+) (mẫu củng cố)

tính (N-) (mẫu trắng)

Dương tính

PA (Dương tính theo qui

FP (Dương tính giả)

định)

Âm tính

FN (Âm tính giả)

NA (Âm tính theo qui định)

PA + NA

Độ xác thực (%) =

x 100

Où N = N+ + N-

PA

Độ nhạy (%) =

x 100

Độ đặc hiệu (%) =

x 100

N+

N-

Gián tiếp - Canh tranh

1. Một plate 96 giếng có phủ KT tinh sạch của cừu kháng lại KT có nguồn

gốc thỏ

2. 7 lọ có chứa dung dịch chuẩn (KN): 1, 0.5, 0.3, 0.2, 0.1, 0.05 và 0 ng/ml

3. Dung dịch chứa KN có gắn với men gây phản ứng tạo màu (Peroxide cọnugated norfloxacin)

4. Lọ chứa KT có nguồn gốc từ thỏ đặc hiệu với KN được đông khô

5. 1 lọ 18 ml Substrate/chromogen (tham gia phản ứng tạo màu perocide/TMB)

6. 50 ml dung dịch đệm pha loãng pH 7,4 - 10x

7. Dung dịch dừng phản ứng H2SO4 6N

8. 50 ml dung dịch đệm để rửa - 10x

9. Tài liệu thông số kỹ thuật của Kit

1. Phủ kháng thể đã được tinh lọc lên bề mặt rắn (1 µg kháng thể cừu kháng

lại kháng nguyên có nguồn gốc thỏ IgG)

Kháng h t ể

+ °C

16/04/2008

2. b) Cho kháng nguyên có gắn men

2. a) Cho mẫu đã được tách chiết hoặc dung dịch kháng nguyên chuẩn vào

vào

E

Ag-Enz

E

Antigen

E E

E

E E

2. c) Cho kháng thể đặc hiệu thỏ vào

3. ủ 2h ở 4°C

Specific Ab

E

4. Rửa loại bỏ các chất không

được gắn (ba lần)

5. Cho dung dịch phản ứng màu vào TMB/H2O2 và ủ 30’ trong bóng tối

Substate /chromophore

E

E E

6. Dừng phản ứng bằng H2SO4.

7. Đọc ở 450 nm.

PBS pH 7.4 : 9g NaCl + 7,78g Na2HPO4.2H2O+ 0,75 g KH2PO4 trong 1 lít H2O

Methanol/PBS (50/50 V/V)

Pha loãng dung dịch đệm 10x

Pha loãng KN gắn enzyme 100x

Khôi phục KT đông khô (+ 6 ml dung dịch pha loãng)

!

Lượng hoá chất chuẩn bị số mẫu phân tích + đường chuẩn

30’’

10’, 4000rpm

lắc đảo đầu 30’

5 gam mẫu 5 ml methanol/PBS (50/50 v/v)

0,5 ml

50 µl/giếng

Ly tâm 10 phút với vận tốc 3000 vòng/phút

30 giây

4,5 ml d2 đệm pha loãng (pha loãng 10x)

(*) PBS pH 7.4 :9 gam NaCl, 7,78 gam Na2HPO4.2H2O và 0,75 gam KH2PO4 trong 1 lít nước cất

1

2

3

4

5

6

7

8

9 10 11 12

A NS NS S1 S1 S9

S2 S2 S9

B

.05

.05 S3 S3 S10

Chuẩn bị Plate

C D 0.1 0.1 S4 S4 S10 E 0.2 0.2 S5 S5 S11 0.3 0.3 S6 S6 S11 F G 0.5 0.5 S7 S7 S12 S8 S8 S12 H

Dung dịch chuẩn Mẫu

ô

B2

B3

B4

B5

B6

B7

B8

B9

B10

Bước1

A1 A2

-

150 µl dd đệm p.loãng

đ

B1 B2

50 µl dd 0 ng/ml

C1 C2

50 µl dd 1 ng/ml

D1 D2

50 µl dd 0.5 ng/ml

L ắ c n h ẹ ,

o

5 0 µ

E1 E2

50 µl dd 0.3 ng/ml

l

ở b

F1 F2

50 µl dd 0.2 ng/ml

1 0 0 µ

p h ú t

ư

l

1 5 0 µ

l

G1 G2

50 µl dd 0.1 ng/ml

d d E

H1 H2

50 µl dd 0.05 ng/ml

.

1 0 0 µ

l

A3 A4

50 µl mẫu 1 tách chiết

j

ủ 1 h ở 4 ° C

B3 B4

50 µl mẫu 2 tách chiết

/

d ố c b ỏ h ế t , r ử a 3 l ầ n = d d đ ệ m

C3 C4

50 µl mẫu 3 tách chiết

L ắ c n h ẹ 1 p h ú t r ồ i ủ 1 h ở

ớ c s ó n g 4 5 0 t r o n g

/

d d K T g i ế n g

D3 D4

50 µl mẫu 4 tách chiết

p e r o x i d e / T M B g i ế n g

4 ° C

C o n u g a t e / g i ế n g

v ò n g

E3 E4

50 µl mẫu 5 tách chiết

d d d ừ n g p h ả n ứ n g m à u g i ế n g

, v ỗ ú p h ế t

50 µl mẫu 6 tách chiết

L ắ c n h ẹ , ủ 3 0 p h ú t t r o n g b ó n g t ố i t ° p h ò n g

3 0

50 µl mẫu 7 tách chiết

50 µl mẫu 8 tách chiết

2,000

y = -1,0115x - 1,2697 R2 = 0,9915

) )

1,500 1,000 0,500

S N - 0 B

( / )

0,000

S N B

( ( t i

-3,500

-3,000

- 2,500

- 2,000

- 1,500

- 1,000

- 0,500

0,000

0,500

g o

- 0,500 -1,000

- 1,500

ln (concentration)

Đồ thị 1. Đường chuẩn

- B, B0 tương ứng là mật độ quang của dung dịch chuẩn ở các nồng độ khác nhau và tại nồng độ bằng 0.

- NS mật độ quang của dung dịch không đặc hiệu

Dung dịch chuẩn

Mật độ quang (OD)

NSB*

0 0,07

C0

0 1,226

C1

1 0,307

C2

0,5

0,485

C3

0,3

0,642

C4

0,2

0,801

C5

0,1

0,923

C6

0,05

1,043

Mẫu 1: OD = 0,121 Mẫu 2: OD = 0,095

Mẫu 3: OD = 0,45

 Hãy tính Nồng độ thực ?? Và đưa ra kết luận??

RECEPTOR ASSAY

Assay for tetracycline residues: The Milk Protocol

SỮA

MẬT ONG

MÔ ĐÔNG VẬT

Kidney, Liver, Muscle Pig, Chicken, Beef, Seafood, Fish, Eggs

LIST OF THE PROCEDURE LIST OF THE PROCEDURE

 Chloramphenicol  Nitrofurans  Sedatives  Antithyroid agents Antithyroid agents  Beta-agonists  Tetracyclines Tetracyclines  Sulphonamides

•Mp：150.5-151.5 ℃

•UV：278 nm

•solubility：

•2.5 mg/ml water

•Soluble in most solvents

•pH in water：4.5--7.5

Aplastic anaemia Gray syndrome LD50，1210 (pregnant), 1530 (non-pregnant,1260 - 1840) mg/kg b.w.

 EU、US、Jp. Korea、Aust. China: ND  JECFA: “zerô” fôr MRL、ADI (not set)  Reference:

Chloramphenicol (WHO Food Additives Series 23) Chloramphenicol (WHO Food Additives Series 33) Chloramphenicol (IARC Summary & Evaluation, Volume 50,

1990)

protein conjugate: 50-60% distribution in body: most part of the body such as tissue and body fluid have different metabolites but in small percentage marker residue: parent drug

Molecular weight

 CAP: 322  CAP-(TMS)2: 451  CH3-CAP- (TMS)2: 466

1.1Method of analysis for chloramphenicol in meat, chicken meat and fish tissue using NICI/GC/MS

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

Procedure

Weigh 10 of sample into a 250 ml

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

Conical flask

Procedure

•Shake for 30 min,

•Add 100 ml of ethyl ester, 30 g of unhydrous sodium sulfate

•Filtrate the supernatant

•Add 75 ml of ethyl ester to the

residue, extract and filtrate

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

•Combine the solution, evaporate to nearly dryness

Procedure

•Add 4 ml methanol + 4% sodium chloride solution(2+8) and 4 ml of n- hexane into the residue vortex for 1 min, transfer into a 10 ml centrifuge tube,vortex for 0.5 min

•Centrifuge for 2 min at 2000rpm

•Pipette and discard the supernatant

•Add 4 ml n-hexane, repeat the operation

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

•Add 4 ml ethyl ester, vortex for 1 min, pipette upper layer, repeat the operation

•Combine the solution of upper layer,evaporate to dryness

Procedure

•Sep-Pek C18 cartridge:pre-washed with 5 ml methanol, 5 ml dichloromethane, 10 ml of water

•Use 3 ml acetonitrile/water(5:95) to dissolve residue,load into the cartridge

•Wash the cartridge with 5 ml of acetonitrile/water(5:95) and discard

•Add 2 times of 5 ml ethyl ester, vortex for 1 min at 2000 rpm

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

•Elute and collect chloramphenicol with 3 ml of acetonitrile/water(50:50)

•Combine ester solution, evaporate to 1 ml

Procedure

•Transfer the residual solution into a small bottle for derivatization, evaporate to dryness with a flow of nitrogen

•Add 200 μ l of BSTFA + TMCS(99+1), fix the cap and heat at 70 ℃ for 1 h

•After cool, evaporate the solution nearly to dryness under nitrogen flow

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

•Add 1 ml n-hexane to dissolve the residue for GC/MS determination

Procedure

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

• NICI/GC/MS analysis

• Column I: : DB-5MS, 25m × 0.25 mm ID,

0.1 μ m of film thickness;

• oven temperature: 70℃, programmed at a rate of 25℃/min to 270℃, keep for 8 min;

• injection port temperature: 280℃; interface: 270℃ • carrier gas: helium • injection mode: splitless for 1min; • injection volume: 1 μ l

NICI/GC/MS analysis

• Column II: : HP-1, 30m × 0.25 mm ID, 0. μm of

film thickness;

• oven temperature: 70℃, programmed at a rate of

25℃/min to 270℃, keep for 8 min; • injection port temperature: 280℃; interface: 270℃ • carrier gas: helium • injection mode: splitless for 1min; • injection volume: 1 μ l

NICI/GC/MS analysis • ion source parameter: temperature 140℃, filament

current 200uA, ionization energy 70-90 eV;

• reaction gas: methane; • pressure: 3 × 10-6torr, ion source 50 Pa; calibration: FC43: m/z 169, 283, 414, 514, 557,

595, 633;

• dwell time 0.052s/ion • selective monitoring ions: m/z= 376,378,466, 468,470 (in case of 2H labeled CAP used for quality control, m/z=471 is selected);

• quantitation: single ion calibration, m/z=466 •

NICI/GC/MS analysis

• Blank sample • Spiked sample • Calibration curve • Samples to confirm

• Limit of detection : 0.1 μ g/kg

 EEC, Cy 3.5  Cloramphenicol: confirmation of chloramphenicol

in meat, milk, egg and urine by gas chromatography-mass spectrometry

 EEC, Cy 3.6  Cloramphenicol: confirmation of chloramphenicol in meat by gas chromatography-mass spectrometry

structure：

1.2 Simultaneous Determination of Chloramphenicol, Thiamphenicol, and Florfenicol Residues in animal tissues by Gas Chromatography/Mass Spectrometry

Chloramphenicol R1＝NO2，R2＝OH； Thiamphenicol R1＝CH3SO2，R2＝OH； Florfenicol R1＝CH3SO2，R2＝F

Procedure

Weigh 10 of sample into a 250 ml

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

Conical flask

Procedure

• Add 100 ml ethyl acetate, 30 g unhydrous sodium sulfate,

•Shake for 30 min,

•Transfer the supernatant

•Add 75 ml ethyl acetate to the residue ，filtrate the supernatant

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

•Combine the solution ，evaporate to dryness

Procedure

•Add 4 ml methanol + 4% sodium chloride solution (2+8) and 4 ml hexane, votex for 1 min, transfer into 10 ml centrifuge tube，votex for 0.5 min

• centrifuge for 5 min at 2000rpm

•Take the supernatant

• add 4 ml hexane, repeat the above operation

•Add 4 ml ethyl acetate, votex for 1 min, take the supernatant, repeat operation

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

• combine the supernatant

• evaporate to dryness

Procedure

• Dissolve the residue with 3 ml acetonitrile/water(5:95) , and transfer onto the cartridge.

• Wash the column with 5 ml acetonitrile /water (5:95) , discard the eluate

•Elute and collect the target compounds with 3 ml acetonitrile/water(50:50)

•Add 2 X 5 ml ethyl acetate, votex 1 min

centrifuge at 2000 rpm for 5 min

•Take the supernatants and combine，evaporate to about 1 ml

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

• Sep-Pek C18 cartridge: use 5 ml methanol, 5 ml dichloromethane, 10 ml water to prewash the column in series.

Procedure

•Transfer the residual solution into a small bottle for derivatization, evaporate to dryness with a flow of nitrogen

•Add 200 μ l of BSTFA + TMCS(99+1), fix the cap and heat at 70 ℃ for 1 h

•After cool, evaporate the solution nearly to dryness under nitrogen flow

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

•Add 1 ml n-hexane to dissolve the residue for GC/MS determination

Procedure

Sample Extraction Clean-up Derivatisation GC/MS analysis

• NICI/GC/MS analysis

GC operation condition

Model 6890N gas chromatography equipped with DB- 5MS column, 30m×0.25 mm id×0.25 μm film thickness, and mode 5973N mass spectrometry equipped with NCI option (Agilent, America) were used. Gas chromatography conditions: carrier gas velocity of helium is 1.0 mL/min; injection temperature, 250℃; initial over temperature held at 50 ℃ for 1 min, 25 ℃/min ramp, and final temperature held at 280 ℃ for 5 min. Splitless injection 1 μL. Transfer line temperature 280 ℃.

NICI MS condition

negative chemical ionization

Reaction gas: methane (purity 99.999%)

selected ion monitoring was used and ions were chosen respectively for the monitoring at

source temperature 150 ℃;

m/z 376、378、466、468 for CAP,

m/z 432、466、468、470 for m-CAP,

m/z 409、411、499、501 for TAP,

m/z 339、341、429、431 for FF.

Mass spectrum of TMS derivative of three chloramphenicols in NCI mode: (a) CAP, (b) TAP, (c) FF

TAP

CAP FF

(b)

(a)

Respresentative chromatograms of purified (a) matrix blank, (b) 10 ng/mL standard, and (c) 1μg/kg spiked sample

(c)

Responses（peak area）of chloramphenicols derivatives produced in different solvents Responses

Acetonitril Pyridin

No solvent

n- Hexane

Toluen e

120 358 56 34

137 390 57 36

253 874 167 144

214 659 65 52

197 627 72 61

m- Chloramphenicol Chloramphenicol Florfenicol Thiamphenicol

Table 2 Linear equations and correlation coefficients of the standard curves

Linear equations

Correlation coefficients (r2)

Linear range (μg/kg)

Analyte

0.9992 0.9923 0.9987 Chloramp henicol Florfenic ol Thiamph enicol A=34.536C +0.1253 A=8.6557C +0.0460 A=8.2301C +0.0179 0.1~8.0 0.2~4.0 0.2~4.0

A: peak area; C: spiked concentration of analyte, μg/ kg.

Average recovery of three chloramphenicols in different animal matrix fortified with different concentration ( n = 7 )

Chicken liver

Fish

Porcine muscle

RSD / %

Analyte

RSD / %

Add ed / (μg/k g)

Recov ery / %

Reco very / %

RS D / %

88.1 86.4 98.1 98.9 105.8 88.0 111.5 94.0 93.6

9.8 5.5 1.2 12.9 10.4 15.1 8.8 8.3 7.7

80.2 85.4 90.5 101.6 92.8 85.3 98.0 93.1 89.5

80.0 88.7 94.2 109.7 102.3 89.9 110.9 100.5 90.3

10.0 7.2 2.1 15.4 12.2 10.7 10.5 8.8 6.9

Chloram phenico l Florfeni col Thiamp henicol

0.1 1 2 0.5 1 2 0.5 1 2

8.9 5.7 1.5 14. 6 11. 3 10. 1 8.9 7.9 6.5

 Have been widely used in form of additives for treatment of gastrointestinal infections used in cattle, pigs and poultry.

 Furaltadone, Nitrofurantoin, Nitrofurazone :

Annex IV in 1993

 Furazolidone moved to annex IV in 1995.

 Yellow powder  Molecular weight 225，  CA No.67-45-8，  Melting point 255℃  25℃ Solubility in water: 45mg/L, dissolvable in ethyl ether,slightly dissolve in ethanol  Max. UV absorb wavelength 262nm和356nm  Light sensitive

Furazolidone

 Yellow needle crystal or powder  Molecular weight 268  CA No.67-20-9  Melting point 238.16℃  24℃ Solubility in water 79.5mg/L  Light sensitive

 Yellow crystal powder  Molecular weight 198  CA No.59-87-0  Melting point 238℃  25℃ Solubility in water 210mg/L, water solution pH10, dissolve in acetone ethanol

 Light sensitive

 Yellow crystal powder  Molecular weight 324  CA No.139-91-3  Melting point 206℃  25℃ Solubility in water 750mg/L  Light sensitive

 Furazolidone, Nitrofurazone

◦ Mutagenic ◦ Carcinogenic

 Metabolites : AOZ mutagen  Other nitrofurans

◦ Lack of data ◦ Classified in Annex IV (Juy 1993) by EMEA

EU： ND，LOD 1ng/g CAC：No MRL should be set China：Prohibited，LOD 0.1~1ng/g USA：to be Prohibited

 Rapid metabolism with half-lives in vivo in the range

of no more than a number of hours : Rapid elimination of the parent molecule

 Studies with 14C-labelled furazolidone shown that

protein-bound residues are formed.

 High stability  Longer residence time  Their detection is still possible when concentrations of the parent drugs have fallen below their detection limits.

 AOZ, AMOZ, AHD and SEM :

◦ Very small molecules (MW between 75 and 201) ◦ non-specific fragmentation in LC/MS-MS ◦ higly abundant mass spectrometric background noise

Derivatisation

2-Nitro-benzaldehyde

Sample pretreatment • Hydrolysis：buffer, acid, wash with buffer before hydrolysis

• Extraction：water solution • Cleanup：SPE • Derivatisation： 2-Nitro-

• Hydrolysis and derivatisation the

same time • Avoid light

benzaldehyde

Instrumental analysis：HPLC

HPLC/UV HPLC/PDA detect the marker drug, no method

for metabolites determination

LOD 1-50ppb

Instrumental analysis ：： Instrumental analysis HPLC/MS HPLC/MS

 HPLC/MS，ESI  HPLC/MS，APCI  LOD 1~5ng/g

 Precursor and daughter ions  Identification and quantification  LOD, 0.1~1ng/g

compound

Ion pair 1

Ion pair 2

NP-AMOZ

12.5 335->262

335->291

NP-AHD

11.1 249->178

249->134

NP-AOZ

11.2 236->104

236-134

NP-SEM

11.6 209->166

209->192

Mass chromatogram of Mass chromatogram of Derivatised metabolites Derivatised metabolites

 Managment of stress in meat producing animals  Farm

slaughterhouse

stress

metabolic changes in muscle

quality of meat  (PSE)

 Short time between administration - slaughter High levels for residues in edible tissues

(azaperone, azaperol, carazolol)

(promazines)

MRL

/ Prohibited

 Analysis: HPLC-UV, LC-MSn

 depressant to man, which depress nerve, skeletal,

and cardiac muscle.

 affects the cardiovascular systems and can induce

coma.

 distribute into all tissue and organs in vivo  used as animal food additive and chemical

protection drugs in animal butchery and in horse race.

 Extraction  C18 SPE cleaning-up  CH3I methylation  GC-MS determination

Dimethyl-barbital Dimethyl-amobarbital

Dimethyl-phenobarbital

Fragmentation patterns of main ions for three dimethyl- derivatives

The chromatograms of extracts from spiked samples

Three barbiturates monitoring ions and retention time

Analytes

Retention time / min

Monitoring ion

Barbital

7.05

126, 169*, 183, 184

Amobarbital

8.69

169*, 170, 184, 226

Phenobarbital

10.83

175, 232*, 245, 260

* Note: this ion is quantification ion.

Analyte

Linear equations

Regression coefficients

Barbital

A=133.74C+114.25

0.9993

Amobarbital A=1368.1C+737.83

0.9998

Phenobarbital A=247.84C+145.3

0.9994

A: peak area, C: spiked concentrations

The linear equations and regression coefficients of the calibration curves (n=3)

Recoveries of three barbiturates in pork fortified with different concentrations (n=6)

Analyte

Spike (µg/Kg) Recovery (%)

CV (%)

2.5

100.38

11.0

Barbital

90.58

7.3

89.00

11.7

2.5

83.99

1.6

Amobarbital

94.55

4.7

90.56

7.6

2.5

101.41

5.0

Phenobarbital

102.97

6.1

89.67

9.0

diazepam

estazolam

alprazolam

triazolam

Molecular structure of four benzodiazepines

 anticonvulsants, anxiolytics, hypnotics or muscle

relaxants

 tolerance, dependence, excessive sedation and cause

anesthesia, coma and even death,

 used as animal feed additive, ataractic and chemical protection drugs in animal feeding and butchery.

 prohibited

 Extraction  Cleanup  GC-MS determination

Typical total ion current chromatogram. (A) drug-free pork sample; (B) mixture of four Standard benzodiazepines. 1 (100µg/L), 2, 3.and 4 (200µg/L); (C) drug-free pork fortified with four benzodiazepines. 1 (The spiked concentrations is 20 µg/kg), 2, 3 and 4 (The spiked concentrations is 40µg/kg) . chromatographic peaks: 1. diazepam, 2. estazolam, 3. alprazolam, 4. triazolam

Four benzodiazepines monitoring ions and retention time

Monitoring ions Retention time / min

165, 256*, 257, 284 239, 259*, 294 204, 273*, 308 238,279,313*,342

Diazepam Estazolam Alprazolam Triazolam 9.29 11.24 11.43 12.02

* Note: this ion was quantification ion.

The linear equations and regression coefficients of the calibration curves

Standard Sample Linear equations Regression coefficients

Y=1473.3X+1378 6 Y=885.78X- 19696 Y=1314.9X- 16914 Y=873.21X- 38414

Y: peak area；X: spiked concentrations（µg/L）

Diazepam Estazolam Alprazolaml Triazolam 0.9999 0.9999 0.9999 0.9974

The recoveries of four benzodiazepines in pork fortified with different concentrations (n=6)

RSD(%) Added（µg/L） Sample Recovery （%）

Diazepaml Estazolam Alprazolam Triazolam

20 50 100 40 100 200 40 100 200 40 100 200 74.7 90.0 85.1 85.0 94.8 103.9 85.4 90.4 96.5 89.8 95.5 102.7 3.9 1.3 2.1 2.1 7.0 8.7 10 1.7 6.7 1.5 8.0 3.6

• Action: inhibit function of thyroid

gland

weight 

 Fraud: sell “water” for the price of meat

 Carcinogenic and teratogenic

 Prohibited in many country

- increased filling of gastro-intestinal tract - higher water retention

 Classification

◦ natural (glucosinolates in plant material) ◦ synthetic

Compound

Species

Matrix

Method

thyroid urine serum

GC - MS LC - MS HPLC

Thiouracil (TU) Methylthiouracil Propylthiouracil Phenylthiouracil Tapazol

cattle pigs sheep goat horses poultry

Antithyroid agents

• Chemical structure – thiouracil analogues – mercaptoimidazole analogues

tapazol

mercaptobenzimidazole

Antithyroid agents

• Methods

– Indirect: gravimetry of thyroid gland

– Direct: HPTLC, GC-MS, LC-MS

 Matrices

– thyroid gland – Musculus diaphragma (for screening of MTU)

gland > 60 g : suspicious

 Action

◦ bronchodilators ◦ repartitioners: fat  and muscle  ◦ better feed conversion

 Example

◦ dose of 2 till 4 ppm in the feed during 2 – 3 months ◦ ◦

growth increases with 20 % carcass quality improves with 10 %

Group Anilinic

Fenolic

R5 C(CH 3 ) 3 C(CH 3 ) 3 C(CH 3 ) 3 C(CH 3 ) 3 C(CH 3 ) 2 C 2 H 5 C(CH 3 ) 2 C 2 H 5 CH(CH 3 ) 2 CH(CH 3 ) 2 C(CH 3 ) 3 C(CH 3 ) 3 CH(CH 3 )CH 2 OPh C(CH 3 ) 3 C(CH 3 ) 3 CHCH 3 (CH 2 ) 2 C 6 H 4 OH

Resorcinolic

R4 R3 R1 R2 Molecules NH 2 Cl Cl H clenbuterol NH 2 H NC cimbuterol H NH 2 Br Br bromobuterol H NH 2 Cl CF 3 H mabuterol NH 2 Cl CF 3 H mapenterol NH 2 Cl Cl clenpenterol H NH 2 H NC cima terol H NH 2 Cl Cl clenproperol H CH 2 OH H salbutamol OH H NHCONH 2 OH H H carbuterol OH H H H isoxsuprine OH H CH 2 OH H pirbuterol OH H Cl H tulobuterol OH H H ractopamine H H OH H terbutaline H OH fenoterol H H OH metaproterenol H

OH C(CH 3 ) 3 OH CHCH 2 C 6 H 4 OH OH CH(CH 3 ) 2

Compound (Metabolite)

Species

Matrix

Method

IA GC - MS LC - MS

Bromobuterol Cimaterol Cimbuterol Clenbuterol

(Hydroxymethylclenbuterol)

cattle pigs sheep horses poultry game rabbit

retina liver muscle urine plasma feed

Clencyclohexerol Clenisopenterol Clenpenterol Clen properol Fenoterol Isoxsuprine Mabuterol Mapenterol Orciprenalin Ractopamin Ritodrine Salbutamol Terbutalin Tulobuterol Zilpaterol

 Hydrolysis  Extraction  Cleanup: SCX, ODS  GC-MS, HPLC-MS determination

 > 65 % of the antibiotics for veterinary use  Treatment of respiratory disease  Broad spectrum  Target matrix: bones (found months after

application)

 Most important: oxy-,chlor-, tetracycline

tetracycline

 Antibacterial compounds  Carcinogenic  Widespectrum against G+ and G- bacteria  Action: on targets in bacterial DNA synthesis  MRL: 100 µg / kg (milk: 10 µg / kg)  Analysis: LC-UV, LC-MS

Name

formula

solvent

Note

Molecular weight

Melting point

Dissolve in acetone, boiling water, slightly dissolve in

sulfanilamide, SN

172.21

C6H8N2O2S [63-74-1]

164.5- 166.5

ethanol, water, not soluble in ethyl ether, chloroform, benzene

Avoid light， LD50 ， 2.0g /kg

Easily dissolve in hydrochloric acid, basic solution,

267.30

192-197

Avoid light

C11H13N3O3S [127-69-5]

Property of sulfonamides

sulfisoxazole, sulfafurazole, SIZ

chloroform slightly dissolve in ethanol, not soluble in water

278.34

Avoid light

sulfisomidine, sulfasomidine,SM’2

C12H14N4O2S [515-64-0]

243(decp .)

Easily dissolve in hydrochloric acid, slightly dissolve in ethanol, slightly dissolve in ethanol, very slightly dissolve in ethyl ether and chloroform

Easily dissolve in hydrochloric acid, basic solution,

sulfadimidineo,sulfametha

278.34

197-200

Avoid light

zine,SM2

C12H14N4O2S [57-68-1]

dissolve in hot ethanol, not soluble in water and ethyl ether

Easily dissolve in diluted acid and basic solution, slightly

sulfamethoxypyridazine,

280.32

182-183

Avoid light

C11H12N4O3S [80-35-3]

SMP

dissolve in dimethyl formamide, acetone, hot alcohol, almost not soluble in water.

sulfamethoxypyrazine,

Easily dissolve in diluted acid and basic solution, slightly

C11H12N4O3S

280.32

173-175

Avoid light

dissolve in ethanol, almost not soluble in water.

SMPZ

sulfamethoxazole,sinomin

Easily dissolve in diluted acid and basic solution, slightly

253.27

168-172

Avoid light

C10H11N3O3S [723-46-6]

dissolve in ethanol, almost not soluble in water.

e,SMZ

C11H12N4O2S

264.32

234-238

Avoid light

sulfamerazine, SM sulfamethyldiazine

Easily dissolve in hydrochloric acid, basic solution, slightly dissolve in acetone, alcohol, very slightly dissolve in water, almost not soluble in ethyl ether, chloroform.

sulfamethoxydiazine,

280.32

210-214

Avoid light

C11H12N4O3S [651-06-9]

Property of sulfonamides

sulfameter, SM1

Easily dissolve in diluted basic solution, slightly dissolve in ethanol, diluted hydrochloric acid, almost not soluble in ether, water.

Easily dissolve in diluted acid and basic

sulfadoxine

C12H14N4O4S

310.33

190-194

Avoid light

solution, slightly dissolve in ethanol, acetone, almost not soluble in water.

Easily dissolve in diluted acid and basic

sulfamonomethoxine,

C11H12N4O3S

280.30

204-206

Avoid light

SMM

solution, slightly dissolve in ethanol, acetone, not soluble in water.

Easily dissolve in diluted acid and basic

sulfadiazine, SD

250.28

252-256

Avoid light

C10H10N4O2S [68-35-9]

solution, slightly dissolve in ethanol, acetone, almost not soluble in water.

Easily dissolve in diluted hydrochloric acid,

sulfamidine,sulfaguan

232.27

190-193

Avoid light

idine, SG

C7H10N4O2S [57-67-0]

slightly dissolve in basic solution, acetone, water.

Dissolve in ethanol, slightly dissolve in water,

sulfacetamide, SA

214.25

182-184

Avoid light

C8H10N2O3S [144-80-9]

or ethyl ether, almost not soluble in benzene or chloroform.

sulfaphenazole, SP

C15H14N4O2S

314.36

179-183

Avoid light

Easily dissolve in inorganic acid and basic solution, slightly dissolve in ethanol, almost not soluble in water.

Dissolve in boiling water, acetone, diluted acid

255.32

200-204

Avoid light

sulfathiazole, thiazamide, ST

C9H9N3O2S2 [72-14-0]

and basic solution, slightly dissolve in ethanol, very slightly dissolve in cold water, not soluble in ethyl ether, chloroform.

Note

T1/2(h)

Tmax( h)

Drug/ urine(%)

Distribut. capacity

Amidat.ratio( %) Blood urine

Protein- bound ratio(%)

Discretion ratio by urine

0.335

sulfamethi azole

SM1

2-3

1.5-4 90

20 60

0.335

73-85

0.18

73-87

4-6

84-90

30 30

0.16

SIZ

10.5

73-87

38 58

73-87

sulfamoxol e

2-4

10-12 65

0.17

50-60

10-36

sulfamethyl isoxazole

Affect by pH

10-15 50

40 15-40

0.36

27-34

SMPZ

37.9

80-95

10-50

Affect by pH

37.9

80-99

SDM

5-19

Affect by pH

SMD

38.2

70-89

15 32

0.2-0.7

30-50

Affect by pH

SMM

36-48 85-90

5 10

50-60

sulfadoxin

169

0.14

SMZ

10-12 65

38 58

50-60

Ratio of concentrations in blood/brain 30-50

Pharmaco-kinetics of sulfonamides Name

Detecting wavelength and detection limits

Antibacterial drugs

Matrices

Mobile phase

Reference

Wavelength, nm

meat

PDA

[1]

SM2,SD N-acetylSM2

50m mol/LnaH2PO4- acetonitrile（8+2）

feed

254

[2]

SM2 sulphaquinoxaline

Acetonitrile-acetic acid buffer- water225+150+625

fish

265

[3]

5 m mol/L oxalic acid - acetonitrile（55+45）

SM2 sulfasole sulfamonomethoxine

pork

272

[4]

acetonitrile-water-acidic acid（30+70+0.05）

SM,SM2 sulfasol sulfamonomethoxine

fish

260

[5]

SM,SMZ sulfasol sulfamonomethoxine

THF-H3PO4- acetonitrile-water （29+1+0.06+69.94）

meat

PDA,275

[6]

50m mol/L NaH2PO4- acetonitrile（2+1）

SD,SM2,SM’2 SN,SM,SMM,SMZ sulfadoxine sulfasol sulphaquinoxaline

Detecting wavelength and detection limits

A acetonitrile,B acidic

Bovine and swine

263

[7]

SM2,SM’2 SN,ST,SM

Tissue

acid buffer; gradient elution

acetonitrile-water-

[8]

Animal products Aqua-products

acetic acid （30+70+0.3）

SM, SM2, SMM sulfasol sulphaquinoxaline

268, 270, 274

（40+60+0.3）

A acetonitrile,B acidic

Fish

270

[9]

SN, SM, SM2,SD sulfasol

acid buffer; gradient elution

Chicken tissue

270

[10]

SN, SMZ, SMM sulfasol sulphaquinoxaline

10m mol/L H3PO4 buffer(pH5.9)- acetonitrile （85+15）

10m mol/L phophate

Bovine plasma

265

[11]

SM2, SM, SD SN,ST acetylSM2

buffer(pH7)- acetonitrile （85+15）

acetonitrile-water-aetic

Pork

285

[12]

acid

（18+81+1）

SN, SD,ST, SM SM2, SMZ,SIZ sulfapyridine sulfamethiazole sulfachlorpyridazine

[1] Horie M Saito K Hoshino Y, J Chromatogr, 1990, 502:371-378 [2] Cody M K Clark G B Conway B O B, Analyst(London), 1990, 115(1):1-8 [3] Masakazu H Koichi S Yoji H, J Chromatogr, 1991,538(2):484-491 [4] Japanese method [5] AOAC methods [6] Japanese method [7] Walker L V Walsh J R Webber J J, J Chromatogr, 1992，595(1,2)：179-

184

[8] Japanese method [9] Reimer J J Suarez A, J AOAC, 1992，75(6)：979-981 [10] Endon Y S Yakahashi Y Nishikawa M, J Liq. Chromatogr,1992，15(12)：

2091-2110

[11] Brewster J D Lightfield A R Barford R A, J Chromatogr,

1992,598(1):23-31

[12] Chinese mthod

Classification Classification

GROUPE A GROUPE A Substances with anabolic effect and non authorised Substances with anabolic effect and non authorised

substances substances

GROUPE B GROUPE B Veterinary drugs and contaminants Veterinary drugs and contaminants

Substances with anabolic effect and unauthorized GROUP A -- Substances with anabolic effect and unauthorized GROUP A

substances substances

) Stilbenes, stilbene derivatives, and their salts and esters ((11) Stilbenes, stilbene derivatives, and their salts and esters ) Antithyroid agents ((22) Antithyroid agents ) Steroids ((33) Steroids ) Resorcylic acid lactones including zeranol ((44) Resorcylic acid lactones including zeranol agonists ((55) Beta ) Beta--agonists Compounds Other Compounds ((66) ) Other

List of pharmacologically active substance for which no List of pharmacologically active substance for which no maximum levels can be fixed maximum levels can be fixed

furazolidone) (including furazolidone)

Aristolochia spp. and preparations thereof Aristolochia spp. and preparations thereof Chloramphenicol Chloramphenicol Chloroform Chloroform Chlorpromazine Chlorpromazine Colchicine Colchicine Dapsone Dapsone Dimetridazole Dimetridazole Metronidazole Metronidazole Nitrofurans (including Nitrofurans Ronidazole Ronidazole

Veterinary drugs and contaminants GROUP B –– Veterinary drugs and contaminants GROUP B

(1) Antibacterial substances, including sulphonamides, (1) Antibacterial substances, including sulphonamides, quinolones quinolones (2) Other veterinary drugs (2) Other veterinary drugs (a) Anthelmintics (a) Anthelmintics (b) Anticoccidials, including nitroimidazoles (b) Anticoccidials, including nitroimidazoles (c) Carbamates and pyrethroids (c) Carbamates and pyrethroids (d) Sedatives (d) Sedatives (e) Non--steroidal anti (e) Non (f) Other pharmacologically active substances (f) Other pharmacologically active substances (3) Other substances and environmental contaminants (3) Other substances and environmental contaminants (a) Organochlorine compounds including PCBs (a) Organochlorine compounds including PCBs (b) Organophosphorus compounds (b) Organophosphorus compounds (c) Chemical elements (c) Chemical elements (d) Mycotoxins (d) Mycotoxins (e) Dyes (e) Dyes (f ) Others (f ) Others

inflammatory drugs (NSAIDs) steroidal anti--inflammatory drugs (NSAIDs)

A.1. Stilbenes and derivatives

Synthetic estrogens Used as feed additive or as implant in the ear to promote growth Extensively used till 1979 (USA) Carcinogenic Banned

A.1. Stilbenes and derivatives

• Structure

DES

 Metabolism

– absorbed from gastointestinal tract – slowly metabolized in liver – excreted in urine and feces

 Methods

HPLC, GC-MS, HPTLC, RIA, EIA

A.1. Stilbenes and derivatives

Compound (Metabolite) Species

Matrix

Method

Diethylstilbestrol

cattle

urine

Hexestrol

feces

TLC

pigs

Dienestrol

fat

GC - MS

sheep

muscle

horses

farmed fish

bile

poultry

A.2. Antithyroid agents

• Action: inhibit function of thyroid

gland

weight 

 Fraud: sell “water” for the price of meat

 Carcinogenic and teratogenic

 Prohibited in many country

- increased filling of gastro-intestinal tract - higher water retention

 Classification

◦ natural (glucosinolates in plant material) ◦ synthetic

Compound

Species

Matrix

Method

thyroid urine serum

GC - MS LC - MS HPLC

Thiouracil (TU) Methylthiouracil Propylthiouracil Phenylthiouracil Tapazol

cattle pigs sheep goat horses poultry

A.2. Antithyroid agents

• Chemical structure – thiouracil analogues – mercaptoimidazole analogues

tapazol

mercaptobenzimidazole

A.2. Antithyroid agents

• Methods

– Indirect: gravimetry of thyroid gland

– Direct: HPTLC, GC-MS, LC-MS

 Matrices

– thyroid gland – Musculus diaphragma (for screening of MTU)

gland > 60 g : suspicious

Compound

Species

Matrix

Method

calves

plasma

17 - ß - Oestradiol Testoster one Progesterone

 Base skeleton

◦ 3 hexane rings (A, B, C) ◦ 1 pentane ring (D) with linear alkane chain or different

substituents

C D

estrogens

androgens

gestagens

 Stimulate growth

– gain in protein deposition – improved food conversion rate

A B

 Metabolism - two phases

Functionalisation reactions

Conjugative reactions

water solubility  of compound to facilitate the excretion via bile or urine

estrogens A.3. Steroids -- estrogens A.3. Steroids

 Classification

◦ Natural ◦ Semi-synthetic

 esterification of OH-group of estradiol  better activity than estradiol

◦ Synthetic

 derivatives of estradiol: EE2 and mestranol  stilbenes: DES, hexestrol, dienestrol  derivatives of resorcylic acid lactones: zeranol

 Chemical structure

 Production site

– Nonpregnant: ovary – Pregnant: placenta

 Active form: 17-beta

 Classification

◦ Natural: testosterone ◦ Semi-synthetic

 esterified at the 17-OH group with organic acid  “retard” preparates  action period  length of carbon chain of acid

◦ Synthetic

 Nandrolone, methyltestosterone, 17b-boldenone,  methylboldenone, methandriol, trenbolone, stanozolol,

nôrethandrôlône,…

 200 mg of

methyltestosterone

 to a bovine

Urine 2 days after treatment Urine 8 days after treatment Feces 2 days after treatment Feces 8 days after treatment

MT ng ml-1/ng g-1 7 2 0 0

MeAD ng ml-1/ng g-1 41 7 209 74

MeAD = biological marker for MT in

urine and feces

 Use

◦ cases of osteoporosis ◦ deficiency in protein

synthesis

 Metabolism: almost

 LC-MSn

completely metabolised

 Effect

◦ development of the endometrium ◦ maintaining pregnancy

 Classification

◦ natural ◦ semi-synthetic

 esters of hydroxyprogesterone  in kidney fat

◦ synthetic

 acetate esters  in kidney fat

corpus luteum

progesterone

liver

urine 17a-hydroxyprogesterone

 Growth stimulant with estrogenic activity  To reduce stress in cattle  Formed in vivo from the mycotoxins zearalenone

and a-zearalenol produced by Fusarium species on grains

 Expected levels: ppb to ppt range

O H

C H 3

H O

z e a r a l e n o n e

O H

O H O

C H 3

O H

H O

O H

 - z e a r a l e n o l

a - z e a r a l e n o l

H O F U S A R I U M F U N G U S

O H

C H 3

O H O

C H 3

O H

H O

O H

a - z e a r a l a n o l ( z e r a n o l )

 - z e a r a l a n o l ) ( t a l e r a n o l

O H

C H 3

Z E R A N O L I M P L A N T

H O

z e a r a l a n o n e

 Action

◦ bronchodilators ◦ repartitioners: fat  and muscle  ◦ better feed conversion

 Example

◦ dose of 2 till 4 ppm in the feed during 2 – 3 months ◦ ◦

growth increases with 20 % carcass quality improves with 10 %

Compound (Metabolite)

Species

Matrix

Method

IA GC - MS LC - MS

Bromobuterol Cimaterol Cimbuterol Clenbuterol

(Hydroxymethylclenbuterol)

cattle pigs sheep horses poultry game rabbit

retina liver muscle urine plasma feed

Clencyclohexerol Clenisopenterol Clenpenterol Clen properol Fenoterol Isoxsuprine Mabuterol Mapenterol Orciprenalin Ractopamin Ritodrine Salbutamol Terbutalin Tulobuterol Zilpaterol

 Broad spectrum

antibiotic

 Against pathogenic G-

bacteria  Action:

◦

inhibition of bacterial

protein biosynthesis  Chemical structure:

 Application: mouth, intravenous, eye  Inactivation: liver  Excretion: kidneys, urine, faeces (poorly)  Residues: all edible tissues, milk, eggs  Metabolites:

chloramphenicol-glucuronide

dehydroamphenicol

chloramphenicol base

nitrophenylamino-propanedione

hydroxyamphenicol

nitroso-chloramphenicol

 Analysis: HPLC, GC-MS, HPTLC

 Synthetic antibacterial compounds  Treat: salmonellosis and E.coli infections  Mutagenic  Prohibited for use in food-producing animals

 Furazolidone:

 Metabolism / absorption:

~ species (ruminants  non-ruminants)

 Target tissue for routine = muscle

~ age

Chlorpromazine

Compound ( Metabolite) Species

Matrix

Method

Chlorpromazine

muscle

cattle pigs

HPLC/DAD GC - MS

 Treatment:

◦ histomoniasis in turkeys ◦ trichomoniasis in pigeons, cattle ◦ haemorrhagic enteritis in pigs

 Methods of analysis:

◦ LC-MS ◦ GC-MS

2-hydroxymethyl-1- methyl-5-nitroimidazole

ronidazole

88 % eliminated from turkeys within 3 days

76 % eliminated from pigs within 7 days

dimetridazole

GROUP B GROUP B -- Veterinary drugs and Veterinary drugs and contaminants contaminants

(1) Antibacterial substances, including sulphonamides, quinolones (2) Other veterinary drugs (a) Anthelmintics (b) Anticoccidials, including nitroimidazoles (c) Carbamates and pyrethroids (d) Sedatives (e) Non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) (f) Other pharmacologically active substances (3) Other substances and environmental contaminants (a) Organochlorine compounds including PcBs (b) Organophosphorus compounds (c) Chemical elements (d) Mycotoxins (e) Dyes (f ) Others

penicillins

cephalosporins

 Analysis – bioassays – LC – UV, UV-PDA, fluorescence – LC-MS (confirmation)

 > 65 % of the antibiotics for veterinary use  Treatment of respiratory disease  Broad spectrum  Target matrix: bones (found months after

application)

 Most important: oxy-,chlor-, tetracycline

tetracycline

(more human medicine)

 Relatively new synthetic antibiotics  Treatment of urinary tract infections   broad spectrum  1st generation: nalidixic acid, oxolinic acid   2nd generation: fluoroquinolones (more potent)  Analysis: HPLC + UV / Fluo-detection

 LC-MS

 Action:

◦ treat respiratory disease ◦ promote growth

 Produced by Streptomyces spp.  Against: G+ and G- bacteria

 mycoplasmas

 Analysis:

◦ microbiological assays ◦ LC-MS

lactons

deoxy / amino sugars

sugars

 Wide spectrum: G+ and G- bacteria  Accumulate in kidney  Most important: ◦ streptomycin ◦ dihydrostreptomycin

streptomycin

 Against:

◦ mycoplasmas ◦ organisms implicated in chronic respiratory disease in

poultry

 Most important: ◦ spectinomycin ◦ apramycin

 To control internal worm parasites  Analysis:

◦ liquid chromatography ◦ enzyme immunoassay

 Major classes:

 To treat coccidiosis

 Major disease problem in poultry  Coccidia= parasites of intestinal epithelium  Acute form: high mortality  Subacute form: – weight gain  – feed conversion  – egg production 

disease carried by unicellular org. genus Eimeria (< Sporozoa)

 Due to resistance  rotation programmes  Ionophores

◦ more efficient method of control ◦ bird develops a level of immunity

 Managment of stress in meat producing animals

 Farm

slaughterhouse

stress

metabolic changes in muscle

quality of meat  (PSE)

 Short time between administration - slaughter High levels for residues in edible tissues

(azaperone, azaperol, carazolol)

(promazines)

MRL

/ Prohibited

 Analysis: HPLC-UV, LC-MSn

Therapy for inflammation

 Two groups:

immunosuppressive activity)

◦ glucocorticoids (anti-inflammatory and

 Illegal growth promoters  Combination with b-agonists / anabolic steroids  Effect:

◦ mineralcorticoids (salt-sparing activity)

 Analysis: EIA, GC-MS or LC-MS

◦ feed intake ◦ live mass gain  ◦ feed conversion rate 

 5.1. Các phương pháp phân tích kiểm định vi sinh

vật trong sản phẩm nông nghiệp

 5.2. Các phương pháp phân tích côn trùng dịch hại

trong sản phẩm nông nghiệp

 6.1. Phương pháp truyền thống kiểm định độc tố

sinh học trong sản phẩm nông nghiệp

 6.2. Các phương pháp phân tích mới kiểm định độc

tố sinh học trong sản phẩm nông nghiệp

 6.3. Các phương pháp phân tích nhanh độc tố sinh

học trong sản phẩm nông nghiệp

Độc tố nấm mốc là độc tố được sản xuất bởi các loài nấm ở điều kiện nhiệt độ và ẩm độ thích hợp.

Nấm Aspergilus flavus

Nấm Aspergilus penicillium

 Được phát hiện 5,000 trước tại Trung Quốc.  Năm 1861 tại Nga  1891, phát hiện gạo mốc tại Nhật  1960, phát hiện độc tố aflatoxin.

Ochratoxin A Trichothecene Zearalenone Fumonisin Patulin Beauvericin Moniliformin Aflatoxins

Các sản phẩm thường nhiễm nấm

- Là chất hòa tan và

- Là một chất hấp thu quang phổ tia cực tím (quan sát được ở bước sóng 428 nm)

-Công thức hóa học: C20H18ClNO6 -Trọng lượng phân tử = 403.82 g/mol - sản phẩm chính của Penicllium. verrucosum và nhiều loài Aspergillus khác.

- Mức cho phép trong sản phẩm khoảng 0.5- 10 µg/kg thực phẩm và các sản phẩm nông sản chưa qua chế biến theo tiêu chuẩn châu Âu.

phân cực (tối đa ở bước sóng 213 nm và 332 nm trong ethanol)

Công thức hóa học của trichothecene type B: DON (R1 = OH, R2 = H, R3 = OH, R4 = OH) NIV (R1 = OH, R2 = OH, R3 = OH, R4 = OH) Công thức hóa học của 3-AcDON (R1 = OAc, R2 = H, R3 = OH, R4 = OH) trichothecene type A: 15-AcDON (R1 = OH, R2 = H, R3 = OAc, R4 = OH) FUS-X (R1 = OH, R2 = OAc, R3 = OH, R4 = OH) T-2: (R1 = OAc)

HT-2 (R1 = OH)

Mức cho phép của DON trong thực phẩm và nông sản chưa qua chế biến khoảng 200 -1250 µg/kg thực phẩm và các sản phẩm nông sản chưa qua chế biến theo tiêu chuẩn châu Âu.

Cấu tạo hóa học của zearalenone và a - zearalenone

- Tác động như estrogen và những những tác động đồng hoá quan sát được trên heo, chuột, chuột cống.

- Mức cho phép của chất này trong sản phẩm 20 - 200 microgram/kg theo tiêu chuẩn Châu Âu.

Công thức

Độc tố

Trọng lượng phân tử [g/mol]

FB1

C34H59NO15

721.8

FB2

C34H59NO14

705.8

FB3

C34H59NO14

705.8

C34H59NO13

689.8

FB4

Cấu tạo hóa học của fumonisin B1-B4 Fumonisin B1: R1= OH; R2= OH; R3= OH Fumonisin B2: R1= H; R2= OH; R3= OH Fumonisin B3: R1= OH; R2= OH; R3= Các độc tố fumonisin là sản phẩm của Fusarium spp. như F. moniliforme H và F. proliferatum. Fumonisin B4: R1= H; R2= OH; R3= H Mức cho phép trong thực phẩm và nông sản chưa qua chấ biến khoảng 200 -2000 µg/kg thực phẩm và các sản phẩm nông sản chưa qua chế biến theo tiêu chuẩn châu Âu.



Patulin là độc tố nấm mốc Penicillium, Aspergillus và Byssochylamys



Công thức hóa học của patulin: 4-hydroxy-4H-furo[3,2- c]pyran-2(6H)-1

là các loại nấm có thể phát triển trên nhiều loại thực phẩm (Táo, rau củ, ngũ cốc)



Patulin là một hợp chất

tinh thể không màu, điểm nóng chảy 110 °C. Hấp thụ tia UV cực đại ở bước sóng 276 nm.

Mức cho phép của chất này trong sản phẩm khoảng 30-50 µg/lít ở nhiều quốc gia.

 Là một cyclodepsipeptide độc hại về mặt sinh học

 Beauvericin là sản phẩm của nhiều loài nấm Fusarium

chứa 3 nhóm D-a-hydroxy-isovaleryl and N- methyl-L-phenylalanyl.

và cũng tìm được ở nấm Beauveria bassiana.

 Moniliformin có tên hóa học là 3-hydroxy-3- cyclobutene-1,2-dione, 1 anion kết hợp với potassium hay sodium

 Là sản phẩm của các loài Fusarium (F. fujikuroi, F. proliferatum, avenaceum, subglutinans). MON có dạng độc và không độc.

Aflatoxins là sản phẩm của nhiều loài nấm

Aspergillus species (chủ yếu là A. Flavus, A. parasiticus, và A. nomius).

Cấu trúc hóa học của các loại aflatoxin B1,

B2, G1, G2 và M1, M2 trong đó B1 là phổ biến nhất và độc hại nhất.

 Hạt  Sữa  Táo  Yến mạch  Các lôại đậu  Khoai tây

 Bắp  Lúa mạch  Hạt bông  Đậu phộng  Kê  Lúa mì  Thức ăn gia súc ủ

trong xilô

Cấu tạo hóa học của các nhóm aflatoxin

[1]: Aflatoxin B1; [2]: Aflatoxin B2; [3]: Aflatoxin B3 [4]: Aflatoxin G2 ; [5]: Aflatoxin M1; [6]: Aflatoxin M2 Mức cho phép của Aflatoxin B1 trong các sản phẩm sữa và các loại hạt là 0.5 – 0.8 microgram/kg và của aflatoxin tổng số ở các loại ngũ cốc là 4 đến 15 microgram/kg theo tiêu chuẩn Châu Âu.



Ochratôxin A đi vàô tế

bàô thông qua vật chuyên chở aniôn đặc hiệu. Cấu tạô của



Ochratôxin A chứa 1 nửa là isôcumarin kết hợp với phenyalanine.



Ochratôxin A tác động

đến quá trình chuyển hóa phenyalanine từ đó ngăn trở quá trình tổng hợp prôtein, tổng hợp các enzyme có phenyalanine và gắn vàô các prôtein ở cơ quan.

Deoxynivalenol và trichothecene khuếch tán vào trong tế bào , bám vào và ức chế hoạt động giải mã của các ribosome hoạt động chịu trách nhiệm truyền tín hiệu đến các enzyme proteinkinase được hoạt hóa bởi RNA (RNA-actived protein kinase: PKR) và enzyme tạo tế bào máu (haematopoietic cell kinase- Hck). Quá trình phosphoryl hóa các proteinkinase được hoạt hóa bởi quá trình phân bào dẫn đến hoạt hóa yếu tố phiên mã (transcription factor activation) và dẫn đến các tác hại mãn tính như suy nhược, giảm cân hay kích thích phản ứng viêm, hay tác động đến cơ chế chết theo chu kỳ dẫn đến việc mất, giảm chức năng của mô và gây suy giảm miễn dịch.

Cấu trúc của fumonisin B1 và sự ngăn trở của enzyme sphinganine N- acetyltransferase dẫn đến phong tỏa sự tổng hợp sphingolipid phức hợp de novo. Sự tích lũy của sphinganine (đôi khi là sphingosine) và sự chuyển đổi sphinganine thành sphiganine 1- phosphate từ đó bị phá hủy cho ra các sản phẩm lipid xấu (các aldehyde béo và ethanolamine phosphate). Các fumonisin cũng phong tỏa sự tái tổ hợp acyl của sphingosine và các sphingosine đó được phóng thích bởi vòng tuần hoàn của những sphingolipid phức tạp hơn. Kết quả là quá trình trao đổi chất của sphingolipid giảm, Nhiều chất trung gian lipid có hoạt tính sinh học gia tăng và một số khác bị mất đi. Một số ví dụ về hoạt tính sinh học của các chất trung gian này là gia tăng các sphingoid base tự do nội bào làm ức chế enzyme protein kinase C; gia tăng sphiganine 1- phosphate khởi động sự phóng thích canxi lưới nội chất và hoạt động như một phần tử của các điểm tiếp nhận ngoại bào trong mạch máu (S1P receptor) gia tăng sphinganine tự do làm ảnh hưởng đến sự sinh sản của tế bào, làm gia tăng chu kỳ tế bào; gây chết tế bào theo chu kỳ hay hoại tử tế bào; gia tăng lượng sphiganine 1- phosphate trong huyết thanh và thận, 1 phần của S1P receptor; và làm suy kiệt các sphingolipid phức tạp (glycosphingolipid và sphingomyelin hiện diện ở màng tế tào nhờ ceramide với nhóm đầu là + hay -) là những thành phần cần thiết trong các quá trình điều hòa sự phát triển của tế bào, làm gia tăng chu kỳ tế bào, chức năng chuyên chở lipid (như ngăn trở sự hấp thu muối folate ăn vào) và sự tương tác giữa tế bào và bế bào.

Zearalenone (Z) xâm nhập vào

Phức hợp receptor-Z (phức

trong tế bào nhờ receptor cytosolic estrogen do Z giống phytoestrogen (PE) và các estrogen ngoài môi trường (AE), vận chuyển thụ động qua màng tế bào và bám vào receptor cytosolic estrogen. hợp PE/AE) nhanh chóng được vận chuyển vào nhân tế bào và bám vào các receptor đặc hiệu trong nhân và dẫn đến các đáp ứng của estrogen thông qua việc hoạt hóa gen sản xuất mRNA mã hóa cho các protein có tính chất khác các protein mà thông thường do sự kết hợp của hỗn hợp receptor-estrogen kéo dài thời gian lên giống, giảm tính dục, testosteron trong máu, giảm số con / lứa đẻ.

Các quá trình traô đổi chất của

aflatôxin dẫn đến ung thư và gây độc tế bàô. Aflatôxin vàô trông tế bàô và được traô đổi chất thông qua enzyme mônôôxygenase bên trông lưới nội chất tác động đến chất chuyển hóa được hydrôxy hóa từ đó chuyển hóa thành glucôrônide và các chất kết hợp với sulfat hay được ôxy hóa thành epôxide hôạt hóa, chất này trải qua quá trình thủy phân tự phát thành AFB1-8- 9-dihydrôdiôl và có thể bám dính vàô prôtein từ đó gây độc tế bàô. Epôxide có thể tương tác với DNA hay prôtein gây biến dị dẫn đến ung thư hay được khử độc bởi enzyme glutathiône S- transferase thành những chất có liên kết với glutathiône. Các DNA và prôtein bị chuyển hóa được xem là một maker sinh học trên người và thú.

Lấy mẫu

Nghiền và đồng nhất mẫu

Tách chiết 10-200 g mẫu

Lọc mẫu

Tinh sạch và tách chất cần phân tích khỏi mẫu ban đầu

Chuẩn bị cho phân tích mẫu, chuẩn độ trước và xác định lượng dung môi thêm vào

Phân tích

Các giai đoạn phân tích độc tố nấm mốc

 Phương pháp lắc và trộn dùng tách chiết mẫu

(Zearalenone, Ochratoxin A, Patulin, Fumonisins)

Dùng dung môi thích hợp có độ phân cực và trộn

đều để chia các tách các chất cần phân tích

Trichothecenes)

Tách dung dịch khỏi dung dịch dựa trên sự chia tách các thành phần hữu cơ

giữa mẫu lỏng và dung môi hữu cơ không phân cực hay phân cựu yếu

 Phương pháp tách chiết pha rắn (Solid phase extraction: SPE) (A & B-

Trichothecenes, Ochratoxin A, Zearalenone, Fumonisins)

Phương pháp tinh sạch mẫu  Phương pháp tách dung dịch – dung dịch (Zearalenone, B-

Moniliformin)

Nguyên tắc giữ lại thành phần mong muốn dựa trên lực hút tĩnh điện của nhóm chức năng trên bề mặt silica của cột. pH của hỗn hợp mẫu phải được đưa về 1 giá trị mà ở đó chỉ có chất cần phân tích được giữ lại.

Để tách rửa chất cần phân tích, các nhóm chức năng khác bám vào cột hấp thu phải được trung hòa. Để rửa chất mong muốn, phá vỡ lực hút tĩnh điện giữ hai chất và thu được thành phần mong muốn dùng một dung môi có tính ion hóa cao hay một số ion có thể thay thế chất cần phân tích đã được hấp thụ. Các cột tao đổi ion được sử dụng tinh sạch các mẫu chứa các độc tố nấm mốc moniliformin ion hóa.

Phương pháp tinh sạch mẫu  Phương pháp sử dụng các cột trao đổi ion (Fumonisins,

Phương pháp tinh sạch mẫu  Phương pháp tách chiết chất lỏng tới hạn (Supercritical Fluid

Extraction: SFE) (B-Trichothecenes)

Phương pháp SFE sử dụng chất lỏng tới hạn để tách chiết. CO2 thường được sử dụng là dung môi tách chiết do không độc hại, cháy và trơ. Ưu điểm chính của dung dịch tới hạn này là mật độ và khả năng solvate cao cũng như độ nhớt và khả năng khuếch tán tốt hơn các chất lỏng tách chiết thông thường. Qui trình thực hiện nhanh và có thể thực hiện có hệ thống hay độc lập và các chất hỗ trợ như methanol gia tăng năng lực tách chiết các phân tử phân cực.

Phương pháp tinh sạch mẫu  Phương pháp sử dụng các cột miễn dịch (Immunoaffinity columns)

(Zearalenone, Ochratoxin A, Deoxynivalenol, Fumonisins)

Phương pháp tạo dẫn xuất nâng

Phương pháp tinh sạch mẫu  Phương pháp tạo dẫn xuất

cao khả năng phát hiện độc tố. Nó khuyếch đại chất cần phân tích để chất này phát quang và độ phát quang tỷ lệ với số lượng chất cần phân tích có trong mẫu

(1) Trimethyl chloro silane (TMCS, chất để tạo dẫn xuất với B-trichothecenes) (2) N-Trimethylsilyl-imidazole (TMSI, chất để tạo dẫn xuất với B- trichothecenes) (3) N,O-Bis-(Trimethyl silyl) acetamide (BSA, chất để tạo dẫn xuất với B- trichothecenes) (4) Tetrabutylammoniumhydroxid (TBAH, chất để tạo dẫn xuất với moniliformin) (5) ortho-Phtalaldehyde (OPA, chất để tạo dẫn xuất với Fumonisins) (6) heptafluorbutyryl-imidazole (HFBI,

Phương pháp tinh sạch mẫu  Phương pháp sử dụng các cột Mycosep™ (A & B-Trichothecenes,

Patulin, Zearalenone)

Cấu tạo có Một vành nhựa, một mảnh thủy tinh có các lỗ nhỏ li ti và một van 1 chiều ở phần cuối phía dưới đảm bảo rằng chất tách chiết chịu áp lực để đi qua vật liệu trong ống khi cột này nối với tube nuôi cấy. Thời gian tinh sạch qua ống nhựa khoảng 10 – 30 giây. Không cần bước rửa như trong phương pháp SPE và tất cả các chất không mong muốn còn trong cột và chất cần phân tích không giống các vật liệu sử dụng trong ống.

Phương pháp ELISA Hiện có các bộ kít phát hiện aflatoxin tổng số, aflatoxin

B1, aflatoxin M1, ochratoxin A, citrinin, zearalenone, T-2 toxin, deoxynivalenol, fumonisins B1, B2, B3, patulin, moniliformin.

Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Phương pháp sắc ký khí (Gas Chromatography: GC)

Hệ thống mày sắc ký khí HP 5890 Các phương pháp phát hiện:

•Các khí trơ như helium, argon, hydrogen và nitrogen được sử dụng làm khí mang.

Phương pháp phát hiện bằng cách bắt giữ điện tử (Electron Capture Detection: ECD)

Phương pháp phát hiện bằng phương pháp phổ kế khối lượng (Mass Spectrometric Detection: MS)

• Có 8 loại độc tố fusarium mycotoxin (B-trichothecene và zearalenone) và patulin được tách và phát hiện bằng phương pháp GC-MS. Thời gian phân tích 1 mẫu từ 15 đến 20 phút.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography: HPLC)

Ứng dụng cho ochratoxin A, deoxynivalenol (DON), nivalenol (NIV), fusarenon-X, 3- và 15- acetyl deoxynivalenol, moniliformin và beauvericin, Aflatoxins

Phương pháp sắc ký pha thường với 1 pha cố định phân cực (ví dụ như silica gel) và 1 dung dịch không phân cực (Ví dụ: hexane)

hệ thống máy HP 1100 HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha ngược (reversed phase chromatography: RP- HPLC) trong đó pha cố định là hydrocarbon C8 hay C18 với dung dịch phân cực như nước, methanol hay acetonitrile.

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid

Chromatography: HPLC) (tt)

Các kỹ thuật phát hiện của máy HPLC - Phát hiện bằng hệ mạng 2 cực (Diode Array Detection: DAD): dùng điện cực để phát hiện độc tố dựa trên khoảng thời gian phát tính hiệu ở 1 bước sóng phù hợp

- Phát hiện bằng sự phát huỳnh quang (Fluorescence Detection: FLD): dựa vào sự phát màu của phân tử là khả năng phát sáng của phân tử ở những mức năng lượng cao do hấp thụ bức xạ điện tử

- Phát hiện phổ khối lượng cùng sự ion hóa bằng phương pháp hóa học ở áp suất không khí (Mass Spectrometric Detection with Atmospheric Pressure Chemical Ionisation: APCI-MS):

Nguyên tắc dùng các phân tử bắn thành các phần nhỏ đi vào vùng chân không của phổ khối lượng và sau khi đi qua bộ phận tiêu điểm các chất cần phân tích sẽ được phát hiện bằng thiết bị bắt ion thích hợp

 Độc tố nấm mốc là độc tố do một số loại nấm mốc sản xuất. Một số loại độc tố nấm mốc gây ngộ độc thực phẩm thường gặp là Ochratoxin A, trichothecenes, aflatoxin, Patulin, fumonisin, zearalenone, và Beauvericin và Moniliformin.

 Độc tố nấm mốc gây hư hỏng thực phẩm, giảm tính

ngon miệng, gây ngộ độc thực phẩm, gây rối loạn một số hoạt động sinh học, ức chế hoạt động miễn dịch, gây các bệnh mãn tính và gây ung thư trên người.  Có nhiều phương pháp định tính và định lượng. Trong đó các xét nghiệm ELISA, sắc ký lớp mỏng được sử dụng như các test sàng lọc. Các phương pháp sắc ký lỏng hiệu xuất cao, phương pháp sắc ký khí, phương pháp phổ ký khối lượng thường được sử dụng định với tính chính xác cao trong định tính và định lượng các loại độc tố nấm mốc.

 7.1. Khái niệm và các vấn đề liên quan đến sinh vật

biến đổi gen

 7.2. Sản phẩm nông nghiệp từ sinh vật biến đổi gen  7.3. Các phương pháp phân tích hàm lượng sinh vật

biến đổi gen trông sản phẩm nông nghiệp

 Normally:  genes are only passed between members of

the SAME species

 Change takes a LONG time  Difficult to get EXACTLY what you want

Interspecific Cross Interspecific Cross

Wheat Rye

X

Triticale

New species, but NOT Biotechnology products

What is the Result of GMO ?? What is the Result of GMO

An organism showing a novel trait encoded by an introduced gene(s), which generally produce an additional protein(s) that confers the trait of interest.

Extended shelf-life tomato (FlavrSavr Tomato)

Herbicide resistant soybean (Roundup Ready Soybean)

How Do You Introduce a Foreign Gene into a Recipient Organism?

 Physical Transformation Methods

 Osmotic Shock  Electroporation  Microinjection  Carbon Filament

 Direct Transformation

 Apical excision  Pollen Transformation

 Biological Transformation

 Agrobacterium mediated transfer  Viruses (TMV, CMV, ACMV)

Agrobacterium Transformation – Engineering the bacterium

Agrobacterium tumefaciens

Plant Viruses

Coat Protein Gene

Isolated Ti plasmid DNA

Engineered Ti plasmid with viral coat protein gene

Recombinant plasmid returned to Agrobacterium

Agrobacterium Transformation – Plant Transformation

Agrobacterium infects plant cells. Protein gene is transferred into cell chromosome.

Plant tissue is cultured to produce transformed plantlets with each cell containing transgene.

Generated plant will express resistance if infected with virus.

1st - Need plant tissue-culture regeneration 2nd – Regeneration of transformed cell Proper media requirements are difficult to determine Balanced hormonal signals must be applied in a timely manner for plant formation

Callus

Leaf Discs

Transformation series of events

Transform individual cells

Callus formation

Remove from sterile conditions

Cytokinins

Auxins

 Corn  Soybeans  Cotton  Canola  Cauliflo

•Tomato •Sugar beet •Papaya •Potato •Cabbage

•Alfalfa •Tobacco •Sugarcane •Rice •Peppers

Not available for commercial production

Wheat Grapes Pineapple Onion

Barley Bananas Carrots Celery

“Round Up”is a Pesticide that kills ALL PLANTS (unless they have the RR gene)

Trait of GMOs Fatty acid composition Fertility restoration Herbicide tolerance Insect resistance Male sterility Modified color Mutations Ripening delayed Selectable marker Virus resistance

Herbicide resistant crops

 current: soybean, corn, canola  coming: sugarbeet, lettuce, strawberry, alfalfa, potato, wheat (2005)  resistance gene from bacteria

Source: Monsanto

 papaya, squash, potato  resistance gene from a virus

Virus resistance

Insect resistant cotton

 Bt toxin kills the cotton boll worm  toxin gene from a bacteria

Source: USDA

Insect resistant corn

 Bt toxin kills the European corn borer  toxin gene from a bacteria  Rootworm GM approved (2/26/03)

Normal

Transgenic

Turfgrass

 Herbicide resistance  Slower growing reduced mowing = reduced pollution

Bio Steel

 Spider silk strongest known protein  Protein expressed in goat milk  Protein used to make soft-body, bullet proof vests (Nexia)

Next Generation of Ag Biotech Products

Golden Rice

 Increased Vitamin A content  Transgenes from bacteria and daffidol  Controversory: large amount needed to solve problem

Sunflower

Source: Minnesota Microscopy Society

 White mold resistance  Resistance gene from wheat

I am GM cock! I am GM cock!

DNA based testing methods

Protein based testing methods

Qualitative PCR

Quantitative real-time PCR

Southern blot

NIR spectroscopy

Gene construction for plant transformation

1. Selectable

2. Transgene

3. Promotor

4. Terminator

* Selectable gene : Reporter genes; NPT II, HPT and GUS

 Rely on 2 complementary DNA strands that hybridize in a sequence-specific manner  rDNA in the crop consists of several unique

35S promoter CaMV

elements

EPSPS CP EPSPS CP44 NOS terminator Agrobacterium tumefaciens

promoter sequence, structural gene，a stop sequence

Sampling method

DNA isolation

PCR reaction

Analysis of PCR result

Raw Materials

Processed Products

Highly Processed Products

Raw Materials

- Plant tissue

leave

root

stem

- Seed

- Fruit

- Flour Soy flour corn flour wheat flour etc. - Starch corn starch cassava starch - Soy protein extract - Paste - Animal feed

Highly Processed Products

- SAUCE

tomato suace , soybean

sauce, etc

- vegetable Oil

-Lecitin

chocolate,etc

Both sample size and sampling procedures are

important issues for testing GMOs in raw

material and food ingredients if one is to avoid

problems of nonhomogeneity.

Break cell walls

Dry ice or Liquid nitrogen Cell membrane disruption Detergents e.g. CTAB or SDS Inactivate nucleases EDTA binds Mg2+ & Proteinases Separate inhibitory polysaccharides Separate Hydrophobic cell constituents E.g.. lipids & polyphenols with organic solvent Separate from detergent with alcohol

Scope  raw GMO materials, processing food Scope products including sauce, lecithin, chocolate, refined oil (applied for patent)… Methods  CTAB, SDS, commercial kit, special Methods method …

ABI 2700

ABI 9700

 Gel electrophoresis – size

◦ Artefact of same size leads to false +ve’s

 Enzyme digestion

◦ Convenience

 Southern Blot Assay

◦ Reliable but time consuming

 Nested PCR allows for discrimination

◦ 2nd primer pair within amplicon

 Sequencing

◦ Convenience and time consuming

of PCR amplicon Sequencing of PCR amplicon Sequencing

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 4 5 6 7 8

 Quantitative results  Differs from typical PCR by addition of a fluorogenic probe

 No carry-over contamination

 Gel-free analysis  Integrated and automated amplification, detection, data collection

between PCR primers  Greater specificity provided by TaqMan probe  Single, closed tube analysis of amplified product

 High throughput, 96-well format  IPC prevents false negative result

and analysis

Real time PCR - TaqMan™ Technology

FAM™ or VIC™ Dyes R = Reporter FAM™ or VIC™ Dyes R = Reporter

Q = Quencher Q = Quencher

TAMRA™ Dye TAMRA™ Dye

Fluorescence emitted from reporter when cleaved from amplified DNA product

Three steps to accurate %GM calculation

1. Sample preparation 2. Amplification and detection 3. Data analysis

Positive samples

Negative control

Ct value

Screening Detection of GM potato and rapeseed

Amplification of EPSPS gene

Amplification of lectin gene

Quantitative detection of Roundup Ready Soybean

ABI PRISM 7900 Sequence Detection System

7900HT system complete with Automation Accessory and Windows NT® computer

 The plate is identified using

the hand-held bar code reader automatically linking the experimental set-up information to the plate

 The plate can now be

placed in an active input stack of the Automation Accessory

 The plate is picked up by the Automation Accessory and loaded into the 7900HT system drawer  The plate bar code is read by the integrated barcode reader

 Experimental set-up

information is retrieved and run begins

 Co-amplification of target sequence & internal standard

◦ Corrects for decreased reaction efficiency ◦ Unknown specific target and known control template  Optimally want to use same primers that amplify sequences

 Double QC-PCR uses 2 different reactions

of 2 different sizes

 E.g. lectin (lel) gene in soybeans, for RRS

◦ GM target and trait specific

◦ Competitor equivalent to 1% GM soybean (+/-)

QCQC--PCRPCR

Adapted from Hübner et al., 1999

+ve

-ve

 Begin by cutting DNA of GMO into fragments with Restriction Enzymes

 Run DNA on an agarose gel  “Blot” onto a membrane  Probe membrane  Autoradiography

P32 labelled probe

Western blot ELISA Lateral flow strip Magnetic particles Protein chips

 Highly specific qualitative test  Typically used for research  Use denaturing SDS-PAGE

Protein samples subjected to gel-electrophoresis and the separated proteins blotted to membranes. Color tagged antibody specifically bind to the antigene of interests.

eliminated

◦ Solubilizes, removes aggregates & adventitious proteins are

weight Paper towel

Wet filter paper

Paper towel

Transfer membrane

 Antibody-coated microwells

◦ Quantitative, highly sensitive, economical, high throughput & ideal

for laboratory analysis  Provided non denatured protein

◦ Detects 0.25% GMO in seeds & 1.4% toasted meal

Enzyme-labelled Anti- antibody antibody

GMO protein specific to antigen

Colour Response Concentration Dependent

Antigen

Blocking protein

well

 Similar Approach to ELISA  Better suited to field testing ◦ Useful for Qualitative testing ◦ Quantitative test difficult with no standards

 ELISA variation with immobilized double antibodies, specific to expressed proteins are coupled to a colour reactant and incorporated to a nitrocellulose strip

 Fast, economical, transferable & good for initial screening

1 2

1. Punch leaf disc

 Tests for CryI(Ab) & CP4 EPSPS  Plant & seeds  More coming

2. Add buffer and grind in tube

soon

Insert flow strips for testing

Lateral Flow Strip Assay Lateral Flow Strip Assay

Easy to perform, cheap

and reliable

Test results within few

minutes

Best for raw agricultural

control test

commodities

Event specific

Identification is possible

negative

positive

Quicktest strip for Cry1Ab/Ac

Magnetic particles Magnetic particles

Magnetic particles as solid support surface

Coated with capture antibody & placed in tube

Separation using a magnet excludes unbound reactants Superior kinetics and precision due to uniformity

Summary of detection methods for Summary of detection methods for rDNA products of GM foods rDNA products of GM foods

Protein based

DNA based

Note: NIR detects structural changes (not DNA/protein), takes within a minute and is inexpensive

 GMO testing to comply with international and national

 Sensitive assays have been devised but all have limitations -

regulation is pushing research goals

 A need for available, accurate & consistent reference material to

LOD

•So many GMO’s! What to do? Biochips! •New innovations for spot testing needed

–All steps of food production chain

GMO’s is imperative

DNA Microarray Technology

Specific detection for Bt11 maize

Multiple PCR and hybridization results of soybean

Specific detection for GA21 maize

Specific detection for Bt176 maize

Multiple PCR and hybridization results of cotton

12 SN standard protocols

 The general requirements for the laboratories for gene detection and identification  Protocol of the Qualitative Polymerase Chain Reaction (PCR) for Detecting Genetically Modified Component in Soybeans  Protocol of the Polymerase Chain Reaction for Detecting Genetically Modified Components in Potatoes  Protocol of the Polymerase Chain Reaction for Detecting Genetically Modified Components in cotton  Protocol of the real-time PCR for detecting genetically modified plants and their derived products  Protocol of PCR for detection of genetically modified feed  Protocol of the Polymerase Chain Reaction for Detecting Genetically Modified Components in maize  Methods of sampling and preparation of samples for detection of genetically modified components in plants and their derived products  Protocol of the Detection Methods for Genetically Modified tobacco  Protocol of the polymerase chain reaction for detecting genetically modified in rapeseeds  Protocol of the Qualitative Polymerase Chain Reaction for Detecting Genetically Modified Plant Components in Food  Protocol of the Qualitative Polymerase Chain Reaction for Detecting Genetically Modified Plant Components in Edible Oil

 Detection of genetically modified organisms and derived products - Nucleic acid extraction  Detection of genetically modified organisms and derived products – Gene chip detection  Detection of genetically modified organisms and derived products – Protein based methods  Detection of genetically modified organisms and derived products - Methods for sampling and sample preparation  Detection of genetically modified organisms and derived products - Quantitative nucleic acid based methods  Detection of genetically modified organisms and derived products - Qualitative nucleic acid based methods  Detection of genetically modified organisms and derived products - General requirements for laboratories  Detection of genetically modified organisms and derived products - General requirements and definitions

What Are the Public Concerns?

Economics Are we changing the economics on the farm?

Environmental Are we irreversibly modifying the environment?

Globalization Is technology becoming centralized in too few hands?

Social Will we develop a class of genetic outcasts?

Religious Are we playing God?

Genetically modified organisms (GMOs) in agriculture

Opponents are concerned about:

 The environment  Food safety  Market power  Ethics

Genetically modified organisms (GMOs) in agriculture

Proponents argue that GMOs can offer:

 Increased ag productivity & higher farm profits

 Better use of natural resources

 Less use of chemicals

 More nutritious foods

National Standard National Standard

European Union:

De facto moratorium since June 1999 Labelling required on all GMO-inclusive foods

United States:

Flexible permit procedure Labelling of GMOs is generally not required

Others are also beginning to regulate GMOs, with some (e.g. Sri Lanka) already banning their importation

EU Labeling Regulations EU Labeling Regulations

• Foods with less than 0.9% of GM gene product Labeling not required • Products derived from a GM crop Labeling required • Applies even if the product does not contain the GM gene product Ex: Corn syrup: does not have the Bt protein, but must be labeled • Animal feeds from GM crops Same guidelines apply

EU Traceability Regulations EU Traceability Regulations

GMO containing food must be declared at

departure point

List does not have to be modified if part of

shipment is off-loaded in route

A compromise regulation:

Some wanted documentation from each step of the route

EU Traceability Regulations EU Traceability Regulations

GMO containing food must be declared at

departure point

List does not have to be modified if part of

shipment is off-loaded in route

A compromise regulation:

Some wanted documentation from each step of the route

What kind of problems? What kind of problems?

Negative

GMO test

GMO detection Positive

Authorised?

Illegal

GMO identification

Yes

Assay individual ingredients

No need for labelling

Less than 1%

Labelling required

More than 1%

Labeling System for GMO Foods Labeling System for GMO Foods in Japan in Japan

Law: Japan Agriculture Standards Law(MAFF) Food Sanitation Law(MHLW) Purpose of labeling: providing information as a consumers’ right Enforcement: April, 2001 Extent of labeling: Food and Food ingredients from GM crops which have been assessed for safety by government. A food made chiefly from a GM crop, which is among the top three of all ingredients in weight, and not less than 5% in the food. Five transgenic crops and the 24 kinds of processed foods derived from the crops.

ontent of Labeling and CContent of Labeling and Implementation Implementation

Labeling categories (e.g. soybean)

 Soybean (genetically modified)  Soybean (genetically modified soybean NOT segregated)  Soybean (non genetically modified or segregated from genetically

modified soybean)

Definition of non genetically modified products  Food produced from non genetically modified varieties which

are distributed by “Identity Preserved” handling channels.

 Unintentional mixing is inevitable and acceptable when proper

confirmation has been done.

Threshold: 5% for soy and maize

Biosafety Regulation for GMO Biosafety Regulation for GMO Foods in China Foods in China

Safety Administration and Regulation On Genetic Engineering, 1993

safety categories

general principles

risk evaluation

application and approval

safety control measures

legal responsibility

Biosafety Regulation for GMO Biosafety Regulation for GMO Foods in China Foods in China

Implementation Regulation on Agricultural Biological Engineering, 1996

 Similar to the US’s GMO biosafety regulations

 No labeling part in this regulation

 No restriction imposed on import and export of GMOs products

 No regulation on processed food products use GMOs as inputs

Biosafety Regulation for GMO Biosafety Regulation for GMO Foods in China Foods in China

Regulation on Safety Administration of Agricultural GMOs, in May 2001

To replace an early regulation (Safety Administration and Regulation On Genetic Engineering, 1993)

Labeling System for GMO Labeling System for GMO Foods in China Foods in China

Three detail regulations of GM farm products were issued in July 2001 and taken effect in March 2002

An extra pre-production trail stage prior to commercial

approval

New processing regulation for GM products

Labeling

Labeling requirements for products marketed in both

domestic and international markets

New export and import regulations for GMOs and GMO

products

Local and provincial level GMO monitoring guidelines

Labeling System for GMO Labeling System for GMO Foods in China Foods in China

Labeling requirements for products marketed in both domestic and international markets

Purpose of labeling: providing information as a consumers’ right, but not for safety concerns Enforcement: March, 2002

Labeling System for GMO Labeling System for GMO Foods in China Foods in China

Designated Processed Foods in Labeling System for GMO

Corn  Corn seed, Corn, Corn oil, Corn flour

Rapeseed  seed, Rapeseed, Rapeseed oil,

Cotton  Cotton seed

Tomato  Tomato seed, fresh tomato, tomato

SoybeanSoybean seed, Soybean, Soybean Soybean powder, Soybean oil, soybean meal Corn Rapeseed oilseed meal Cotton Tomato puree

Labeling System for GMO Labeling System for GMO Foods in China Foods in China

Types of Labels

Genetically modified X X (corn,

soybean)

Made with Genetically modified XX or

From a GM source

From a GM source, but no GM

component in final products

The First Group of Safety Certificates for The First Group of Safety Certificates for 2004 Import Raw Material GMO in 2004 Import Raw Material GMO in

Crops

Traits

Company Expired Data

Approval No.

2004 No.002

Monsanto 20 Feb, 2007

Herbicide resistance

Roundup-Ready GTS40-3-2 Soybean

2004 No.003 Maize GA21

Monsanto 20 Feb, 2007

Herbicide resistance

2004 No.004 Maize MON810

Monsanto 20 Feb, 2007

Insect resistance

2004 No.005

Cotton 531

Monsanto 20 Feb, 2009

Insect resistance

2004 No.006

Cotton 1445

Monsanto 20 Feb, 2009

Herbicide resistance

Asia-Pacific Economic Cooperation (APEC) The Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) The Convention on Biological Diversity (CBD) The World Trade Organisation (WTO) The World Intellectual Property Organisation (WIPO) The Biological Weapons Convention (BWC) The World Health Organisation (WHO) The Food and Agriculture Organisation (FAO) Consultative Group on International Agricultural Research (CGIAR) International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) Office of International Epizootics (OIE) International Plant Protection Convention (IPPC) Codex Alimentarius Commission (CAC) United Nations Conference on Trade and Development (UNCTAD) United Nations Environment Program (UNEP) United Nations Economic Commission for Europe (UNECE) United Nations Industrial Development Organisation (UNIDO) World Bank

GMO detection center of AQSIQ in CAIQ

Food Authentication

To allow ethnic groups a

choise where the consumption of pork meat beef meat is forbidden by religion

To identify the presence or absence of high price species

DNA sequence is highly conserved within a species Every individual contains unique DNA sequence Every cell contains exact copy of DNA sequence Differences in DNA sequence can be detected

DNA-Based methods in species identification

Mitochondrial DNA sequences

(cytochrome b, tRNA, rRNAs, ATPases) 􀂄

Satellite DNA

Nuclear genes (GH-gene)

Alignment of 9 anmial cytb DNAs

Validation

Specification Limitation Primer design according to the alignment

Primer design

(sequence：mitocondrial cytochromeb) Sequence length between primer is 208bp

PCR amplification

Total volume (50 L)

10×PCR buffer 5 L dNTPs (5 mmol/L) 1 L primers(各5mol/L) 2 L Taq DNA (5 U/L) 0.5 L Template DNA (0.1～1.0g) 10L Add ddH2O to 50L

PCR conditions 94℃ 5 min 94℃ 30 s，63℃30 s，72℃ 30 s，30cycles 72℃ 5 min

Post-PCR

Post-PCR analysis carried out by Agarose Gel Electrophoresis

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

300bp 200bp

208bp

Fig1. Amplification of 13 animals by primer cam208 1.Marker, 2. single-humped camel, 3.Two-humped Camel, 4. Domestic Two-humped Camel, 5. sheep, 6.rabbit, 7.pig, 8.chicken, 9.bovine, 10.fish, 11.dog, 12.horse, 13.donkey, 14.deer, 15.blank.

Verification of PCR Results

Enzyme digestion

300bp

200bp

53 bp

155 bp

100bp

Fig2. Taq I Enzyme digestion of amplicon 1.Maker 2.amplicon 3.digestion

Verification of PCR Results

Sequence digestion

Fig3. Alignment of amplicon sequence with Genbank sequence

(homology is 91.4%)

Limitation

0.1% for camel material

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

300bp 200bp

208 bp

Fig4. Detection limitation of camel materials in fish meal 1.marker, 2. 5% camel meat meal, 3. 2% camel meat meal, 4.1% camel meat, 5.0.5 camel meat, 6. 0.2% camel meat, 7. 0.1%camel meat, 8.0.05% camel meat, 9.0.01% camel meat, 10.puer fish meal

More methods for bovine sheep goat pig deer dog donkey horse rabbit chicken duck

Manmmalian materials

Universal methods for Ruminant materials

animal Two

animal Three

animal One

animal Four

Micro-array Diagnostics Results

1% bovine materials

Specification detection of bovine, sheep and pig materials

Microarray spotter

Mircoarray Scanner

DNA analysis highly effective tool for recovery (lost tags) and verification of individual animal identity Individual animal identity can be determined and verified using DNA profiles, with a success rate of 100% and within a forty-eight hour time period DNA profiling can enhance the effectiveness of animal traceability systems An animal’s DNA profile is a unique, permanent identifier that is tamper-proof, and remains effective despite the loss of other forms of identification, and expands animal tracking systems from post- harvest sector back to the animal of origin

 8.1. Quy trình chứng nhận chất lượng sản phẩm

nông nghiệp

 8.2. Tính pháp lý và quy chuẩn chất lượng sản phẩm

nông nghiệp