Báo cáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài cấp nhà nước: Nghiên cứu sản xuất Bộ sinh phẩm để chẩn đoán nhanh bệnh sốt Dengue/sốt xuất huyết Dengue và bệnh Viêm đường hô hấp cấp (SARS) ở Việt Nam.

Bé Khoa häc vµ C«ng nghÖ

Ch−¬ng tr×nh KC- 04

B¸o c¸o

tæng kÕt khoa häc vµ kü thuËt §Ò tµi cÊp nhµ n−íc §Ò tµi: KC 04 - 32

Nghiªn cøu s¶n xuÊt Bé sinh phÈm ®Ó chÈn ®o¸n nhanh bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS) ë ViÖt Nam. GS.TS. Tr−¬ng uyªn Ninh

ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng

6701 24/12/2007

Hµ Néi, 9- 2007

B¶n quyÒn thuéc VVSDTTW- Bé Y TÕ

Nh÷ng ch÷ viÕt t¾t trong b¸o c¸o

(cid:91)☯(cid:92)

ARN Axit ribonucleic

ADN Axit deoxyribonucleic

CID Center of Infection Diseases

Trung t©m c¸c bÖnh nhiÔm trïng

CDC Center of Diseases Control

Trung t©m kiÓm so¸t bÖnh tËt

ELISA Enzym linked Immunosorbent Assay

Thö nghiÖm miÔn dÞch men

GAC- ELISA IgG Capture ELISA

Kü thuËt miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn IgG

HI Hemagglutination Inhibition test

HT HuyÕt thanh

FBS Fetal Bovin Serum

IFAT (Immunofluorescent indirect Antibody Technique)

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp

IFDT (Immunofluorescent direct Antibody Technique)

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang trùc tiÕp

IFA (Immunofluorescent Indirect Antibody Technique)

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp

MAC - IgM Capture ELISA

ELISA Kü thuËt miÔn dÞch enzym ph¸t hiÖn IgM

ML Maximum Likelihood

Ph−¬ng ph¸p ch¾c ch¾n tèi ®a

MP Maximum Pasimony

Ph−¬ng ph¸p chi li tèi ®a

Neighbor Joining NJ

Ph−¬ng ph¸p kÕ cËn liÒn kÒ

Ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HI) NNKHC

§äan måi ADN Primer

Plaque Assay and Plaque Reduction Neutralization PRNT

tests.

Kü thuËt trung hoµ vµ Kü thuËt Trung hoµ gi¶m ®¸m

ho¹i tö

Polymerase Chain Reaction PCR

Ph¶n øng chuçi Polymeraza

RT- PCR Reverse transcriptase- Polymerase chain reaction

Ph¶n øng dao chÐp ng−îc khuÕch ®¹i chuçi

SARS Severe Acute Respiratory Syndrome

Héi chøng viªm ®−êng h« hÊp cÊp tÝnh

SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona

virus

Virus Corona g©y bÖnh SARS

SD Sèt Dengue

SXHD Sèt xuÊt huyÕt Dengue

TCYTTG Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi

VVSDTTW ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung ¦¬ng

VCNSH ViÖn C«ng nghÖ Sinh häc

WHO World Health Organization

(Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi)

WB Western Blot

Môc lôc

Sè TT

Néi dung

Trang

1

Ch−¬ng I.

Tæng quan tµi liÖu

A. Nghiªn cøu virus Dengue g©y nªn bÖnh Sèt

Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ë ViÖt Nam

BÖnh sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue

§Æt vÊn ®Ò

1.1

5

BiÓu hiÖn l©m sµng

1.1.1

T¸c nh©n truyÒn bÖnh

1.1.2

6

T×nh h×nh dÞch bÖnh trªn thÕ giíi

1.1.3

8

T×nh h×nh dÞch bÖnh ë ViÖt Nam

1.1.4

11

Virus Dengue

1.2

11

§Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ cÊu tróc

1.2.1

13

Genome cña virus

1.2.2

13

Chu tr×nh nh©n lªn vµ c¬ chÕ g©y bÖnh cña virus Dengue

1.2.3

15

§Æc ®iÓm kh¸ng nguyªn

1.2.4

17

Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ

1.2.4.1

18

Ph©n lËp virus

1.2.4.2

20

B. nghiªn cøu virus corona g©y bÖnh viªm ®−êng

h« hÊp cÊp SARS ë ViÖt Nam

T×nh h×nh nghiªn cøu trªn thÕ giíi

1.1

26

C¸c nghiªn cøu t¹i ViÖt nam

1.2

42

Ch−¬ng II

§èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

A. Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n nhanh bÖnh Sèt Dengue/

Sèt xuÊt huyÕt Dengue

§èi t−îng vµ vËt liÖu

2.1

44

§èi t−îng

2.1.1

VËt liÖu

2.1.2

Ho¸ chÊt

2.1.3

49

Trang thiÕt bÞ

2.2

54

Ph−¬ng ph¸p

2.3

55

C¸c ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn vµ Kh¸ng huyÕt thanh

S¶n xuÊt kh¸ng nguyªn

2.3.1

55

Ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng huyÕt thanh

2.3.2

58

Ph−¬ng ph¸p ELISA ph¸t hiÖn IgM

2.3.3

59

Kü thuËt trung hoµ (Neutralization Test - NT)

2.3.4

59

Ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch hÊp phô liªn kÕt men

60

2.3.5

ph¸t hiÖn KT IgG (GAC- ELISA)

C¸c ph−¬ng ph¸p ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh type virus

2.4

60

CÊy truyÒn trªn n·o chuét æ (1-3 ngµy tuæi)

2.4.1

60

Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus trªn tÕ bµo muçi

2.4.2

61

Aedes. albopictus dßng C6/36.

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang trùc tiÕp

64

2.4.3

(Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA).

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp

65

2.4.4

(Indirect ImmunoFluorescent AntibodyAssay – IFA).

Kü thuËt Trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö

66

2.4.5

( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT )

Ph−¬ng ph¸p tæng hîp d©y chuyÒn chuçi nhê polymerase

68

2.4.6

(RT-PCR - Polymerase Chain Reaction)

C. Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh

bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS

§èi t−îng nghiªn cøu

2.1

73

VËt liÖu

2.2

74

MÉu bÖnh phÈm

2.2.1

74

TÕ bµo

2.2.2

74

Sinh phÈm kh¸c

2.2.3

74

M«i tr−êng vµ ho¸ chÊt

75

2.2.4

Trang thiÕt bÞ vµ dông cô

76

2.2.5

Ph−¬ng ph¸p

78

2.3

Ph©n lËp virus SARS-CoV

78

2.3.1

T¹o plasmid t¸i tæ hîp.

78

2.3.2

BiÓu lé vµ tinh s¹ch kh¸ng nguyªn .

79

2.3.3

Ph−¬ng ph¸p hÊp phô miÔn dÞch liªn kÕt enzyme tãm b¾t

80

2.3.4

kh¸ng thÓ IgM (MAC- ELISA)

Ph−¬ng ph¸p Western Blot.

2.3.5

81

Ch−¬ng III

KÕt qu¶ vµ Bµn luËn

A. KÕt qu¶ s¶n xuÊt bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh

bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue.

Nu«i cÊy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus

82

3.1

Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) trªn tÕ bµo muçi

Aedes albopictus dßng C6/36.

Nh©n virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus

82

3.1.1

Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) vµo tÕ bµo muçi

Aedes albopictus dßng C6/36 ®Ó t¸ch chiÕt ARN.

Quan s¸t sù nh©n lªn cña virus Dengue trong tÕ bµo muçi Aedes

100

3.1.2

albopictus dßng C6/ 36 d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö

Nghiªn cøu qui tr×nh c«ng nghÖ biÓu hiÖn, t¸ch chiÕt, tinh chÕ kh¸ng

106

3.2

nguyªn Dengue t¸i tæ hîp c¸c type.

Kh¸ng nguyªn Dengue th«

106

3.2.1

Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp.

108

3.2.2

109

3.2.3

Quy tr×nh t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp cña virus dengue tõ chñng E. coli cho c¶ bèn typ virus dengue T¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®äan gen PreM vµ E cña 4 type virus

117

3.3

Dengue.

3.3.1

117

T¸ch RNA tæng sè cña tÕ bµo muçi C6/36 KhuÕch ®¹i ®o¹n gene PreM vµ E b»ng ph−¬ng ph¸p RT-PCR

118

3.3.2

BiÓu hiÖn kh¸ng nguyªn mµng vµ vá cña virus Dengue type 1, 2, 3, 4

148

3.3.3

trong hÖ nÊm men Pichia pastoris

163

3.3.4

BiÓu hiÖn gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn preM-E (gen preM-env) trong Pichia pastoris

167

3.3.5

KiÓm tra ph¶n øng cña kh¸ng nguyªn DxME t¸i tæ hîp víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù nhiªn b»ng Western Blot ThiÕt kÕ cÆp måi vµ x©y dùng kÕ häach t¸ch dßng gen m· hãa kh¸ng

168

3.4

nguyªn vá cña virus Dengue c¸c type I, II, III, IV.

ChÕ t¹o céng hîp (Gold monoclonal antibodies) g¾n kh¸ng nguyªn vµo

173

3.5

gi¸ thÓ (mµng thÊm Nitrocellulo membrane)

Nghiªn cøu dung dÞch ®Öm buffer tèi −u

179

3.6

dïng trong ph¶n øng

Hoµn thiÖn Bé sinh phÈm

183

3.7

Thö nghiÖm Bé sinh phÈm trong phßng thÝ nghiÖm Th−êng qui sö dông Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh sèt Dengue/

198 200

3.8 3.8.1

sèt xuÊt huyÕt Dengue

So s¸nh kÕt qu¶ thö nghiÖm trong phßng thÝ nghiÖm

204

3.8.2

210

3.9

øng dông Bé sinh phÈm trong thùc ®Þa

KÕt qu¶ kiªm tra t¹i phßng thÝ nghiÖm Sèt xuÊt huyªt Arbovirus, ViÖn

210

3.9.1

VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng

Gi¸ thµnh vµ chÊt l−îng Bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh bÖnh sèt

211

3.9.2

Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue

Mét sè h×nh ¶nh khi tiÕn hµnh thÝ nghiÖm t¹i c¸c ®iÓm nghiªn cøu

3.9.3

213

B. KÕt qu¶ s¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n nhanh

bÖnh viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS)

Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp protein N - SARS-CoV

217

3.1

X¸c ®Þnh c¸c th«ng sè c¬ b¶n cho bé sinh phÈm MAC-ELISA chÈn

218

3.2

®o¸n nhiÔm virus SARS-CoV

X¸c ®Þnh thêi gian sö dông tèi −u cña bé sinh phÈm.

219

3.2.1

X¸c ®Þnh ®é ®Æc hiÖu cña Bé sinh phÈm

220

3.2.2

X¸c ®Þnh ®é nh¹y cña sinh phÈm.

220

3.2.3

Thµnh phÇn bé sinh phÈm.

221

3.3

Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM trong huyÕt thanh bÖnh nh©n SARS vµ nh©n

221

3.4

viªn y tÕ cã tiÕp xóc trùc tiÕp víi bÖnh nh©n SARS.

Bµn luËn

Mét ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n sím trong phßng thÝ nghiÖm cã hiÖu qu¶

226

1

Trong giai ®o¹n ®Çu cña dÞch SARS, mét sè ph−¬ng ph¸p ELISA ®−îc

234

2

giíi thiÖu

Bé sinh phÈm MAC- ELISA ph¸t hiÖn sím nhiÔm virus SARS

236

3

Toµn bé bÖnh nh©n ®−îc x¸c ®Þnh nhiÔm virus SARS-CoV trªn l©m

239

4

sµng ®· ®−îc kh¼ng ®Þnh l¹i khi ph¸t hiÖn ®−îc kh¸ng thÓ IgM kh¸ng

®Æc hiÖu virus SARS –CoV th«ng qua ph−¬ng ph¸p MAC-ELISA.

Sù xuÊt hiÖn cña KT kh¸ng ®Æc hiÖu virus SARS-CoV trªn mét sè

239

5

ng−êi kh«ng cã biÓu hiÖn l©m sµng

241

KÕt luËn

244

Tµi liÖu tham kh¶o

§Æt vÊn ®Ò

Trong vßng 15 n¨m gÇn ®©y, nhiÒu dÞch bÖnh nguy hiÓm ë qui m« khu vùc còng

nh− toµn cÇu ®· x¶y ra vµ lÇn ®Çu tiªn g©y ¶nh h−ëng lín ®Õn nÒn kinh tÕ thÕ

giíi. TÊt c¶ c¸c bÖnh dÞch nguy hiÓm nµy (nh− dÞch h¹nh Ên §é vµo n¨m 1994,

dÞch cóm gia cÇm t¹i Hång K«ng 1997, dÞch viªm n·o Nipah t¹i Malaysia, dÞch

SARS hay héi chøng h« hÊp cÊp tÝnh ë Trung Quèc tõ n¨m 2002 ®Õn 2003, vµ

cóm gia cÇm ë vïng §«ng Nam ¸ tõ n¨m 2003 ®Õn2007)… ®Òu cã mÇm bÖnh

tõ ®éng vËt vµ ph¸t sinh t¹i ¸ Ch©u vµ dÇn dµ l©y lan lµm ¶nh h−ëng ®Õn nÒn

kinh tÕ thÕ giíi. Víi tiÕn tr×nh toµn cÇu ho¸ hiÖn nay, chóng t«i thiÕt nghÜ trong

t−¬ng lai sÏ x¶y ra nhiÒu dÞch bÖnh ë tÇm møc t−¬ng tù. H¬n n÷a, do c¸c yÕu tè

x· héi, v¨n ho¸ vµ nh©n khÈu ë Ch©u ¸… cã lÏ vÉn lµ n¬i tiÕp tôc xuÊt hiÖn c¸c

dÞch bÖnh b¾t nguån tõ ®éng vËt… ViÖc ph¸t hiÖn æ dÞch trong ch−¬ng tr×nh

“chiÕn l−îc dù phßng sím” t¹i ¸ ch©u sÏ gióp chóng ta chñ ®éng ph¸t hiÖn vµ

ng¨n chÆn kÞp thêi c¸c bÖnh dÞch ®· biÕt ®Õn còng nh− c¸c bÖnh dÞch míi ph¸t

sinh. Trong c¸c bÖnh dÞch míi gÇn ®©y, næi lªn cã dÞch SD/ SXHD vµ Viªm

®−êng h« hÊp cÊp SARS....

Sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue (SD/ SXHD) lµ mét bÖnh nhiÔm trïng cÊp

tÝnh do virus Dengue g©y ra. BÖnh kh«ng cã vacxin vµ thuèc ®iÒu trÞ. BiÓu hiÖn

l©m sµng cña SD/ SXHD rÊt ®a d¹ng tõ sèt cao ®ét ngét kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm

theo triÖu chøng ®au ®Çu, ®au c¬, ®au x−¬ng, ®au khíp, ®au bông cho tíi buån

n«n, ph¸t ban... Sau ®ã cã thÓ cã biÓu hiÖn xuÊt huyÕt d−íi da, xuÊt huyÕt néi

t¹ng (ch¶y m¸u cam, ch¶y m¸u lîi, n«n ra m¸u, ®i ngoµi ra m¸u...). Ngoµi ra

cßn cã thÓ cã thªm c¸c dÊu hiÖu kh¸c nh− gan to, sèc, huyÕt ¸p h¹ vµ cã thÓ dÉn

tíi tö vong (Barnes W. J. S. vµ Rosen L., 1974). BÖnh SD/ SXHD lµ bÖnh do

muçi (Aedes aegypti, Aedes albopictus) [33] truyÒn v× vËy bÖnh th−êng dÔ dµng

ph¸t triÓn thµnh dÞch. Virus Dengue ®−îc Sabin ph©n lËp ®Çu tiªn ë Calcuta, Ên

®é, New-Guinea vµ Hawaii (Sabin A. vµ cs, 1952)... Sau nµy ®−îc x¸c ®Þnh lµ

virus Dengue type 1-Hawaii vµ virus Dengue type 2-New-Guinea. C¸c type virus

Dengue 3 vµ virus Dengue 4 ®−îc Hammon W.M. vµ cs ph©n lËp ë Philippines

vµo n¨m 1956 (Hammon W.M. vµ cs 1960). TiÕp ®ã nhiÒu chñng virus Dengue

®· ®−îc ph©n lËp tõ nhiÒu vïng kh¸c nhau trªn thÕ giíi nh−ng ®Òu ®−îc x¸c ®Þnh

lµ thuéc 4 type huyÕt thanh nªu trªn (Anonymous, 1986).

Tíi n¨m 1997 bÖnh SD/ SXHD ®· lan réng trªn ph¹m vi toµn thÕ giíi. Theo

Gubler, D.J. (1997) th× hiÖn nay cã tíi h¬n 2,5 tû ng−êi ®ang sèng trong khu vùc

cã l−u hµnh SD/ SXHD vµ hµng n¨m cã kho¶ng 100 triÖu ng−êi m¾c bÖnh nµy.

§Ó cã thÓ phßng chèng bÖnh mét c¸ch hiÖu qu¶ th× viÖc chñ ®éng gi¸m s¸t

huyÕt thanh häc, dÞch tÔ häc, c«n trïng häc virus Dengue g©y nªn bÖnh sèt

Dengue/sèt xuÊt huyÕt Dengue lµ hÕt søc cÇn thiÕt.

C¸c ph−¬ng ph¸p chñ yÕu chÈn ®o¸n huyÕt thanh häc cña virus Dengue bao

gåm: Ph¶n øng Ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HI), ph¶n øng kÕt hîp bæ thÓ (CF),

ph¶n øng trung hßa gi¶m ®¸m ho¹i tö (PRNT), ph¶n øng miÔn dÞch hÊp phô g¾n

enzym ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM (MAC-ELISA) vµ ph¶n øng miÔn dÞch hÊp phô

g¾n enzym ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgG (GAC-ELISA), kü thuËt RT- PCR

Ngoµi bÖnh SD/ SXHD, Héi chøng viªm ®−êng h« hÊp cÊp tÝnh nÆng (SARS) lµ

mét bÖnh dÞch míi xuÊt hiÖn trªn ph¹m vi toµn cÇu. SARS ®· xuÊt hiÖn t¹i 23

Quèc gia: Trung Quèc, Hång K«ng, Singapore, Canada, Hoa Kú, ViÖt Nam,

Malaysia, Th¸i Land… TÝnh ®Õn th¸ng 04 n¨m 2004 trªn toµn thÕ giíi ®· cã

tæng sè m¾c/ tæng sè chÕt lµ: 3169/ 144 ng−êi (Theo Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi-

WHO) [39].

T¸c nh©n g©y bÖnh SARS lµ mét biÕn thÓ hä Corona (Coronaviridae); Mét

nhãm virus cã thÓ g©y bÖnh cho c¶ ng−êi vµ ®éng vËt [41]. Trªn ng−êi, Corona

th−êng g©y ra viªm ®−êng h« hÊp trªn, chñ yÕu ng−êi tr−ëng thµnh. Ngoµi ra

còng cÇn chó ý tíi mét sè lo¹i vi khuÈn, virus c¬ héi th−êng xuyªn cã mÆt ë

®−êng h« hÊp cña ng−êi; Cã thÓ gãp phÇn g©y ra c¸c béi nhiÔm ®−êng h« hÊp

d−íi vµ viªm phæi kh«ng ®iÓn h×nh trªn bÖnh nh©n SARS.

Virus nµy cã søc ®Ò kh¸ng yÕu, tån t¹i víi ®éng lùc lín trong kh«ng khÝ m¸t

l¹nh kho¶ng 2- 5 giê. Virus SARS nh¹y c¶m víi nhiÖt ®é cao, tia cùc tÝm, c¸c

ho¸ chÊt khö trïng…

Nguån bÖnh vµ æ chøa virus SARS: Ch−a biÕt râ rµng. Ng−êi cã thÓ lµ nguån

bÖnh chÝnh trong chuçi m¾t xÝch l©y truyÒn Ng−êi- Ng−êi. Ng−êi bÖnh SARS,

nhÊt lµ bÖnh nh©n nÆng ®ang trong giai ®o¹n khëi ph¸t vµ toµn ph¸t lµ nguån

truyÒn nhiÔm nguy hiÓm. Theo qui luËt chung cña c¸c bÖnh do virus th× SARS

cã thÓ th¶i mÇm bÖnh tõ 5 ®Õn 15 ngµy sau khëi ph¸t. Thêi gian ñ bÖnh trung

b×nh 7 ngµy; Mét sè tr−êng hîp cã thÓ kÐo dµi tíi 14- 15 ngµy [32].

TriÖu chøng: H¾t h¬i, ch¶y n−íc mòi, ng¹t mòi, ho, ®au häng hoÆc khã thë…Cã

thÓ dÉn ®Õn biÕn chøng nh−: NhiÔm khuÈn huyÕt, viªm mµng n·o do béi nhiÔm

vi khuÈn…

§Ó chÈn ®o¸n bÖnh nµy, ng−êi ta th−êng:

Ph¸t hiÖn trùc tiÕp virus hoÆc kh¸ng nguyªn virus. Cã thÓ cã kÕt qu¶ trong vµi

giê nÕu bÖnh phÈm lÊy tèt; Råi tiÕn hµnh c¸c kü thuËt:

- MiÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp lµ ph−¬ng ph¸p nh¹y c¶m ®Ó ph¸t hiÖn virus

trong mÉu bÖnh phÈm l©m sµng vµ nu«i cÊy tÕ bµo. Tû lÖ d−¬ng tÝnh lµ 30%.

- C¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c: Ph¶n øng chuçi polymerase (PCR) dïng trong nghiªn

cøu. Kü thuËt nµy kh¸ chÝnh x¸c nh−ng ®ßi hái c¸c trang bÞ kü thuËt ®¾t tiÒn

còng nh− tay nghÒ cña c¸n bé kü thuËt

ViÖc ph¸t hiÖn nhanh virus Dengue g©y bÖnh SD/ SXHD hay bÖnh Viªm ®−êng

h« hÊp cÊp SARS sÏ gióp cho c¸c b¸c sü l©m sµng cã h−íng ®iÒu trÞ thÝch hîp vµ

c¸c nhµ DÞch tÔ häc ®−a ra c¸c gi¶i ph¸p h÷u hiÖu, lµm gi¶m tû lÖ m¾c vµ tû lÖ

chÕt v× bÖnh nµy.

Cã nhiÒu ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n hai bÖnh trªn trong phßng thÝ nghiÖm, tuy

nhiªn ®Òu tu©n thñ nguyªn t¾c:

- Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ (IgG, IgM) kh¸ng virus Dengue hay virus Corona trong

huyÕt thanh bÖnh nh©n.

- X¸c ®Þnh virus trong huyÕt thanh hoÆc trong c¸c tæ chøc cã kh¶ n¨ng nhiÔm

virus.

Dùa vµo c¸c ®iÒu kiÖn trªn mµ chóng t«i ®−a ra môc tiªu cña Ch−¬ng tr×nh

nghiªn cøu nµy lµ:

1. X©y dùng ®−îc qui tr×nh kü thuËt chÈn ®o¸n nhanh vµ chÝnh x¸c sèt

Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp (SARS).

2. S¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÊt l−îng cao, dÔ sö dông cho viÖc chÈn ®o¸n

bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue vµ bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp

(SARS).

Ch−¬ng I.

Tæng quan tµi liÖu

A. Nghiªn cøu virus dengue g©y bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt

huyÕt Dengue ë ViÖt Nam

1.1 BÖnh sèt Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue

1.1.1. BiÓu hiÖn l©m sµng

Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue ®−îc chia thµnh nhiÒu cÊp ®é kh¸c nhau tuú

theo møc ®é nÆng cña bÖnh mµ bÖnh nh©n cã nh÷ng biÓu hiÖn nh−: sèt cao tõ

38 0C ®Õn 40 0C, thêi gian kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm theo c¸c triÖu chøng ®au ®Çu,

®au c¬, buån n«n, ph¸t ban, cã thÓ kÌm theo rÐt tuy kh«ng thµnh c¬n, cho¸ng

v¸ng, chãng mÆt, xuÊt huyÕt d−íi da, xuÊt huyÕt niªm m¹c, xuÊt huyÕt phñ t¹ng.

ë thÓ nÆng bÖnh nh©n cã thÓ bÞ sèc hay cßn gäi lµ héi chøng sèc Dengue

(HCSD). HCSD x¶y ra víi trÎ em nhiÒu h¬n ë ng−êi lín, phæ biÕn nhÊt vµo ngµy

sèt thø 4 ®Õn thø 6, ë bÖnh nh©n nÆng cã dÊu hiÖu suy tuÇn hoµn, ®au bông, bån

chån, vËt v·, nÕu kh«ng ®−îc can thiÖp sím bÖnh nh©n cã thÓ bÞ tö vong sau tõ

12 ®Õn 24 giê [8].

C¸c triÖu chøng cña bÖnh th−êng rÊt ®a d¹ng nh−ng l¹i kh«ng cã tÝnh chÊt ®Æc

tr−ng. Do ®ã, kh«ng thÓ ph©n biÖt ®−îc sù kh¸c biÖt vÒ l©m sµng gi÷a c¸c bÖnh

nh©n nhiÔm c¸c type virus Dengue kh¸c nhau. MÆt kh¸c, c¸c triÖu chøng nµy

còng t−¬ng tù nh− c¸c triÖu chøng gÆp ph¶i khi bÞ nhiÔm c¸c lo¹i virus g©y bÖnh

kh¸c nh− cóm, sëi, viªm n·o….

C¨n cø theo biÓu hiÖn l©m sµng cña bÖnh SD/ SXHD cã thÓ chia thµnh 3 cÊp ®é

sau ®©y :

+ Sèt Dengue (SD): cßn gäi lµ sèt Dengue cæ ®iÓn, th−êng cã c¸c triÖu

chøng nh− c¸c bÖnh nhiÔm virus kh¸c lµ: sèt tõ 38 0 C- 40 0 C, ®au mái c¬ vµ c¸c

khíp x−¬ng, ®au ®Çu vïng tr¸n vµ th¸i d−¬ng, rÊt Ýt gÆp m¶ng xuÊt huyÕt d−íi

da, tØ lÖ tö vong thÊp (kho¶ng 0.018%) [21].

+ Sèt xuÊt huyÕt Dengue: Sèt cÊp tÝnh cao, kÐo dµi 2-7 ngµy kÌm theo nhøc

®Çu, ®au khíp, ®au c¬, xuÊt hiÖn m¶ng hoÆc chÊm xuÊt huyÕt d−íi da, niªm

m¹c, xuÊt huyÕt néi t¹ng, h¹ sèt do xuÊt huyÕt nhiÒu, xuÊt hiÖn c¸c biÓu hiÖn

nh− ch¶y m¸u mòi, ch¶y m¸u ch©n r¨ng ... nhiÒu vµ kÐo dµi [21]

+ Héi chøng sèc Dengue: cã c¸c biÓu hiÖn t−îng tù nh− SXHD nh−ng cßn

kÌm theo hiÖn t−îng m¹ch ®Ëp nhanh, huyÕt ¸p tôt, da l¹nh vµ −ít. Khi sèc s©u,

kÐo dµi cã thÓ dÉn tíi suy thËn cÊp, rèi lo¹n tiªu ho¸, ngõng tim, xuÊt huyÕt néi

t¹ng vµ tö vong sau 12-24 giê [30].

ë ng−êi m¾c sèt Dengue th−êng thÊy c¸c ®Æc ®iÓm nh−: H¹ch lympho s−ng ®au

toµn th©n, l−îng tiÓu cÇu Ýt gi¶m, gi·n m¹ch ngo¹i vi, b¹ch cÇu gi¶m, hematocrit

t¨ng nhÑ. §èi víi tr−êng hîp m¾c SXHD th× cã thªm c¸c ®Æc ®iÓm kh¸c n÷a

nh−: gan to, tiÓu cÇu gi¶m, hematocrit t¨ng h¬n 20% so víi b×nh th−êng, cã biÓu

hiÖn vµng da, xuÊt huyÕt phñ t¹ng hÖ tiªu ho¸ vµ ngoµi tiªu ho¸ nh− n·o, mµng

n·o ... nÆng cã thÓ chuyÓn sang c¸c giai ®o¹n kh¸c nghiªm träng h¬n nh− SXHD

thÓ n·o (héi chøng n·o cÊp), SXHD thÓ suy gan cÊp ....

1.1.2 T¸c nh©n truyÒn bÖnh

BÖnh SD vµ SXHD l©y qua ®−êng m¸u. C¸c nghiªn cøu vÒ trung gian truyÒn

bÖnh ®· x¸c ®Þnh muçi v»n Aedes aegypti (A.aegypti) lµ vector chñ yÕu, ngoµi ra

c¸c lo¹i muçi kh¸c nh− Aedes albopictus, Aedes polynesiens còng cã thÓ truyÒn

bÖnh SXHD. Muçi A.aegypti lµ lo¹i muçi sèng ë trong nhµ hoÆc xung quanh

nhµ. ChØ cã muçi c¸i ®èt ng−êi vµo ban ngµy, chñ yÕu vµo s¸ng sím vµ chiÒu tèi

[35]. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn bÖnh sau thêi kú ñ bÖnh 3 ®Õn 10 ngµy hoÆc cã thÓ

truyÒn bÖnh ngay nÕu ®ang hót m¸u bÖnh nh©n dë dang råi ®èt sang ng−êi kh¸c.

N¬i ®Ëu cña muçi lµ nh÷ng chç tèi t¨m trong nhµ nh−: hèc tñ, gÇm gi−êng, gÇm

bµn, chç treo quÇn ¸o, ch¨n mµn (80.5%) vµ nh÷ng vËt dông kh¸c. Mét ®iÓm

®¸ng l−u ý lµ muçi A.aegypti cã kh¶ n¨ng truyÒn virus Dengue qua l¨ng qu¨ng,

nghÜa lµ virus Dengue cã chu kú xuyªn qua trøng. §©y còng lµ mét yÕu tè quan

träng trong c«ng t¸c phßng chèng bÖnh, diÖt muçi tr−ëng thµnh ph¶i ®i ®«i víi

diÖt l¨ng qu¨ng trong c¸c vËt chøa n−íc. §iÒu nµy chÝnh lµ c¬ së cña ph−¬ng

ph¸p qu¶n lý muçi dùa vµ céng ®ång. Vßng ®êi cña muçi A.aegypti ®−îc thÓ

hiÖn ë H×nh 1.1.

H×nh 1.1. Vßng ®êi cña Muçi

Sau khi bÞ nhiÔm virus, muçi sÏ bÞ nhiÔm suèt ®êi. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn virus

Dengue cho trøng vµ trøng l¹i cã kh¶ n¨ng tån t¹i rÊt l©u trong ®iÒu kiÖn kh«

h¹n (cã thÓ trªn 1 n¨m) [24], ®©y lµ mét yÕu tè khã kh¨n cho viÖc diÖt muçi.

Muçi sinh s¶n vµo mïa m−a, ë nh÷ng n¬i chøa n−íc nh©n t¹o (vòng n−íc ®äng,

chum, v¹i ...v.v).

Thêi gian virus nh©n lªn trong h¹ch n−íc bät muçi lµ tõ 3 – 10 ngµy tuú theo

nhiÖt ®é m«i tr−êng. Muçi c¸i cã thÓ truyÒn däc virus Dengue sang thÕ hÖ sau

tuy nhiªn ®−êng truyÒn däc nµy kh«ng cã vai trß lín trong c¬ chÕ l©y truyÒn

Dengue sang ng−êi, ng−êi vÉn lµ vËt chñ chÝnh nh©n virus Dengue.

1.1.3 T×nh h×nh dÞch bÖnh trªn thÕ giíi

Sèt Dengue/ Sèt xuÊt huyÕt Dengue lµ bÖnh nhiÔm virus cÊp tÝnh ®ang lan trµn

réng trªn thÕ giíi... BÖnh th«ng th−êng lµ nhÑ (sèt Dengue - SD) nh−ng cã thÓ

nÆng nÕu cã xuÊt huyÕt (Sèt xuÊt huyÕt Dengue- SXHD). BÖnh hay bïng næ

thµnh dÞch lín ë nh÷ng vïng ch−a tõng bÞ nhiÔm virus Dengue vµ cã ®iÒu kiÖn

thuËn lîi cho sù ph¸t triÓn lan trµn cña vect¬ truyÒn bÖnh.

DÞch Sèt Dengue lÇn ®Çu tiªn ®−îc Y v¨n ghi nhËn lµ vµo mïa hÌ n¨m 1780 t¹i

Philadenphia, Hoa Kú. Sau ®ã bÖnh ®−îc thÊy ë nhiÒu n−íc nhiÖt ®íi vµ cËn

nhiÖt ®íi... T¹i ch©u A, n¨m 1953, SXHD xuÊt hiÖn lÇn ®Çu tiªn ë Manila

(philipin). Råi Th¸i Lan, Indonexia, Singapore, India, Banglades... ë vïng T©y

Th¸i B×nh D−¬ng, cã tõ 28 ®Õn 35 n−íc ®· tr¶i qua c¸c vô dÞch SD/ SXHD. Sèt

Dengue vµ sèt xuÊt huyÕt Dengue ®· ®−îc c¸c n−íc trªn thÕ giíi c«ng nhËn lµ

mét vÊn ®Ò Y tÕ c«ng céng quan träng [34].

T¹i ViÖt Nam, SXHD ®−îc ph¸t hiÖn lÇn ®Çu tiªn ë miÒn B¾c vµo n¨m 1958;

Cßn miÒn Nam lµ n¨m 1960. Sau ®ã dÞch lan réng tíi hÇu hÕt c¸c tØnh trong c¶

n−íc...Nh÷ng n¨m cã dÞch lín lµ: 1969,1977,1978,1979,1980,1983,1987,1991,

1994, 1998. HiÖn nay bÖnh SD/ SXHD kh«ng chØ l−u hµnh ë thµnh thÞ, khu vùc

®«ng d©n c− mµ cßn lan trµn c¶ c¸c vïng n«ng th«n ®ång b»ng, trung du vµ

miÒn nói [26].

Theo thèng kª cu¶ TCYTTG th× ë ViÖt Nam tõ n¨m 1963 ®Õn n¨m 1988 cã sè

bÖnh nh©n m¾c trªn sè bÖnh nh©n chÕt vÒ SD/ SXHD lµ 1.111.734/ 10.415; ®©y

lµ sè l−îng bÖnh nh©n m¾c vµ chÕt lín nhÊt so víi c¸c n−íc trong khu vùc §«ng

Nam A vµ T©y Th¸i B×nh D−¬ng, tÝnh trung b×nh hµng n¨m cã 50.000 - 100.000

ng−êi m¾c SD/ SXHD.

BÖnh c¶nh l©m sµng cña sèt Dengue kÌm theo xuÊt huyÕt ®−îc Hamon vµ CS

m« t¶ n¨m 1953 ë Manila (Philippine). §Õn n¨m 1956, còng t¹i Manila, virus

Dengue ®· ®−îc Sabin ph©n lËp tõ m¸u bÖnh nh©n vµ muçi.

Tõ n¨m 1979 ®Õn n¨m 1980 dÞch lan sang vïng nam Th¸i B×nh D−¬ng, B¾c

Qeensland (Australia)...

ë ch©u Mü, sau vô dÞch ®Çu tiªn t¹i Philadenphia n¨m 1780 th× m·i ®Õn n¨m

1826-1828, ng−êi ta l¹i ghi nhËn cã nh÷ng trËn dÞch t−¬ng tù x¶y ra t¹i vïng

biÓn Caribe (Nam Mü). Trong thËp kû tõ 1950 ®Õn 1960, t¹i vïng nµy cã nh÷ng

chiÕn dÞch lín nh»m lo¹i trõ muçi truyÒn bÖnh ®· ®−îc tiÕn hµnh ë Mexico,

Panama... Nh−ng sau ®ã muçi l¹i xuÊt hiÖn ë hÇu hÕt c¸c n−íc trong vïng. Tõ

®ã tÇn sè c¸c vô dÞch SXHD l¹i t¨ng lªn víi ®Çy ®ñ c¶ 4 type virus Dengue.

Trong 15 n¨m gÇn ®©y do sù giao l−u thuËn tiÖn nªn chØ tõ th¸ng 1 ®Õn th¸ng

10/1995 ®· cã 200.000 bÖnh nh©n sèt Dengue vµ 5.500 bÖnh nh©n sèt xuÊt huyÕt

Dengue ®−îc b¸o c¸o tõ c¸c n−íc: Brazin, Hondurat, Nicaragoa, Venezuela.

Nh×n vµo H×nh 1.2. B¶n ®å dÞch tÔ vÒ t×nh h×nh m¾c SD/ SXHD trªn thÕ giíi cã

thÓ nhËn thÊy r»ng dÞch SD/SXHD cã xu h−íng lan réng kh«ng nh÷ng trong mçi

n−íc mµ cßn ra nhiÒu n−íc kh¸c; N¨m 1970- 1980 SD/ SXHD lan ra c¸c n−íc

trong khu vùv §«ng Nam A; TiÕp theo 1980- 1997, dÞch SD/ SXHD lan sang ¢n

§é….Tõ ®ã hµng n¨m cã sù gia t¨ng sè n−íc b¸o cã dÞch vµ sè tr−êng hîp m¾c

bÖnh. Råi tiÕp ®Õn c¸c n−íc vïng T©y Th¸i B×nh D−¬ng vµ Trung Mü ®ang lµ

vïng ho¹t ®éng m¹nh cña virus Dengue g©y nªn bÖnh SD/ SXHD. Theo thèng

kª cña WHO tõ n¨m 1995 ®Õn nay, mçi n¨m cã kho¶ng 50 triÖu ng−êi bÞ nhiÔm

virus Dengue víi kho¶ng 500.000 tr−êng hîp ph¶i nhËp viÖn do m¾c SXHD,

trong ®ã cã kho¶ng 12.000 tr−êng hîp tö vong hoÆc cao h¬n n÷a nÕu nh− bÖnh

nh©n kh«ng ®−îc chÈn ®o¸n vµ ®iÒu trÞ kÞp thêi. §Æc biÖt vµo nh÷ng th¸ng ®Çu

n¨m 2004, t¹i In®«nªxia dÞch SD/SXHD ®· bïng ph¸t m¹nh víi tæng sè tr−êng

hîp bÞ nhiÔm h¬n 80.000, sè tö vong lµ h¬n 1000 tr−êng hîp [17].

H×nh 1.2. B¶n ®å dÞch tÔ vÒ t×nh h×nh m¾c SD/ SXHD trªn thÕ giíi

Nh×n vµo H×nh 1.3, ta thÊy bÖnh SD/ SXHD hiÖn ®ang l−u hµnh t¹i vïng

Trung, Nam Mü vµ vïng §«ng Nam A.

H×nh 1.3. Vïng l−u hµnh bÖnh SD/ SXHD hiÖn nay

BÖnh SD/ SXHD hiÖn ®ang ®e däa tÝnh m¹ng vµ søc kháe têi hµng tû ng−êi n»m

trong khu vùc nhiÖt ®íi, A nhiÖt ®íi [14].

1.1.4 T×nh h×nh dÞch bÖnh ë ViÖt Nam

ë ViÖt Nam, tõ n¨m 1913, Gaide ®· th«ng b¸o vÒ bÖnh Dengue cæ ®iÓn ë miÒn

B¾c vµ miÒn Trung. N¨m 1929, Boye cã viÕt vÒ mét vô dÞch Dengue cæ ®iÓn x¶y

ra ë miÒn Nam ViÖt nam vµo n¨m 1927.

MiÒn B¾c ViÖt Nam, vô dÞch SXHD ®©u tiªn ®−îc Mirosky. J, F. Vymola,

Hoang Thuc Thuy ghi nhËn vµo mïa hÌ n¨m 1958 [19]. NhiÒu t¸c gi¶ ®· m« t¶

c¸c ®Æc ®iÓm l©m sµng cña 68 bÖnh nh©n n»m viÖn gièng hÖt nh− c¸c nÐt l©m

sµng cña nh÷ng tr−êng hîp m¾c SXHD ë c¸c n−íc kh¸c trong vïng ®· ®−îc x¸c

minh vÒ mÆt virus häc. TiÕp ®ã, n¨m 1969, ®· cã dÞch lín x¶y ra ë 19 tØnh,

thµnh phè miÒn B¾c [23]. Theo Tr−¬ng Uyªn Ninh vµ CS [27]: N¨m 1976 cã 11

tØnh th× ®Õn 1987 lªn ®Õn 17 tØnh thµnh miÒn B¾c cã SD/ SXHD.

MiÒn Nam ViÖt Nam, dÞch SXHD ®−îc m« t¶ ®Çu tiªn vµo n¨m 1960 víi 60

bÖnh nh©n tö vong. TiÕp theo, tõ th¸ng 6 ®Õn th¸ng 10 n¨m 1963, cã 331 bÖnh

nh©n nhËp ViÖn vµ tö vong 116 tr−êng hîp do virus Dengue type 2 ®· ®−îc

Halstead ghi nhËn. Sau ®ã, liªn tôc n¨m nµo còng cã bÖnh nh©n th−êng x¶y ra

hµng n¨m ë c¸c tØnh, thµnh phè ®«ng ng−êi, miÒn ®ång b»ng ch©u thæ vµ c¸c

vïng ven biÓn. BÖnh ®· lan réng ®Õn c¸c thÞ x·, thÞ trÊn, huyÖn lþ miÒn nói, trªn

c¸c trôc ®−êng giao th«ng chÝnh liªn tØnh. Sè m¾c trung b×nh hµng n¨m tõ

50.000 - 100.000 ng−êi. Trong giai ®o¹n 1980-1989, SD/ SXHD cã tû lÖ chÕt

®øng ®Çu: 0,84/100.000 d©n. Tõ 1985-1989 tû lÖ m¾c cao thø ba trong c¸c bÖnh

truyÒn nhiÔm: 201,5/ 100.000 d©n, sau héi chøng cóm vµ Øa ch¶y [9]. Theo Lª

Hång Hinh vµ CS [10] th× SD/ SXHD lµ mét trong 10 bÖnh truyÒn nhiÔm cã tû

lÖ m¾c vµ chÕt cao nhÊt ë ViÖt Nam (1994).

1.2. ViruS Dengue

M

E

Lipids từ vật chủ

Capsid

Hệ gen ssRNA ~ 11 kb

Sợi ARN đơn chứa khoảng 11,000 bazơ

N.R.

5’

CAP

3

650 Vùng cấu trúc

Vùng không cấu trúc

N.C.R ~ 100 nt

2a 2b

4a 4b

C

prM

Enzymes liên quan đến quá trình dịch mã

: NS2B/NS3 serine protease complexe : Furin-like Golgi protease : ER signalases

H×nh 1.4. H×nh th¸i cÊu tróc cña virus Dengue

Vïng NS1..NS5: Khu vùc cã cÊu tróc gièng c¸c virus thuéc hä Flaviviridae

(ChiÕm >50% sè l−îng nucleotid trong chuçi ARN)

Vïng C-prM-E: Khu vùc cã cÊu tróc riªng biÖt (Khu vùc më)

1.2.1 §Æc ®iÓm h×nh th¸i vµ cÊu tróc

Virus Dengue thuéc hä Flaviridae, gièng Flavivirus bao gåm 4 type huyÕt

thanh lµ Dengue1, Dengue2, Dengue3, Dengue4. Virus Dengue h×nh khèi cÇu cã

®−êng kÝnh kho¶ng 40-50 nm, chøa mét sîi ARN ®¬n-d−¬ng (kho¶ng 10200

nucleotide). Còng nh− c¸c Flavivirus kh¸c virus Dengue cã mét líp vá

(envelope) b¶n chÊt lµ glycoprotein-lipit bao quanh mµng protein, líp vá nµy b¾t

nguån tõ mµng tÕ bµo vËt chñ (H×nh 1.4). Ngoµi ra nucleocapsid cã cÊu tróc ®èi

xøng 20 mÆt. H¹t virus cã hÖ sè l¾ng kho¶ng 175S ®Õn 215S. Tû träng x¸c ®Þnh

b»ng ly t©m gradien sacarosa kho¶ng 1.19 g/cm3. Tû lÖ nµy cã thÓ thay ®æi ®«i

chót do c¸c kü thuËt tinh chÕ [25]

1.2.2 Genome cña virus

Virus Dengue cã hÖ gen cña Flavivirus ®iÓn h×nh. Genome lµ mét sîi ARN ®¬n,

d−¬ng cã chiÒu dµi xÊp xØ 10200 ribonucleotit. HÖ gen chøa mét khung ®äc më

m· ho¸ thµnh mét chuçi polyprotein duy nhÊt. Chuçi nµy, sau ®ã sÏ ®−îc ph©n

c¾t bëi c¸c enzyme cña tÕ bµo vËt chñ vµ c¸c enzyme cña virus thµnh 10 ph©n tö

protein chøc n¨ng, bao gåm 3 protein cÊu tróc vµ 7 protein phi cÊu tróc. Genome

cña virus Dengue cã cÊu tróc ph©n bè cña c¸c gen theo thø tù nh− sau: 5’-C-

preM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4a-NS4b-NS5-3’ (H×nh 1.5).

H×nh 1.5. CÊu tróc bé gen cña virus Dengue

- §Çu 5’ kh«ng m· ho¸ dµi kho¶ng 100 nucleotit.

- §Çu 5’ kh«ng m· ho¸ dµi kho¶ng 100 nucleotit, ®−îc metyl ho¸ ®¶m

b¶o sù bÒn v÷ng cho vËt liÖu di truyÒn. §Çu 3’ (kh«ng ®−îc polyadenin ho¸)

kh«ng m· ho¸ dµi kho¶ng 400 nucleotit.

- Kho¶ng mét phÇn t− chiÒu dµi cña genome tÝnh tõ ®Çu 5’ m· cho c¸c

protein cÊu tróc: protein lâi (C), protein mµng (M), protein vá (E). §o¹n gen nµy

®· ®−îc hiÓu râ vµ ®· ®−îc gi¶i tr×nh tù. §o¹n nµy chøa nhiÒu vïng ®Æc hiÖu loµi

vµ ®Æc hiÖu type. Ng−êi ta dùa vµo c¸c vïng ®Æc biÖt nµy ®Ó ph©n biÖt cÊu tróc

gen cña c¸c virus trong nhãm vµ c¸c type virus trong loµi.

-PhÇn cßn l¹i cña genome m· ho¸ cho 7 protein phi cÊu tróc thùc hiÖn c¸c

chøc n¨ng sinh häc x¸c ®Þnh vßng ®êi cña virus. Chøc n¨ng cña c¸c protein nµy

®Õn nay vÉn ch−a ®−îc biÕt ®Çy ®ñ.

Kho¶ng 1/ 4 chiÒu dµi cña genome tÝnh tõ ®Çu 5’ (kho¶ng h¬n 2000

nucleotid) m· ho¸ cho c¸c protein cÊu tróc. §o¹n gen nµy chøa nhiÒu vïng

quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn quan träng gãp phÇn ®¸nh gi¸ ®Æc hiÖu type. TÝnh chÊt

®Æc tr−ng cña vïng nµy cho phÐp ph©n biÖt cÊu tróc gen cña c¸c virus trong

nhãm vµ trong cïng type huyÕt thanh. HiÖn nay ®· ph©n biÖt ®−îc 4 type huyÕt

thanh cña virus Dengue g©y bÖnh lµ: virus Dengue type I (D1), virus Dengue

type II (D2), virus Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4). VÒ

ph−¬ng diÖn kh¸ng nguyªn , c¶ 4 type huyÕt thanh nµy ®Òu cã liªn quan chÆt chÏ

víi nhau vµ cã ph¶n øng chÐo nhau [6]. Khi c¬ thÓ nhiÔm mét trong bèn type

virus Dengue, c¬ thÓ sÏ sinh miÔn dÞch ®èi víi type virus ®ã trong mét thêi gian

dµi nh−ng kh«ng cã t¸c dông miÔn dÞch ®èi víi c¸c type cßn l¹i. §iÒu nµy gi¶i

thÝch t¹i sao mét ng−êi cã thÓ nhiÔm c¶ bèn type virus trong suèt cuéc ®êi [12,

25].

• Protein cÊu tróc

Bao gåm protein lâi (C), protein vá (E), protein mµng (M).

+ Protein lâi (C) lµ protein cã kÝch th−íc nhá vµ lµ thµnh phÇn c¬

b¶n t¹o nªn lâi nucleocapsit cña virus.

+ Protein vá (E) cã nguån gèc tõ mµng tÕ bµo chñ, ®−îc glycosyl

ho¸ ë pH thÊp, mang c¸c kh¸ng nguyªn trung hoµ, kh¸ng nguyªn g©y ng−ng kÕt

hång cÇu vµ t−¬ng t¸c víi c¸c thô thÓ g©y ra c¸c triÖu chøng cña SD/SXHD.

+ Protein mµng (M) Cã hai d¹ng phô thuéc vµo ®é sinh tr−ëng cña

virus bao gåm M cã khèi l−îng ph©n tö 8 kDa vµ pre_M cã khèi l−îng ph©n tö

19 – 23 kDa.

• Protein phi cÊu tróc

Chøc n¨ng cña nhãm protein nµy ch−a ®−îc biÕt mét c¸ch ®Çy ®ñ. C¸c

chøc n¨ng sinh häc nµy x¸c ®Þnh vßng ®êi cña virus . CÊu tróc ®o¹n gen nµy kh¸

gièng nhau ë c¸c type virus Dengue kh¸c nhau, ®©y chÝnh lµ nguyªn nh©n g©y

lªn c¸c ph¶n øng chÐo nhau trong chÈn ®o¸n huyÕt thanh häc.

+ NS1 lµ glycoprotein ë d¹ng chÊt tiÕt hoÆc kh«ng tiÕt, cã thÓ gi÷ vai

trß sao chÐp ban ®Çu

+ NS2 cã thµnh phÇn lµ c¸c enzyme quan träng trong viÖc sao chÐp

ARN, helicase vµ ARN triphotphatase t¹o thµnh cÊu tróc ®Çu 5’, protease ®Ó

ph©n c¾t polyprotein vµ liªn kÕt víi mµng.

+ NS5 thµnh phÇn lµ c¸c enzyme polymerase phô thuéc ARN cã chøc

n¨ng phiªn m· DNA vµ enzyme methyltransferase metyl ho¸ ®Çu 5’.

+ Ngoµi ra cßn cã c¸c vÞ trÝ cña NS2A, NS2B, NS4A, NS4B. C¸c

protein nµy cïng phèi hîp thùc hiÖn c¸c chøc n¨ng sinh häc trong vßng ®êi cña

virus [12].

1.2.3 Chu tr×nh nh©n lªn vµ c¬ chÕ g©y bÖnh cña virus Dengue

Flaviviri Hạt virut on

Plasma membrane

Các nhân tố gắn và thụ thể

H+

RCs

H+

> 20 h p.i.

H+

E n d os o m e

Bộ máy Golgi

3-10 h p.i.

RCs dsRNA

+ -

nhân

NS1

RF

dạng sao chép

prME

-

+

IR

+

>15 h p.i.

Endoplasmic reticulum

NC

H×nh 1.6. C¬ chÕ g©y bÖnh cña virus Dengue

Sau khi b¸m vµo tÕ bµo chñ, nhê liªn kÕt víi c¸c thô thÓ ®Æc hiÖu trªn bÒ mÆt tÕ

bµo chñ thÝch hîp lµ Fc vµ C3, virus Dengue x©m nhËp ngay vµo tÕ bµo theo c¬ chÕ thùc bµo. T¹i vïng cã pH thÊp, h×nh d¹ng cña virus bÞ biÕn ®æi, x¶y ra qu¸

tr×nh dung gi¶i vá protein E, ARN virus ®−îc gi¶i phãng vµo trong bµo t−¬ng.

ARN virus ho¹t ®éng nh− mét mARN nhê enzyme polymerase cña tÕ bµo chñ

trùc tiÕp dÞch m· thµnh polyprotein. Ho¹t ®éng nµy diÔn ra trong tÕ bµo chÊt

vïng gÇn nh©n vµ ®−îc sù hç trî cña m¹ng l−íi néi chÊt. §Ó sao chÐp genome

cña m×nh, virus ph¶i t¹o mét sîi ARN ©m bæ sung víi sîi ®¬n d−¬ng cña m×nh.

Qu¸ tr×nh nµy ®−îc xóc t¸c bëi mét protein lµ replicase vµ enzyme ARN

polymerase cña tÕ bµo chñ, sau ®ã ARN sîi ®¬n ©m nµy sÏ ®−îc sö dông nh−

mét sîi khu«n ®Ó tæng hîp ra mét b¶n sao míi cña sîi d−¬ng. Khi c¸c protein

capsit ®−îc tæng hîp ®ñ, chóng tËp hîp l¹i thµnh mét cÊu tróc rçng gäi lµ

procapsit, sîi ARN d−¬ng ®i vµo cÊu tróc nµy vµ kÕt hîp thµnh nucleocapsit.

C¸c nucleocapsit nµy di chuyÓn ®Õn mµng tÕ bµo chÊt nhê bé m¸y Golgi, sau ®ã

chóng di chuyÓn ®Õn mÆt trong cña mµng vµ ®−îc bao bäc bëi mµng. C¸c h¹t

virus trong mét tÕ bµo ®−îc h×nh thµnh vµ gi¶i phãng ra ngoµi do tÕ bµo chñ bÞ

huû ho¹i. C¸c nucleocapsit cã mµng bao chÝnh lµ mµng sinh chÊt cña tÕ bµo chñ

cò vµ c¸c virion míi cã thÓ sö dông c¸c bao mµng nµy ®Ó hoµ nhËp víi mµng

cña tÕ bµo chñ míi (H×nh 1.6).

ë trong c¬ thÓ, virus Dengue t¨ng sinh trong c¸c ®¹i thùc bµo. Khi c¬ thÓ bÞ

nhiÔm virus Dengue type kh¸c th× nh÷ng kh¸ng thÓ cã s½n trong c¬ thÓ kh«ng cã

kh¶ n¨ng ph¶n øng ®Æc hiÖu víi kh¸ng nguyªn nªn kh«ng trung hoµ ®−îc kh¸ng

nguyªn cña virus. Virus x©m nhËp vµo b¹ch cÇu ®¬n nh©n, sè l−îng b¹ch cÇu

®¬n nh©n to t¨ng lªn. Ho¹t ho¸ c¸c CD4, CD8, lympho ®éc tÕ bµo. C¸c lympho

T ho¹t ho¸ gi¶i phãng ra nhiÒu cytokinin, c¸c b¹ch cÇu ®¬n nh©n to nhiÔm virus

bÞ ly gi¶i do ®¸p øng miÔn dÞch qua trung gian tÕ bµo. XuÊt hiÖn tho¸t huyÕt

t−¬ng vµ xuÊt huyÕt [15]. Theo thèng kª cã ®−îc tõ Tæ Chøc Y TÕ ThÕ Giíi th×

c¶ bèn type virus ®Òu cã thÓ g©y SD, SXHD vµ shock Dengue.

1.2.4. §Æc ®iÓm kh¸ng nguyªn

Virus Dengue mang c¸c kh¸ng nguyªn trung hoµ, kh¸ng nguyªn g©y ng−ng kÕt

hång cÇu, kh¸ng nguyªn kÕt hîp bæ thÓ trªn protein mµng (E) [15]. Virus

Dengue cã nhiÒu kh¸ng nguyªn, trong ®ã cã kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu type, kh¸ng

nguyªn chung cña ph©n nhãm vµ cña nhãm, dùa vµo sù kh¸c biÖt gi÷a c¸c ®Æc

®iÓm quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn ng−êi ta ph©n chia virus Dengue thµnh 4 type

kh¸c nhau tõ virus Dengue type I (D1) ®Õn virus Dengue type IV (D4). C¶ 4

type huyÕt thanh cña virus Dengue rÊt gÇn nhau vÒ ph−¬ng diÖn kh¸ng nguyªn

nh−ng kh¸c nhau ë chç cã mét phÇn miÔn dÞch chÐo. Virus Dengue cßn cã

chung mét sè ®Æc ®iÓm kh¸ng nguyªn víi mét sè Flavivirus kh¸c. Kh¸ng

nguyªn cña virus Dengue khu tró ë ®¹i thùc bµo phæi, l¸ch, gan, tuyÕn øc, c¸c tæ

chøc da vµ b¹ch cÇu ®¬n nh©n. Khi x©m nhËp vµo c¬ thÓ c¸c kh¸ng nguyªn cña

virus lµ kh¸ng nguyªn trung hoµ, kh¸ng nguyªn ng−ng kÕt hång cÇu vµ kh¸ng

nguyªn kÕt hîp bæ thÓ sÏ kÝch thÝch c¬ thÓ h×nh thµnh c¸c kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu

t−¬ng øng [17].

§Ó ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue trong huyÕt thanh bÖnh nh©n hoÆc

x¸c ®Þnh sù cã mÆt cña virus Dengue trong c¸c tæ chøc c¬ quan nghi nhiÔm virus

ph¶i sö dông mét trong c¸c kü thuËt cña hai nhãm ph−¬ng ph¸p sau ®©y.

1.2.4.1. Ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ

Víi thÓ ®iÓn h×nh dùa vµo c¸c yÕu tè sau:

- YÕu tè DÞch tÔ: BÖnh nh©n ë mïa dÞch, võa ë n¬i cã dÞch trë vÒ...

- L©m sµng: BÖnh nh©n sèt, dÊu hiÖu Tourniquet d−¬ng tÝnh, xuÊt huyÕt, gan to...

- XÐt nghiÖm: TiÓu cÇu d−íi 100.000/ mm3 . Hematocrite t¨ng thªm trªn 20%,

b¹ch cÇu, lympho bµo gi¶m hoÆc b×nh th−êng.

Nh−ng chØ cã c¸c xÐt nghiÖm huyÕt thanh häc, virus häc míi cho kÕt luËn chÝnh

x¸c vô dÞch c¨n nguyªn vô dÞch SD/ SXHD.

Nh− chóng ta ®· biÕt tiÕp theo sau c¸c nhiÔm trïng, c¸c kh¸ng thÓ ng¨n ng−ng

kÕt hång cÇu, kh¸ng thÓ trung hoµ xuÊt hiÖn sau 7 ngµy khëi bÖnh; C¸c kh¸ng

thÓ kÕt hîp bæ thÓ h×nh thµnh tõ 7 ®Õn 14 ngµy sau... Kh¸ng thÓ IgM th−êng

xuÊt hiÖn sím sau 2, 3 ngµy ®Çu m¾c bÖnh; Kh¸ng thÓ nµy tån t¹i trong vßng 90

ngµy sau. Trong khi ®ã kh¸ng thÓ IgG th−êng xuÊt hiÖn muén sau 5, 6 ngµy vµ

tån t¹i l©u dµi. Dùa vµo tÝnh chÊt nµy mµ ng−êi ta ®· s¸ng t¹o ra nhiÒu kü thuËt

chÈn ®o¸n nhanh, sím vµ kh¸ chÝnh x¸c bÖnh SD/ SXHD...

- Ph¶n øng ng−ng kÕt hång cÇu thô ®éng: lµ ph¶n øng trong ®ã dïng mét

kh¸ng nguyªn hoµ tan ®Ó ph¸t hiÖn mét kh¸ng thÓ t−¬ng øng.

- Ph¶n øng ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu: Theo Clarke vµ Casals (1958) [5] dïng

hång cÇu ®· g¾n kh¸ng nguyªn hoµ tan ®Ó ph¸t hiÖn vµ ®o l−êng kh¸ng thÓ

t−¬ng øng. §Ó thùc hiÖn kü thuËt nµy ph¶i mÊt trªn 15 ngµy sau khi khëi

bÖnh... Bëi v× kh¸ng thÓ IgG th−êng h×nh thµnh chËm.

- Kü thuËt ELISA ph¸t hiÖn IgM (IgM antibody capture ELISA) hay cßn gäi lµ

MAC-ELISA [22]: Lµ mét kü thuËt míi ®−îc ph¸t hiÖn nh−ng ®· nhanh

chãng ®−îc sö dông réng r·i. Kü thuËt ®¬n gi¶n, nhanh vµ ®ßi hái Ýt trang bÞ

kü thuËt cao. Kü thuËt MAC-ELISA dùa trªn nguyªn t¾c ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ

IgM ®Æc hiÖu cña Dengue cã trong m¸u bÖnh nh©n b»ng kh¸ng thÓ kh¸ng

IgM ®· g¾n tr−íc vµo b¶n nhùa. NÕu IgM trong huyÕt thanh bÖnh nh©n cã

kh¸ng thÓ kh¸ng Dengue, nã sÏ g¾n víi kh¸ng nguyªn Dengue ®−îc thªm

vµo sau vµ ®−îc ph¸t hiÖn b»ng mét kh¸ng thÓ kh¸ng Dengue g¾n enzym

cho thªm vµo sau n÷a. Kh¸ng thÓ g¾n enzym nµy cã thÓ lµ kh¸ng thÓ ng−êi

kh¸ng Dengue hoÆc lµ kh¸ng thÓ ®¬n dßng. Khi cho c¬ chÊt vµo, nÕu ph¶n

øng d−¬ng tÝnh, sÏ xuÊt hiÖn mµu...

Kh¸ng thÓ IgM kh¸ng virus Dengue th−êng xuÊt hiÖn sím h¬n kh¸ng thÓ

IgG ë ngµy thø 5 sau khi khëi ph¸t, hÇu hÕt c¸c tr−êng hîp d−¬ng tÝnh víi

xÐt nghiÖm NNKHC th× ®Òu ph¸t hiÖn ®−îc kh¸ng thÓ IgM kh¸ng virus

Dengue. Kü thuËt MAC-ELISA cßn cã thÓ ph¸t hiÖn ë giai ®o¹n sím tõ

ngµy thø hai sau khi bÖnh khëi ph¸t; Trong khi ®ã kü thuËt NNKHC kh«ng

cã kh¶ n¨ng nµy. Tuy nhiªn sù xuÊt hiÖn kh¸ng thÓ IgM cßn tuú thuéc vµo

tõng c¬ thÓ bÖnh nh©n... vµ v× thÓ tû lÖ d−¬ng tÝnh th−êng xª dÞch tõ 75%

®Õn 82%. Kü thuËt MAC-ELISA ®· trë nªn cã gÝa trÞ ®Æc biÖt trong viÖc

gi¸m s¸t SD/ SXHD. Nã cã thÓ dïng ®iÒu tra sµng läc mét l−îng lín huyÕt

thanh v× kü thuÈt ®¬n gi¶n, thêi gian nhanh, sím (chØ cÇn lÊy m¸u ®¬n), víi

sè l−îng huyÕt thanh lín. Nhê kÕt qu¶ cña kü thuËt MAC-ELISA mµ c¸c

nhµ dÞch tÕ cã thÓ ph¸t hiÖn sím ®Ó cã h−íng dËp dÞch; C¸c b¸c sÜ l©m sµng

cã h−íng ®iÒu trÞ kÞp thêi.

- Kü thuËt chÈn ®o¸n nhanh IgM vµ IgG ë bÖnh nh©n m¾c SD/ SXHD b»ng

ph−¬ng ph¸p S¾c ký miÔn dÞch (Panbio Dengue Fever Rapid Test). Theo

Chew Theng Sang (BÖnh viªn ®a khoa Singapore) vµ BS. David Vaughn cïng

CS. (ViÖn nghiªn cøu Y häc Qu©n ®éi Hoa kú, Bangkok, Thai Lan) th× thÊy

®©y lµ mét kü thuËt s¾c ký miÔn dÞch ®Ó ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ IgM vµ IgG ë

bÖnh nh©n m¾c SD/ SXHD. TÊt c¶ c¸c thµnh phÇn bao gåm kh¸ng nguyªn

Dengue lÉn c¸c ho¸ chÊt cña qu¸ tr×nh ph¶n øng ®−îc tÈm s½n trªn tÊm card

giÊy; Sau khi nhá thªm dung dÞch ®Öm vµ huyÕt thanh bÖnh nh©n; 07 phót

sau ®äc kÕt qu¶.

1.2.4.2. Ph©n lËp virus.

Cã 4 hÖ thèng ph©n lËp cã thÓ sö dông ®Ó ph©n lËp virus Dengue:

-CÊy truyÒn trªn n·o chuét æ (1-3 ngµy tuæi).

- CÊy truyÒn trªn tÕ bµo cña ®éng vËt cã vó (LLC-MK2)

- CÊy truyÒn vµo ngùc muçi tr−ëng thµnh.

- CÊy truyÒn trªn tÕ bµo muçi (A.albopictus dßng C6/36).

∗ CÊy truyÒn trªn n·o chuét æ (1-3 ngµy tuæi)

TÊt c¶ 4 type virus Dengue ®Òu cã thÓ ph©n lËp ®−îc tõ huyÕt thanh ng−êi khi

g©y nhiÔm trªn n·o chuét æ. Ph−¬ng ph¸p nµy ®ßi hái nhiÒu thêi gian, cho kÕt

qu¶ chËm vµ kh«ng kinh tÕ. H¬n thÕ n÷a do sù kÐm nh¹y nªn cã rÊt nhiÒu virus

hoang d¹i kh«ng thÓ ph©n lËp ®−îc ë trªn chuét. Ph©n lËp virus trªn chuét æ ph¶i

qua nhiÒu lÇn g©y nhiÔm ®Ó thóc ®Èy sù nh©n lªn cña virus trªn n·o chuét, v×

vËy rÊt tèn tiÒn vµ thêi gian. ¦u ®iÓm cña ph−¬ng ph¸p nµy lµ mét sè arbovirus

kh¸c cã triÖu chøng gièng SD/SXHD còng cã thÓ ph¸t hiÖn ®−îc nhê ph−¬ng

ph¸p nµy. Ngµy nay hÇu hÕt c¸c phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi kh«ng sö dông

ph−¬ng ph¸p nµy ®Ó ph©n lËp virus [18].

∗ CÊy truyÒn trªn tÕ bµo ®éng vËt cã vó.

Ph©n lËp virus trªn tÕ bµo ®éng vËt cã vó (LLC-MK2) cã nh÷ng nh−îc ®iÓm

gièng nh− ph©n lËp trªn chuét æ ®ã lµ: kh«ng kinh tÕ, chËm vµ kÐm nh¹y c¶m.

Ph−¬ng ph¸p nµy còng ®ßi hái ph¶i cÊy truyÒn nhiÒu lÇn tr−íc khi nh×n thÊy sù

huû ho¹i cña tÕ bµo. Ph−¬ng ph¸p nµy hiÖn nay còng chØ thùc hiÖn trong mét sè

phßng thÝ nghiÖm chø kh«ng ®−îc sö dông réng r·i nh− c¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c.

∗ CÊy truyÒn vµo ngùc muçi tr−ëng thµnh

§©y lµ mét ph−¬ng ph¸p nh¹y nhÊt trong ph©n lËp virus Dengue. Tuy kh«ng ®¹t

tíi tû lÖ 100% nh−ng ®ñ ®é nh¹y ®Ó thµnh c«ng trong viÖc x¸c ®Þnh virus

Dengue trong c¸c tr−êng hîp tö vong cña SD/ SXHD. Trong rÊt nhiÒu vô dÞch

virus Dengue ®· ®−îc x¸c nhËn håi cøu th«ng qua ph−¬ng ph¸p nµy. Cã 4 loµi

muçi ®−îc sö dông ®Ó ph©n lËp virus ®ã lµ: Ae.aegypti, Ae.albopictus,

Toxorhynchities amboinensis vµ T.splendens [42]. Sù nh©n lªn cña virus

Dengue trong muçi rÊt nhanh (106-107 MID 50) trong 4-5 ngµy vµ phô thuéc vµo nhiÖt ®é trong qu¸ tr×nh g©y nhiÔm. Virus Dengue nh©n lªn trong tÊt c¶ c¸c tæ

chøc tÕ bµo cña muçi kÓ c¶ n·o. GÇn ®©y ph−¬ng ph¸p nµy cßn ®−îc ¸p dông

trªn n·o bä gËy vµ muçi Toxorhynchities. Tuy nhiªn viÖc c¶i tiÕn trªn còng

kh«ng lµm t¨ng tÝnh nhËy c¶m h¬n so víi g©y nhiÔm vµo ngùc muçi. Ph−¬ng

ph¸p nµy ®ßi hái ph¶i cã phßng thÝ nghiÖm chuyªn dông vµ kh¶ n¨ng duy tr× mét

l−îng muçi lín, h¬n n÷a lµ sù an toµn trong c«ng viÖc sö dông muçi c¸i

Ae.aegypti hoÆc Toxorhynchities, bëi v× chÝnh ®ã lµ vect¬ truyÒn bÖnh vµ lµ

nguyªn nh©n g©y nhiÔm virus cho nh©n viªn lµm viÖc t¹i phßng thÝ nghiÖm ®ã.

∗CÊy truyÒn trªn hÖ thèng tÕ bµo muçi.

§©y lµ ph−¬ng ph¸p ®−îc sö dông réng r·i hiÖn nay. Cã 3 dßng tÕ bµo muçi

nh¹y c¶m hiÖn nay ®−îc sö dông réng r·i ®ã lµ:

+ TÕ bµo muçi Ae.albopictus dßng C6/36 ®−îc dïng réng r·i nhÊt.

Sö dông dßng tÕ bµo nµy lµm cho ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus Dengue trë

nªn nhanh, nhËy vµ kinh tÕ nhÊt ®ång thêi còng lµ ph−¬ng ph¸p lý t−ëng

®Ó gi¸m s¸t virus. So víi ph©n lËp trªn ngùc muçi, ph−¬ng ph¸p nµy kÐm

nh¹y h¬n kho¶ng 15% tuy nhiªn nã vÉn ®−îc sö dông réng r·i v× cã kh¶

n¨ng gi¶i quyÕt ®−îc mét sè l−îng mÉu lín dÔ dµng trong thêi gian ng¾n.

+ TÕ bµo muçi A. pseudocutellaris dßng 61(AP-61). §é nhËy cña

dßng tÕ bµo nµy kÐm h¬n so víi C6/36 . V× vËy nÕu chØ dïng dßng tÕ bµo

nµy sÏ bá sãt nhiÒu tr−êng hîp nhiÔm virus Dengue. Tuy nhiªn nhiÒu nhµ

nghiªn cøu vÉn thÝch sö dông lo¹i tÕ bµo nµy bëi v× cã thÓ quan s¸t ®−îc

sù ®¸p øng cña tÕ bµo víi virus Dengue th«ng qua viÖc t¹o CPE

(Cytopathogenic effect). Ngµy nay ng−êi ta th−êng sö dông dßng tÕ bµo

nµy ®i kÌm víi C6/36 ®Ó ph©n lËp virus Dengue.

+ TÕ bµo muçi Tx.amboinensis (TRA-dßng 284). §©y lµ dßng tÕ

bµo nhËy c¶m nhÊt ®èi víi virus Dengue nh−ng kh¶ n¨ng duy tr× vµ ph¸t

triÓn cña dßng tÕ bµo nµy khã v× vËy kh«ng ®−îc sö dông réng r·i nh−

dßng C6/36 hiÖn nay.

C¸c ph−¬ng ph¸p x¸c ®Þnh type virus [18]

∗ Ph−¬ng ph¸p th«ng dông

Ph−¬ng ph¸p th«ng dông ®Ó x¸c ®Þnh type huyÕt thanh cña virus Dengue hiÖn

nay ®ã lµ ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch huúnh quang (Immuno Fluorescent Assay –

IFA) lu«n ®−îc thùc hiÖn cïng víi c¸c ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus. Ph−¬ng

ph¸p nµy sö dông kh¸ng thÓ ®¬n dßng ®Æc hiÖu type ®−îc t¹o ra trªn tÕ bµo nu«i

cÊy hoÆc dÞch b¸ng miÔn dÞch chuét kÕt hîp víi kh¸ng thÓ kh¸ng IgG chuét g¾n

huúnh quang. Ph−¬ng ph¸p nµy dÔ dµng thùc hiÖn trªn tÕ bµo ®· g©y nhiÔm, n·o

muçi hoÆc tiªu b¶n m«, tiªu b¶n tæ chøc n·o chuét... ®−îc cè ®Þnh b»ng

Formalin hoÆc parafin...

§©y lµ ph−¬ng ph¸p ®¬n gi¶n, ®¸ng tin cËy vµ rÊt nhanh, thªm n÷a nã cã thÓ

ph¸t hiÖn ®−îc nhiÒu lo¹i virus trªn cïng mét bÖnh nh©n trong tr−êng hîp bÖnh

nh©n bÞ nhiÔm nhiÒu type cña virus Dengue.

Ph−¬ng ph¸p nµy muèn thµnh c«ng phô thuéc vµo nhiÒu yÕu tè:

- Tæ chøc vµ b¶o qu¶n mÉu: §©y lµ yÕu tè quan träng v× virus cã

thÓ bÞ bÊt ho¹t bëi nhiÖt ®é, pH vµ mét sè ho¸ chÊt. YÕu tè nµy th−êng lµ

nguyªn nh©n g©y ra thÊt b¹i cña trong qu¸ tr×nh ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh

virus.

- Nång ®é virus cã trong m¸u trong giai ®o¹n ®Çu cña bÖnh. Th«ng

th−êng virus nh©n lªn trong m¸u ®¹t tíi ®Ønh cao trong mét thêi gian rÊt

ng¾n ë giai ®o¹n ®Çu cña bÖnh. Khã cã thÓ ph¸t hiÖn virus sau 4-5 ngµy

m¾c bÖnh.

- HÖ thèng ph©n lËp virus ®−îc cho còng lµ mét yÕu tè quan träng

quyÕt ®Þnh sù thµnh c«ng cña ph−¬ng ph¸p nµy.

∗ Mét sè ph−¬ng ph¸p kh¸c

Trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y cã mét sè ph−¬ng ph¸p míi ®· ®−îc ph¸t triÓn gãp

phÇn vµo viÖc hoµn thiÖn c¸c ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n nhiÔm virus Dengue.

Nh÷ng ph−¬ng ph¸p tiªu biÓu cã thÓ kÓ ®Õn ®ã lµ: ph¶n øng khuyÕch ®¹i chuçi

(Polymerase chain reaction - PCR), ph−¬ng ph¸p m¶nh lai ghÐp (Hybridization

probes), ho¸ miÔn dÞch m« (Immunohistochemistry).

- Ph¶n øng khuyÕch ®¹i chuçi.

(Reverse Transcriptase - PCR)

Ph−¬ng ph¸p tæng hîp ng−îc RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR) ®· ®−îc

ph¸t triÓn vµ ¸p dông cho phÇn lín c¸c virus cã vËt liÖu di truyÒn lµ ARN trong

nh÷ng n¨m gÇn ®©y ®· lµ cuéc c¸ch m¹ng lín trong lÜnh vùc sinh häc ph©n tö.

Ph−¬ng ph¸p nµy ®· bæ xung thªm vµo c¸c ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n cña virus

Dengue vµ lµ mét ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n nhanh, ®Æc hiªô, nh¹y, ®¬n gi¶n vµ

cho kÕt qu¶ chÝnh x¸c, nÕu nh− ®−îc kiÓm so¸t tèt. Ph−¬ng ph¸p nµy cã kh¶

n¨ng ph¸t hiÖn ®o¹n ARN ®Æc hiÖu cña virus trong mÉu huyÕt thanh cña ng−êi,

trªn m« cña tö thi hoÆc tõ muçi. Kh¸c víi c¸c ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus kh¸c,

c¸c yÕu tè nh− ®iÒu kiÖn b¶o qu¶n, kü n¨ng thùc hiÖn, sù xuÊt hiÖn cña KT trong

mÉu còng kh«ng ¶nh h−ëng tíi kÕt qu¶ cña RT-PCR. Tuy vËy trong c¸c phßng

thÝ nghiÖm, ph−¬ng ph¸p nµy còng kh«ng sö dông réng r·i do gi¸ thµnh qu¸ cao,

trang thiÕt bÞ yªu cÇu cao vµ nguyªn nh©n chñ yÕu lµ do ®é nh¹y cña RT-PCR

qu¸ cao nªn nÕu kh«ng kiÓm so¸t ®−îc sù t¹p nhiÔm cña c¸c t¸c nh©n ngo¹i lai

th× viÖc t¹o ra c¸c kÕt qu¶ sai lÖch lµ kh«ng tr¸nh khái.

- Ph−¬ng ph¸p m¶nh lai ghÐp .

(Hybridization probes)

§©y còng lµ ph−¬ng ph¸p ph¸t hiÖn ®o¹n ARN ®Æc hiÖu cña virus b»ng m¶nh lai

ghÐp v« tÝnh. M¶nh nµy ®Æc hiÖu cho toµn bé c¸c type cña virus Dengue ®−îc

cÊu t¹o dùa vµo chuçi nucleotit cña virus Dengue. §©y lµ ph−¬ng ph¸p nhanh

®¬n gi¶n cã thÓ sö dông cho c¸c mÉu thu thËp trªn l©m sµng còng nh− trªn tö thi.

§é nh¹y cña ph−¬ng ph¸p nµy kÐm h¬n RT- PCR vµ còng ®ßi hái trang thiÕt bÞ

cao, ®¾t tiÒn v× vËy còng kh«ng sö dông réng r·i trong c¸c phßng thÝ nghiÖm.

- Ph−¬ng ph¸p ho¸ miÔn dÞch m« .

(Immunohistochemistry).

Mét vÊn ®Ò cßn v−íng m¾c trong c¸c phßng thÝ nghiÖm chÈn ®o¸n virus lµ x¸c

®Þnh nguyªn nh©n cña c¸c tr−êng hîp tö vong. Trong mét thêi gian ng¾n nÕu chØ

dùa vµo mét huyÕt thanh thu nhËp ®−îc vµ kÕt qu¶ cña c¸c ph−¬ng ph¸p chÈn

®o¸n huyÕt thanh häc th× viÖc nhËn ®Þnh kÕt qu¶ rÊt h¹n chÕ, ®Æc biÖt lµ mét sè

tr−êng hîp tö vong sím hoÆc chØ sèt nhÑ khi ®ã viÖc ph©n lËp virus rÊt khã kh¨n.

Víi kü thuËt ho¸ miÔn dÞch m« nµy cã thÓ gi¶i quyÕt vÊn ®Ò ®ã b»ng c¸ch ph¸t

hiÖn kh¸ng nguyªn cña virus trªn c¸c tæ chøc kh¸c nhau.

Còng nh− ph−¬ng ph¸p IFA, ph−¬ng ph¸p nµy sö dông c¸c kh¸ng thÓ g¾n enzym

(céng hîp) nh− peroxidase, photphatase g¾n víi c¸c kh¸ng thÓ ®a dßng hoÆc ®¬n

dßng kh¸c nhau. Ph−¬ng ph¸p nµy cã thÓ ¸p dông cho c¸c mÉu míi hoÆc mÉu ®·

®−îc cè ®Þnh trong c¸c tr−êng hîp tö vong v× SXHD/SD. HiÖn t¹i ph−¬ng ph¸p

nµy còng kh«ng ®−îc sö dông réng r·i trong chÈn ®o¸n mµ chØ ¸p dông cho

nghiªn cøu håi cøu.

+ Nhãm ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus g©y bÖnh vµ ®Þnh type virus cã thÓ sö

dông ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch huúnh quang (IFA: Immunofluorescense assay)

hoÆc ph−¬ng ph¸p RT-PCR (Reverse transcriptase polymerase chain reaction).

Trong hai ph−¬ng ph¸p nªu trªn th× RT-PCR lµ ph−¬ng ph¸p cho kÕt qu¶ nhanh,

nh¹y vµ ®Æc hiÖu nh−ng tiÕn hµnh kh¸ phøc t¹p, ®ßi hái kü thuËt cao, ®Çu t− tµi

chÝnh lín nªn khã ®¸p øng vµ phæ biÕn réng r·i trong c¸c phßng thÝ nghiÖm

chÈn ®o¸n SD/SXHD ë n−íc ta.

+ Nhãm ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n huyÕt thanh häc. §©y lµ nhãm ph−¬ng

ph¸p ®¬n gi¶n, gióp ph¸t hiÖn bÖnh vµ nghiªn cøu dÞch tÔ, bao gåm c¸c ph−¬ng

ph¸p sau:

- Dùa vµo ph¶n øng ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HI).

- Dùa vµo ph¶n øng kÕt hîp bæ thÓ (CF).

- Dùa vµo ph¶n øng trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö (PRNT).

- Dùa vµo ph¶n øng Dot blot, ELISA. Ph¶n øng nµy nh»m ph¸t hiÖn

nh÷ng kh¸ng thÓ IgG vµ IgM dùa trªn hai kiÓu ®¸p øng miÔn dÞch cña c¬ thÓ lµ

®¸p øng miÔn dÞch tiªn ph¸t ®èi víi ng−êi ch−a bÞ nhiÔm virus Dengue vµ mét

virus kh¸c trong loµi Flavivirus hay ch−a dïng vaccin Flavivirus, IgM hiÖu gi¸

cao h¬n h¼n IgG hoÆc lµ ®¸p øng miÔn dÞch thø ph¸t ®èi víi ng−êi cã tiÒn sö

nhiÔm virus Dengue hay ®· dïng vaccin. V× vËy ph¶n øng Dot blot, ELISA rÊt

cã ý nghÜa trong viÖc ®¸nh gi¸ nhiÔm trïng hiÖn t¹i cña virus .

B. nghiªn cøu virus corona g©y bÖnh viªm ®−êng h« hÊp cÊp

SARS ë ViÖt Nam

1.1.T×nh h×nh nghiªn cøu trªn thÕ giíi

BÖnh dÞch SARS hay Héi chøng viªm ®−êng h« hÊp cÊp tÝnh nÆng lµ mét bÖnh

dÞch míi xuÊt hiÖn vµ cho ®Õn nay ®−îc x¸c ®Þnh lµ ®· xuÊt hiÖn lÇn ®Çu tiªn t¹i

Qu¶ng §«ng -Trung Quèc vµo th¸ng 11 n¨m 2002 (tr−êng hîp m¾c bÖnh ®Çu

tiªn vµo ngµy 16/11/2002 t¹i thµnh phè Foshan).

TiÕp theo ®ã trong th¸ng 2 vµ 3 n¨m 2003 c¸c ca bÖnh viªm ®−êng h« hÊp cÊp

tÝnh g©y nguy hiÓm ®Õn tÝnh m¹ng nhiÒu ng−êi vµ kh«ng râ nguyªn nh©n ®·

®−îc th«ng b¸o tõ ViÖt Nam, Hång K«ng, Canada... . C¸c tr−êng hîp viªm

®−êng h« hÊp cÊp tÝnh nÆng míi xuÊt hiÖn cã kh¶ n¨ng l©y lan nhanh ®Æc biÖt lµ

cho ng−êi nhµ vµ nh©n viªn y tÕ víi tØ lÖ tö vong cao. Héi chøng nµy sau ®ã

®−îc Tæ chøc Y tÕ ThÕ giíi (TCYTTG) ®Þnh nghÜa lµ Héi chøng viªm ®−êng h«

hÊp cÊp tÝnh nÆng (SARS: Severe Acute Respiratory Syndrome). §Õn ngµy

28/4/2003 trªn thÕ giíi ®· cã 26 n−íc b¸o c¸o cã bÖnh nh©n SARS víi tæng sè

m¾c lµ 5050 ng−êi vµ 321 tr−êng hîp tö vong. Sè bÖnh nh©n m¾c vµ chÕt do

SARS t¨ng lªn hµng ngµy ®· g©y ¶nh h−ëng nghiªm träng tíi ®êi sèng vµ sù

ph¸t triÓn kinh tÕ x· héi cña nhiÒu n−íc, theo −íc tÝnh ban ®Çu dÞch SARS ®·

lµm thiÖt h¹i tíi hµng tr¨m tû USD. Sau khi Héi chøng SARS bïng ph¸t ë Hång

K«ng, ViÖt Nam, Singapore, Trung Quèc, §µi Loan, Canada vµ mét sè n−íc

kh¸c trªn thÕ giíi, Tæ chøc kiÓm so¸t bÖnh tËt Hoa Kú CDC ®· t×m vµ x¸c ®Þnh

c¨n nguyªn g©y bÖnh lµ mét vi rót míi hä corona (nh−ng kh«ng gièng vi rót

corona cæ ®iÓn).

RÊt nhiÒu tr−êng hîp m¾c bÖnh cã thÓ s¾p xÕp trong chuçi m¾t xÝch l©y nhiÔm

tõ 1 B¸c sü ë Qu¶ng §«ng ®· ghÐ qua Hång K«ng, bÞ ph¸t bÖnh t¹i ®©y vµ ®· tö

vong. NhiÒu tr−êng hîp bÖnh sau nµy ë mét sè n−íc cã liªn quan ®Õn bÖnh

nh©n tõ Qu¶ng §«ng vµ mét trong nh÷ng ng−êi ®ã lµ Johnny Chong Chen quèc

tÞch Mü gèc Trung Quèc. Johnny Chen ®Õn ViÖt Nam 23/2/2003 sau Ýt ngµy v×

cã dÊu hiÖu sèt cao, ®au ®Çu vµ viªm ®−êng h« hÊp ®· vµo ®iÒu trÞ t¹i bÖnh viÖn

ViÖt Ph¸p (BVVP) ngµy 26/2/2003. ChÈn ®o¸n l©m sµng ®èi víi Johnny lµ viªm

phæi lan to¶ nhanh (chØ trong 6 giê ®· tæn th−¬ng toµn phæi). BÖnh nh©n suy h«

hÊp nÆng, ph¶i thë m¸y, c¸c triÖu chøng sèt cao kÌm ®au ®Çu, ®au c¬ vµ ho

khan. T×nh tr¹ng toµn th©n suy sôp nhanh, ®e do¹ tÝnh m¹ng. §Õn ngµy

5/3/2003 theo nguyÖn väng cña bÖnh nh©n vµ gia ®×nh, Johnny Chen ®· chuyÓn

sang Hång K«ng vµ tö vong t¹i ®ã vµo ngµy 14/3/2003. Trong vßng 15 ngµy ®·

cã 30 nh©n viªn y tÕ vµ 10 bÖnh nh©n ®ang ®iÒu trÞ t¹i thêi ®iÓm nµy ®· bÞ l©y

bÖnh phæi bëi Johnny, còng víi c¸c triÖu chøng viªm ®−êng h« hÊp cÊp nÆng.

Mét ngµy sau khi Johnny Chen chÕt, y t¸ NguyÔn ThÞ L−îng, ng−êi ch¨m sãc

trùc tiÕp cho Johnny còng tö vong. 17/3/2003, b¸c sÜ ng−êi Ph¸p Dorosier,

ng−êi ®Æt néi khÝ qu¶n cho bÖnh nh©n Johnny Chen, còng ®· tö vong t¹i BVVP

®ång thêi rÊt nhiÒu bÖnh nh©n kh¸c víi c¸c biÓu hiÖn l©m sµng t−¬ng tù còng

trong t×nh tr¹ng nhiÔm bÖnh rÊt nÆng. Liªn tiÕp nh÷ng ngµy sau ®ã thªm 3 ca

bÖnh ®Òu lµ c¸c nh©n viªn y tÕ cña BVVP ®· bÞ l©y nhiÔm vµ kh«ng qua khái.

TÝnh ®Õn ngµy 8/4/2003 ViÖt Nam cã 63 tr−êng hîp m¾c héi chøng SARS, víi

5 tr−êng hîp tö vong ®Òu lµ c¸c nh©n viªn y tÕ cña BVViÖt Ph¸p.

Tr−íc nguy c¬ bïng ph¸t cña bÖnh dÞch SARS , Ban ChØ ®¹o quèc gia phßng

chèng dÞch SARS cña ViÖt nam ®−îc thµnh lËp vµ ®· phèi hîp víi TCYTTG

b−íc ®Çu tiÕn hµnh mét sè nghiªn cøu ®Ó x¸c ®Þnh t¸c nh©n g©y bÖnh, c¸c yÕu tè

cã liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh lan truyÒn dÞch vµ triÓn khai c¸c biÖn ph¸p phßng

chèng. KÕt qu¶ lµ ®Õn ngµy 28/4/2003, ViÖt nam ®· trë thµnh quèc gia ®Çu tiªn

trªn thÕ giíi thµnh c«ng trong khèng chÕ dÞch SARS.

VÒ c¨n nguyªn bÖnh SARS:

Ngay tõ cuèi th¸ng 11/2002 (khi dÞch bÖnh b¾t ®Çu t¹i Qu¶ng §«ng –Trung

Quèc) hµng lo¹t c¸c nghiªn cøu vÒ c¨n nguyªn cña bÖnh l¹ ®· ®−îc tiÕn hµnh

[21]. C¸c nhµ khoa häc Trung Quèc cho r»ng Chlamydia pneumonia lµ thñ

ph¹m g©y ra bÖnh dÞch nµy, tuy nhiªn nh÷ng ®Æc tÝnh sinh häc cña vi sinh vËt

nµy, cïng víi c¸c diÔn biÕn l©m sµng nÆng nÒ cña bÖnh kh«ng ®ñ kh¶ n¨ng

thuyÕt phôc gi¶ thuyÕt trªn lµ ®óng. §Õn gi÷a th¸ng 3 n¨m 2003, dùa trªn

nghiªn cøu vÒ hiÓn vi ®iÖn tö c¸c nhµ khoa häc Hång K«ng t×m ra virus human

pneumonia (hMPV) thuéc hä Paramyxoviridae trong dÞch tiÕt cña bÖnh nh©n

nhiÔm SARS, kÕt qu¶ nµy còng ®−îc sù ®ång t×nh cña c¸c nhµ khoa häc Canada

khi t×m thÊy ARN cña hMPV trong dÞch tiÕt cña bÖnh nh©n th«ng qua ph−¬ng

ph¸p RT-PCR. Gi¶ thuyÕt nµy mét lÇn n÷a l¹i bÞ lo¹i bá khi c¸c nhµ khoa häc

Mü (CDC-Attlanta) ngµy 16 th¸ng 4 n¨m 2003 ®−a ra nh÷ng h×nh ¶nh cô thÓ

cña mét lo¹i virus ph©n lËp ®−îc tõ nh÷ng bÖnh nh©n SARS víi kÝch th−íc tõ

100- 120 nm cã c¸c gai (spike) trªn bÒ mÆt gièng víi 1 loµi virus g©y bÖnh

cho ng−êi ®· tõng biÕt ®ã lµ virus Corona. Tuy nhiªn sù kh¸c biÖt lín nhÊt

gi÷a virus Corona míi nµy so víi c¸c virus Corona cïng lo¹i lµ ®éc lùc m¹nh

g©y chÕt ng−êi vµ kh¶ n¨ng lan truyÒn m¹nh. Virus míi nµy ®−îc gäi lµ SARS-

CoV ( Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona virus) vµ ®−îc

kh¼ng ®Þnh chÝnh lµ nguyªn nh©n g©y ra bÖnh SARS. Tõ ®ã, c¸c ph−¬ng ph¸p

chÈn ®o¸n trong phßng thÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh nghiªn cøu mét c¸ch khÈn

tr−¬ng víi môc ®Ých ®−a ra mét ph−¬ng ph¸p cã kh¶ n¨ng x¸c ®Þnh sím sù

nhiÔm virus SARS ®ång thêi t×m hiÓu ®−îc ®Æc ®iÓm sinh häc cña t¸c nh©n g©y

bÖnh nµy.

Ph−¬ng ph¸p di truyÒn ph©n tö (RT-PCR) ®−îc hÇu hÕt c¸c nhµ khoa häc trªn

thÕ giíi quan t©m do kh¶ n¨ng cho kÕt qu¶ sím víi ®é nh¹y vµ ®Æc hiÖu cao.

HiÖu qu¶ cña ph−¬ng ph¸p nµy phô thuéc rÊt nhiÒu vµo tr×nh tù cña c¸c cÆp måi

. §©y lµ ph−¬ng ph¸p chÝnh ®−îc c¸c phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi còng nh−

t¹i ViÖt Nam ¸p dông ®Ó chÈn ®o¸n sím nhiÔm virus SARS –CoV hiÖn nay.

Ph−¬ng ph¸p Real-time PCR chÈn ®o¸n bÖnh SARS còng ®−îc ¸p dông t¹i mét

sè phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi CDC-Mü , Canada, Trung quèc.... ph−¬ng

ph¸p nµy cã ®é nh¹y cao h¬n tõ 10 ®Õn 20 % so víi c¸c ph−¬ng ph¸p PCR

th«ng th−êng, tuy nhiªn vÒ gi¸ thµnh cña ph−¬ng ph¸p nµy cao h¬n rÊt nhiÒu so

víi ph−¬ng ph¸p RT-PCR truyÒn thèng.

Vµo th¸ng 7 n¨m 2003 c¸c nhµ khoa häc cña c«ng ty ho¸ häc Eiken- vµ

Tr−êng ®¹i häc Nagasaki NhËt b¶n ®· ®−a ra mét ph−¬ng ph¸p míi ®−îc ph¸t

triÓn dùa trªn nguyªn lý vÒ di truyÒn ph©n tö ®ã lµ RT-LAMP (Reverse

Transcriptase Loop Mediated Isothemal Amplification). §é nhanh, nh¹y, ®Æc

hiÖu cña ph−¬ng ph¸p nµy ®−îc ®¸nh gi¸ th«ng qua mét sè l−îng lín mÉu thu

th©p ë c¸c bÖnh nh©n SARS ViÖt Nam. HiÖn t¹i, ph−¬ng ph¸p nµy ®ang ®−îc

ph¸t triÓn ®Ó chÈn ®o¸n nhanh mét sè bÖnh truyÒn nhiÔm do virus kh¸c nh− sèt

xuÊt huyÕt dengue, viªm n·o NhËt b¶n B …

Mét sè lín c¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c ¸p dông ®Ó x¸c ®Þnh sù nhiÔm virus SARS

th«ng qua kh¸ng thÓ kh¸ng ®Æc hiÖu virus SARS-CoV trong huyÕt thanh bÖnh

nh©n còng ®· ®−îc ph¸t triÓn : MiÔn dÞch hÊp phô liªn kÕt men gi¸n tiÕp

(ELISA gi¸n tiÕp), miÔn dÞch huúnh quang (IFA), trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö (

PRNT)...... C¸c ph−¬ng ph¸p nµy ®Òu ®¸p øng yªu cÇu chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh

nhiÔm virus SARS-CoV víi ®é nh¹y, vµ ®Æc hiÖu cao ( >90%) tuy nhiªn hiÖu

qu¶ tèt chØ thÓ hiÖn ë giai ®o¹n håi phôc cña bÖnh hoÆc trong c¸c nghiªn cøu håi

cøu.

Ph©n lËp virus SARS-CoV nh»m hiÓu râ h×nh thÓ, cÊu tróc ph©n tö còng nh− sù

nh©n lªn cña virus trong tÕ bµo chñ còng ®−îc mét sè phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ

giíi ¸p dông, tuy nhiªn ®©y lµ mét virus ®Æc biÖt nguy hiÓm v× vËy yªu cÇu vÒ an

toµn sinh häc ®−îc ®Æt ra hÕt søc nghiªm ngÆt trong ®iÒu kiÖn lµm viÖc ®Æc biÖt

ph¶i ®−îc kiÓm so¸t mét c¸ch chÆt chÏ.

Ph¶n øng cña c¬ thÓ ng−êi khi virus SARS-CoV th©m nhËp g©y nªn mét sè biÓu

hiÖn toµn th©n nh− : Sèt cao, mÖt mái ,ho khan,khã thë… ngoµi ra mét sè triÖu

chøng nhiÔm virus nãi chung còng biÓu hiÖn trªn mét sè chØ sè tÕ bµo vµ sinh

ho¸ trong m¸u ngo¹i vi nh−: tiÓu cÇu gi¶m, b¹ch cÇu gi¶m, c¸c men chuyÓn ho¸

alanine, aspartate t¨ng … . Còng nh− nhiÔm c¸c lo¹i virus nãi chung, ®¸p øng

miÔn dÞch c¬ thÓ th«ng qua 2 hÖ thèng miÔn dÞch dÞch thÓ vµ miÔn dÞch tÕ bµo,

c¸c kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu kh¸ng virus SARS –CoV nh− IgA, IgM vµ IgG còng xuÊt

hiÖn trong m¸u sau khi virus th©m nhËp tõ 5-10 ngµy. Thêi gian tån l−u vµ kh¶

n¨ng b¶o vÖ cña c¸c lo¹i KT nµy còng nh− ¶nh h−ëng cña interferon ®Õn kh¶

n¨ng nh©n l©n cña virus SARS-CoV hiÖn nay vÉn tiÕp tôc ®−îc nghiªn cøu.

H×nh ¶nh cña virus SARS-CoV ®· quan s¸t râ trªn tÕ bµo c¶m nhiÔm Vero –E6

. §ã lµ virus cã h×nh d¹ng gièng c¸c virus thuéc hä Coronaviridae víi ®−êng

kÝnh trung b×nh lµ 78 nm. H¹t virus h×nh trßn nh©n s¸ng mµu mµng nh©n (

nucleocapsid) cã d¹ng xo¾n, gai (Spike) xuÊt hiÖn trªn bÒ mÆt cña h¹t virus. VËt

liÖu di truyÒn cña virus lµ mét sîi RNA d−¬ng, cã chiÒu dµi kho¶ng 27 kb bao

gåm 5 gen m· hãa cho 4 protein cÊu tróc : S (gai),E (vá), M (mµng), N (mµng

nh©n) vµ 1 protein kh«ng cÊu tróc ®ã lµ Polymerase bao gåm rÊt nhiÒu c¸c

enzym chøc n¨ng kh¸c nhau. Thø tù s¾p xÕp cña c¸c gen nh− sau : 5’- Pol-S-E-

M-N-3’. KÝch th−íc ARN cña virus SARS-CoV ng¾n h¬n c¸c virus kh¸c cïng

hä Corona kho¶ng 5kb, sù thiÕu hôt cña mét l−îng nucleotid m· ho¸ cho mét

sè enzym chøc n¨ng trong vËt liÖu di truyÒn cã thÓ lµ nguyªn nh©n lµm cho ®éc

tÝnh cña virus SARS-CoV biÕn ®æi. Protein N cã kÝch th−íc kho¶ng 46 kDa lµ

yÕu tè miÔn dÞch chÝnh, ®−îc sö dông trong nghiªn cøu c¸c ph−¬ng ph¸p chÈn

®o¸n sím b»ng huyÕt thanh häc. Protein S cã kÝch th−íc kho¶ng 139 kDa, b¶n

chÊt lµ mét glycoprotein, sù hiÖn diÖn cña protein nµy trong huyÕt thanh bÖnh

nh©n nhiÒu t¸c gi¶ cho r»ng ®ã lµ kÕt qu¶ cña nh÷ng sù can thiÖp cã tÝnh chÊt

b¶o vÖ cña c¬ thÓ víi virus SASR- CoV.

T¹i ViÖt Nam: ngay tõ tr−êng hîp nhiÔm SARS ®Çu tiªn ®−îc ph¸t hiÖn, víi

chøc n¨ng lµ mét ViÖn ®Çu ngµnh, ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng ®· tiÕn

hµnh hµng lo¹t c¸c nghiªn cøu x¸c ®Þnh c¨n nguyªn cña c¨n bÖnh l¹. Nh÷ng t¸c

nh©n virus, vi khuÈn nghi ngê cã thÓ lµ c¨n nguyªn g©y nªn héi chøng viªm phæi

cÊp nh− : cóm tÝp A (Influ A), cóm tÝp B (Influ B), sëi (Mealse), virus hîp bµo

®−êng h« hÊp (RSV), virus Adeno, virus viªm phæi (hMPV), phÕ cÇu khuÈn,

chlamydia pneumonia… ®Òu ®−îc ®Ò cËp vµ ®· ®−îc lo¹i trõ. Phèi hîp víi Tæ

chøc Y tÕ ThÕ giíi (WHO) vµ c¸c phßng thÝ nghiÖm ë c¸c n−íc kh¸c nh− CDC-

Mü, NIID –NhËt b¶n, ViÖn Jacques Monod –Ph¸p, c¸c nghiªn cøu tiÕp theo ®·

®−îc tiÕn hµnh nh»m t×m hiÓu râ c¨n nguyªn cña bÖnh SARS. Sù nh©n lªn cña

virus SARS- CoV t¹i tÕ bµo niªm m¹c ®−êng h« hÊp trªn ®Æc biÖt lµ niªm m¹c

mòi ®· chØ ra vÞ trÝ lý t−ëng ®Ó thu thËp bÖnh phÈm l©m sµng dïng cho chÈn

®o¸n sím trong phßng thÝ nghiÖm cã hiÖu qu¶. C¸c ph−¬ng ph¸p sö dông ®Ó

nghiªn cøu vÒ virus häc còng ®· ®−îc ¸p dông nh− ph©n lËp virus, di truyÒn

ph©n tö… vµ ®· chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh ®−îc c¸c tr−êng hîp nhiÔm virus SARS t¹i

Ninh b×nh ®Çu th¸ng 4 n¨m 2003. H×nh ¶nh virus SARS-CoV do ViÖn VSDTT¦

ph©n lËp l¹i bÖnh nh©n K (Ninh B×nh) ®· ®−îc c«ng bè, trïng hîp víi h×nh ¶nh

virus SARS-CoV ®ang g©y dÞch trªn thÕ giíi.

Vª l©m sµng vµ bÖnh häc SARS:

C¶ TCYTTG (WHO) vµ Trung t©m kiÓm so¸t vµ phßng chèng bÖnh Hoa Kú

(Center for Disease Control and Prevention) ®Òu ®−a ra ®Þnh nghÜa ca bÖnh cho

c¸c tr−êng hîp nghi ngê, cã kh¶ n¨ng vµ kh¼ng ®Þnh nhiÔm SARS. Tr−êng hîp

nghi ngê lµ nh÷ng bÖnh nh©n sèt cao vµ cã mét hoÆc nhiÒu biÓu hiÖn cña nhiÔm

khuÈn h« hÊp (nh− ho, thë nhanh nÆng hoÆc khã thë) vµ cã tiÒn sö tiÕp xóc trùc

tiÕp víi ng−êi bÖnh ®ã ®−îc chÈn ®o¸n SARS tr−íc ®ã. Tr−êng hîp cã kh¶ n¨ng

nhiÔm SARS lµ nh÷ng bÖnh nh©n cã ®Çy ®ñ tiªu chuÈn nghi ngê nhiÔm SARS,

kÌm theo cã thay ®æi ë phæi trªn h×nh ¶nh X quang. §Þnh nghÜa ca bÖnh SARS

rÊt cã lîi trong c«ng t¸c thèng kª gi¸m s¸t vµ cã thÓ ¸p dông trªn l©m sµng víi

nh÷ng bÖnh nh©n ®Õn muén hoÆc ®−îc chÈn ®o¸n sau khi nhËp viÖn. Tuy nhiªn

nÕu nh÷ng ®Þnh nghÜa nµy ®−îc bæ sung thªm c¸c tiªu chuÈn ®Ó ph¸t hiÖn sím

ng−êi bÖnh ngay trong tuÇn ®Çu hoÆc tr−íc khi ®Õn bÖnh viÖn, th× ®é nh¹y cña

nã chØ cßn ®¹t møc 25%. Së dÜ ®é nh¹y cña tiªu chuÈn ®¹t thÊp lµ do trong ®Þnh

nghÜa nµy, tÊt c¶ c¸c tiªu chuÈn ®Òu ph¶i ®−îc ®¸nh gi¸ ®Çy ®ñ trong khi ®ã c¸c

biÓu hiÖn h« hÊp th−êng l¹i xuÊt hiÖn tõ tuÇn thø 2 trë ®i, vµ nhiÒu bÖnh nh©n

mÆc dï c¶m thÊy sèt nh−ng khi cÆp nhiÖt ®é l¹i kh«ng ®¹t møc 38 oC.

Tiªu chuÈn xÐt nghiÖm ®Ó chÈn ®o¸n SARS cã thÓ ®−îc dïng ®Ó kh¼ng ®Þnh ca

bÖnh, x¸c nhËn c¸c tr−êng hîp huyÕt thanh ©m tÝnh hoÆc kh«ng x¸c ®Þnh. SARS

cã thÓ ®−îc kh¼ng ®Þnh hoÆc b»ng ph¶n øng chuçi men PCR d−¬ng tÝnh víi

virus g©y SARS, hoÆc chuyÓn ®¶o huyÕt thanh trªn ph¶n øng ELISA, hoÆc ph©n

lËp virus. C¸c tr−êng hîp ©m tÝnh vÒ mÆt huyÕt thanh häc ®−îc ®Þnh nghÜa lµ c¸c

tr−êng hîp kh«ng cã kh¸ng thÓ kh¸ng SARS-CoV trong huyÕt thanh sau 21

ngµy kÓ tõ khi cã biÓu hiÖn l©m sµng. §Þnh nghÜa huyÕt thanh kh«ng x¸c ®Þnh

®−îc ¸p dông cho c¸c bÖnh nh©n kh«ng cã hoÆc cã kÕt qu¶ huyÕt thanh kh«ng

hoµn chØnh.

BiÓu hiÖn l©m sµng:

BiÓu hiÖn l©m sµng cña SARS rÊt ®a d¹ng. SARS ®iÓn h×nh ®Æc tr−ng th−êng

b¾t ®Çu b»ng c¸c biÓu hiÖn gièng cóm, gåm sèt (94 - 100%), rÐt run (43 - 56%),

mÖt mái (43 - 56%), ®au c¬ (51 - 68%), ra må h«i vµo ban ®ªm (28%) vµ ch¸n

¨n (10 - 54%). Trong 2 ®ît bÖnh lín ë Hång K«ng, biÓu hiÖn l©m sµng cña

bÖnh nh©n lµ rÊt kh¸c nhau cho thÊy SARS cã thÓ ®−îc l©y lan qua ®−êng h«

hÊp, hoÆc ®−êng ph©n - miÖng. Sau ®ã vµi ngµy, c¸c biÓu hiÖn ®−êng h« hÊp

hoÆc ®−êng d¹ dµy - ruét th−êng tiÕn triÓn ngµy cµng rÇm ré (cã thÓ tuú theo

con ®−êng l©y bÖnh), nh− ho khan (29 - 62%), ®êm (28%), ch¶y mòi (24%),

®au häng (20 - 23%), thë nhanh nÆng (4 - 30%), buån n«n (22%) vµ n«n

(14%), ®au bông (13%) vµ Øa ch¶y (1 - 70%). §au ®Çu (15 - 50%) vµ chãng mÆt

(3 - 30%) còng th−êng x¶y ra. MÆc dï viªm phæi th−êng tiÕn triÓn ë hÇu hÕt

bÖnh nh©n SARS nh−ng chØ cã d−íi 1% cã biÓu hiÖn ®au ngùc. Theo mét sè t¸c

gi¶, Øa ch¶y gÆp ë phÇn lín bÖnh nh©n vµo viÖn (73%), nh−ng cho tíi nay ng−êi

ta vÉn ch−a râ ®©y lµ hËu qu¶ cña nhiÔm virus, hay do thuèc chèng virus vµ c¸c

liÖu ph¸p ®iÒu hoµ miÔn dÞch.

Th¨m kh¸m l©m sµng cho thÊy, chØ rÊt Ýt bÖnh nh©n SARS cã triÖu chøng râ rÖt.

TiÕng ran phÕ qu¶n gÆp ë 38% ®Õn gÇn 100% bÖnh nh©n vµo viÖn nh−ng mÆc

dï ®· ®−îc kiÓm tra sím, nh−ng chØ rÊt Ýt bÖnh nh©n cã viªm phæi khi vµo viÖn

cã biÓu hiÖn nµy. Kh«ng thÊy cã biÓu hiÖn ®au häng, h¹ch to, næi ban trªn da.

V× thÕ cã thÓ nãi c¸c biÓu hiÖn sím cña SARS lµ kh«ng ®Æc tr−ng.

VÒ tiÕn triÓn cña bÖnh trªn l©m sµng, cã thÓ chia SARS thµnh 3 giai ®o¹n Giai

®o¹n ®Çu lµ giai ®o¹n virus nh©n lªn, t−¬ng øng víi c¸c biÓu hiÖn ban ®Çu cña

bÖnh (sèt, ®au c¬ trong kho¶n vµi ngµy vµ th−êng sau ®ã sÏ gi¶m xuèng). Giai

®o¹n hai th−êng b¾t ®Çu tõ ngµy thø 8 cña bÖnh, th−êng liªn quan tíi c¸c tæn

th−¬ng phæi theo c¬ chÕ miÔn dÞch qua trung gian dÞch thÓ. Trong giai ®o¹n nµy

bÖnh nh©n cã thÓ cã sèt tõng ®ît vµ tæn th−¬ng phæi tiÕn triÓn nhiÒu kÝch th−íc,

nhiÒu æ xuÊt ph¸t tõ mét æ ban ®Çu. PhÇn lín c¸c tr−êng hîp ®Òu tiÐn triÓn tèt

lªn sau khi dïng steroid vµ b−íc vµo giai ®o¹n håi phôc (giai ®o¹n 3). Sau

kho¶ng 8 - 9 ngµy kÓ tõ khi b¾t ®Çu cã triÖu chøng, ph©n ¸p oxy trong m¸u

®éng m¹ch gi¶m xuèng d−íi 90% ë nhiÖt ®é phßng ë 45% sè bÖnh nh©n. Trong

giai ®o¹n 3, kho¶ng 20% bÖnh nh©n sÏ cã tæn th−¬ng phæi nÆng víi biÓu hiÖn

cña héi chøng suy h« hÊp cÊp (ARDS - acute respiratory distress syndrome) vµ

cÇn can thiÖp h« hÊp hç trî.

Còng gièng nh− c¸c bÖnh nhiÔm virus kh¸c, c¸c bÖnh nh©n SARS cã thÓ tù tËp

hîp l¹i thµnh mét quÇn thÓ riªng. Còng cã thÓ c¸c bÖnh nh©n nµy bÞ nhiÔm trïng

bÖnh viÖn vµ viªm phæi. V× thÕ kÕt qu¶ xÐt nghiÖm t×m vi khuÈn d−¬ng tÝnh

kh«ng lo¹i trõ ®−îc SARS.

Ngay tõ khi dÞch bÖnh b¾t ®Çu t¹i Qu¶ng §«ng –Trung Quèc (th¸ng 11 n¨m

2002) hµng lo¹t c¸c nghiªn cøu vÒ c¨n nguyªn cña bÖnh l¹ ®· ®−îc tiÕn hµnh.

C¸c nhµ khoa häc Trung Quèc cho r»ng Chlamydia pneumonia lµ thñ ph¹m

g©y ra bÖnh dÞch nµy, tuy nhiªn nh÷ng ®Æc tÝnh sinh häc cña vi sinh vËt nµy

,cïng víi c¸c diÔn biÕn l©m sµng nÆng nÒ cña bÖnh kh«ng ®ñ kh¶ n¨ng thuyÕt

phôc gi¶ thuyÕt trªn lµ ®óng. §Õn gi÷a th¸ng 3 n¨m 2003, dùa trªn nghiªn cøu

vÒ hiÓn vi ®iÖn tö c¸c nhµ khoa häc Hongkong t×m ra virus human pneumonia

(hMPV) thuéc hä Paramyxoviridae trong dÞch tiÕt cña bÖnh nh©n nhiÔm SARS,

kÕt qu¶ nµy còng ®−îc sù ®ång t×nh cña c¸c nhµ khoa häc Canada khi t×m thÊy

ARN cña hMPV trong dÞch tiÕt cña bÖnh nh©n th«ng qua ph−¬ng ph¸p RT-PCR.

Gi¶ thuyÕt nµy mét lÇn n÷a l¹i bÞ lo¹i bá khi c¸c nhµ khoa häc Mü (CDC-

Attlanta) ngµy 16 th¸ng 4 n¨m 2003 ®−a ra nh÷ng h×nh ¶nh cô thÓ cña mét lo¹i

virus ph©n lËp ®−îc tõ nh÷ng bÖnh nh©n SARS víi kÝch th−íc tõ 100- 120 nm

cã c¸c gai (spike) trªn bÒ mÆt gièng víi 1 loµi virus g©y bÖnh cho ng−êi ®·

tõng biÕt ®ã lµ virus Corona. Tuy nhiªn sù kh¸c biÖt lín nhÊt gi÷a virus

Corona míi nµy so víi c¸c virus Corona cïng lo¹i lµ ®éc lùc m¹nh g©y chÕt

ng−êi vµ kh¶ n¨ng lan truyÒn m¹nh. Virus míi nµy ®−îc gäi lµ SARS-CoV

(Severe Acute Respiratory Syndrome associated Corona virus) vµ ®−îc kh¼ng

®Þnh chÝnh lµ nguyªn nh©n g©y ra bÖnh SARS [43].

C¸c ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n trong phßng thÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh nghiªn cøu

mét c¸ch khÈn tr−¬ng víi môc ®Ých ®−a ra mét ph−¬ng ph¸p cã kh¶ n¨ng x¸c

®Þnh sím sù nhiÔm virus SARS ®ång thêi t×m hiÓu ®−îc ®Æc ®iÓm sinh häc cña

t¸c nh©n g©y bÖnh nµy.

Ph−¬ng ph¸p di truyÒn ph©n tö (RT-PCR) ®−îc hÇu hÕt c¸c nhµ khoa häc trªn

thÕ giíi quan t©m do kh¶ n¨ng cho kÕt qu¶ sím víi ®é nh¹y vµ ®Æc hiÖu cao

HiÖu qu¶ cña ph−¬ng ph¸p nµy phô thuéc rÊt nhiÒu vµo tr×nh tù cña c¸c cÆp

måi. §©y lµ ph−¬ng ph¸p chÝnh ®−îc c¸c phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi còng

nh− t¹i ViÖt Nam ¸p dông ®Ó chÈn ®o¸n sím nhiÔm virus SARS –CoV hiÖn nay.

Ph−¬ng ph¸p Real-time PCR chÈn ®o¸n bÖnh SARS còng ®−îc ¸p dông t¹i mét

sè phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi CDC-Mü, Canada, Trung quèc.... Ph−¬ng ph¸p

nµy cã ®é nh¹y cao h¬n tõ 10 ®Õn 20 % so víi c¸c ph−¬ng ph¸p PCR th«ng

th−êng, tuy nhiªn vÒ gi¸ thµnh cña ph−¬ng ph¸p nµy cao h¬n rÊt nhiÒu so víi

ph−¬ng ph¸p RT-PCR [41] truyÒn thèng.

Vµo th¸ng 7 n¨m 2003 c¸c nhµ khoa häc cña c«ng ty ho¸ häc Eiken- vµ tr−êng

§¹i häc Nagasaki NhËt b¶n ®· ®−a ra mét ph−¬ng ph¸p míi ®−îc ph¸t triÓn dùa

trªn nguyªn lý vÒ di truyÒn ph©n tö ®ã lµ RT-LAMP ( Reverse Transcriptase

Loop Mediated Isothemal Amplification). §é nhanh, nh¹y, ®Æc hiÖu cña ph−¬ng

ph¸p nµy ®−îc ®¸nh gi¸ th«ng qua mét sè l−îng lín mÉu thu th©p ë c¸c bÖnh

nh©n SARS ViÖt Nam. HiÖn t¹i, ph−¬ng ph¸p nµy ®ang ®−îc ph¸t triÓn ®Ó chÈn

®o¸n nhanh mét sè bÖnh truyÒn nhiÔm do virus kh¸c nh− sèt xuÊt huyÕt

dengue, viªm n·o NhËt b¶n B …

Ph©n lËp virus SARS-CoV nh»m hiÓu râ h×nh thÓ, cÊu tróc ph©n tö còng nh− sù

nh©n lªn cña virus trong tÕ bµo chñ còng ®−îc mét sè phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ

giíi ¸p dông, tuy nhiªn ®©y lµ mét virus ®Æc biÖt nguy hiÓm v× vËy yªu cÇu vÒ an

toµn sinh häc ®−îc ®Æt ra hÕt søc nghiªm ngÆt trong ®iÒu kiÖn lµm viÖc ®Æc biÖt

ph¶i ®−îc kiÓm so¸t mét c¸ch chÆt chÏ.

Ph¶n øng cña c¬ thÓ ng−êi khi virus SARS-CoV th©m nhËp g©y nªn mét sè biÓu

hiÖn toµn th©n nh− : Sèt cao, mÖt mái ,ho khan,khã thë… ngoµi ra mét sè triÖu

chøng nhiÔm virus nãi chung còng biÓu hiÖn trªn mét sè chØ sè tÕ bµo vµ sinh

ho¸ trong m¸u ngo¹i vi nh−: tiÓu cÇu gi¶m, b¹ch cÇu gi¶m, c¸c men chuyÓn ho¸

alanine, aspartate t¨ng …. Còng nh− nhiÔm c¸c lo¹i virus nãi chung, ®¸p øng

miÔn dÞch c¬ thÓ th«ng qua 2 hÖ thèng miÔn dÞch dÞch thÓ vµ miÔn dÞch tÕ bµo,

c¸c kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu kh¸ng virus SARS –CoV nh− IgA, IgM vµ IgG còng xuÊt

hiÖn trong m¸u sau khi virus th©m nhËp tõ 5-10 ngµy. Thêi gian tån l−u vµ kh¶

n¨ng b¶o vÖ cña c¸c lo¹i KT nµy còng nh− ¶nh h−ëng cña interferon ®Õn kh¶

n¨ng nh©n l©n cña virus SARS-CoV hiÖn nay vÉn tiÕp tôc ®−îc nghiªn cøu.

Tuy nhiªn mét sè lín c¸c ph−¬ng ph¸p kh¸c ¸p dông ®Ó x¸c ®Þnh sù nhiÔm

virus SARS th«ng qua kh¸ng thÓ kh¸ng ®Æc hiÖu virus SARS-CoV trong huyÕt

thanh bÖnh nh©n còng ®· ®−îc ph¸t triÓn : MiÔn dÞch hÊp phô liªn kÕt men gi¸n

tiÕp (ELISA gi¸n tiÕp), miÔn dÞch huúnh quang (IFA), trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i

tö ( PRNT)...... C¸c ph−¬ng ph¸p nµy ®Òu ®¸p øng yªu cÇu chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh

nhiÔm virus SARS-CoV víi ®é nh¹y, vµ ®Æc hiÖu cao (>90%) ®Æc biÖt c¸c

ph−¬ng ph¸p huyÕt thanh häc cã ®é an toµn sinh häc cao do sö dông kh¸ng

nguyªn SARS –CoV bÊt ho¹t hoÆc kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp , v× vËy toµn bé thö

nghiÖm cã thÓ thùc hiÖn trong ®iÓu kiÖn an toµn sinh häc cÊp 2 vµ cã thÓ ¸p

dông réng r·i taÞ c¸c phßng thÝ nghiÖm tuyÕn tØnh [44].

C¸c thay ®æi sinh ho¸ - huyÕt häc:

C¸c biÓu hiÖn th−êng gÆp vÒ huyÕt häc bao gåm gi¶m sè l−îng b¹ch cÇu ®a

nh©n trung tÝnh (82% bÖnh nh©n) vµ lympho (68% tíi 98%, trong ®ã gi¶m nÆng

lµ 75%), gi¶m b¹ch cÇu (26%), kÐo dµi thêi gian ®«ng m¸u do thromboplastin

(63%) vµ ®«ng m¸u néi qu¶n r¶i r¸c (2,5%). Gi¶m sè l−îng tiÓu cÇu (37% ®Õn

55%) th−êng x¶y ra sím vµ sau ®ã lµ hiÖn t−îng vì tiÓu cÇu hµng lo¹t (49%).

BÖnh nh©n th−êng kh«ng cã biÓu hiÖn thiÕu m¸u, nh−ng nång ®é hemoglobin

cã thÓ gi¶m xuèng d−íi 20 g/L nÕu bÖnh tiÕp tôc tiÕn triÓn. L−îng hemoglobin

gi¶m nhiÒu kh¶ n¨ng lµ do kÕt qu¶ cña c¸c thuèc kh¸ng virus. VÒ sinh ho¸, cã

hiÖn t−îng t¨ng nång ®é c¸c enzym lactat dehydrogenase, alanine

aminotransferase (29%), aspartate aminotransferase (32% ®Õn 34%) vµ

creatinine kinase (26 ®Õn 36%). MÆc dï gi¶m tiÓu cÇu lµ biÓu hiÖn th−êng thÊy

trong SARS, nh−ng cã tíi 50% sè tr−êng hîp cã biÓu hiÖn gi¶m tiÓu cÇu (mét

sè tr−êng hîp gi¶m xuèng cßn 0,2 x 109/L) l¹i kh«ng cã biÓu hiÖn viªm phæi vµ

kh«ng cã tiÕn triÓn vÒ huyÕt thanh häc.

H×nh ¶nh cña virus SARS-CoV ®· quan s¸t râ trªn tÕ bµo c¶m nhiÔm Vero –E6

. §ã lµ virus cã h×nh d¹ng gièng c¸c virus thuéc hä Coronaviridae víi ®−êng

kÝnh trung b×nh lµ 78 nm. H¹t virus h×nh trßn nh©n s¸ng mµu mµng nh©n

(nucleocapsid) cã d¹ng xo¾n, gai (Spike) xuÊt hiÖn trªn bÒ mÆt cña h¹t virus.

VËt liÖu di truyÒn cña virus lµ mét sîi RNA d−¬ng, cã chiÒu dµi kho¶ng 27 kb

bao gåm 5 gen m· hãa cho 4 protein cÊu tróc : S (gai),E (vá), M ( mµng), N (

mµng nh©n) vµ 1 protein kh«ng cÊu tróc ®ã lµ Polymerase bao gåm rÊt nhiÒu

c¸c enzym chøc n¨ng kh¸c nhau. Thø tù s¾p xÕp cña c¸c gen nh− sau : 5’- Pol-

S-E-M-N-3’. KÝch th−íc ARN cña virus SARS-CoV ng¾n h¬n c¸c virus kh¸c

cïng hä Corona kho¶ng 5kb, sù thiÕu hôt cña mét l−îng nucleotid m· ho¸ cho

mét sè enzym chøc n¨ng trong vËt liÖu di truyÒn cã thÓ lµ nguyªn nh©n lµm

cho ®éc tÝnh cña virus SARS-CoV

biÕn ®æi. Protein N cã kÝch th−íc

kho¶ng 46 kDa lµ yÕu tè miÔn dÞch

chÝnh, ®−îc sö dông trong nghiªn cøu

c¸c ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n sím b»ng

huyÕt thanh häc. Protein S cã kÝch

th−íc kho¶ng 139 kDa, b¶n chÊt lµ

mét glycoprotein, sù hiÖn diÖn cña

protein nµy trong huyÕt thanh bÖnh

nh©n nhiÒu t¸c gi¶ cho r»ng ®ã lµ kÕt

qu¶ cña nh÷ng sù can thiÖp cã tÝnh

chÊt b¶o vÖ cña c¬ thÓ víi virus

SASR- CoV.

BiÓu hiÖn trªn X quang phæi:

BiÓu hiÖn th−êng gÆp nhÊt trªn phim X quang phæi cña bÖnh nh©n SARS lµ c¸c

®¸m mê ®ång nhÊt trong nhu m« phæi (h×nh 1), t−¬ng tù nh− h×nh ¶nh viªm phÕ

qu¶n - phæi do c¸c c¨n nguyªn kh¸c. Tæn th−¬ng phæi xuÊt hiÖn sím nhÊt vµo

kho¶ng ngµy thø 2 - 3 cña bÖnh gÆp ë kho¶ng 71% bÖnh nh©n, vµ lan réng ra

hÕt mét phÕ tr−êng ë 50% bÖnh nh©n. H×nh th¸i tæn th−¬ng cã thÓ lµ mét æ,

nhiÒu æ (h×nh 2) hoÆc lan to¶. Trµn dÞch mµng phæi th−êng Ýt gÆp.

H×nh 1 – Tæn th−¬ng 1 æ, d¹ng ®¸m mê ®ång nhÊt ë thuú d−íi phæi tr¸i

(Nguån: Courtesy of Department of Diagnostic Radiologic and Organ Imaging,

Chinese University of Hong Kong)

H×nh 2 - Tæn th−¬ng nhiÒu æ ë nöa d−íi

2 phæi

(Nguån: Courtesy of Department of

Diagnostic Radiologic and Organ

Imaging, Chinese University of Hong

Kong)

Mét sè bÖnh nh©n l¹i kh«ng cã biÓu hiÖn tæn th−¬ng trªn X quang th«ng th−êng

nh−ng l¹i cã nh÷ng tæn th−¬ng ë vïng c¹nh tim vµ c¬ hoµnh trªn phim chôp c¾t

líp vi tÝnh. C¸c tæn th−¬ng nµy th−êng cã d¹ng khèi trßn ®iÓn h×nh cña viªm

tiÓu phÕ qu¶n (h×nh 3 - 4).

H×nh 3 – Kh«ng thÊy h×nh ¶nh tæn H×nh 4 - H×nh ¶nh tæn th−¬ng d¹ng nèt

th−¬ng trªn phim X quang th«ng th−êng trßn trªn phim CT-scan

(Nguån: Courtesy of Department of Diagnostic Radiologic and Organ Imaging,

Chinese University of Hong Kong)

Vµo kho¶ng ngµy thø 7 - 10 cña bÖnh, c¸c tæn th−¬ng míi xuÊt hiÖn hoÆc c¸c

tæn th−¬ng cò sÏ nÆng h¬n ë kho¶ng 80% bÖnh nh©n. C¸c tæn th−¬ng nµy sau ®ã

sÏ håi phôc ë kho¶ng 60% bÖnh nh©n vµ kh«ng thay ®æi ë kho¶ng 20% bÖnh

nh©n. Cã tíi 20% c¸c tr−êng hîp tæn th−¬ng nÆng lªn, cÇn ph¶i ®−îc ®iÒu trÞ

tÝch cùc b»ng h« hÊp hç trî.

§iÒu trÞ:

C¸c thuèc kh¸ng virus nh− Oseltamivir (cã t¸c dông ®iÒu hoµ miÔn dÞch) ®·

®−îc dïng nh”m lµm gi¶m l−îng virus vµ phßng ngõa c¸c biÕn chøng h« hÊp.

Ng−êi ta còng ®· thö dïng steroid víi c¶ liÒu cao vµ thÊp cho nhiÒu ®èi t−îng

bÖnh nh©n SARS (cã chøc n¨ng h« hÊp b×nh th−êng, hoÆc rèi lo¹n). Tuy nhiªn

do ch−a cã c¸c thö nghiÖm l©m sµng ngÉu nhiªn, nªn c¸c kÕt qu¶ nghiªn cøu

ch−a cho phÐp ®¸nh gi¸ hiÖu qu¶ cña c¸c thuèc trªn trong viÖc dù phßng hoÆc

lµm gi¶m møc ®é suy h« hÊp hoÆc viªm phÕ qu¶n - phæi t¾c nghÏn. ë nh÷ng

bÖnh nh©n cã biÓu hiÖn thiÕu oxy trong m¸u nªn tiÕn hµnh h« hÊp hç trî kh«ng

x©m nhËp hoÆc thë m¸y.

Ca(cid:31)c thuèc nho(cid:31)m (cid:31)(cid:31)c chê(cid:31) neuraminidase nh− Ribavirin, Oseltamivir

(Tamiflu) co(cid:31) kha(cid:31) n¨ng chô(cid:31)ng la(cid:31)i SARS. V(cid:31)(cid:31)i liÒu ®iÒu tri(cid:31) 5 nga(cid:31)y, thuèc

co(cid:31) kha(cid:31) n¨ng ng¨n ng(cid:31)(cid:31)a bÖnh ho(cid:31)(cid:31)c la(cid:31)m gia(cid:31)m nhe(cid:31) triÖu ch(cid:31)(cid:31)ng khi

nhiÔm bÖnh. Ca(cid:31)c nghiªn c(cid:31)(cid:31)u ta(cid:31)i Hoa Ky(cid:31) kh(cid:31)(cid:31)ng ®i(cid:31)nh SARS-CoV kh«ng

nha(cid:31)y ca(cid:31)m v(cid:31)(cid:31)i Ribavirin va(cid:31) vi(cid:31) thê(cid:31), thuèc kh«ng co(cid:31) ta(cid:31)c du(cid:31)ng d(cid:31)(cid:31)

pho(cid:31)ng hay ®iÒu tri(cid:31) SARS.

Ca(cid:31)c glucocorticoid ®−(cid:31)(cid:31)c chi(cid:31) ®i(cid:31)nh cho nh(cid:31)(cid:31)ng bÖnh nh©n sô(cid:31)t ke(cid:31)o da(cid:31)i

trªn 3 nga(cid:31)y ho(cid:31)(cid:31)c co(cid:31) tiÕn triÓn bÖnh ly(cid:31) trªn X quang phæi. Thuèc co(cid:31) ta(cid:31)c

du(cid:31)ng c¶i thiÖn tæn th−¬ng trªn phim X quang phæi sau khi s(cid:31)(cid:31) du(cid:31)ng. Thuèc

®−(cid:31)(cid:31)c l(cid:31)(cid:31)a cho(cid:31)n ha(cid:31)ng ®Çu la(cid:31) Methylprednisolone v(cid:31)(cid:31)i liÒu 80 -

240mg/nga(cid:31)y (cid:31)(cid:31) nh(cid:31)(cid:31)ng bÖnh nh©n nhe(cid:31), ho(cid:31)(cid:31)c 500 mg/nga(cid:31)y (cid:31)(cid:31) nh(cid:31)(cid:31)ng

bÖnh nh©n n(cid:31)(cid:31)ng. (cid:31)(cid:31) nh(cid:31)(cid:31)ng bê(cid:31)nh nh©n sèt n(cid:31)(cid:31)ng, co(cid:31) thÓ cho

Methylprednisolon t(cid:31)(cid:31)i 1g/nga(cid:31)y trong 2 - 3 nga(cid:31)y. Tuy nhiªn, Dexamethasone

la(cid:31)i chi(cid:31) co(cid:31) ta(cid:31)c du(cid:31)ng rÊt i(cid:31)t v(cid:31)(cid:31)i SARS.

Th«ng khi(cid:31) nh©n ta(cid:31)o:

Ca(cid:31)c ph−¬ng pha(cid:31)p th«ng khi(cid:31) nh©n ta(cid:31)o CPAP/BiPAP ®−(cid:31)(cid:31)c s(cid:31)(cid:31) du(cid:31)ng cho

nh(cid:31)(cid:31)ng bÖnh nh©n cã SaO2 d−íi 93% sau khi ®· cho thë oxy víi nång ®é 3 - 5 L/phót, cã c¬n ngõng thë, nhÞp thë trªn 30 lÇn/phót hoÆc tæn th−¬ng tiÕn triÓn

liªn tôc trªn X quang. ¸p lùc d−¬ng thë vµo (IPAP - inspiration positive airway

pressure) nªn ®Æt ë møc 6 - 10cm H2O. Cã thÓ ®Æt néi khÝ qu¶n cho bÖnh nh©n nÕu c¸c triÖu chøng l©m sµng kh«ng c¶i thiÖn sau khi cho thë CPAP/BiPAP, rèi

lo¹n nhÞp thë nghiªm träng lµm bÖnh nh©n kh«ng thÓ thë b»ng CPAP/BiPAP,

hoÆc t×nh tr¹ng bÖnh nh©n xÊu ®i mét c¸ch nhanh chãng. ¸p lùc d−¬ng cuèi kú

thë ra (PEEP - positive end expiratory pressure) ë møc 10 - 15cm H2O cã thÓ ng¨n ngõa ®−îc t×nh tr¹ng ph× ®¹i phÕ nang vµ t¨ng c−êng cung cÊp oxy cho

bÖnh nh©n.

BiÕn chøng:

Ng¨n chÆn t×nh tr¹ng nhiÔm trïng thø ph¸t ®ãng mét vai trß rÊt quan träng, ®Æc

biÖt ë bÖnh nh©n cã t¨ng sè l−îng b¹ch cÇu vµ b¹ch cÇu ®a nh©n. C¸c vi khuÈn

cã thÓ g©y nhiÔm trïng thø ph¸t lµ tô cÇu vµng kh¸ng Methicillin (MRSA -

methicillin resistant Staphylococcus aureus), P. aeruginosa vµ Chlamydia.

C¸c biÖn ph¸p kh¸c:

Immunoglobulin ®−êng tÜnh m¹ch (IVIG - intravenous immunoglobulin) víi

liÒu 5 mg/kg/ngµy x 3 ngµy cã thÓ gióp bÖnh nh©n ng¨n ngõa t¸c ®éng cña vi

khuÈn vµ c¸c ®éc tè. C¸c nghiªn cøu gÇn ®©y cho thÊy mét sè thuèc §«ng y

cña Trung Quèc cã thÓ cã Ých trong viÖc lµm gi¶m c¸c triÖu chøng chung trong

giai ®o¹n cÊp tÝnh.

Qu¶n lý bÖnh nh©n SARS:

Cho tíi khi chÈn ®o¸n ®−îc kh¼ng ®Þnh, tÊt c¶ c¸c tr−êng hîp nghi ngê SARS

®Òu ph¶i ®−îc qu¶n lý chÆt chÏ, c¸ch ly khái c¸c bÖnh nh©n kh¸c. Ngay c¶ khi

chÈn ®o¸n SARS ®−îc lo¹i trõ, c¸c bÖnh nh©n nµy vÉn cÇn ®−îc theo dâi riªng

v× trong qu¸ tr×nh n»m viÖn chung, nh÷ng bÖnh nh©n SARS cã thÓ ®· truyÒn

virus cho hä. HiÖn nay, ch−a cã v¾c-xin cho SARS vµ c¸c thuèc kh¸ng virus dù

phßng còng kh«ng cã hiÖu qu¶. Tuy nhiªn, c¸c nghiªn cøu trªn ®éng vËt cho

thÊy trong t−¬ng lai gÇn cã thÓ sÏ cã v¾c-xin phßng SARS. C¸c biÖn ph¸p

phßng ngõa hiÖn thêi bao gåm vÖ sinh c¸ nh©n, c¸ch ly vµ tr¸nh tô tËp ®«ng

ng−êi.

C¸c khuyÕn c¸o hiÖn thêi ®Òu dùa trªn nh÷ng kinh nghiÖm l©m sµng vÒ qu¶n lý

vµ ®iÒu trÞ bÖnh nh©n viªm phæi do vi khuÈn vµ virus m¾c ph¶i t¹i céng ®ång, vµ

kinh nghiÖm ®iÒu trÞ c¸c bÖnh nh©n suy h« hÊp cÊp vµ viªm phÕ qu¶n t¾c nghÏn

kÌm theo viªm phæi. Nh÷ng tr−êng hîp cã kh¶ n¨ng SARS, theo ®Þnh nghÜa ca

bÖnh, nh−ng kh«ng cã biÓu hiÖn viªm phæi sÏ cã Ýt nguy c¬ suy h« hÊp vµ tö

vong. Nh÷ng bÖnh nh©n nµy cÇn ®−îc theo dâi y tÕ, gi÷ g×n vÖ sinh c¸ nh©n,

®iÒu trÞ triÖu chøng vµ c¸ch ly khái céng ®ång. Còng ®· cã nh÷ng c«ng bè vÒ

mét vµi dÊu hiÖu cã tÝnh chÊt tiªn l−îng bÖnh nh©n, nh−ng nh÷ng dÊu hiÖu nµy

chØ ¸p dông ®−îc cho quÇn thÓ nghiªn cøu, ch−a ®ñ tin cËy ®Ó ¸p dông cho c¸c

quÇn thÓ kh¸c.

C¸c tr−êng hîp cã kh¶ n¨ng m¾c SARS cÇn ®−îc theo dâi hµng ngµy b»ng c¸c

xÐt nghiÖm th−êng qui, ®iÒu trÞ triÖu chøng vµ c¸ch ly. Do chÈn ®o¸n ch−a ®−îc

kh¼ng ®Þnh, bÖnh nh©n kh”ng nªn ®iÒu trÞ trong c¸c khoa th”ng th−êng. C¸c

biÓu hiÖn h« hÊp cña bÖnh nh©n SARS diÔn biÕn rÊt nhanh, th−êng chØ trong 24

®Õn 48 giê, nªn nh÷ng bÖnh nh©n kh«ng cã biÓu hiÖn viªm phæi trªn X quang

vÉn cÇn ph¶i gi¸m s¸t vµ c¸ch ly chÆt chÏ, cho dï t¹i bÖnh viÖn (nÕu cã phßng

c¸ch ly riªng) hay t¹i nhµ tuú theo chÝnh s¸ch cña tõng ®Þa ph−¬ng.

C¸c nghiªn cøu cho thÊy, nÕu chØ dùa vµo tiÒn sö tiÕp xóc, c¸c tiªu chuÈn l©m

sµng vµ sèt th× ®é nh¹y ®Ó ph¸t hiÖn SARS ®¹t ®−îc ngay t¹i tuyÕn c¬ së chØ lµ

80%. Tuy nhiªn, nÕu bæ xung thªm tiªu chuÈn X quang phæi hµng ngµy (th«ng

th−êng hoÆc c¾t líp vi tÝnh) th× ®é nh¹y cã thÓ ®¹t tíi 100% vµ gi¸ trÞ dù ®o¸n

d−¬ng tÝnh tíi 60%. V× thÕ, c¸c bÖnh nh©n nghi nhiÔm SARS cÇn ®−îc theo dâi

X quang phæi ®Þnh kú (hµng ngµy hoÆc sau mçi 48h) cho tíi khi mÊt c¸c triÖu

chøng l©m sµng. NÕu c¸c triÖu chøng vÉn tån t¹i vµ cã tiÒn sö tiÕp xóc râ rµng

víi bÖnh nh©n SARS, nªn cho ng−êi bÖnh nghi ngê ®i chôp CT-scan ..

Tr−íc nguy c¬ bïng ph¸t cña bÖnh dÞch SARS , Ban ChØ ®¹o quèc gia phßng

chèng dÞch SARS cña ViÖt nam ®−îc thµnh lËp vµ ®· phèi hîp víi TCYTTG

b−íc ®Çu tiÕn hµnh mét sè nghiªn cøu ®Ó x¸c ®Þnh t¸c nh©n g©y bÖnh, c¸c yÕu

tè cã liªn quan ®Õn qu¸ tr×nh lan truyÒn dÞch vµ triÓn khai c¸c biÖn ph¸p phßng

chèng. KÕt qu¶ lµ ®Õn ngµy 28/4/2003, ViÖt nam ®· trë thµnh quèc gia ®Çu tiªn

trªn thÕ giíi thµnh c«ng trong khèng chÕ dÞch SARS. Tuy nhiªn do tÝnh chÊt

nguy hiÓm cña lo¹i bÖnh dÞch míi nµy còng nh− nh÷ng hiÓu biÕt s©u h¬n vÒ c¨n

nguyªn g©y bÖnh hiÖn nay cßn ®ang ®−îc tiÕp tôc nghiªn cøu, kh¶ n¨ng t¹o ra

mét v¨c xin phßng bÖnh SARS cßn ph¶i tiÕp tôc trong mét thêi gian dµi n÷a míi

cã thÓ trë thµnh hiÖn thùc. V× vËy viÖc nghiªn cøu x©y dùng c¸c kü thuËt chÈn

®o¸n x¸c ®Þnh c¨n nguyªn, nghiªn cøu vÒ dÞch tÔ häc, l©m sµng, ®iÒu trÞ vµ c¸c

biÖn ph¸p phßng chèng SARS trong giai ®o¹n hiÖn nay lµ hÕt søc cÇn thiÕt, ®Æc

biÖt lµ tr−íc nguy c¬ quay trë l¹i cña bÖnh dÞch SARS trong thêi gian tíi.

1.2. C¸c nghiªn cøu t¹i ViÖt nam

Ngay tõ nh÷ng tr−êng hîp nhiÔm SARS ®Çu tiªn ®−îc ph¸t hiÖn, víi chøc n¨ng

lµ mét ViÖn ®Çu ngµnh cña hÖ thèng y häc dù phßng, ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ

Trung −¬ng ®· tiÕn hµnh hµng lo¹t c¸c ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu nh»m t×m ra c¨n

nguyªn cña bÖnh. Nh÷ng virus hoÆc vi khuÈn lµ c¨n nguyªn g©y nªn héi chøng

viªm phæi cÊp nh− : Cóm tÝp A (Influ A), cóm tÝp B (Influ B), sëi (Mealse), virus

hîp bµo ®−êng h« hÊp (RSV), virus Adeno, virus viªm phæi ( hMPV), phÕ cÇu

khuÈn, chlamydia pneumonia… ®Òu ®−îc ®Ò cËp vµ ®· ®−îc lo¹i trõ . Phèi hîp

víi Tæ chøc y tÕ thÕ giíi ( WHO) vµ c¸c phßng thÝ nghiÖm ë c¸c n−íc kh¸c nh−

CDC-Mü, NIID –NhËt b¶n, ViÖn Jacques Monod –Ph¸p, c¸c nghiªn cøu tiÕp

theo ®· ®−îc tiÕn hµnh nh»m t×m hiÓu râ c¨n nguyªn cña bÖnh SARS. Sù nh©n

lªn cña virus SARS- CoV t¹i tÕ bµo niªm m¹c ®−êng h« hÊp trªn ®Æc biÖt lµ

niªm m¹c mòi ®· chØ ra vÞ trÝ lý t−ëng ®Ó thu thËp bÖnh phÈm l©m sµng dïng

cho chÈn ®o¸n sím trong phßng thÝ nghiÖm cã hiÖu qu¶. C¸c ph−¬ng ph¸p sö

dông ®Ó nghiªn cøu vÒ virus häc còng ®· ®−îc ¸p dông nh− ph©n lËp virus, di

truyÒn ph©n tö… vµ ®· chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh ®−îc c¸c tr−êng hîp nhiÔm virus

SARS t¹i Ninh b×nh ®Çu th¸ng 4 n¨m 2003. H×nh ¶nh virus SARS-CoV,do ViÖn

VSDTT¦ ph©n lËp l¹i bÖnh nh©n K.(Ninh B×nh) ®· ®−îc c«ng bè, trïng hîp víi

h×nh ¶nh virus SARS-CoV ®ang g©y dÞch trªn thÕ giíi.

Tr−íc nguy c¬ quay trë l¹i cña dÞch bÖnh SARS, ph¸t triÓn 1 bé sinh phÈm cã

kh¶ n¨ng ph¸t hiÖn sù nhiÔm virus SARS –CoV th«ng qua ph¶n øng huyÕt thanh

häc ®¸p øng ®−îc môc tiªu ph¸t hiÖn sím bÖnh, ®¶m b¶o an toµn sinh häc trong

chÈn ®o¸n phßng thÝ nghiÖm vµ cã thÓ ¸p dông réng r·i lµ hÕt søc cÇn thiÕt. C¸c

nghiªn cøu cña chóng t«i h−íng tíi c¸c môc tiªu sau:

- Nghiªn cøu s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn SARS-CoV t¸i tæ hîp .

- Ph¸t triÓn bé sinh phÈm MAC-EILSA chÈn ®o¸n sím nhiÔm virus

SARS-CoV th«ng qua sù hiÖn diÖn cña KN IgM kh¸ng ®Æc hiÖu virus SARS-

CoV.

§èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

Ch−¬ng II

A. Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n nhanh bÖnh Sèt Dengue/ Sèt xuÊt

huyÕt Dengue

2.1. §èi t−îng vµ vËt liÖu

2.1.1. §èi t−îng

- §èi t−îng nghiªn cøu lµ virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2),

virus Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) ®−îc ph©n lËp ë ViÖt

Nam.

- Virus Corona (Coronaviridae)

- S¶n xuÊt Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n nhanh ®Ó x¸c ®Þnh hai bÖnh: Sèt Dengue vµ

SARS

2.1.2. VËt liÖu

2.1.2.1. C¸c sinh phÈm

KIT t¸ch dßng TA cloning (Invitrogen).

KIT lµm ph¶n øng RT-PCR SuperScriptTM One-Step RT-PCR with

Platinum Tag (Invitrogen).

KIT lµm ph¶n øng x¸c ®Þnh tr×nh tù BigDye® Terminator v3.1.

KIT tinh s¹ch plasmid - S.N.A.P.TM (Invitrogen).

Kit t¸ch chiÕt DNA tõ gel agarose - S.N.A.P free UV (Invitrogen).

Cét protein A Sepharose ®Ó tinh chÕ kh¸ng thÓ (Invitrogen).

Cét Con-A (Concanavalin A) Sepharose ®Ó tinh chÕ kh¸ng thÓ sau khi g¾n

céng hîp (Invitrogen).

Céng hîp kh¸ng IgG ng−êi g¾n HRP (Bio Rad).

Céng hîp kh¸ng IgG thá g¾n HRP (Bio Rad).

Céng hîp kh¸ng IgG chuét g¾n HRP (Bio Rad).

Vector biÓu hiÖn pET-TRX-FuS.

TÕ bµo vi khuÈn E. coli lµm vËt chñ t¸ch dßng c¸c chñng DH5α [end A1

rec A1 hsd R17 sup E44 gyp A96 thi-1 relA1 lac U169 (φ80 lacZM15)]

TÕ bµo vi khuÈn E. coli lµm vËt chñ biÓu hiÖn chñng BL21 (DE3) star [F

omp hsd SB(rBmB)gal dcm (DE3) plysS(Caml)]

HÖ vector biÓu hiÖn trong nÊm men P. pastoris pPIC9.

Chñng nÊm men P. pastoris lµm vËt chñ biÓu hiÖn chñng GS115 [His-]

2.1.2.2. HÖ t¸ch dßng pCR2.1

Chóng t«i sö dông plasmid pCR® 2.1 cña h·ng Invitrogen lµm vector cho

c«ng viÖc t¹o dßng gen vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù kh¸ng nguyªn vá virus dengue.

Plasmid pCR® 2.1 cã kÝch th−íc 3.9 kb. Thµnh phÇn cÊu t¹o nªn plasmid

vµ vÞ trÝ cña tõng thµnh phÇn trong plasmid ®−îc thÓ hiÖn ë b¶ng vµ h×nh d−íi

C¸c thµnh phÇn cña vect¬ pCR2.1

Thµnh phÇn VÞ trÝ

1 – 57 Gen LacZ

239 – 255 Sp6 promoter

269 – 381 VÞ trÝ t¹o dßng

T7 promoter 388 – 407

F1 ori 572 – 986

Gen kh¸ng kanamycin 987 – 2114

Gen kh¸ng ampicillin 2133 – 2992

ColE1 ori 3182 – 3765

H×nh CÊu tróc vect¬ t¸ch dßng pCR2.1

Vector pCR® 2.1 ®−îc thiÕt kÕ cã g¾n mét operon chuyÓn hãa ®−êng Lactose lµ

operon-lac. T¹i vïng ranh giíi gi÷a promoter cña operon nµy vµ gen cÊu tróc m·

hãa cho β-galactosidase cã vïng c¾t g¾n ®a vÞ víi 18 vÞ trÝ c¾t cho c¸c emzym

giíi h¹n: EcoR I, Hind III, Nsi I, Kpn I, Sac I, BamH I, Spe I, BstX I, EcoR V,

Not I, Ava I, PeaR 71, Xho I, Xba I, Apa I. Trong ®ã EcoR I, BstX I, Nsi I, cã hai

vÞ trÝ c¾t, cßn c¸c enzym cßn l¹i chØ cã mét vÞ trÝ c¾t.

Ngoµi ra, vector pCR® 2.1 cã chøa gen kh¸ng kh¸ng sinh kanamycin vµ

ampicillin. Nhê ®ã mµ vi khuÈn cã g¾n gen cÇn thiÕt vÉn cã thÓ sinh tr−ëng b×nh

th−êng trªn m«i tr−êng cã chøa kanamycin hoÆc ampicillin víi nång ®é øc chÕ

tèi thiÓu.

2.1.2.3. Vector biÓu hiÖn pET-TRX-FuS

§Ó biÓu hiÖn domain 3 (E3) m· ho¸ mét vïng kh¸ng nguyªn vá cña virus dengue

c¸c type, chóng t«i sö dông hÖ vector pET-TRX-Fus. HÖ vector nµy sÏ t¹o ra s¶n

phÈm mong muèn liªn kÕt víi thioredoxin (trx). §©y lµ protein cã ¸i lùc cao víi

thiobond do ®ã cã thÓ cã thÓ dÔ dµng tinh s¹ch protein dung hîp b»ng s¾c ký ¸i

lùc sö dông chÊt gi¸ thiobond. Ngoµi ra, thioredoxin cßn cã vai trß lµm t¨ng kh¶

n¨ng hoµ tan cña protein cÇn biÓu hiÖn trong E. coli.

Trong hÖ pET-TRX-Fus do chóng t«i thiÕt kÕ cßn cã ®o¹n gene m· ho¸ cho ®o¹n

6 axit amin his (HisTag), v× vËy, protein dung hîp cã thªm mét lùa chän ®Ó tinh

s¹ch b»ng cét s¾c ký dïng cét Ni2+ chelating Resin.

2.1.2.4. HÖ biÓu hiÖn Pichia pastoris

HÖ biÓu hiÖn gen trong P. pastoris ®−îc xem lµ hÖ biÓu hiÖn gen ë nÊm men thÕ

hÖ thø hai, ra ®êi sau khi c¸c nhµ khoa häc ®· nghiªn cøu kÜ hÖ biÓu hiÖn gen

trong S. cerevisiae. HÖ biÓu hiÖn míi nµy ®· kh¾c phôc ®−îc nh÷ng nh−îc ®iÓm

cña thÕ hÖ hÖ biÓu hiÖn tr−íc ®ã. Plasmit ®−îc sö dông ®Ó biÓu hiÖn gen trong

nÊm men P. pastoris lµ plasmit cã kh¶ n¨ng tÝch hîp vµo genom cña nÊm men

nªn bÒn v÷ng h¬n. Bªn c¹nh ®ã vect¬ dïng ®Ó biÓu hiÖn gen ngo¹i lai trong P.

pastoris cã chøa tÝn hiÖu tiÕt α-MF prepro ®−îc thiÕt kÕ s½n. §ã lµ tÝn hiÖu tiÕt

rÊt hiÖu qu¶ cã nguån gèc trùc tiÕp tõ S. cerevisiae. Nhê tÝn hiÖu tiÕt nµy mµ

protein t¸i tæ hîp ®−îc tiÕt ra ngoµi m«i tr−êng nu«i cÊy, do ®ã dÔ dµng cho viÖc

tinh s¹ch sau nµy.

HÖ biÓu hiÖn gen trong nÊm men P. pastoris cã nhiÒu ®iÓm thuËn lîi h¬n so víi

hÖ biÓu hiÖn gen trong nÊm men S. cerevisiae. NÊm men P. pastoris cã mét

promot¬ m¹nh b¾t nguån tõ gen m· ho¸ enzym alcohol oxidaza ®Ó khëi ®Çu qu¸

tr×nh phiªn m· gen ngo¹i lai. Gen nµy ®−îc ®iÒu khiÓn chÆt chÏ vµ bÞ øc chÕ

trong ®iÒu kiÖn sinh tr−ëng kh«ng cã metanol. Trong m«i tr−êng cã metanol,

promot¬ ®−îc c¶m øng vµ tiÕn hµnh phiªn m·. Con ®−êng trao ®æi metanol b¾t

®Çu tõ sù oxi ho¸ metanol thµnh formaldehit vµ hi®ro peroxit (H2O2) nhê sù xóc t¸c cña enzym alcohol oxidaza (AOX1). Sù biÓu hiÖn cña gen nµy ®−îc ®iÒu hoµ

mét c¸ch nghiªm ngÆt. Khi nÊm men sinh tr−ëng trªn m«i tr−êng cã glucoza

hay ethanol th× gen AOX1 kh«ng ®−îc biÓu hiÖn trong tÕ bµo. Tuy nhiªn, khi nã

sinh tr−ëng trªn m«i tr−êng cã methanol lµ nguån cacbon duy nhÊt th× AOX1 cã

thÓ t¹o ra 35% protein tæng sè cña tÕ bµo. §Ó tr¸nh chÊt ®éc H2O2, enzym AOX1 ®−îc bäc trong mét c¬ quan tö gäi lµ peroxisome vµ nã thuû ph©n H2O2 thµnh H2O vµ O2. Mét phÇn cña formaldehit ®−îc t¹o ra sÏ rêi khái peroxisome vµ bÞ oxi ho¸ thµnh axit formic vµ CO2 nhê enzym dehydrogenaza trong tÕ bµo. C¸c ph¶n øng nµy lµ nguån n¨ng l−îng gióp cho tÕ bµo sinh tr−ëng trªn m«i

tr−êng cã metanol lµ nguån cacbon duy nhÊt.

Mét thuËn lîi n÷a cña nÊm men P. pastoris lµ kh¶ n¨ng lªn men kh«ng m¹nh

nh− S. cerevisiae. NÊm men khi lªn men m¹nh sÏ t¹o ra nhiÒu ethanol vµ nång

®é etanol cao sÏ g©y ®éc cho tÕ bµo. Th«ng th−êng nång ®é protein ngo¹i lai tiÕt

vµo m«i tr−êng tØ lÖ víi mËt ®é tÕ bµo. MËt ®é tÕ bµo cµng cao th× protein tiÕt ra

cµng nhiÒu. P. pastoris lµ chñng lªn men yÕu do vËy c¸c tÕ bµo Ýt bÞ g©y ®éc vµ

mËt ®é tÕ bµo cã thÓ ®¹t kho¶ng 100 g/l.

NÊm men P. pastoris ®−îc lùa chän ®Ó biÓu hiÖn gen ngo¹i lai nhê mét sè −u

®iÓm sau ®©y:

- Kh«ng g©y bÖnh

- Kh«ng t¹o liposaccharit g©y dÞ øng

- Kh«ng chøa virus trong tÕ bµo

- Cã kh¶ n¨ng t¹o ra s¶n phÈm gièng víi cÊu tróc tù nhiªn.

- Cã kh¶ n¨ng t¹o s¶n phÈm gen t¸i tæ hîp ë møc ®é cao trong m«i tr−êng

nu«i cÊy rÎ tiÒn.

- T¹o protein ngo¹i lai víi l−îng lín trong peroxisome nªn s¶n phÈm dÔ

®−îc nhËn biÕt bëi c¸c yÕu tè trong con ®−êng vËn chuyÓn vµ tiÕt

protein

- Cã mét promotor m¹nh vµ cã thÓ ®iÒu hoµ

Theo kÕt qu¶ cña mét nhãm nghiªn cøu Trung Quèc, vïng gen m· ho¸ cho

protein E cña virus dengue typ 2 ®· ®−îc biÓu hiÖn thµnh c«ng trong P. pastoris

víi träng l−îng ph©n tö kho¶ng 60 kDa [1]. §iÒu nµy chøng tá P. pastoris ®·

®−îc chän nh− lµ mét vËt chñ thÝch hîp ®Ó biÓu hiÖn gen cña virus dengue.

Trong nghiªn cøu nµy, chóng t«i sö dông nÊm men P. pastoris ®Ó biÓu hiÖn

vïng gen preM-env cña virus dengue c¸c typ D1, D2, D3 vµ D4 víi môc ®Ých

thu ®−îc kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp.

2.1.3. Ho¸ chÊt

C¸c hãa chÊt tinh khiÕt ®−îc sö dông trong nghiªn cøu sinh häc ph©n tö cña h·ng

Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad… bao gåm IPTG, Ethanol, Acetat natri, Cao

nÊm men, Trypton, Chloroform, EDTA, Agarose, Natriclorua, Agar-bacter, Tris-

HCL, SDS, MgCl2, Acrylamide, bis-Acrylamide v.v...

Dung dÞch vµ m«i tr−êng

+ Dung dÞch t¸ch chiÕt plasmid tõ E. coli:

- Dung dÞch 1:

Tris HCl, pH8 25mM

EDTA, pH8 10mM

Glucose 50mM

- Dung dÞch 2:

NaOH 0,2M

SDS 1%

- Dung dÞch3:

§Öm Axetat kali 3 M, pH 5,5

§èi víi m«i tr−êng th¹ch, cÇn bæ sung 2 % agar.

- Dung dÞch chloroform : isomylalcohol (24:1)

- Dung dÞch TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA)

+ Dung dÞch dïng cho ®iÖn di ADN:

Dung dÞch ®Öm ®iÖn di TAE 50X:

Tris base 121 g

Axit acetic glacial 28,6 ml

0,5 M EDTA pH 8,0 50 ml

N−íc khö ion võa ®ñ 500 ml

- Agarose 1%: C©n 1 g agarose, bæ sung 100 ml ®Öm TAE 1X.

§un tan agarose trong lß vi sãng 2 phót. §Ó nhiÖt ®é h¹ xuèng kho¶ng

50 oC råi ®æ ra khay ®iÖn di.

- Ethidium bromit (EtBr) dung dÞch mÑ: 10mg/ml. Hßa 1g EtBr

vµo 100ml H2O. QuÊy vµi giê b»ng m¸y khuÊy tõ cho tan ®Òu. Gi÷ trong

lä tèi ë nhiÖt ®é phßng. Khi dïng pha 20 µl dung dÞch mÑ trong 100 ml

®Öm TAE 1X.

- §Öm tra mÉu ADN (Loading buffer) 5X:

Tris-HCl 1 M pH 8,0 1 ml

EDTA 0,5 M pH 8,0 0,2 ml

Glycerol 2 ml

Bromphenol Blue 1 % 2 ml

+ Dung dÞch dïng cho ®iÖn di protein:

- Dung dÞch ®Öm SDS-PAGE 10X:

Tris base 15,14 g

Glycine 72,1 g

KhuÊy tan råi bæ sung 25 ml SDS 20 %

Sau ®ã bæ sung n−íc khö ion võa ®ö 500 ml

- Dung dÞch ®Öm tra mÉu cho Protein (Loading buffer) 2X:

Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 1 ml

Glycerol 0,8 ml

SDS 20 % 0,8 ml

2-Mercaptoethanol 0,4 ml

Bromphenol Blue 1 % 0,2 ml

N−íc khö ion võa ®ñ 4 ml

- Dung dÞch acrylamide-bisacrylamide 29+1%:

Acrylamide 29 g

Bisacrylamide 1 g

N−íc khö ion võa ®ñ 100 ml

- Dung dÞch protein chØ thÞ:

Mét lä protein chØ thÞ d¹ng ®«ng kh« cña h·ng Amersham-Pharmacia

Biotech chøa c¸c lo¹i protein sau: Phosphorylase (94 kDa), bovine serum

albumin (67 kDa), ovalbumin (43 kDa), carbonic anhydrase (30 kDa),

soybean trypsin inhibitor (20,1 kDa) vµ α-lactalbumin (14,4 kDa). §−îc

pha trong 70 µl 0,5 M NaCl v« trïng vµ b¶o qu¶n ë -20 oC. Sö dông 1,5

µl cho mçi kªnh ®iÖn di.

- Dung dÞch t¶y mµu:

450 ml methnol + 450 ml n−íc khö ion + 100 ml acid acetic

glacial. B¶o qu¶n ë nhiÖt ®é phßng.

- Dung dÞch Coomassie brilliant blue (CBB) 0,25 %: C©n 0,25 g

Coomassie brilliant blue (Merck) hßa tan trong 100 ml dung dÞch t¶y

mµu.

+ Dung dÞch dïng cho Western blot:

- §Öm chuyÓn protein sang mµng 10X:

Tris 30 g

Glycine 144,13

H20 1000 ml - §Öm chuyÓn protein sang mµng 1 lÇn:

100 ml ®Öm chuyÓn 10X

200 ml metanol

H20 1000ml

- Dung dÞch ®Öm TBS 2X

50 mM Tris HCl pH= 7,5

1 M NaCl

- Dung dÞch ®Öm TTBS 1X

250 ml 2X TBS

250 ml H2O

250 µl Tween 20

- Dung dÞch Ponceau: 50 mg Ponceau (Merck) hoµ trong 50 ml dung dÞch axÝt

axªtic 2%.

- Dung dÞch gelatin 2% :

1g gelatin trong 50 ml TTBS 1X

- Dung dÞch gelatin 1% (pha tõ dung dÞch gelatin 2% tr−íc khi sö dông): Ng©m

dung dÞch gelatin 2% vµo bÓ c¸ch thñy 37oC cho tan råi trén víi ®Öm TTBS 1X

theo tû lÖ 1:1.

- Dung dÞch 5% BSA:

2,5 g BSA trong 50 ml TBS 1X

- Dung dÞch hiÖn mÇu:

5 ml metanol ®Ó trªn ®¸+15 mg chÊt hiÖn mÇu (Bio-Rad)

25 ml TBS 1X +15µl H2O2 30%

Trén 2 thµnh phÇn vµo víi nhau tr−íc khi hiÖn mµu.

+ Dung dÞch dïng cho ELISA

Dung dÞch g¾n b¶n, pH = 9.6:

1,18g

3,47g

0,20g

1 lÝt

NaCO3 NaHCO3 NaN3 H2O (§Ó trong tñ l¹nh dïng trong 2 tuÇn)

Dung dÞch röa b¶n, pH = 7.2 - 7.5:

NaCl 8.870g

1,650g

0.220g

0.200g

Na2HPO4.2H20 NaH2PO4.H20 NaN3 Tween 20 0.5ml

N−íc cÊt 2 lÇn 1 lÝt

Dung dÞch pha lo·ng vµ che ch¾n b¶n (Skim milk 5% trong dung dÞch röa):

Skim milk 5g

Dung dÞch röa 100ml

- Dung dÞch mµu dïng cho ®Þnh l−îng protein b»ng ph−¬ng ph¸p Bradford:

Coomassi-Brillian-BlueSERVAN-35050(G250) 40mg

Ethanol.95% 20ml

40ml

40ml H3PO4.85% H2O

Dung dÞch nµy ®−îc b¶o qu¶n ë 40C vµ cã thÓ dïng trong nhiÒu n¨m.

- Dung dÞch dïng trong tinh chÕ vµ g¾n kh¸ng thÓ víi enzyme:

- Dung dÞch sulphat amon b·o hoµ: Hoµ tan 1000g sulphat amon trong

1000ml n−íc cÊt ë nhiÖt ®é 500C. §Ó ®øng qua ®ªm ë nhiÖt ®é phßng. ChØnh

pH tíi 7,2 b»ng hydroxit amon hoÆc H2SO4 ®· pha lo·ng. - Dung dÞch 100mM NaIO4 pha tr−íc khi dïng - Dung dÞch ®Öm acetat natri 1mM, pH4,4

- Dung dÞch ®Öm carbonat 200mM, pH 9,5

C©n 21,2g Na2CO3 pha trong 1000ml n−íc cÊt. 16,8g NaHCO3 pha trong 1000ml n−íc cÊt

Dïng dung dÞch Na2CO3 ®Ó chØnh dung dÞch NaHCO3 tíi pH 9,5. - Dung dÞch NaBH4: 4mg/ml n−íc cÊt - Dung dÞch ®Öm Con A:

100mM acetat, pH 6,0 + 1M NaCl, 1mMCaCl2, 1mM MgCl2, 1mM MnCl2

- Dung dÞch 10-100 mM α-methyl - D -mannopyranoside trong ®Öm Con A.

M«i tr−êng nu«i cÊy E. coli

M«i tr−êng LB (g/l):

- Yeast extract: 10g

- Trypton : 10g

- NaCl : 10g

pH 7,4 (chØnh b»ng NaOH 1N)

§èi víi m«i tr−êng th¹ch, cÇn bæ sung 2 % agar.

M«i tr−êng nu«i cÊy nÊm men P. pastoris

- M«i tr−êng láng PEG (1% yeast extract, 2% peptone, 1% glycerol).

- M«i tr−êng MD khuyÕt histidine (YNB 0,34%, Glucose 2%, Biotin

0,0004%).

- M«i tr−êng PEM (2% peptone, 1% yeast extract, 1% methanol).

2.2. Trang thiÕt bÞ

Dông cô ®Ó tiÕn hµnh ph¶n øng huyÕt thanh vµ ph©n lËp virus Dengue:

- Hèt v« trïng h·ng BAKER, Model 36.400, Hoa Kú

- Tñ Èm THERMO

- M¸y ly t©m tèc ®é trung b×nh

- Ly t©m siªu tèc BECKMAN Coulter, Optima L 90 K Ultracentrifuge, Mü

- B×nh ®ùng Nitrogen láng;

- Tñ l¹nh s©u SANYO, NhËt B¶n

- KÝnh hiÓn vi huúnh quang Olympus, Model BH 2-RFL, NhËt B¶n.

- KÝnh hiÓn vi lén ng−îc, PME Olympus Tokyo, NhËt B¶n.

- M¸y röa, m¸y ñ vµ m¸y ®äc ELISA, model Pasteur 01254, Ph¸p.

- Dµn m¸y PCR

- BÓ ®iÖn di ®øng ch¹y PAGE cña h·ng ATTA, NhËt B¶n

- BÓ sÊy PAGE cña h·ng ATTA, NhËt B¶n

- C¸c lo¹i Pipetman cña GILSON víi c¸c cì 20, 100, 1000, 5000 µl.

- C¸c dông cô tiªu hao : Chai nhùa nu«i tÕ bµo, pipette c¸c cì...

2.3 Ph−¬ng ph¸p

2.3.1. C¸c ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn vµ Kh¸ng huyÕt thanh

2.3.1.1.S¶n xuÊt kh¸ng nguyªn

2.3.1.1.Kh¸ng nguyªn s¶n xuÊt b»ng n·o chuét b¹ch(Swiss) 24 giê tuæi

2.3.1.1.1. Tr−íc khi tiÕn hµnh s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn, cÇn ph¶i tiªm truyÒn c¸c

chñng virus Dengue vµi lÇn trªn chuét b¹ch 24 giê tuæi ®Ó n¨ng hiÖu gi¸.

C¸c b−íc ®−îc tiÕn hµnh nh− sau:

• NghiÒn n·o chuét ®· nhiÔm virus Dengue pha trong PBS pH 7,8 thµnh nång

®é tõ 10-1 ®Õn 10-2 .

• Tiªm vµo n·o chuét víi l−îng 0,01 ml/ chuét hçn dÞch ®· chuÈn bÞ ë trªn.

• Theo dâi sù thay ®æi cña chuét hµng ngµy.

• Thêi gian chuét èm phô thuéc vµo tõng chñng virus Dengue:

• Dengue I: Ngµy thø 6 sau khi tiªm.

• Dengue II: Ngµy thø 5 - 6 sau khi tiªm.

• Dengue III: Ngµy thø 7 sau khi tiªm.

• Dengue IV: Ngµy thø 3 - 4 sau khi tiªm.

• Khi chuét èm, c¾t tim cho ch¶y hÕt m¸u vµ röa kü b»ng dung dÞch s¸t trïng.

• Mæ chuét, hót n·o ®Ó chÕ ngay kh¸ng nguyªn hay b¶o qu¶n ë – 70 0C.

2.3.1.1.2. Ph−¬ng ph¸p chiÕt xuÊt n·o trong m«i tr−êng kiÒm

• N·o chuét ®· g©y nhiÔm virus Dengue ®−îc nghiÒn vµ pha thµnh hçn dÞch 10

– 20% trong ®Öm Borate pH 9,0 (2 n·o + 3 ml Borate).

• Ly t©m 10.000 vßng/ phót/ 60 phót.

• Ch¾t lÊy n−íc næi phÝa trªn, chia nhá, b¶o qu¶n ë +4 0C.

• ChuÈn ®é hiÖu gi¸ (Kh«ng nªn dïng ngay v× th−êng hiÖu gi¸ thÊp).

2.3.1.1.3. Ph−¬ng ph¸p sö lý n·o b»ng Protamin sulphate

• ChÕ hçn dÞch n·o chuét ®· nhiÔm virus Dengue nh− ë trªn.

• §Ó ë +4 0C trong 24 giê ®Õn 48 giê.

• Ly t©m 2.500 vßng/ phót/ 15 phót.

• Ch¾t lÊy n−íc næi

• Pha dung dÞch Protamin sulphate trong n−íc muèi sinh lý theo tû lÖ 1/ 50.

Trén ®Òu, ®Ó 30 phót ë +4 0C.

• L¾c ®Òu.

• Ly t©m 2.500 vßng/ phót/ 15 phót.

• G¹n n−íc n«i ë trªn, ®ãng lä, chuÈn ®é hiÖu gi¸.

Chó ý: Protamin sulphate cã thÓ g©y ng−ng kÕt hång cÇu kh«ng ®Æc hiÖu ë

®iÒu kiÖn pH 6,0 – 6,4 vµ +4 0C.

2.3.1.2. Kh¸ng nguyªn s¶n xuÊt trªn tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36

B−íc 1:

ChuÈn bÞ dông cô: Chai nu«i tÕ bµo, Pipetter man

- TÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36.

- Pha m«i tr−êng ph¸t triÓn cã 15% huyÕt thanh bµo thai bª (FBS) vµ

méi tr−êng duy tr× cã 2% huyÕt thanh bµo thai bª (FBS)

B−íc 2:

Nu«i tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36 trong

m«i tr−êng DMEM cã 15% FBS, ë nhiÖt ®é 28 0C.

Sau 3- 5 ngµy c¸c tÕ bµo mäc thµnh mét líp trªn bÒ mÆt ®¸y chai.

B−íc 3:

C¸c chñng virus Dengue sö dông ®−îc cÊt gi÷ ë - 80 0C,

d−íi d¹ng dung dÞch ®−îc g©y nhiÔm vµo c¸c chai tÕ bµo trªn.

Víi liÒu l−îng: 1 ml virus + 9 ml m«i tr−êng sinh tr−ëng

cò cßn l¹i trong chai tÕ bµo.

ñ ë 37 0C trong 2 h.

Sau 2 h hÊp phô, cho m«i tr−êng duy tr× cã 2% FBS vµo mçi chai tÕ

bµo. Nu«i tiÕp trong 4 ®Õn 8 ngµy ë 28 0C, m«i tr−êng lóc nµy cã

mµu hång, ®é pH vµo kho¶ng 7,2 - 7,5.

B−íc 4:

GÆt kh¸ng nguyªn virus Dengue.

Sau 7- 10 ngµy g©y nhiÔm virus vµo c¸c chai tÕ bµo,

pH lóc nµy thay ®æi tõ 6,0 ®Õn 6,5.

LÊy n−íc næi cña tÕ bµo ®Ó ph¸t hiÖn sù xuÊt hiÖn cña

virus Dengue qua kiÓm tra hiÖu gia Ng−ng kÕt hång cÇu.

Khi hiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu cao (cid:194) tiÕn hµnh c« ®Æc/ PEG 8000.

B−íc 5:

C« ®Æc virus b»ng PEG 8000.

Thªm NaHCO3 7,5% vµo mçi chai tÕ bµo (2,5 ml/ chai).

ñ t¹i 28 0C trong 2 h.

Thu vµ kiÓm tra thÓ tÝch cña l−îng n−íc næi.

Thªm NaCl 3,5% vµo víi tû lÖ 1 ml NaCl+ 9 ml n−íc næi.

®o l¹i thÓ tÝch cuèi cïng cña dung dÞch n−íc næi,

Thªm PEG 8000 ®Ó ®¹t 7% trong dung dÞch n−íc næi.

KhuÊy tõ qua ®ªm t¹i 4 0C.

Ly t©m 10.000vßng/ 30 phót ë 4 0C.

Lo¹i bá n−íc næi, thu håi cÆn ly t©m.

Lµm tan cÆn ly t©m b»ng muèi Borat pH 9,0 thu ®−îc kh¸ng nguyªn.

§èi víi Dengue type 1, Dengue type 2, Dengue type 3

ph¶i tr¶ l¹i 1 ml ®Öm Borat pH 9,0/ chai 80 cm2.

§èi víi Dengue type 4 tr¶ l¹i 0.5 ml ®Öm Borat pH 9,0/ chai 80 cm2.

B−íc 6:

Hçn hîp 4 type virus Dengue theo tû lÖ hiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu.

B−íc 7:

Chia thµnh c¸c type nhá cÊt trong tñ l¹nh - 80 0C.

Chó ý: C¸c b−íc tiÕn hµnh cÇn ph¶i b¶o ®¶m ®iÒu kiÖn v« trïng.

2.3.2. Ph−¬ng ph¸p s¶n xuÊt kh¸ng huyÕt thanh.

2.3.2.1. Kh¸ng huyÕt thanh.

Virus: chÕ hçn dÞch n·o chuét ®· g©y nhiÔm virus Dengue 1/ 10 trong ®Öm

phèt ph¸t pH 7,4. L¾c ®Òu, ly t©m 10 phót víi tèc ®é 1500 vßng/ phót. LÊy

n−íc næi ë trªn ®Ó g©y miÔn dÞch.

Tiªm miÔn dÞch cho chuét 4 lÇn, mçi lÇn c¸ch nhau mét tuÇn víi liÒu tiªm

0,2 ml hçn dÞch virus vµo æ bông.

Ngµy thø 21 sau mòi tiªm cuèi, lÊy m¸u vµo èng nghiÖm, ®Ó nhiÖt ®é phßng

30 phót, ch¾t huyÕt thanh, ly t©m, n−íc trong ë trªn lµ kh¸ng huyÕt thanh.

Xö lý:

- Kh¸ng huyÕt thanh dïng trong ph¶n øng trung hoµ: BÊt häat 56 0C/ 30 phót.

- Trong ph¶n øng ¦CNKHC, xö lý b»ng kaolin vµ hång cÇu ngçng.

2.3.2.2. DÞch b¸ng miÔn dÞch.

Sóc vËt thÝ nghiÖm:

Chuét nh¾t tr¾ng (gièng Swiss) 20 - 25g, trong mét l« s¶n xuÊt ph¶i dïng

chuét cïng mét gièng, chuét c¸i th−êng t¹o ra nhiÒu b¸ng h¬n.

ChuÈn bÞ kh¸ng nguyªn:

Tr−íc khi g©y miÔn dÞch ph¶i tiªm truyÒn c¸c chñng trªn chuét æ 1- 3 ngµy

tuæi ®Ó t¨ng hiÖu gi¸. ChuÈn bÞ hçn dÞch n·o chuét 10% ®· g©y nhiÔm virus

Dengue trong PBS pH 7,4, ly t©m 3000 vßng/ phót/ 15 phót. LÊy mét phÇn

n−íc næi trén víi mét phÇn t−¬ng ®−¬ng t¸ d−îc Freund, trén ®Òu.

G©y miÔn dÞch vµ t¹o b¸ng:

Tiªm miÔn dÞch cho chuét 5 lÇn, kho¶ng c¸ch gi÷a c¸c lÇn tiªm lµ mét tuÇn.

Mçi lÇn tiªm 0,2 ml kh¸ng nguyªn ®· chuÈn bÞ trªn vµo æ bông.

Tr−íc lÇn tiªm miÔn dÞch cuèi cïng mét ngµy, tiÕn hµnh t¹o b¸ng b»ng c¸ch

tiªm vµo æ bông mçi chuét 0,25 ml tÕ bµo Sacom TG - 180 ®· pha lo·ng 1/ 5

trong n−íc muèi sinh lý.

Thu ho¹ch dÞch b¸ng sau 10 -14 ngµy, ly t©m 1500 vßng/ phót/ 15 phót.

N−íc trong ë trªn lµ dÞch b¸ng chøa kh¸ng thÓ chèng Dengue.

2.3.3. Ph−¬ng ph¸p ELISA ph¸t hiÖn IgM

Ph−¬ng ph¸p ELISA ®−îc sö dông ®Ó ph¸t hiÖn sù cã mÆt cña kh¸ng thÓ líp

IgM hoÆc IgG kh¸ng l¹i virus Dengue tù nhiªn trong huyÕt thanh bÖnh nh©n

b»ng protein t¸i tæ hîp (Jaiswal S et al., 2004; Sang CT et al., 1998). Protein t¸i

tæ hîp DxE3 ®−îc hßa trong ®Öm Coating buffer (50mM Sodium carbonate-

bicarbonate pH 9,6; 3mM NaN3) vµ g¾n lªn tÊm nhùa vi l−îng 96 giÕng, mçi giÕng 125ng protein, ñ b¶n ELISA ë 4 oC qua ®ªm.

Röa b¶n 5 lÇn b»ng dung dÞch röa b¶n Washing buffer (0,15mM Phosphate

Buffered Saline pH7,3; 0,05% Tween 20), bæ sung 300 µl dung dÞch ®Öm

Dilution buffer (Washing buffer + 1% skim milk) vµo mçi giÕng ®Ó che c¸c vÞ

trÝ kh«ng g¾n kh¸ng thÓ ; ñ b¶n 1 giê ë 37 0C trong buång Èm.

Röa b¶n 5 lÇn b»ng washing buffer, thªm 100 µl huyÕt thanh bÖnh nh©n ®· pha

lo·ng 5000 lÇn trong Dilution buffer vµo mçi giÕng, ñ 1 giê ë 37 0C.

Röa b¶n 5 lÇn b»ng dung dÞch röa b¶n, ®−a vµo mçi giÕng 100 µl dung dÞch

céng hîp kh¸ng thÓ kh¸ng IgG cña ng−êi cã g¾n peroxidase ®· ®−îc pha lo·ng

10000 lÇn trong dung dÞch ®Öm Dilution buffer, ñ 1 giê ë 37 0C trong buång Èm.

Röa b¶n 10 lÇn b»ng dung dÞch röa b¶n, ®−a vµo mçi giÕng 100 µl dung dÞch c¬

chÊt TMB (3,3,5,5 Tetramethyl Benzidine).

Ph¶n øng x¶y ra ngay ë nhiÖt ®é phßng trong thêi gian tõ 10 ®Õn 60 phót. Dõng

ph¶n øng b»ng : 50 µl/ H2SO4 1N. §o OD ë 450nm b»ng m¸y ®äc ELISA.

2.3.4. Kü thuËt trung hoµ

(Neutralization Test - NT)

§©y lµ ph−¬ng ph¸p nh¹y c¶m vµ ®Æc hiÖu nhÊt trong c¸c ph−¬ng ph¸p chÈn

®o¸n huyÕt thanh häc cña nhiÔm virus dengue. Th−êng quy chung ®−îc dïng

trong c¸c phßng thÝ nghiÖm chÈn ®o¸n virus dengue ®ã lµ kh¸ng thÓ trong huyÕt

thanh pha lo·ng lµm gi¶m sù t¹o plaque cña virus dengue hay cßn gäi lµ ph−¬ng

ph¸p trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö (Plaque redution neutralization test –PRNT).

Nh×n chung KT NT xuÊt hiÖn trong cïng mét thêi gian hoÆc chËm h¬n mét chót

so víi kh¸ng thÓ NNKHC hoÆc KT - ELISA nh−ng xuÊt hiÖn sím h¬n KT CF

vµ tån t¹i Ýt nhÊt lµ 48 n¨m. Nh−ng do sù nh¹y c¶m cña ph−¬ng ph¸p nµy nªn cã

thÓ thÊy sù hiÖn diÖn cña KT NT tr−íc khi KT HI ®¹t tíi møc cã thÓ ph¸t hiÖn

®−îc. Còng nh− c¸c ph−¬ng ph¸p HI, CF, NT chØ cã thÓ x¸c ®Þnh type cña virus

dengue trong nh÷ng tr−êng hîp nhiÔm virus dengue tiªn ph¸t. Vµ kh«ng cã kh¶

n¨ng ®Þnh type huyÕt thanh trong tr−êng hîp nhiÔm virus dengue thø ph¸t do cã

sù liªn quan vÒ ®¸p øng miÔn dÞch gi÷a c¸c type trong giai ®o¹n håi phôc. Sù tån

t¹i l©u dµi cña KT NT rÊt cã Ých cho viÖc sö dông ph−¬ng ph¸p nµy ®Ó nghiªn

cøu håi cøu dÞch tÔ huyÕt thanh häc cña SXHD. Tuy nhiªn ph−¬ng ph¸p NT lµ

ph−¬ng ph¸p ®¾t tiÒn kÌm theo sù kÐo dµi vÒ thêi gian vµ phøc t¹p nªn viÖc sö

dông ph−¬ng ph¸p nµy trong c¸c phßng thÝ nghiªm cßn h¹n chÕ

2.3.5. Ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch hÊp phô liªn kÕt men

ph¸t hiÖn KT IgG (GAC- ELISA)

§©y lµ ph−¬ng ph¸p ®−îc sö dông trong nh÷ng n¨m gÇn ®©y nh»m ph¸t hiÖn KT

IgG trong nh÷ng tr−êng hîp nhiÔm virus dengue tiªn ph¸t vµ thø ph¸t. Ph−¬ng

ph¸p nµy cã nguyªn lý ®¬n gi¶n, thùc hiÖn dÔ dµng vµ rÊt thuËn tiÖn khi xö lý

mét khèi l−îng mÉu lín. So víi ph−¬ng ph¸p HI, ph−¬ng ph¸p nµy nh¹y h¬n

chót Ýt nh−ng còng rÊt kh«ng ®Æc hiÖu. NÕu sè l−îng mÉu thu thËp qu¸ lín th× cã

thÓ sö dông ph−¬ng ph¸p nµy thay cho ph−¬ng ph¸p HI

2.4. C¸c ph−¬ng ph¸p ph©n lËp vµ x¸c ®Þnh type virus.

2.4.1. CÊy truyÒn trªn n∙o chuét æ (1-3 ngµy tuæi)

TÊt c¶ 4 type virus dengue ®Òu cã thÓ ph©n lËp ®−îc tõ huyÕt thanh ng−êi khi

g©y nhiÔm trªn n·o chuét æ. Ph−¬ng ph¸p nµy ®ßi hái nhiÒu thêi gian, cho kÕt

qu¶ chËm vµ kh«ng kinh tÕ. H¬n thÕ n÷a do sù kÐm nh¹y nªn cã rÊt nhiÒu virus

hoang d¹i kh«ng thÓ ph©n lËp ®−îc ë trªn chuét. Ph©n lËp virus trªn chuét æ ph¶i

qua nhiÒu lÇn g©y nhiÔm ®Ó thóc ®Èy sù nh©n lªn cña virus trªn n·o chuét, v×

vËy rÊt tèn tiÒn vµ thêi gian. ¦u ®iÓm cña ph−¬ng ph¸p nµy lµ mét sè arbovirus

kh¸c cã triÖu chøng gièng SD/SXHD còng cã thÓ ph¸t hiÖn ®−îc nhê ph−¬ng

ph¸p nµy. Ngµy nay hÇu hÕt c¸c phßng thÝ nghiÖm trªn thÕ giíi kh«ng sö dông

ph−¬ng ph¸p nµy ®Ó ph©n lËp virus [21,26,49,63].

2.4.2. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus trªn tÕ bµo muçi

Aedes. albopictus dßng C6/36.

2.4.2.1. Ph−¬ng ph¸p nu«i cÊy vµ gi÷ gièng tÕ bµo muçi

Aedes albopictus dßng C6/ 36

a. Nu«i tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36

Th«ng th−êng cø 6 -7 ngµy ph¶i chuyÓn tÕ bµo mét lÇn.

- Chän chai tÕ bµo ®· nu«i cÊy 5 - 7 ngµy, tÕ bµo ®Ñp vµ mäc kÝn 1 líp trªn thµnh

®¸y chai nu«i.

- §æ hÕt m«i tr−êng cò, röa tÕ bµo b»ng PBS pH 7,95.

- §Ó t¸ch tÕ bµo, cho vµo 3ml trypsin tr¸ng ®Òu trªn líp tÕ bµo råi ®æ ®i, sau 30

gi©y tÕ bµo b¾t ®Çu bong ra.

- Dïng pipet cho vµo 5 ml m«i tr−êng ph¸t triÓn vµ sôc m¹nh xuèng thanh chai

nhiÒu lÇn ®Ó tÕ bµo t¸ch ra hoµn toµn.

- T×m sè l−îng tÕ bµo trong 1 ml b»ng buång ®Õm, pha lo·ng tÕ bµo b»ng m«i

tr−êng ph¸t triÓn ®Ó cã 4×105 tÕ bµo trong 1 ml.

- ChuyÓn hçn dÞch tÕ bµo vµo chai ( 5 ml ) hoÆc èng nghiÖm ( 2 ml )

- Nu«i tÕ bµo ë tñ Êm 28 0C, sau 3 ngµy cã thÓ dïng ®Ó g©y nhiÔm virus hoÆc cÊy

bÖnh phÈm.

b. Nu«i tÕ bµo BHK - 21

- Chän vµ t¸ch tÕ bµo gièng nh− tÕ bµo Aedes albopictus dßng C6/36.

- §Õm sè l−îng tÕ bµo trong 1 ml, pha lo·ng tÕ bµo b»ng m«i tr−ßng ph¸t triÓn

cã 3× 105 tÕ bµo trong 1 ml.

ChuyÓn 5 ml hçn dÞch tÕ bµo ®· pha vµo chai nu«i cÊy.

- §Ó ë tñ Êm 37 0C, sau 3 - 4 ngµy tÕ bµo mäc kÝn mét líp trªn thµnh chai vµ cã

thÓ dïng cho ph¶n øng trung hoµ gi¶m m¶ng ho¹i tö (Plaque).

2.4.2.2. Ph−¬ng ph¸p gi÷ gièng tÕ bµo trong nitrogen láng

- Röa vµ t¸ch tÕ bµo nh− th−êng lÖ.

- §Õm tÕ bµo trong 1 ml.

- Ly t©m 1000 vßng/ phót/ 10 phót.

- TÝnh vµ pha sè l−îng m«i tr−êng ph¸t triÓn cã 7,5% DMSO ®ñ ®Ó pha lo·ng

cÆn tÕ bµo thµnh hçn dÞch chøa 4×106 tÕ bµo trong 1 ml.

- §ãng 1 ml hçn dÞch tÕ bµo vµo tõng èng nhùa cã n¾p kÝn.

- §Ó c¸c èng nhùa chøa tÕ bµo ë - 20 0C/ 1 giê, tiÕp theo - 40 0C/ giê vµ - 70 0C

qua ®ªm. Sau ®ã chuyÓn vµo b×nh nitrogen láng.

2.4.2.3. Ph−¬ng ph¸p nh©n gièng tÕ bµo b¶o qu¶n trong nitrogen láng

- LÊy èng tÕ bµo ra khái b×nh nitrogen láng, tan b¨ng nhanh b»ng c¸ch ng©m

trong bÓ n−íc Êm 37 0C.

- S¸t trïng èng bªn ngoµi b»ng cån 70 0C.

- ChuyÓn hçn dÞch tÕ bµo sang 1 èng ly t©m ®· cã s½n 6 ml m«i tr−êng ph¸t

triÓn.

- Ly t©m 1000 vßng/ phót/ 10phót.

- §æ hÕt m«i tr−êng cò, gi÷ l¹i cÆn tÕ bµo.

- Hoµ tan cÆn b»ng 6 ml m«i tr−êng ph¸t triÓn vµ chuyÓn vµo chai nu«i tÕ bµo.

- Nu«i ë nhiÖt ®é thÝch hîp víi tõng lo¹i tÕ bµo.

- Sau 18 giê, thay m«i tr−êng míi.

2.4.2.4. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus Dengue

- LÊy bÖnh phÈm sím ngay tõ mÊy ngµy ®Çu cña bÖnh.

- Giao nhanh bÖnh phÈm ®óng qui c¸ch cho phßng thÝ nghiÖm virus Dengue.

- Chän ph−¬ng ph¸p nh¹y c¶m víi virus Dengue.

a. Ph©n lËp virus Dengue trªn muçi.

4 lo¹i muçi ®· ®−îc dïng trong trong ph©n lËp virus Dengue lµ: A. aegypti, A.

albopictus, T. amboinensis, T. Splenden. Virus Dengue nh©n lªn ë hÇu hÕt c¸c tæ

chøc muçi. HiÖn nay th−êng dïng muçi Toxorhynchites v× nã to nªn dÔ tiªm, dÔ

s«ng sau khi tiªm vµ cho sè l−îng virus nhiÒu h¬n.

+ BÖnh phÈm cã thÓ lµ huyÕt thanh, huyÕt t−¬ng, b¹ch cÇu, m¸u toµn phÇn.

Tr−íc khi tiªm, pha lo·ng 1/5 trong dung dÞch pha lo·ng virus.

+ ChuÈn bÞ muçi, mçi bÖnh phÈm tiªm cho 5 muçi Toxorhynchites, hót muçi

vµo èng nghiÖm vµ bÊt ®éng b»ng c¸ch d×m trong ®¸ 5 - 10 phót.

+ Kü thuËt tiªm: hót hçn dÞch bÖnh phÈm vµo kim, kim cã ®−êng kÝnh 0,4 mm

th× mçi ®o¹n dµi 1 mm chóa kho¶ng 0,13 µl hçn dÞch.

§Ó muçi ®· bÊt ®éng d−íi kÝnh lóp, tiªm vµo buång h¬i phÝa bªn lång ngùc cña

mçi Toxo, sau khi ®· ®©m kim vµo muçi ®Èy b¬m tiªm ®Ó hçn dÞch ch¶y qua 1 -

2 mm, nh− thÕ sÏ b¬m vµo muçi 0,13 - 0,26 µl hçn dÞch bÖnh phÈm. Sau ®ã rót

nhanh vµ nhÑ mòi kim ®Ó b¶o ®¶m thÓ tÝch ®−a vµo.

+ Cho muçi ¨n chÕ ®é 5% ®−êng. Nu«i 14 ngµy ë nhiÖt ®é 30 0C vµ 75% - 80%

®é Èm. Hµng ngµy ®Æt thªm ®−êng miÕng vµo lång muçi. §Ó t¹o ®é Èm 75% -

80% cã thÓ dïng dung dÞch b·o hoµ muèi amon sunfat. Ngµy thø 14 nh÷ng

muçi chÕt bá ®i, nh÷ng muçi sèng sÏ giÕt trong ®«ng l¹nh, b¶o qu¶n ë - 70 0C cã

thÓ dïng ®Ó chÈn ®o¸n huúnh quang trong 9 th¸ng.

+ Lµm tiªu b¶n ®Ó chÈn ®o¸n b»ng ph¶n øng miÔn dÞch huúnh quang:

* XÕp ®Çu muçi theo thø tù cã kÌm theo biªn b¶n ghi râ sè muçi va ®Æc diÓm

cña tõng l« muçi.

* dïng lam kÝnh cã 12 giÕng trßn (mçi hµng 6 giÕng), mçi giÕng ®−îc ®¸nh sè

theo sè ®Çu muçi b»ng bót ch× ®en.

* §Æt muçi trªn miÕng giÊy thÊm, c¾t lÊy ®Çu b»ng dao hoÆc l−ìi dao c¹o ®· lau

s¹ch b»ng cån sau mçi lÇn c¾t ®Çu muçi, ®Æt mçi ®Çu muçi vµo 1 giÕng cña lam

kÝnh ®· ®¸nh dÊu.

* Dïng nÜa kÑp ®Çu muçi di quanh giÕng ®Ó c¸c tÕ bµo ®−îc ph©n bè ®Òu trong

mçi giÕng.

* §Ó kh« trong kh«ng khÝ, cè ®Þnh axeton l¹nh 20 phót, b¶o qu¶n - 20 0C.

+ G©y nhiÔm trªn tÕ bµo C6/36 ®Ó gi÷ chñng vµ x¸c ®Þnh type.

Nh÷ng lç muçi ®· ph¸t hiÖn d−¬ng tÝnh b»ng ph¶n øng miÔn dÞch huúnh quang

trùc tiÕp ®−îc nghiÒn thµnh hçn dÞch: 1 muçi + 0,3 ml dung dÞch pha lo·ng

virus, ly t©m 1500 vßng/ phót/ 10 phót. Sau ®ã tiÕp tôc c¸c b−íc nh− ph©n lËp

trªn tÕ bµo C6/36.

b. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus Dengue trªn tÕ bµo muçi Aedes. albopictus

dßng C6/36.

G©y nhiÔm virus vµo tÕ bµo.

(cid:190) Chän nh÷ng chai tÕ bµo tèt (mäc kÝn trªn mÆt ®¸y cña chai), thay m«i tr−êng

ph¸t triÓn b»ng m«i tr−êng duy tr×, mçi chai 1 ml.

(cid:190) §¸nh dÊu trªn chai tÕ bµo t−¬ng ®−¬ng sè thø tù cña mÉu, chän mét chai lµm

chøng tÕ bµo.

(cid:190) G©y nhiÔm 0,1 ml bÖnh phÈm (m¸u toµn phÇn hoÆc huyÕt thanh), l¸ng ®Òu

trªn bÒ mÆt tÕ bµo, ñ 28 0C/ 60’

(cid:190) Thªm 6 ml m«i tr−êng duy tr× vµo mçi chai tÕ bµo, ñ 28 0C trong 7- 14 ngµy.

§Þnh type virus b»ng ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch huúnh quang.

Theo th−êng quy cña Trung t©m KiÓm so¸t BÖnh tËt

(CDC- Fort Collins, Colorado, US).

2.4.3. Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang trùc tiÕp

(Direct ImmunoFluorescent Antibody Assay – DFA).

(cid:190) Sau 7 ngµy ñ t¹i 28 oC, tÕ bµo ®−îc t¸ch ra khái ®¸y chai nu«i cÊy b»ng que

c¹o tÕ bµo (craper) hoÆc vç nhÑ vµo thµnh chai, t¸ch 1 ml m«i tr−êng cã chøa

tÕ bµo vµo èng ly t©m.

(cid:190) §¸nh dÊu sè thø tù cña mÉu trªn lam kÝnh 12 giÕng theo h×nh “ch÷ chi “

dµnh 1 giÕng cho chøng tÕ bµo. Nhá 20 µl hçn dÞch tÕ bµo cña mçi mÉu

vµo c¸c giÕng t−¬ng øng.

(cid:190) Cho 20 µl kh¸ng thÓ ®a dßng (pha lo·ng theo hiÖu gi¸ ®· chuÈn ®é) vµo tÊt c¶

c¸c giÕng cã tÕ bµo, ñ 37 0C/ 30 phót trong hép gi÷ Èm. Ng©m trong PBS/ 10

phót, tr¸ng qua n−íc cÊt, ®Ó kh« tù nhiªn.

(cid:190) Cho 20 µl céng hîp g¾n Fluorescen (pha lo·ng theo hiÖu gi¸ ®· chuÈn ®é)

vµo tÊt c¶ c¸c giÕng trªn, ñ 37 0C/ 30 phót trong hép gi÷ Èm. Ng©m trong

PBS/ 10 phót, tr¸ng qua n−íc cÊt, ®Ó kh« tù nhiªn.

(cid:190) NhËn ®Þnh kÕt qu¶:

TÕ bµo chøng ©m hoµn toµn kh«ng ph¸t s¸ng.

MÉu d−¬ng tÝnh: xuÊt hiÖn sù ph¸t s¸ng cña huúnh xung quanh mµng tÕ bµo.

2.4.4. Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n tiÕp

(Indirect InmunoFluorescent Antibody Assay– IFA).

TÊt c¶ mÉu d−¬ng tÝnh sÏ tiÕp tôc ®Þnh type b»ng kü thuËt miÕn dÞch huúnh

quang gi¸n tiÕp (IFA).

(cid:190) §¸nh dÊu sè thø tù cña mÉu trªn lam kÝnh 12 giÕng (Mçi bÖnh phÈm ®−îc

lµm trªn mét lam kÝnh).

2 giÕng hµng ®Çu nhá bÖnh ph©m d−¬ng tÝnh ®· biÕt.

2 giÕng hµng thø hai cho tÕ bµo ©m tÝnh (tÕ bµo kh«ng cã virus Dengue)

Nhá 20 µl hçn dÞch tÕ bµo cña mçi mÉu vµo 8 giÕng cuèi lam kÝnh.

Nhá mÉu huyÕt thanh bÖnh nh©n

(cid:190) Cho 20 µl céng hîp g¾n Fluorescen (pha lo·ng theo hiÖu gi¸ ®· chuÈn ®é)

vµo tÊt c¶ c¸c giÕng trªn.

(cid:190) NhËn ®Þnh kÕt qu¶:

Chøng d−¬ng: Ph¸t s¸ng xanh l¸ m¹ bao quanh tÕ bµo

TÕ bµo chøng ©m hoµn toµn kh«ng ph¸t s¸ng.

MÉu d−¬ng tÝnh: Ph¸t s¸ng cña huúnh xung quang mµng tÕ bµo gièng chøng

d−¬ng.

C¸c mÉu ©m tÝnh ®−îc tiÕp tôc nu«i t¹i 28 0C/ 7 ngµy tiÕp, sau ®ã lÆp l¹i ph−¬ng

ph¸p trªn.

Sau khi lÆp l¹i, lo¹i bá toµn bé c¸c mÉu ©m tÝnh lÇn thø 2.

2.4.5. Kü thuËt Trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö

( Plaque Reduction Neutralization Test - PRNT )

a/ ChuÈn bÞ m«i tr−êng:

- Th¹ch 2% trong n−íc cÊt (hÊp 120 0C/ 30 phót) duy tr× d¹ng dung dÞch trong

bÓ n−íc Êm 56 0C.

- M«i tr−êng dinh d−ìng MEM cã 20% FCS, duy tr× trong bÓ ë 44 0C. - MgCl2 100 mM b¶o qu¶n t¹i 4 0C. - Nu«i tÕ bµo BHK-21 trªn phiÕn nhùa 6 giÕng ®¸y b»ng t¹i 37 0C vµ 5% CO2.

b/ ChuÈn ®é virus

- Chñng virus dengue type 1 (Hawaii), dengue type 2 (Newguinea C), dengue

type 3 (H-87) vµ dengue type 4 (H-241) ®−îc pha lo·ng trong m«i tr−êng MEM

cã 5% FCS (tõ 10 -1 ®Õn 10-6).

- Chän phiÕn nhùa tÕ bµo BHK-21 mäc ®Ñp (thµnh 1 líp) lo¹i bá m«i tr−êng cò.

CÊy 0,1 ml virus pha lo·ng ë c¸c nång ®é kh¸c nhau vµo c¸c giÕng kh¸c nhau

trªn phiÕn nhùa. U 37 0C/ 60 phót .

- TÝnh l−îng th¹ch phñ cÇn thiÕt cho mét phiÕn theo c«ng thøc

MEM (10% FCS) : 10 ml

Th¹ch 2% : 10 ml

: 106 µl MgCl2 100 mM

: 0,6 ml

NaHCO3 7, 5% Duy tr× th¹ch phñ t¹i 44 0C.

- Phñ 3ml th¹ch phñ vµo mçi giÕng. §Ó ®«ng th¹ch, lËt óp phiÕn nhùa, ñ t¹i 37 0C vµ 5% CO2. - Sau 7 ngµy (dengue 1, dengue 2) vµ 10 ngµy (dengue 3 vµ dengue 4),

nhuém phiÕn nhùa b»ng dung dÞch nhuém Violet/formalin 10 %.

- §äc vµ tÝnh kÕt qu¶: HiÖu gi¸ t¹o ®¸m ho¹i tö cña virus lµ ®é pha lo·ng

lín nhÊt mµ virus cã kh¶ n¨ng t¹o 1 ®¸m ho¹i tö. (VÝ dô: t¹i ®é pha lo·ng

10-4 virót dengue type 2 t¹o ®−îc 2 ®¸m ho¹i tö , vËy hiÖu gi¸ cña virót

dengue type 2 sÏ lµ 10-4 + lg 2=10-4,2). §ã chÝnh lµ 1 ®¬n vÞ ®¸m ho¹i tö

(Plaque Forming Unit - PFU).

c/ TiÕn hµnh ph¶n øng trung hoµ gi¶m ®¸m ho¹i tö.

- HuyÕt thanh bÖnh nh©n pha lo·ng theo tû lÖ 1/ 5 trong MEM cã 5% FCS. BÊt

ho¹t 30 phót ë 56 0C.

- Pha lo·ng virót theo hiÖu gi¸ ®· chuÈn ®é ®Ó ®¹t nång ®é 200 PFU/ 1ml trong

MEM cã 5% FCS.

- HuyÕt thanh bÖnh nh©n tiÕp tôc ®−îc pha lo·ng bËc hai (tõ 1/ 5-1/ 160) b»ng

MEM cã 5% FCS trªn phiÕn nhùa 96 giÕng ®¸y trßn, dµnh 1 hµng chØ cã MEM

lµm chøng virót.

- Thªm 100 µl virus ®· pha lo·ng (200 PFU/ ml) vµo tÊt c¶ c¸c giÕng (kÓ c¶

hµng chøng virót) nh− vËy ta sÏ cã nång ®é pha lo·ng cuèi cïng víi huyÕt thanh

lµ 1/ 10-1/ 320 vµ virus lµ 100 PFU. ñ ë 4 0C/qua ®ªm.

- Chän phiÕn nhùa tÕ bµo BHK-21 mäc ®Ñp (thµnh 1 líp), lo¹i bá m«i tr−êng cò,

cÊy 100 µl hçn dÞch trªn ë c¸c ®é pha lo·ng vµo c¸c giÕng kh¸c nhau trªn

phiÕn nhùa (mçi huyÕt thanh, chøng virót/ 1 phiÕn nhùa) .

- Phñ 3 ml th¹ch phñ (nh− chuÈn ®é virót) vµo mçi giÕng. §Ó ®«ng th¹ch, lËt óp phiÕn nhùa, ñ t¹i 37 0C vµ 5% CO2. - Sau 7 ngµy nhuém phiÕn nhùa b»ng dung dÞch nhuém Violet/formalin 10%.

- NhËn ®Þnh kÕt qu¶:

+ Nång ®é virót ®Ých thùc dïng cho ph¶n øng sau khi chuÈn ®é l¹i.

+ GiÕng d−¬ng tÝnh lµ c¸c giÕng cã sè ®¸m ho¹i tö ®Õm ®−îc Ýt h¬n 10% tæng sè

PFU cña virót sö dïng cho ph¶n øng (nÕu virót chuÈn ®é l¹i ®¹t 100 PFU th×

giÕng (+) lµ giÕng cã sè ®¸m ho¹i tö ®Õm ®−îc < 10).

+ HiÖu gi¸ KT trung hoµ cña huyÕt thanh lµ ®é pha lo·ng huyÕt thanh cuèi cïng

cã sè ®¸m ho¹i tö ®Õm ®−îc gi¶m 90% so víi nång ®é virus sö dông.

2.4.6. Ph−¬ng ph¸p tæng hîp d©y chuyÒn chuçi nhê polymerase

(RT-PCR - Polymerase Chain Reaction)- Karl Mullis vµ CS - 1985

1. Nguyªn t¾c.

TÊt c¶ c¸c DNA polymerase khi ho¹t ®éng tæng hîp mét m¹ch DNA míi tõ

m¹ch khu«n ®Òu cÇn sù hiÖn diÖn cña nh÷ng måi chuyªn biÖt. Måi lµ nh÷ng

®o¹n DNA ng¾n, cã kh¶ n¨ng b¾t cÆp bæ sung víi mét m¹ch cña khu«n vµ DNA

polymerase sÏ nèi dµi måi ®Ó h×nh thµnh m¹ch míi. Ph−¬ng ph¸p PCR ®−îc

h×nh thµnh dùa vµo ®Æc tÝnh ®ã cña c¸c DNA polymerase. §Ó khuÕch ®¹i mét

tr×nh tù DNA x¸c ®Þnh, ta ph¶i cã th«ng tin tèi thiÓu vÒ tr×nh tù ®ã ®Ó ®ñ t¹o ra

c¸c måi bæ xung chuyªn biÖt; C¸c måi nµy gåm mét måi xu«i (sens primer hay

F) vµ mét måi ng−îc (antisera primer hay R) theo chiÒu phiªn m· cña gen.

2. C¸c b−íc c¬ b¶n.

Ph¶n øng PCR lµ mét chuçi nhiÒu chu kú (cycle) nèi tiÕp nhau. Mçi chu kú gåm

ba b−íc:

- B−íc 1: Giai ®o¹n biÕn tÝnh (Denaturation)

Trong dung dÞch cÇn thiÕt cho sù sao chÐp, ph©n tö DNA ®−îc biÕn tÝnh ë

nhiÖt ®é cao h¬n Tm cña ph©n tö (th−êng 94-95 0C) trong 30gi©y - 1 phót

- B−íc 2: Giai ®o¹n lai (Hybridization) NhiÖt ®é ®−îc h¹ thÊp (thÊp hon måi

Tm) cho phÐp c¸c måi b¾t cÆp víi khu«n (kho¶ng 40-70 0C tuú thuéc Tm cña

måi sö dông) kÐo dµi trong 30 gi©y - 1 phót.

- B−íc 3: Giai ®o¹n tæng hîp (hay kÐo dµi) Elongation. NhiÖt ®é t¨ng.

72 0C gióp cho DNA polymerase sö dông (Polymera se nµy chÞu nhiÖt ho¹t

®éng tæng hîp tèt nhÊt). Thêi gian tuú thuéc ®é dµi cña tr×nh tù DNA cÇn

khuyÕch ®¹i, th−êng tõ 30 gi©y ®Õn nhiÒu phót.

Mét chu kú gåm ba b−íc trªn sÏ ®−îc lÆp ®i lÆp l¹i nhiÒu lÇn vµ mçi lÇn sÏ

t¨ng gÊp ®«i l−îng mÉu lÇn tr−íc (khuyÕch ®¹i theo cÊp sè nh©n). Theo tÝnh

to¸n sau 30 chu kú sù khuyÕch ®¹i sÏ lµ 106 so víi l−îng mÉu ban ®Çu.

3. Th−êng quy tæng hîp d©y chuyÒn chuçi nhê polymerase

Ph−¬ng ph¸p nµy ®−îc tiÕn hµnh qua 3 giai ®o¹n

a/ T¸ch chiÕt ARN.

Sö dông bé sinh phÈm cña h·ng Qiagen (Mü) dùa vµo sù g¾n chän läc

c¸c ph©n tö nhá (ARN) vµo mµng silicagen phèi hîp víi kü thuËt quay trßn vi

cÊp (microspin). §©y lµ ph−¬ng ph¸p lý t−ëng nhÊt ®Ó t¸ch chiÕt ARN hiÖn nay.

Toµn bé c¸c b−íc tiÕn hµnh ë nhiÖt ®é phßng thÝ nghiÖm. Qui tr×nh ®−îc tiÕn

hµnh qua c¸c b−íc sau:

- Trén ®Òu 140 µl mÉu thö (dÞch næi nu«i tÕ bµo, huyÕt thanh,huyÕt t−¬ng...) víi

560 µl ®Öm AVL. §Ó 10 phót. (1)

- Thªm 560 µl ethanol (100%) vµo hçn dÞch trªn, trén ®Òu.(2)

- §Æt cét QIA amp spin vµo èng ly t©m s¹ch. T¸ch 630 µl hçn dÞch vµo cét QIA

amp spin.

- Ly t©m 3000 vßng /phót/ phót. Lo¹i bá èng ly t©m.(3)

- LÆp l¹i (3).

- §Æt cét QIA amp spin vµo èng ly t©m s¹ch, röa cét QIA amp spin b»ng 500 µl

®Öm AV, ly t©m t¹i 3000 vßng/ phót/ phót. Lo¹i bá èng ly t©m.(4)

- LÆp l¹i (4) nh−ng ly t©m ë tèc ®é cao 14000 vßng/ phót/ 3 phót.

- §Æt l¹i cét QIA amp spin vµo èng ly t©m s¹ch (cã n¾p b¶o qu¶n tèt). Cho 50

µl n−íc cÊt tinh khiÕt (®· lµm nãng t¹i 80 0C) vµo cét, ñ t¹i 80 0C/ 5 phót, ly t©m

8000 vßng / phót. Lo¹i bá cét QIA amp spin, gi÷ l¹i n−íc trong èng ly t©m (®ã

chÝnh lµ ARN cña virus).

- B¶o qu¶n t¹i -20 0C hoÆc -70 0C trong 1 n¨m.

b/ PCR giai ®o¹n 1(RT-PCR).

(Tæng hîp cADN ®Æc hiÖu cho nhãm Flavivirus tõ ARN)

H×nh 7. Ph¶n øng Polymerasa sao chÐp ng−îc

- TÝnh l−îng hçn dÞch sinh phÈm cÇn dông cho 1 mÉu theo c«ng thøc sau :

+ N−íc cÊt tinh khiÕt 28 µl

+ 5x ®Öm PCR 10 µl

+ d NTP 1 µl

+ DTT 100 mM 2,5 µl

+ RNAza Inhibitor 0,5 µl

+ Primer D1 (100 µM) 1 µl

+ Primer D2 (100 µM) 1 µl

+ Enzym phiªn m· ng−îc

(Reverse Transcriptase) 1 µl

+ Enzym chÞu nhiÖt

(Taq- Polymeraza) 1 µl

- Trén 45 µl hçn hîp PCR víi 5 µl ARN ®· t¸ch chiÕt.

- Cµi ®Æt c¸c chu kú nhiÖt vµo m¸y PCR

45 0C 70 phót

94 0C 03 phót

94 0C 30 gi©y

50 0C 1 phót

68 0C 8 phót

Gi÷ t¹i 4 0C.

- §iÖn di trªn th¹ch: Sö dông th¹ch 1,3 % cã thªm

ethidium bromid, ®iÖn di trong 30 phót.

Trong giai ®o¹n RT-PCR nµy ph¶n øng PCR ®· diÔn ra qua 2 qu¸ tr×nh: phiªn

m· ng−îc ARN thµnh cADN ®Æc hiÖu cña Flavivirus víi sù tham gia cña primer

D1 kÕt hîp ARN cña virus (®ãng vai trß primer bæ trî) kÕt hîp víi enzym phiªn

m· ng−îc (RT); TiÕp lµ thùc hiÖn khuyÕch ®¹i chuçi ADN víi sù tham gia cña

primer D1 vµ D2 (primer ®Æc hiªô cña Flavivirus). KÕt thóc giai ®o¹n nµy c¸c

virus trong nhãm Flavivirus ®−îc x¸c ®Þnh lµ c¸c b¨ng d−¬ng tÝnh cã ®é dµi 511

cÆp baz¬ (bp). TÊt c¶ c¸c mÉu d−¬ng tÝnh sÏ ®−îc tiÕn hµnh PCR ë giai ®o¹n 2.

c/ PCR giai ®o¹n 2 (Nested PCR)

X¸c ®Þnh type cña virót Dengue.

+ TÝnh l−îng hçn hîp sinh phÈm PCR cÇn cho 1 mÉu theo c«ng thøc sau:

- N−íc tinh khiÕt 68 µl

- 5x ®Öm PCR 20 µl

- d NTP 2 µl

- Primer D1 1 µl

- Primer TS 1 1 µl

- Primer TS 2 1 µl

- Primer TS 3 1 µl

- Primer TS 4 1 µl

- Taq -polymeraza 0,5 µl

+ Trén ®Òu 5 µl cADN tæng hîp ®−îc t¹i PCR giai ®o¹n 1 (®· pha lo·ng 1/

100 trong n−íc tinh khiÕt) víi 50 µl hçn hîp PCR.

+ Cµi ®Æt chu kú nhiÖt vµo m¸y PCR

20 chu kú 94 0C/ 1phót

50 0C/ 2 phót

72 0C/ 3 phót

1 chu kú 72 0C/ 7 phót

Gi÷ t¹i 4 0C

+ §iÖn di trªn th¹ch 1,3 % cã ethidium bromid, 30 phót.

Ph¶n øng PCR giai ®o¹n 2 víi sù tham gia cña c¸c primer ®Æc hiÖu cña 4

type virót dengue (®ãng vai trß bæ trî) kÕt hîp víi primer D1, sau 20 chu kú

nhiÖt s¶n phÈm ADN ®Æc hiÖu cho 4 type virót dengue sÏ ®−îc nh×n thÊy sau

khi ®iÖn di ®ã lµ c¸c b¨ng d−¬ng tÝnh víi ®é dµi kh¸c nhau ë c¸c type kh¸c

nhau

ADN ®Æc hiÖu cña virót dengue type 1 cã ®é dµi 482 bp

ADN ®Æc hiÖu cña virót dengue type 2 cã ®é dµi 119 bp

ADN ®Æc hiÖu cña virót dengue type 3 cã ®é dµi 290 bp

ADN ®Æc hiÖu cña virót dengue type 4 cã ®é dµi 392 bp

B. Bé sinh phÈm chÈn ®ãan bÖnh Viªm ®−êng h« hÊp cÊp SARS

2.1. §èi t−îng nghiªn cøu

- 37 bÖnh nh©n trªn l©m sµng ®−îc chÈn ®o¸n lµ nhiÔm SARS

theo c¸c tiªu chuÈn cña TCYTTG qui ®Þnh.

+TriÖu chøng toµn th©n : Sèt cao trªn 380C,m¹ch

nhanh,®au ®Çu, ®au mái c¸c c¬.

+TriÖu chøng h« hÊp : cã mét trong c¸c triÖu chøng sau :

Ho khan, khã thë: thë nhanh n«ng trªn 25 lÇn/phót

C¸c dÊu hiÖu suy h« hÊp cÊp.

Nghe phæi cã thÓ cã nhiÒu ran.

- 112 nh©n viªn bÖnh viÖn ViÖt –Ph¸p ,viÖn Y häc L©m sµng c¸c bÖnh

nhiÖt ®íi Hµ n«i, BÖnh viÖn ®a khoa tØnh Ninh B×nh n¬i tiÕp nhËn vµ ®iÒu trÞ

bÖnh nh©n SARS.

C¸ch tiÕp cËn:

SARS lµ mét lo¹i bÖnh dÞch míi cã c¨n nguyªn g©y bÖnh lµ virus, v× vËy:

Tõ c¸c ph−¬ng ph¸p, c¸c kü thuËt theo qui tr×nh chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh bÖnh cña

c¸c phßng thÝ nghiÖm chuÈn thøc quèc tÕ trong x¸c ®Þnh t¸c nh©n g©y ra 4 bÖnh

dÞch míi ë ViÖt Nam mµ §Ò tµi KC.04.32 ®ang tiÕn hµnh; kÕt hîp víi c¸c

ph−¬ng ph¸p, ®iÒu kiÖn kü thuËt kinh nghiÖm s½n cã cña c¸c Phßng thÝ nghiÖm

chuÈn thøc quèc gia cña ViÖn VSDTT¦ trong ph©n lËp, nghiªn cøu c¸c t¸c

nh©n g©y bÖnh (nh− virus cóm ë ng−êi vµ gia cÇm, virus dengue, virus Hanta,

virus viªm n·o NhËt b¶n vµ c¸c vi khuÈn g©y bÖnh) cã thÓ ph¸t triÓn c¸c kü thuËt

míi trong nghiªn cøu x¸c ®Þnh c¨n nguyªn g©y bÖnh dÞch SARS ; cïng víi ho¹t

®éng cña HÖ thèng gi¸m s¸t c¸c bÖnh truyÒn nhiÔm g©y dÞch ë 61 tØnh/ thµnh phè

trong c¶ n−íc sÏ t¹o ®iÒu kiÖn cho viÖc triÓn khai nghiªn cøu còng nh− viÖc ¸p

dông kÕt qu¶ nghiªn cøu trong c«ng t¸c phßng chèng bÖnh dÞch SARS ë ViÖt

Nam.

2.2. VËt liÖu

2.2.1. MÉu bÖnh phÈm 2

2.2.1.1. Virót SARS- CoV

Virus SARS dïng ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn (SARS- CoV/ Hanoi 01-03) ®−îc

ph©n lËp tõ 1 bÖnh nh©n ViÖt nam (P.T.L) , ®−îc khuyÕch ®¹i trªn dßng tÕ bµo

th−êng trùc Vero E6 duy tr× trong m«i tr−êng MEM (Eagle Minimum Essential

medium ) cã bæ sung thªm 2% huyÕt thanh bª bµo thai (FBS) vµ mét sè acid

amin cÇn thiÕt kh¸c. ñ t¹i 37 0C trong vßng 4 ngµy.

2.2.1.2. HuyÕt thanh bÖnh nh©n

- 36 bÖnh nh©n ®−îc chÈn ®o¸n l©m sµng lµ nhiÔm virrut SARS –CoV

- 112 nh©n viªn y tÕ cã tiÕp xóc trùc tiÕp víi bÖnh bÖnh nh©n SARS-CoV

kh«ng cã biÓu hiÖn l©m sµng

- 175 ng−êi t×nh nguyÖn kháe m¹nh.

. TiÕn hµnh lÊy 2-5 ml m¸u tÜnh m¹ch:

Ly t©m 2000 vßng/ phót, ch¾t huyÕt thanh, b¶o qu¶n -80 0C cho tíi khi sö

dông.

2.2.2. TÕ bµo

TÕ bµo thËn khØ th−êng trùc: Vero E6 (CDC - Mü).

2.2.3. Sinh phÈm kh¸c :

Tªn sinh phÈm Lo¹t

HuyÕt thanh chøng d−¬ng VVSDTT¦

Céng hîp g¾n g¾n enzyme (kh¸ng thÓ dª kh¸ng IgA, IgG vµ KPL- Mü

IgM ng−êi) KPL-Mü

C¬ chÊt ABTS vµ hydrogen peroxide QIAgen- §øc.

KÝt t¸ch chiÕt ARN Invitrogen -

Enzym giíi h¹n Bam HI Mü

Vµ mét sè sinh phÈm ®Æc hiÖu kh¸c. .

2.2.4. M«i tr−êng vµ ho¸ chÊt :

M«t tr−êng ho¸ chÊt sö dông cho nghiªn cøu ®−îc cung cÊp bëi h·ng Gibco

BRL vµ sö dông theo th−êng quy cña h·ng.

2.2. Nghiªn cøu c¨n nguyªn SARS:

Ph¸t triÓn c¸c kü thuËt chÈn ®o¸n c¨n nguyªn SARS còng nh− mét hiÓu biÕt

s©u h¬n vÒ virus lµ rÊt cÇn thiÕt trong kiÓm so¸t bÖnh SARS . GÇn ®©y ®· cã

nhiÒu tiÕn bé vÒ c¸c Test chÈn ®o¸n SARS sö dông ELISA, IFA, RT-PCA vµ

nu«i cÊy virus. B−íc ®Çu ë ViÖt Nam ®· nghiªn cøu thµnh c”ng ph−¬ng ph¸p

ph¸t hiÖn t¸c nh©n g©y bÖnh SARS (tõ bÖnh phÈm cña bÖnh nh©n trong vô

dÞch) b»ng kü thuËt RT-PCR, nhËn d¹ng virus SARS Corona b”ng ph−¬ng

ph¸p hiÓn vi ®iÖn tö truyÒn qua (TEM) vµ ph©n lËp virus trªn dßng tÕ bµo

Vero E6.

Do ch−a hoµn chØnh ®−îc phßng ThÝ nghiÖm P3, nªn c¸c kü thuËt nµy míi lµm

®−îc trªn mét sè l−îng mÉu cßn rÊt nhá (kho¶ng 15 % sè mÉu thu thËp ®−îc

trong vô dÞch), cÇn tiÕp tôc nghiªn cøu ®Ó hoµn chØnh kü thuËt vµ quy tr×nh

chÈn ®o¸n x¸c ®Þnh. MÆt kh¸c do tÝnh chÊt nguy hiÓm cña lo¹i bÖnh dÞch nµy

®ßi hái ph¶i cã nh÷ng nghiªn cøu vµ hiÓu biÕt nhiÒu h¬n n÷a vÒ ®Æc tÝnh cña

t¸c nh©n g©y bÖnh ®Ó lµm c¬ së cho c«ng t¸c phßng chèng SARS cã hiÖu qu¶.

2.2.1. ChuÈn bÞ phßng thÝ nghiÖm an toµn sinh häc cÊp 3:

- Virus SARS lµ mét vi rut nguy hiÓm thuéc nhãm 4. Do tÝnh chÊt nguy

hiÓm cña lo¹i virus nµy mµ ®ßi hái ph¶i cã mét phßng thÝ nghiÖm an toµn sinh

häc cÊp 3 ®Ó tiÕn hµnh nh÷ng nghiªn cøu s©u h¬n n÷a vÒ t¸c nh©n g©y bÖnh,

lµm c¬ së cho c«ng t¸c phßng chèng SARS cã hiÖu qu¶. §ång thêi, ®¶m b¶o

sù an toµn cho nh©n viªn lµm viÖc t¹i phßng thÝ nghiÖm.

- N©ng cÊp phßng thÝ nghiÖm ®Ó cã mét phßng thÝ nghiÖm an toµn sinh häc

cÊp 3

2.2.2. Ph©n lËp t¸c nh©n c¨n nguyªn cña héi chøng SARS:

- Ph©n lËp virus trªn dßng tÕ bµo nu«i Vero E6.

- MÉu bÖnh phÈm: t¨m b«ng mòi – häng ®−îc b¶o qu¶n trong m«i tr−êng

vËn chuyÓn

- X¸c ®Þnh c¸c mÉu cã hñy ho¹i tÕ bµo (CPE)

2.2.3.X¸c ®Þnh t¸c nh©n c¨n nguyªn:

Virus sau khi ph©n lËp ®−îc x¸c ®Þnh thÓ lo¹i b»ng:

a)Thö nghiÖm RT-PCR:

- PCR ®−îc thiÕt kÕ dùa trªn nguyªn lý ADN polymerase vµ c¸c

oligonucleotide (®o¹n måi) ®Ó tæng hîp mét ®o¹n ADN bÊt kú theo môc ®Ých

nghiªn cøu. §èi víi virus SARS cÊu t¹o vËt liÖu di truyÒn lµ ARN th× ph¶i tr¶i

qua giai ®o¹n tæng hîp ng−îc tõ ARN t¹o thµnh cADN tr−íc khi tiÕn hµnh

PCR.

- Måi sö dông theo thiÕt kÕ CDC-Mü: Cor-p-F2/Cor-p-R1.

- Khi sö dông cÆp måi trªn víi bÖnh phÈm SARS cho s¶n phÈm ADN cã

träng l−îng ph©n tö lµ 368bp.

b)Ph¶n øng trung hßa trªn nu«i tÕ bµo:

Ph¶n øng trung hßa ®−îc tiÕn hµnh víi huyÕt thanh cña bÖnh nh©n ®· håi

phôc trong vô dÞch.

c)H×nh th¸i siªu cÊu tróc ë kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö:

-Ph−¬ng ph¸p nhuém ©m b¶n: quan s¸t trùc tiÕp virus trong n−íc næi nu«i

tÕ bµo.

- Ph−¬ng ph¸p l¸t c¾t máng: quan s¸t t×m virus trong tÕ bµo.

- Nghiªn cøu sù ®¸p øng miÔn dÞch kh¸ng nguyªn kh¸ng thÓ cña virus b»ng

ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch g¾n vµng.

2.2.4. Nu«i virus SARS:

TiÕn hµnh nu«i cÊy mét l−îng ®ñ ®Ó nghiªn cøu vÒ kh¸ng nguyªn

a)ThuÇn khiÕt di truyÒn häc ®Ó cã ®−îc gièng virus chuÈn:

Gièng virus sau khi ®−îc ph©n lËp sÏ ®−îc thuÇn khiÕt di truyÒn häc b»ng kü

thuËt t¹o ®¸m ho¹i tö ba lÇn liªn tiÕp, mçi lÇn tõ mét khoanh ho¹i tö. Nh− vËy,

gièng virus ®−îc thuÇn khiÕt kh«ng nh÷ng ®¶m b¶o tÝnh ®Æc thï vÒ kiÓu lo¹i

miÔn dÞch häc mµ cßn duy tr× ®−îc sù ®ång nhÊt vÒ chÊt l−îng.

b)Nu«i ®ñ l−îng virus:

- KhuyÕch ®¹i chñng virus SARS trªn tÕ bµo Vero E6.

- X¸c ®Þnh hiÖu gi¸ virus b»ng c¸ch t¹o ®¸m ho¹i tö cho c¸c virus trªn nu«i

mét líp tÕ bµo.

- Thu ho¹ch, bÊt ho¹t vµ béc lé yÕu tè kh¸ng nguyªn cña virus.

- Läc qua läc millipore ®Ó thu ®−îc kh¸ng nguyªn tinh khiÕt.

2.2.5. Bé sinh phÈm chÈn ®o¸n ELISA (Ph¶n øng miÔn dÞch g¾n enzym):

Hoµn thiÖn bé sinh phÈm ELISA chÈn ®o¸n SARS ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ

IgM, IgG vµ IgA kh¸ng virus SARS.

Trang thiÕt bÞ vµ dông cô

Toµn bé c¸c thö nghiÖm ®−îc thùc hiÖn t¹i ViÖn VSDT T¦ vµ ViÖn

nghiªn cøu c¸c bÖnh nhiÖt ®íi - §¹i häc Nagasaki – NhËt b¶n víi trang thiÕt bÞ

vµ dông cô ®¶m b¶o an toµn sinh häc cho nh©n viªn phßng thÝ nghiÖm vµ m«i

tr−êng xung quanh.

Trang thiÕt bÞ H·ng

Phßng thÝ nghiÖm an toµn sinh häc cÊp ®é 3 ViÖn VSDTT¦

Buång cÊy an toµn sinh häc (Biosafety Cabinet)- Class 2,3 Bioquell - Anh

Tñ Êm CO2 KÝnh hiÓn vi quang häc lén ng−îc Ceti - BØ

Tñ l¹nh: 40C, -200C vµ -800C Sanyo- NhËt

M¸y ly t©m Sanyo- NhËt

M¸y khuyÕch ®¹i gen ..... Rotofex - Mü

M¸y ®äc tr×nh tù gen MJ-Mü

ABI-Mü

M¸y ®äc ELISA Biorad -Mü

Vµ mét sè trang thiÕt bÞ cÇn thiÕt kh¸c

2.3. Ph−¬ng ph¸p :

2.3.1. Ph©n lËp virus SARS-CoV:

Virus SARS dïng ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn ( SARS- CoV/ Hanoi 01-03)

®−îc ph©n lËp tõ 1 bÖnh nh©n ViÖt nam ( P.T.L) , ®−îc khuyÕch ®¹i trªn dßng

tÕ bµo th−êng trùc Vero E6 duy tr× trong m«i tr−êng MEM ( Eagle Minimum

Essential medium ) cã bæ sung thªm 2% huyÕt thanh bª bµo thai (FBS) vµ mét

sè acid amin cÇn thiÕt kh¸c. ñ t¹i 370C trong vßng 4 ngµy. TÕ bµo Vero E6 xuÊt

hiÖn hñy ho¹i (CPE) sau 24 giê vµ ®¹t 80-100% CPE t sau 4 ngµy.

N−íc næi chøa virus SARS ®−¬c thu thËp vµ ly t©m lo¹i bá tÕ bµo chÕt t¹i

2000vßng/ 10 phót. Virus SARS –CoV ®−îc thu thËp vµ b¶o qu¶n t¹i -800C .

2.3.2. T¹o plasmid t¸i tæ hîp.

VËt liÖu di truyÒn (ARN) cña virus SARS ®−îc t¸ch chiÕt tõ 140ul

n−íc næi nu«i cÊy theo th−êng quy cña bé sinh phÈm t¸ch chiÕt RNA (

Qiagen, Hilden, Germany). ARN cña virus SARS thu ®−îc sau khi t¸ch

chiÕt cã thÓ tÝch 60µl sau ®ã ®−îc sö dông lµm khu«n ®Ó tæng hîp cDNA

sö dông Hexa random primer, Transcriptasse .... (Invitrogen). Ph¶n øng

tæng hîp cDNA tõ ARN khu«n ®−îc thùc hiÖn t¹i 42 0C trong vßng 30

phót.

Protein N cña virus SARS-CoV ®−îc lùa chän ®Ó sö dông lµm kh¸ng

nguyªn t¸i tæ hîp. KhuyÕch ®¹i protein N ®−îc thùc hiÖn th«ng qua ph¶n

øng PCR dùa trªn khu«n mÉu cDNA. HÖ thèng primer thiÕt kÕ cho PCR

dùa vµo c¸c th«ng tin ®· cã trªn Genbank, primer cã cÊu tróc nh− sau :

5’-TAATGGATCCCAATCAAACCAA-3’ ( primer xu«i)

5’-TGTGTCGACATGAGTGTTTAT-3’ ( primer ng−îc)

CÊu tróc primer xu«i vµ ng−îc ®Òu bao gåm khu vùc giíi h¹n cña enzym Bam

HI (g¹ch d−íi) . Ph¶n øng PCR khuyÕch ®¹i cADN sö dông bé sinh phÈm Taq

polymerase (Invitrogen –Mü):1µl cADN vµ 50pmol cña mçi primer trong tæng

sè 50 µl cña 1 ph¶n øng ®−îc ¸p dông theo th−êng quy cña bé sinh phÈm. Ph¶n

øng PCR qua c¸c giai ®o¹n nhiÖt sau: 94 0C /2 phót; lÆp l¹i 34 lÇn c¸c chu kú

nhiÖt tiÕp theo 94 0C /30 gi©y; 54 0C /30 gi©y; 70 0C /30 gi©y vµ chu kú nhiÖt

cuèi cïng 72 0C ®−îc kÐo dµi 10 phót. S¶n phÈm khuyÕch ®¹i ®−îc ph©n tÝch

b»ng ®iÖn di th¹ch 1% trong ®ÖmTris-borate (TBE), vµ quan s¸t ®−îc th«ng qua

nhuém b»ng ethidium bromide. S¶n phÈm PCR cã ®é dµi 1.3 kb ®−îc c¾t bëi

enzym giíi h¹n Bam HI t¹i c¸c vÞ trÝ ®· biÕt vµ ®−îc t¹o dßng trong plasmid

pQE30 (Qiagen, Hilden, Germany). Mét ph©n ®o¹n cña protein N∆ ( tõ vÞ trÝ

122- 422) ®· ®−îc t¹o dßng, biÓu hiÖn trong plasmid pQE30 vµ ®ã chÝnh lµ ®Þnh

d¹ng cña kh¸ng nguyªn SARS-CoV t¸i tæ hîp d¹ng th« cã thÓ sö dông trong

ph¶n øng ELISA ph¸t hiÖn nhiÔm virus SARS-CoV th«ng qua kh¸ng thÓ ®Æc

hiÖu IgM.

2.3.3. BiÓu lé vµ tinh s¹ch kh¸ng nguyªn .

Protein N cña virus SARS-CoV ®−îc biÓu lé th«ng qua viÖc chuyÓn nhiÔm

plamsid pQE30 cã chøa protein N vµo E.coli dßng DH5α cã nhuém b»ng

XL1 vµ nu«i cÊy trong m«i tr−êng Luria-Bertani chøa 100ug /ml ampiciline

t¹i 30 0C. Khi ®é ®ôc cña m«i tr−êng nu«i cÊy ®¹t 600nm (OD 600), sù nh©n

lªn cña E. Coli ®−îc dõng l¹i khi thªm 0,2mM isopropyl- β-d-

thiogalactopyranoside (IPTG) vµ ñ 3 giê t¹i nhiÖt ®é phßng. TÕ bµo vi khuÈn

E.coli ®−îc gÆt b»ng c¸ch ly t©m t¹i 2500 vßng/ 30 phót vµ röa 3 lÇn b»ng PBS

0C. Sau khi tiÕn hµnh qui tr×nh ®«ng b¨ng, tan ch¶y 3 lÇn, hçn dÞch tÕ bµo ®−îc

(pH 7,2) sau ®ã ®−îc hßa tan trong 10mM PBS (pH 7,5) vµ ®«ng b¨ng t¹i -80

0C. N−íc næi sÏ ®−îc tinh läc qua cét läc Talon IMAC, c¸c protein N cã träng

siªu ©m trong vßng 2 phót sau ®ã li t©m 30.000 vßng/ phót trong 15 phót t¹i 4

l−îng ph©n tö x¸c ®Þnh sÏ ®−îc gi÷ l¹i trong mµng läc. Röa s¹ch cét läc 3 lÇn

b»ng 10mM PBS (pH 7,5), protein tinh s¹ch sÏ ®−îc t¸ch ra khái mµng läc b»ng

10mM PBS (pH 7,5) cã chøa 20mM immidazol. Hçn dÞch protein sÏ ®−îc chia

nhá vµ thªm glyceron ®Ó ®¹t nång ®é cuèi cïng lµ 10% gryceron trong hçn

dÞch , b¶o qu¶n t¹i -80 0C. Nång ®é cña protein ®−îc ®Þnh l−îng b»ng ph−¬ng

ph¸p Bradford khi sö dông kit ®Þnh l−îng Bio-rad. §é tinh s¹ch cña protein

®−îc kiÓm tra th«ng qua ®iÖn di trªn th¹ch SDS- PAGE [46].

2.3.4. Ph−¬ng ph¸p hÊp phô miÔn dÞch liªn kÕt enzyme tãm b¾t kh¸ng thÓ

IgM (MAC- ELISA)

• ChuÈn bÞ dung dÞch pha lo·ng:

Thµnh phÇn ThÓ tÝch

§Öm phèt ph¸t (PBS) 880ml

Bét s÷a t¸ch chÊt bÐo (skim milk) 50g

Tween-20 5ml

NaOH 2M ®iÒu chØnh pH 7,4

Tæng thÓ tÝch khi thªm n−íc cÊt 1000ml

• TiÕn hµnh ph¶n øng.

Pha lo·ng mÉu huyÕt thanh (chøng d−¬ng, chøng ©m, mÉu bÖnh phÈm) theo

tØ lÖ 1/100 trong dung dÞch pha lo·ng huyÕt thanh.

a/ Phñ b¶n ELSIA b»ng 100 ul/ giÕng kh¸ng thÓ dª kh¸ng IgM ng−êi

(KPL- Mü) vãi nång ®é 1/250 trong dung dÞch ®Öm PBS pH 7,4 trªn phiÕn nhùa

96 giÕng ®¸y b»ng. §Ó qua ®ªm ë 40C.

b/ Cho 100µl huyÕt thanh bÖnh nh©n ®· pha lo·ng vµo mçi giÕng cña

phiÕn nhùa.

HuyÕt thanh chøng d−¬ng vµ huyÕt thanh chøng ©m còng ®−îc thùc

hiÖn t−¬ng tù. PhiÕn nhùa ®−îc ö t¹i ñ 37 0C/ 60 phót.

c/ Cho 100µl kh¸ng nguyªn SARS t¸i tæ hîp cã nång ®é 0,2µg vµo mçi

giÕng cña phiÕn nhùa, ñ 37 0C/ 60 phót.

d/ Cho 100 µl kh¸ng thÓ ®a dßng kh¸ng SARS-CoV (KT dª kh¸ng

SARS-CoV pha lo·ng 1:4000- ) vµo mçi giÕng cña phiÕn nhùa,

ñ 37 0C/ 60 phót.

e/ Cho 100 µl céng hîp g¾n enzyme horseradish peroxidase (HRP)

(KT chuét kh¸ngdª g¾n enzyme HPR- Biosource- CA-Mü) pha lo·ng 1/4000.

ñ 37 0C/ 60 phót.

g/ Cho 100 µl c¬ chÊt ®−îc pha lo·ng theo tØ lÖ 1/1: ABTS (2,2’-azino-di-

(3-ethlybenzthiazoline-6-sulfonate- Kirkegaar & Perry Laboratory) vµ

hydrogen peroxide vµo mçi giÕng. ñ 370C/ 30 phót, tèi.

f/ §äc kÕt qu¶ ph¶n øng b»ng m¸y ®äc ELISA t¹i b−íc sãng 410 nm vµ

490 nm.

Toµn bé c¸c b−íc cña ph¶n øng khi kÕt thóc ®Òu ph¶i röa 3 lÇn phiÕn

nhùa b»ng PBS - 0,1% Tween 20, pH 7,4 tr−íc khi chuyÓn sang b−íc tiÕp theo.

NhËn ®Þnh kÕt qu¶ :

KÕt qu¶ cña ph¶n øng ®−îc chÊp nhËn khi

Gi¸ trÞ hÊp phô OD chøng d−¬ng / OD chøng ©m ≥ 2

Gi¸ trÞ hÊp phô OD chøng ©m/ OD dd pha lo·ng ≥2

MÉu huyÕt thanh ®−îc nhËn ®Þnh lµ d−¬ng tÝnh khi :

Gi¸ trÞ hÊp phô(OD) mÉu huyÕt thanh / OD chøng ©m ≥ 5

NÕu tû lÖ nµy ≥ 20, mÉu huyÕt thanh ®−îc nhËn ®Þnh lµ d−¬ng tÝnh m¹nh

2.3.5. Ph−¬ng ph¸p Western Blot.

Protein t¸i tæ hîp N ®−îc ph©n t¸ch th«ng qua ®iÖn di trªn gel SDS-

PAGE 12% sau ®ã kÕt qu¶ ph©n t¸ch ®−îc chuyÓn vµo mµng nitrit

cellulose. Sauk hi cè ®Þnh b»ng 5% s÷a t¸ch b¬ trong vßng 2 giê, mµng

cellulose sÏ ®−îc ñ víi kh¸ng thÓ chuét kh¸ng SARS-CoV ®Æc hiÖu N

protein. ( Zymed- Mü) hoÆc huyÕt thanh bÖnh nh©n SARS. Sau khi röa

mµng 3 lÇn b»ng PBS (pH 7,2), mµng sÏ ®−îc ñ b»ng céng hîp HPRO (

rabit –anti mouse IgG -HPRO hoÆc goat anti human IgG-HPRO) trong

vßng 2 giê. Ph¶n øng kÕt thóc khi nhuém mµng b»ng dimethylamino

Ch−¬ng III

benzidine (DAB).

KÕt qu¶ vµ Bµn luËn

A. KÕt qu¶ s¶n xuÊt bé sinh phÈm chÈn ®ãan nhanh

bÖnh sèt Dengue/ sèt xuÊt huyÕt Dengue.

3.1. Nu«i cÊy virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2),

virus Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) trªn tÕ

bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36.

3.1.1. Nh©n virus Dengue type I (D1), virus Dengue type II (D2), virus

Dengue type III (D3) vµ virus Dengue type IV (D4) vµo tÕ bµo muçi Aedes

albopictus dßng C6/36 ®Ó t¸ch chiÕt ARN.

3.1.1.1. TuyÓn chän c¸c type virus Dengue ph©n lËp tõ n¨m 2001 ®Õn n¨m 2005 t¹i

miÕn B¾c, miÒn Trung vµ T©y Nguyªn

§Ó cã kh¸ng nguyªn virus Dengue cã hiÖu gi¸ cao vµ tiªu biÓu cho c¸c chñng ®·

tõng g©y dÞch t¹i ViÖt Nam, Phßng thÝ nghiÖm Arbo virus ®· tiÕn hµnh ph©n lËp

virus Dengue t¹i c¸c miÒn B¾c, miÒn Trung vµ T©y Nguyªn tõ n¨m 2001 ®Õn

n¨m 2004...KÕt qu¶ thu ®−îc nh− sau (B¶ng 3.1):

B¶ng 3.1. KÕt qu¶ ph©n lËp virus Dengue t¹i c¸c miÒn, 2001- 2004

§Þa ph−¬ng Sè bÖnh Tû lÖ Type Dengue

phÈm d−¬ng tÝnh

MiÒn B¾c 69 46,6% 15 D1+ 38 D2+ 10 D3+ 6 D4

MiÒn Trung 42 28,4% 10 D1+ 22 D2+ 7 D3+ 3 D4

T©y Nguyªn 37 25,0% 12 D1+ 17 D2+ 4 D3+ 4 D4

Céng 148 100,0% 37 D1+ 77 D2+ 21 D3+ 13 D4

Tõ n¨m 2001 ®Õn n¨m 2004, phßng thÝ nghiÖm Sèt xuÊt huyÕt- Arbo ®· thu thËp

®−îc 148 bÖnh phÈm, trong ®ã c¸c tØnh miÒn B¾c lµ 69 bÖnh phÈm (chiÕm tû lÖ

46,6% so víi tæng sè bÖnh phÈm ph©n lËp); Cña miÒn Trung lµ 42 bÖnh phÈm

(chiÕm tû lÖ 28,4%) vµ cña T©y Nguyªn lµ 37 bÖnh phÈm (chiÕm tû lÖ 25,0% so

víi tæng sè bÖnh phÈm thu thËp ®−îc.

Tû lÖ c¸c type virus Dengue ®−îc ph©n lËp tõ n¨m 2001 ®Õn 2004 (H×nh 3.1)

cho thÊy chñ yÕu vÉn lµ virus Dengue type 2, chiÕm tû lÖ 52,0%; TiÕn ®Õn lµ

virus Dengue type 1: 25,0%; Råi ®Õn virus Dengue type 3: 14,2% vµ cuèi cïng

lµ virus Dengue type 4: 8,8%.

Theo Tr−¬ng Uyªn Ninh (2003) khi cã “Mét sè nhËn xÐt vÒ Sèt Dengue/ Sèt

xuÊt huyÕt Dengue t¹i mét sè tØnh trong n¨m 2003 qua kÕt qu¶ gi¸m s¸t huyÕt

thanh häc, virus häc“ [29] nhËn xÐt, ViÖt Nam hiÖn ®· cã ®Çy ®ñ c¶ 4 type virus

Dengue cïng l−u hµnh. Tïy ®iÒu kiÖn ®Þa lý vµ khÝ hËu mµ lóc th× type virus nµy

Dengue I

Dengue II

Dengue III

næi tréi, lóc thi type kh¸c l−a hµnh m¹nh lªn....

9%

25%

Dengue IV

14%

52%

H×nh 3.1. Tû lÖ c¸c type virus Dengue ph©n lËp ®−îc

tõ n¨m 2001 ®Õn n¨m 2004

N¨m 2001 (H×nh 3.1) ta thÊy cã ®ñ c¶ 4 type virus Dengue xuÊt hiÖn trªn c¸c

tØnh miÒn B¾c víi tû lÖ g©n nh− ngang nhau...Trong ®ã virus Dengue type II cao

nhÊt 32%; Råi ®Õn virus Dengue type IV chiÕm: 27%; Virus Dengue type I lµ:

21% vµ cuèi cïng lµ virus Dengue type III: 20% so víi tæng sè type virus

Dengue I

Dengue I Dengue II Dengue III

Dengue II Dengue IV

Dengue IV

21%

27%

48%

44%

32%

20%

Dengue l−u hµnh.

H×nh 3.2. Tû lÖ c¸c type virus H×nh 3.3. Tû lÖ c¸c type virus

Dengue l−u hµnh trong n¨m 2001 Dengue l−u hµnh t¹i mét sè tØnh

trong n¨m 2002

N¨m 2002 (H×nh 3.3) tû lÖ nµy l¹i thay ®æi, virus Dengue type 1 ciÕm tû lÖ cao

nhÊt: 48%; Råi ®Õn virus Dengue type 2: 44% vµ cuèi cïng lµ virus Dengue type

4: 8%.

Dengue I

Dengue II

Dengue I

Dengue III

Dengue II

0%0%

14%

Dengue IV

32%

42%

58%

54%

H×nh 3.4. Tû lÖ c¸c type virus Dengue H×nh 3.5. Tû lÖ c¸c type virus Dengue

l−u hµnh t¹i mét sè tØnh l−u hµnh t¹i mét sè tØnh

trong n¨m 2003 trong n¨m 2004

N¨m 2003 (H×nh 3.4) chØ cßn 3 type virus Dengue l−u hµnh t¹i c¸c tØnh miÒn

B¾c, ®ã lµ virus Dengue type 2 chiÕm 54%; Virus Dengue type 4 chiÕm 32% vµ

virus Dengue type 1 lµ 14%

N¨m 2004 (H×nh 3.5) chØ cßn hai type virus Dengue l−u hµnh t¹i miÒn B¾c, ®ã lµ

virus Dengue type 1, chiÕm 58% vµ virus Dengue type 2, chiÕm 42%

Sù biÕn ®æi tû lÖ c¸c type virus Dengue trong n¨m n¨m qua cho ta thÊy dÞch SD/

SXHD ë c¸c tØnh miÒn B¾c ®ang cã xu h−íng trë l¹i type II; Type dÔ lµm bÖnh

nh©n shock vµ dÉn ®Õn tö vong cao.

Theo §ç Quang Hµ, n¨m 2001 cã c¶ 4 type virus Dengue cïng l−u hµnh t¹i c¸c

tØnh Nam Bé. Cßn Tr−¬ng Uyªn Ninh vµ CS.[26] thi nhËn thÊy r»ng viÖc t¨ng tû

lÖ virus Dengue type 2 trong thµnh phÇn cã nghÜa lµ dÞch SD/ SXHD sÏ cã thÓ

diÔn biÕn phøc t¹p trong nh÷ng n¨m tíi. Nh×n l¹i kÕt qu¶ theo giâi diÔn biÕn c¸c

type virus Dengue ë ViÖt Nam tõ n¨m 1987 ®Õn n¨m 2001 th× ®×Òu nµy cµng

minh chøng cho nh÷ng nhËn ®Þnh trªn (H×nh 3.6). Trong 15 n¨m qua, mÆc dï ®·

xuÊt hiÖn virus Dengue type 1, virus Dengue type 3, virus Dengue type 4 nh−ng

virus Dengue type 2 vÉn chiÕm −u thÕ víi tû lÖ lµ: 36%

DEN 1

DEN 2

DEN 3

DEN 4

6%

26%

32%

36%

H×nh 3.6. Tû lÖ c¸c type virus Dengue l−u hµnh t¹i ViÖt Nam, 1987- 2001

Trong h¬n 4 n¨m (2001- 2004), c¸c tØnh miÒn B¾c ViÖt Nam ®· kh«ng cã dÞch

SD/ SXHD. ChØ cã mét vµi æ dÞch nhá mang tÝnh côc bé ®Þa ph−¬ng...Nh÷ng

n¨m ®Çu lµ do c¶ 4 type virus Dengue...Sau ®ã dÞch x¶y ra chØ cßn hai type virus

Dengue cïng l−u hµnh, trong ®ã virus Dengue type II ®ang trçi d¹y.

Nghiªn cøu vÒ cÊu tróc gien cña virus Dengue type 2, Tr−¬ng Uyªn Ninh, Lª

Quúnh Mai, NguyÔn Thu Thuû, Tr−¬ng Thõa Th¾ng [25] nhËn thÊy cã cïng cÊu

tróc víi gien virus Dengue type 2 cña Th¸i Lan

N¨m chñng virus Dengue type 2 ®−îc thu thËp tõ c¸c bÖnh nh©n nghi m¾c

SD/SXHD trong mïa dÞch n¨m 2002 ®Õn n¨m 2004 ë c¸c tØnh Thanh Ho¸,

NghÖ An, Qu¶ng B×nh vµ Qu¶ng TrÞ. Sö dông kü thuËt gi¶i tr×nh tù ®Ó x¸c ®Þnh

tr×nh tù chuçi nucleotit thuéc vïng vá E cña virus Dengue cã ®é dµi 1485bp, c¸c

cÆp måi ®Æc hiÖu ®−îc thiÕt kÕ ®Ó thu thËp ®−îc toµn bé vïng gien E. Sù s¾p xÕp

c¸c nucleotit ë gien E ®−îc thÓ hiÖn th«ng qua c¸c s¶n phÈm ADN ®−îc tæng

hîp tõ ph¶n øng gi¶i tr×nh tù khi phèi hîp enzym víi bèn lo¹i baz¬ nhuém

huúnh quang. Tr×nh tù vïng vá E sau ®ã ®−îc ®äc ë hÖ thèng m¸y ®äc tù ®éng

Applied Biosystem cña tr−êng §¹i häc Queensland- Australia.

Sö dông c¸c phÇn mÒn cña Trung t©m nghiªn cøu genome Australia (ANGIS)

nh− thuËt to¸n ph©n tÝch tèi ®a (Maximum parsmony), kho¶ng c¸ch c©y gia hÖ

(DNA dist, clustalW). C©y gia hÖ thÓ hiÖn sù liªn quan cña c¸c chñng virus

Dengue type 2 l−u hµnh t¹i mét sè tØnh ViÖt Nam víi c¸c chñng l−u hµnh trªn

thÕ giíi ®−îc m« t¶ th«ng qua phÇn mÒn Tree view1.18 [31].

KÕt qu¶ ph©n tÝch tr×nh tù chuçi chØ ra r»ng c¸c chñng virus Dengue type 2 l−u

hµnh ViÖt Nam thuéc 2 nhãm kh¸c nhau. Chñng Dengue 2 ph©n lËp t¹i Thanh

Hãa n¨m 2003 cïng nhãm víi chñng ®· ph©n lËp n¨m 98 ë miÒn B¾c, 95 ë miÒn

Nam cña ViÖt Nam. C¸c chñng virus Dengue type 2 nµy còng thuéc cïng nhãm

víi virus Dengue type 2 cña Brazin vµo n¨m 1990 vµ Th¸i Lan vµo n¨m 1991.

Theo c¸c tµi liÖu nghiªn cøu cña Rebeca Rico-Hesses, 1990 vÒ vïng gien E/NS1

th× virus Dengue type 2 ®−îc chia thµnh 4 genotype ®ã lµ Sylvatic/west Africa,

Americas, Southeast Asia vµ Malaysia/ Indian. Còng theo tµi liÖu nghiªn cøu

nµy th× chñng virus Dengue type 2 Brazin n¨m 1990 thuéc genotype cña §«ng

Nam ch©u ¸ lan sang. §ã lµ nguyªn nh©n g©y SD/ SXHD ë c¸c vïng Trung vµ

Nam Mü. Do vËy chñng Dengue 2 Brazin, 90 ®−îc coi nh− lµ mét genotype míi

truyÒn tõ khu vùc nµy sang §«ng Nam ch©u ¸ vµ khu vùc Trung Nam Mü.

Nhãm thø hai bao gåm c¸c chñng cßn l¹i (chñng ph©n lËp tõ c¸c tØnh NghÖ An,

Qu¶ng B×nh vµ Qu¶ng TrÞ) liªn quan mËt thiÕt víi chñng virus Dengue type 2

Kuranda, thuéc phÝa B¾c cña Australia, Dengue 2 Th¸i Lan, 99 vµ Myama, 96.

C¸c chñng trªn thuéc genotype cña Malaysia vµ vïng lôc ®Þa ¢n §é.

3.1.1.2. Nh©n Virus Dengue type I, Virus Denguey type II, Virus Denguey

type III vµ Virus Denguey type IV vµo tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng

C6/36.

3.1.1.2.1. Qui tr×nh cÊy virus Dengue vµo tÕ bµo muçi

Aedes. albopictus dßng C6/36.

- Nu«i tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36

Th«ng th−êng cø 6 -7 ngµy ph¶i chuyÓn tÕ bµo mét lÇn.

- Chän chai tÕ bµo ®· nu«i cÊy 5 - 7 ngµy, tÕ bµo ®Ñp vµ mäc kÝn 1 líp trªn

thµnh ®¸y chai nu«i.

- §æ hÕt m«i tr−êng cò, röa tÕ bµo b»ng PBS pH 7,95.

- §Ó t¸ch tÕ bµo, cho vµo 3ml trypsin tr¸ng ®Òu trªn líp tÕ bµo råi ®æ ®i, sau

30 gi©y tÕ bµo b¾t ®Çu bong ra.

- Dïng pipet cho vµo 5 ml m«i tr−êng ph¸t triÓn vµ hót lªn sÞt m¹nh xuèng

thµnh chai nhiÒu lÇn ®Ó tÕ bµo t¸ch ra hoµn toµn.

- T×m sè l−îng tÕ bµo trong 1 ml b»ng buång ®Õm, pha lo·ng tÕ bµo b»ng m«i

tr−êng ph¸t triÓn ®Ó cã 4×105 tÕ bµo trong 1 ml.

- ChuyÓn hçn dÞch tÕ bµo vµo chai ( 5 ml ) hoÆc èng nghiÖm (2 ml)

- Nu«i tÕ bµo ë tñ Êm 28 0C, sau 3 ngµy cã thÓ dïng ®Ó g©y nhiÔm virus hoÆc

cÊy bÖnh phÈm.

3.1.1.2.2. Ph−¬ng ph¸p gi÷ gièng tÕ bµo trong b×nh nitrogien láng

- Röa vµ t¸ch tÕ bµo nh− th−êng lÖ.

- §Õm tÕ bµo trong 1 ml.

- Ly t©m 1000 vßng/ phót/ 10 phót.

- TÝnh vµ pha sè l−îng m«i tr−êng ph¸t triÓn cã 7,5% DMSO ®ñ ®Ó pha lo·ng

cÆn tÕ bµo thµnh hçn dÞch chøa 4×106 tÕ bµo trong 1 ml.

- §ãng 1 ml hçn dÞch tÕ bµo vµo tõng èng nhùa cã n¾p kÝn.

- §Ó c¸c èng nhùa chøa tÕ bµo ë - 20 0C/ 1 giê, tiÕp theo - 40 0C/ giê vµ - 70 0C

qua ®ªm. Sau ®ã chuyÓn vµo b×nh nitrogien láng.

3.1.1.2.3. Ph−¬ng ph¸p nh©n gièng tÕ bµo tõ b×nh nitrogien láng

- LÊy èng tÕ bµo ra khái b×nh nitrogien láng, tan b¨ng nhanh b»ng c¸ch ng©m

trong bÓ n−íc Êm 37 0C.

- S¸t trïng èng bªn ngoµi b»ng cån 70 0C.

- ChuyÓn hçn dÞch tÕ bµo sang 1 èng ly t©m ®· cã s½n 6 ml m«i tr−êng ph¸t

triÓn.

- Ly t©m 1000 vßng/ phót/ 10 phót.

- §æ hÕt m«i tr−êng cò, gi÷ l¹i cÆn tÕ bµo.

- Hoµ tan cÆn tÕ bµo b»ng 6 ml m«i tr−êng ph¸t triÓn vµ chuyÓn vµo chai nu«i tÕ

bµo.

- Nu«i ë nhiÖt ®é thÝch hîp víi tõng lo¹i tÕ bµo.

- Sau 18 giê, thay m«i tr−êng míi.

3.1.1.2.4. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus Dengue

Nh÷ng yÕu tè c¬ b¶n gióp cho ph©n lËp thµnh c«ng lµ:

- LÊy bÖnh phÈm sím ngay tõ mÊy ngµy ®Çu cña bÖnh.

- Giao nhanh bÖnh phÈm ®óng qui c¸ch cho phßng thÝ nghiÖm virus Dengue.

- Chän ph−¬ng ph¸p nh¹y c¶m víi virus Dengue.

Nguån gèc BÖnh phÈm

- BÖnh nh©n HuyÕt thanh, huyÕt t−¬ng, b¹ch cÇu

- Tö thi C¸c tæ chøc: gan, l¸ch, h¹ch, tuyÕn øc

- VÐc t¬ Muçi

3.1.1.2.5. Ph−¬ng ph¸p ph©n lËp virus Dengue trªn tÕ bµo muçi Aedes.

albopictus dßng C6/36 [20].

- G©y nhiÔm virus vµo tÕ bµo.

§Ó t¹o kh¸ng nguyªn kh¸ng virus Dengue thuÇn khiÕt, c«ng viÖc ®Çu tiªn

lµ ph¶i nu«i tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36 trong m«i tr−êng

DMEM cã 15% FBS, ë nhiÖt ®é 28 0C. Sau 3- 5 ngµy c¸c tÕ bµo mäc thµnh

mét líp trªn bÒ mÆt ®¸y chai.

C¸c chñng virus Dengue sö dông lµ chñng ®−îc cÊt gi÷ ë - 80 0C, d−íi

d¹ng dung dÞch ®−îc g©y nhiÔm vµo c¸c chai tÕ bµo trªn.

Víi liÒu l−îng: 1 ml virus + 9 ml m«i tr−êng sinh tr−ëng cò cßn l¹i trong

chai tÕ bµo.

ñ ë 37 0C trong 2 giê.

Sau 2 giê hÊp phô, cho m«i tr−êng duy tr× cã 2% FBS vµo mçi chai tÕ bµo.

Nu«i tiÕp trong 4 ®Õn 8 ngµy ë 28 0C, m«i tr−êng lóc nµy cã mµu hång, ®é

pH vµo kho¶ng 7,2 - 7,5.

GÆt kh¸ng nguyªn virus Dengue.

Sau 7- 10 ngµy g©y nhiÔm virus vµo c¸c chai tÕ bµo, pH lóc nµy thay ®æi tõ

6,0 ®Õn 6,5. LÊy n−íc næi cña tÕ bµo ®Ó ph¸t hiÖn sù xuÊt hiÖn cña virus

Dengue qua kiÓm tra hiÖu gia Ng−ng kÕt hång cÇu. Khi cã hiÖu gi¸ ng−ng

kÕt hång cÇu cao th× tiÕn hµnh c« ®Æc b»ng PEG 8000.

(cid:190) Chän nh÷ng chai tÕ bµo tèt (mäc kÝn trªn mÆt ®¸y cña chai), thay m«i tr−êng

ph¸t triÓn b»ng m«i tr−êng duy tr×, mçi chai 1 ml.

(cid:190) §¸nh dÊu trªn chai tÕ bµo t−¬ng ®−¬ng sè thø tù cña mÉu, chän mét chai lµm

chøng tÕ bµo.

(cid:190) G©y nhiÔm 0,1 ml bÖnh phÈm (m¸u toµn phÇn hoÆc huyÕt thanh), l¸ng ®Òu

trªn bÒ mÆt tÕ bµo, ñ 28 0C/ 60’

(cid:190) Thªm 6 ml m«i tr−êng duy tr× vµo mçi chai tÕ bµo, ñ 28 0C tõ 7 ®Õn 14 ngµy.

C« ®Æc virus b»ng PEG 8000.

Thªm NaHCO3 7,5% vµo mçi chai tÕ bµo (2,5 ml/ chai). ñ t¹i 28 0C trong 2 h. Thu vµ kiÓm tra thÓ tÝch cña l−îng n−íc næi. Thªm NaCl 3,5% vµo víi

tû lÖ 1 ml NaCl+ 9 ml n−íc næi. ®o l¹i thÓ tÝch cuèi cïng cña dung dÞch

n−íc næi; Thªm PEG 8000 ®Ó ®¹t 7% trong dung dÞch n−íc næi.

KhuÊy tõ qua ®ªm t¹i 4 0C.

Ly t©m 10.000vßng/ 30 phót ë 4 0C.

Lo¹i bá n−íc næi, thu håi cÆn ly t©m.

Lµm tan cÆn ly t©m b»ng muèi Borat pH 9,0. ®ã chÝnh lµ kh¸ng nguyªn.

§èi víi Dengue type 1, Dengue type 2, Dengue type 3 : ph¶i tr¶ l¹i 1 ml

®Öm Borat pH 9,0/ chai 80 cm2.

§èi víi Dengue type 4 tr¶ l¹i 0.5 ml ®Öm Borat pH 9,0/ chai 80 cm2.

Hçn hîp 4 type virus Dengue theo tû lÖ hiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu.

3.1.1.2.6. §Þnh type virus b»ng ph−¬ng ph¸p miÔn dÞch huúnh quang.

3.1.1.2.6.1/. Kü thuËt huúnh quang trùc tiÕp

(Direct Fluorescent Antibody – DFA).

(cid:190) Sau 7 ngµy ñ 28 oC, tÕ bµo ®−îc t¸ch ra khái ®¸y chai nu«i cÊy b»ng que c¹o

tÕ bµo (craper) hoÆc vç nhÑ vµo thµnh chai, t¸ch 1 ml m«i tr−êng cã chøa tÕ

bµo vµo èng ly t©m.

(cid:190) Ly t©m 1500 vßng / 10 phót, lo¹i bá n−íc næi.

(cid:190) Thªm 1 ml ®Öm phèt ph¸t (PBS) pH 7,2 vµo mçi èng ly t©m, l¾c ®Òu lµm

bong tÕ bµo trong PBS.

(cid:190) §¸nh dÊu sè thø tù cña mÉu trªn lam kÝnh 12 giÕng theo h×nh “ch÷ chi “

dµnh 1 giÕng cho chøng tÕ bµo. Nhá 20 µl hçn dÞch tÕ bµo cña mçi mÉu

vµo c¸c giÕng t−¬ng øng.

(cid:190) §Ó kh« tù nhiªn, cè ®Þnh trong axeton l¹nh / 30 phót.

(cid:190) Cho 20 µl kh¸ng thÓ ®a dßng (pha lo·ng theo hiÖu gi¸ ®· chuÈn ®é) vµo tÊt c¶

c¸c giÕng cã tÕ bµo, ñ 37 0C/ 30 phót trong hép gi÷ Èm. Ng©m trong PBS/ 10

phót, tr¸ng qua n−íc cÊt, ®Ó kh« tù nhiªn.

(cid:190) Cho 20 µl céng hîp g¾n Fluorescen (pha lo·ng theo hiÖu gi¸ ®· chuÈn ®é)

vµo tÊt c¶ c¸c giÕng trªn, ñ 37 0C/ 30 phót trong hép gi÷ Èm. Ng©m trong

PBS/ 10 phót, tr¸ng qua n−íc cÊt, ®Ó kh« tù nhiªn.

(cid:190) Nhá lªn bÒ mÆt lam kÝnh 1 giät dung dÞch g¾n dÇu tù nhiªn hoÆc glycerin

90%/ PBS. §Ëy lamen lªn trªn lam kÝnh. Soi d−íi kÝnh hiÓn vi huúnh quang.

(cid:190) NhËn ®Þnh kÕt qu¶:

TÕ bµo chøng ©m hoµn toµn kh«ng ph¸t s¸ng.

MÉu d−¬ng tÝnh: xuÊt hiÖn sù ph¸t s¸ng cña huúnh xung quanh mµng tÕ bµo.

3.1.1.2.6.2/. Kü thuËt huúnh quang gi¸n tiÕp

(Indirect Fluorescent Antibody – IFA).

TÊt c¶ mÉu d−¬ng tÝnh sÏ tiÕp tôc ®Þnh type b»ng kü thuËt miÕn dÞch huúnh

quang gi¸n tiÕp (Indirect Fluorescent Antibody- IFA).

C¸c b−íc tiÕn hµnh nh− sau:

(cid:190) §¸nh dÊu sè thø tù cña mÉu trªn lam kÝnh 12 giÕng (Mçi bÖnh phÈm ®−îc

lµm trªn mét lam kÝnh).

2 giÕng hµng ®Çu nhá bÖnh phÈm d−¬ng tÝnh ®· biÕt.

2 giÕng hµng thø hai cho tÕ bµo ©m tÝnh (tÕ bµo kh«ng cã virus Dengue)

Nhá 20 µl hçn dÞch tÕ bµo cña mçi mÉu vµo 8 giÕng cuèi lam kÝnh.

(cid:190) §Ó kh« tù nhiªn, cè ®Þnh trong axeton l¹nh / 30 phót, ®Ó kh«.

(cid:190) Nhá 20 µl kh¸ng nguyªn hçn hîp 4 type virus Dengue

(cid:190) Cho 20 µl kh¸ng thÓ ®¬n dßng (pha lo·ng theo hiÖu gi¸ ®· chuÈn ®é) vµo c¸c

hµng giÕng t−¬ng øng.

(cid:190) ñ 3 7 0C/ 30 phót trong hép gi÷ Èm.

(cid:190) Ng©m trong PBS/ 10 phót, tr¸ng qua n−íc cÊt, ®Ó kh« tù nhiªn.

(cid:190) Cho 20 µl céng hîp g¾n Fluorescen (pha lo·ng theo hiÖu gi¸ ®· chuÈn ®é)

vµo tÊt c¶ c¸c giÕng trªn.

(cid:190) ñ 37 0C/ 30 phót trong hép gi÷ Èm.

(cid:190) Ng©m trong PBS/ 10 phót, tr¸ng qua n−íc cÊt, ®Ó kh« tù nhiªn.

(cid:190) Nhá lªn bÒ mÆt lam kÝnh 1 giät dung dÞch g¾n (dÇu tù nhiªn hoÆc glycerin

90%/ PBS).

Phñ trªn lam kÝnh 1 kÝnh máng.

(cid:190) Soi d−íi kÝnh hiÓn vi huúnh quang.

(cid:190) NhËn ®Þnh kÕt qu¶:

Chøng d−¬ng: Ph¸t s¸ng xanh l¸ m¹ bao quanh tÕ bµo

TÕ bµo chøng ©m hoµn toµn kh«ng ph¸t s¸ng.

MÉu d−¬ng tÝnh: Ph¸t s¸ng cña huúnh quang xung quanh nh©n tÕ bµo gièng

chøng d−¬ng.

C¸c mÉu ©m tÝnh ®−îc tiÕp tôc nu«i t¹i 28 0C/ 7 ngµy tiÕp, sau ®ã lÆp l¹i ph−¬ng

ph¸p trªn.

Sau khi lÆp l¹i, lo¹i bá toµn bé c¸c mÉu ©m tÝnh lÇn thø 2.

Cã thÓ tãm t¾t Qui trinh nh− sau:

M¸u toµn

TÕ bµo muçi Aedes.albopictus Kh¸ng thÓ trung hßa gi¶m

Kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n Õ

VSD TTW

H×nh 3.7. Qui tr×nh ph©n lËp virus Dengue trªn tÐ bµo muçi

Aedes albopictus dßng C6/36

H×nh ¶nh tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36 (H×nh 3.7) tr−íc khi g©y

nhiÔm virus Dengue c¸c type. Tª bµo m−ît mµ, mäc mét líp

¶nh 3.1. TÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36 nu«i trong m«i tr−êng

MEM víi 10 % huyÕt thanh bª bµo thai

Sau khi g©y nhiÔm virus Dengue c¸c type vµo tÕ bµo muçi Aedes albopictus

dßng C6/ 36, c¸c tÕ bµo ph×nh to, bÞ ph©n huû, tan r·

¶nh 3.2. TÕ bµo muçi Aedes albopictus

dßng C6/36 sau 6 ngµy nhiÔm virus Dengue

Ngµy 3

Ngµy 4

Ngµy 5

Ngµy 6

¶nh 3.3. Thêi gian nh©n lªn cña Virus Dengue trªn

tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36 (§é phãng ®¹i 300 X)

D1

D2

D3

¶nh 3.4. Sù nh©n lªn cña Virus Dengue type 1, type 2 vµ type 3 trªn tÕ bµo

muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36 vµo ngµy thø s¸u (§é phãng ®¹i 300 X)

ë ®é phãng ®¹i 300 X ta thÊy virus lµm tÕ bµo b¾t ®Çu ph×nh to va cã hiÖn t−îng

biÕn d¹ng theo c¸c thêi gian lµ kh¸c nhau (¶nh 3.2). Tõ ngµy thø t− sau khi cÊy

virus Dengue vµo tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36, Virus Dengue

nh©n lªn trong tÕ bµo vµ b¾t ®Çu cã hiÖu gi¸...Sang ngµy thø 5, tÕ bµo bÞ ph©n

huû manh mÏ ; Ngµy thø s¸u ®Õn thø bÈy, dung dÞch næi cña tÕ bµo th−êng cho

hiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång c©u cao nhÊt...Sau ®ã hiÖu gi¸ l¹i gi¶m dÇn...

Sù ph©n hñy tÕ bµo cña virus c¸c type Dengue th−êng biÓu hiÖn kh¸c nhau. Nh×n

vµo ¶nh 3.4 víi ba type virus Dengue lµ : Dengue 1, Dengue 2 vµ Dengue 3

nh©n lªn trong tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36 vµo ngµy thø t− th×

thÊy : Virus Dengue type 2 nh©n lªn nhanh vµ ph©n huû tÕ bµo muçi Aedes

albopictus kh¸ m¹nh ; TÕ bµo ph×nh to h¬n so víi virus Dengue type 1 vµ virus

Dengue type 3 ; Trong khi ®ã virus Dengue type 4 l¹i cµng yÕu h¬n v× ngµy thø

3 ch−a cã hiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu.

Theo Jaiswal S, Khanna N, Swaminathan S [11] khi nghiªn cøu vÒ vá cña virus

Dengue type 2 cho thÊy virus dÔ dµng x©m nhËp vµo tÕ bµo, sinh s«i n¶y në

nhanh chãng vµ ph¸ vì tÕ bµo nµy ®Ó tiÕp tôc x©m nhËp sang tÕ bµo míi…§Êy

còng chÝnh lµ ®iÒu mµ míi cÊy virus Dengue type 2 vµo tÕ bµo muçi Aedes

albopictus cã hai ngµy mµ ®· thu ®−îc kh¸ng nguyªn víi hiÖu gi¸ lµ 1/ 20 vµ

®Õn ngµy thø 6 th× hiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu cña type nµy ®· lªn ®Õn 1/ 2560.

Cßn Johansson, M., Brooks, A.J., Jans, D.A. and Vasudevan, S.G. [12] khi

nghiªn cøu c¸c type virus Dengue, hä còng thÊy virus Dengue type 1, virus

Dengue type 3 yÕu h¬n virus Dengue type 2 vµ ®Æc biÖt virus Dengue type 4 cho

hiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu thÊp vµ thêi gian th−êng chËm.

H×nh ¶nh huúnh quang x¸c ®Þnh kÕt qu¶ ph©n lËp virus

¶nh 3.5. Kh«ng cã virus nh©n lªn trong tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng

C 6/36 (¢m tÝnh- §é phãng ®¹i 480 X)

Sau khi cÊy bÖnh phÈm nghi cã virus Dengue g©y bÖnh SD/ SXHD vµo dßng tÕ

bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36, 10 ®Õn 12 ngµy sau, cã thÓ kiÓm tra sù

cã mÆt cña virus Dengue hay kh«ng b»ng kü thuËt miÔn dÞch huúnh quang gi¸n

tiÕp, nÕu kh«ng thÊy ph¸t s¸ng nh− ¶nh 3.5. thi bÖnh phÈm lµ ©m tÝnh, kh«ng

cã mÆt cña virus Dengue trong bÖnh phÈm nµy.

Ng−îc l¹i nÕu ¶nh cã mµu xanh l¸ m¹ víi nhiªu tÕ bµo ph¸t s¸ng (¶nh 3.6)

chøng tá cã virus Dengue nh©n lªn trong tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng

C6/36. BÖnh phÈm cã virus Dengue nh©n lªn.

Nhê kü thuËt nµy, chóng t«i ®· thu ®−îc 148 bÖnh phÈm cña 3 miÒn cã kh¸ng

thÓ kh¸ng virus Dengue

¶nh 3.6. Virus Dengue nh©n lªn trong tÕ bµo muçi Aedes albopictus

dßng C 6/36 (D−¬ng tÝnh- §é phãng ®¹i 480 X)

Tr−¬ng Uyªn Ninh (23) trong bµi gi¸m s¸t virus Dengue l−u hµnh t¹i ViÖt Nam

trong giai ®o¹n 1987- 1999 còng cho thÊy c¸c h×nh ¶nh huúnh quang ph¸t s¸ng

t−¬ng tù nh− ¶nh 4 khi cã virus Dengue nh©n lªn trong tÕ bµo muçi Aedes

Albopictus dßng C6/36.

C¸c t¸c gi¶ Kuhn RJ, Zhang W, Rossman MG, Pletnev SV, Corver J, Lenches E,

Jones CT, Mukhopadhyay S, Chipman PR, Strauss EG, Baker TS, Strauss JH

[15], khi nghiªn cøu vÒ cÊu tróc virus Dengue (n¨m 2002) th× hä thÊy mµng bµo

Ribosome cña virus ®· gióp cho huúnh quang ph¸t s¸ng rùc rì; §ã lµ chØ thÞ ®Ó

ph©n biÖt gi÷a bÖnh nh©n m¾c SD/ SXHD víi bÖnh nh©n kh«ng m¾c bÖnh nµy...

KiÓm tra hiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu cña c¸c type virus Dengue sau khi cÊy

virus Dengue vµo tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36:

B¶ng 3. 2 . KÕt qu¶ kiÓm tra hiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu theo thêi gian

Ngµy 1 3 4 5 6 7 8 10 2

D 1 - - 1/10 1/20 1/80 1/320 1/640 1/320 1/80

D 2 - 1/20 1/80 1/160 1/640 1/2560 1/2560 1/640 1/160

D 3 - - 1/20 1/80 1/160 1/ 640 1/1280 1/320 1/160

D 4 - - - 1/20 1/40 1/160 1/320 1/80 1/40

Nh×n vµo B¶ng 3.2, chóng ta thÊy ngµy ®Çu, c¶ 4 type virus Dengue ®Òu kh«ng

cã hiÖu gi¸; Sang ngµy thø 2 th× b¾t ®Çu cã hiÖu gi¸ thÊp ë Virus Dengue type 2;

Sang ngµy thø ba cã 3 type virus Dengue cã hiÖu gi¸; Sang ngµy thø t− th× c¶ 4

type virus Dengue ®Òu cã hiÖu gia...HiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu cao nhÊt cña

c¶ 4 type virus Dengue lµ vµo ngµy thø 6 ®Õn ngµy thø 8 sau ®ã hiÖu gi¸ gi¶m

3000

2500

2000

dÇn vµo ngµy thø 10.

¸ i g

1500

i

u Ö H

1000

500

Ngµy

H×nh 3.8. HiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu theo thêi gian

Nh×n vµo H×nh 3.8. thÊy hiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu t¨ng cao tõ ngµy thø 5 ®Õn

ngµy thø 8; Sau ®ã gi¶m dÇn vµo ngµy thø 10. HiÖu gi¸ cao nhÊt lµ cña virus

Dengue type 2 vµ hiÖu gi¸ thÊp nhÊt lµ virus Dengue type 4

V× thÕ ®Ó cã kh¸ng nguyªn cã hiÖu gi¸ ng−ng kÕt hång cÇu cao nhÊt th× nªn gÆt

n−íc næi tõ ngµy thø 6 ®Õn ngµy thø 8.

3.1.2.2. Quan s¸t sù nh©n lªn cña virus Dengue trong tÕ bµo muçi Aedes

albopictus dßng C6/ 36 d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö

100

* Sù ph¸ huû tÕ bµo C6/36 sau khi g©y nhiÔm.

Quan s¸t tiªu b¶n l¸t c¾t cùc máng tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36

b×nh th−êng chóng t«i thÊy nh©n tÕ bµo (N) cã d¹ng h×nh cÇu, mµng nh©n ®iÓn

h×nh, chÊt nhiÔm s¾c râ vµ tr¶i ®Òu trong nh©n. H¹ch nh©n ®Ëm ®Æc víi tia ®iÖn

tö, d¹ng h×nh cÇu vµ th−êng n½m lÖch h¼n vÒ mét phÝa trong nh©n. Mµng ngoµi

cña nh©n cßn nèi víi hÖ thèng m¹ng l−íi néi bµo (¶nh 3.7.a vµ 3.7.b). Bµo t−¬ng

tÕ bµo víi c¸c ty thÓ (Ti), kh«ng bµo (Kb), l−íi néi bµo h¹t, c¸c kh«ng bµo

Kb N

rçng... ®Òu thÊy râ.

¶nh 3.7.a. TÕ bµo C6/36 b×nh ¶nh 3.7.b: Ty thÓ cña tÕ bµo C6/36

th−êng b×nh th−êng

ë ¶nh 3.7.b. víi ®é phãng ®¹i lín c¸c kh«ng bµo rçng, c¸c h¹t rib«xom tr¶i ®Òu

kh¾p, mµo ty thÓ râ.

Sù ph¸ huû cÊu tróc tÕ bµo C6/36 sau khi g©y nhiÔm virus: Nh×n chung khi quan

s¸t tÕ bµo muçi nhiÔm virus Dengue type 1 chóng t«i thÊy cÊu tróc tÕ bµo Ýt thay

®æi nh− mµo ty thÓ, nh©n tÕ bµo thay ®æi Ýt mÆc dï virus cã nhiÒu trong bµo

t−¬ng tÕ bµo. §iÒu nµy còng phï hîp víi quan s¸t tÕ bµo g©y nhiÔm Dengue

type 1 d−íi kÝnh hiÓn vi quang häc. ¶nh 3.8: Sau 7- 8 ngµy sau khi g©y nhiÔm

virus, tÕ bµo phÇn lín kh«ng thay ®æi, chÊt nh©n tr¶i ®Òu trong nh©n, mµng nh©n

vÉn cßn nguyªn mµng kÐp. Bµo t−¬ng tÕ bµo: h¹t riboxom tr¶i t−¬ng ®èi ®Òu

101

trong bµo t−¬ng. NhiÒu h¹t virus ®−îc h×nh thµnh trong bµo t−¬ng.

¶nh 3.8. Virus g¾n vµo mµng bµo t−¬ng

Nh÷ng h¹t virus nµy ë c¸c giai ®o¹n kh¸c nhau cña qu¸ tr×nh tæng hîp, l¾p gi¸p

c¸c thµnh phÇn protein cÊu tróc vµ protein kh«ng cÊu tróc virus. ¶nh 3.9. cho

thÊy virus å ¹t x©m nhËp vµo tÕ bµo, ph¸ vì mµng tÕ bµo ®Ó vµo trong. Quan s¸t

kü ë ¶nh 4 thÊy cã h¹t virus ®· vµo trong tÕ bµo, ®ang cëi ¸o chØ cßn lâi virus.

§Õm sè l−îng tÕ bµo trªn c¸c vi tr−êng chóng t«i thÊy ®¹i ®a sè c¸c tÕ bµo Ýt

thay ®æi. Cã xu h−íng ph×nh to, mµng nh©n gå ghÒ, ®øt ®o¹n hoÆc mÊt ®i, cã khi

thÊy mµng nh©n ph× ®¹i, chÊt nh©n kÕt vãn l¹i thµnh tõng ®¸m ®Ëm ®Æc b¸m vµo

mµng trong nh©n. ChÝnh v× vËy mµ xuÊt hiÖn nhiÒu hèc s¸ng trong nh©n so víi tÕ

bµo b×nh th−êng. ë nh÷ng tÕ bµo tho¸i ho¸ m¹nh: bµo t−¬ng còng tho¸i ho¸

kh«ng cßn cÊu tróc b×nh th−êng, t¹o thµnh c¸c kho¶ng trèng s¸ng, c¸c tói to,

nhá

Sù tæn th−¬ng nhiÒu, Ýt cña tÕ bµo diÔn ra cïng víi sù nh©n lªn cña virus trong

tÕ bµo. Khi virus x©m nhËp vµo tÕ bµo Aedes albopictus dßng C6/36, phÇn lín

102

chóng ®−îc nh©n lªn trong bµo t−¬ng tÕ bµo, l−íi néi bµo h¹t, nhÊt lµ ë vïng

Golgi. C¸c thµnh phÇn h¹t virus ®−îc tæng hîp, l¾p r¸p , sau ®ã phÇn lín chóng

®−îc tËp hîp trong c¸c kh«ng bµo, bµo t−¬ng tÕ bµo, trong c¸c tói nhá, n¶y chåi

ra ngoµi lÊy mµng tÕ bµo lµm mµng virus ®Ó t¹o thµnh nh÷ng virus hoµn chØnh

cho thÊy virus n¶y chåi ra ngoµi mµng bµo t−¬ng tÕ bµo. Còng cã khi quan s¸t

chóng t«i thÊy virus tËp trung thµnh ®¸m dµy ®Æc gièng nh− m¹ng tinh thÓ n»m

trong bµo t−¬ng tÕ bµo. Cïng víi sù nh©n lªn cña virus hÖ thèng l−íi néi bµo bÞ

ph¸ vì kh«ng cßn cÊu tróc cña mét hÖ thèng mµng kÐp víi nh÷ng tói dÑt song

song. HÖ thèng l−íi néi bµo biÕn d¹ng thµnh h×nh cÇu, tói to, nhá kh¸c nhau

hoÆc t¹o thµnh c¸c kho¶ng trèng s¸ng. C¸c h¹t rib«x«m kÕt vãn l¹i thµnh tõng

®¸m, hoÆc biÕn ®i cßn l¹i rÊt Ýt n»m r¶i r¸c trong bµo t−¬ng tÕ bµo. Ty thÓ còng

thay ®æi kh«ng cßn cÊu tróc h×nh bÇu dôc, cã mµng kÐp bao quanh. Mµo ty thÓ

biÕn d¹ng. §«i chç thÊy mµo ty thÓ khæng lå, phó r¸ch n¸t. Qu¸ tr×nh nh©n lªn

cña virus lµm cho tÕ bµo C6/36 thay ®æi, tho¸i ho¸, ly gi¶i [16].

Khi quan s¸t d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö ë ®é phãng ®¹i lín chóng t«i thÊy h×nh

). Thay ®æi ®é phãng ®¹i kh¸c nhau ta thÊy th¸i cña h¹t virus ®iÓn h×nh (

h×nh th¸i, cÊu tróc c¬ b¶n cña virus Dengue bao gåm: lâi axit nucleic ®Ëm ®Æc

víi tia ®iÖn tö, bao quanh lâi capsit Ýt ®Ëm ®Æc h¬n víi tia ®iÖn tö, ngoµi cïng lµ

mét líp mµng máng bäc xung quanh phøc hîp nucleocapsÝt. Virus Dengue cã

d¹ng ®èi xøng h×nh khèi cÇu, th−êng tËp trung thµnh tõng ®¸m, n»m r¶i r¸c hoÆc

b¸m vµo mµng tÕ bµo. Khi quan s¸t trªn nhiÒu tiªu b¶n thÊy h×nh th¸i, cÊu tróc

cña virus tån t¹i nhiÒu d¹ng kh¸c nhau theo c¸c giai ®o¹n nh©n lªn cña virus, ®ã

). HÇu hÕt c¸c h¹t virus n»m trong c¸c lµ c¸c h¹t virus ch−a hoµn chØnh (

bµo quan (ch−a ph¸ vì c¸c bµo quan) th× chóng míi chØ cã c¸c thµnh phÇn cÊu

tróc c¬ b¶n: axit nucleic vµ vá capsit. Khi c¸c h¹t nµy “ n¶y chåi “ th× chóng lËp

tøc ®−îc kho¸c trªn m×nh mét líp mµng máng (cÊu tróc kh«ng c¬ b¶n), mµng

máng ngoµi cïng nµy cã nguån gèc tõ tÕ bµo vµ cã b¶n chÊt ho¸ häc lµ lipit

103

hoÆc lipoprotein.

¶nh 3.9. Virus Dengue type 1 sau khi nh©n lªn trong tÕ bµo

ë tiªu b¶n l¸t c¾t cùc máng tÕ bµo C6/36 sau khi g©y nhiÔm virus Dengue type 3

cho thÊy:

Nh©n tÕ bµo: Khi quan s¸t tÕ bµo d−íi kÝnh hiÓn vi ®iÖn tö JEM 1010 ë ®é phãng

®¹i lín, chóng t«i thÊy nh©n tÕ bµo biÕn ®æi m¹nh thÓ hiÖn: KÝch th−íc thay ®æi,

h×nh th¸i biÕn d¹ng, kh«ng cßn d¹ng h×nh cÇu ®iÓn h×nh, ®é ®Ëm ®Æc víi tia ®iÖn

tö gi¶m, kh«ng ®Òu. Mµng nh©n cã xu h−íng ph×nh to, bÒ mÆt mµng nh©n låi,

lâm, ®øt ®o¹n hoÆc mÊt ®i, chÊt nh©n kÕt vãn h¹ch nh©n nhá, kh«ng tËp trung

mµ ph©n t¸n ra gÇn phÝa mµng nh©n hoÆc tiªu biÕn.

Bµo t−¬ng tÕ bµo: Sau khi g©y nhiÔm virus Dengue type III cã bµo t−¬ng tÕ bµo

muçi Aedes albopictus dßng C6/36 thay ®æi m¹nh mÏ. §é ®Ëm ®Æc víi tia ®iÖn

tö kh«ng ®Òu, bµo t−¬ng xuÊt hiÖn rÊt nhiÒu hèc s¸ng cã kÝch th−íc kh¸c nhau

104

do kÕt vãn cña c¸c thµnh phÇn ë trong bµo t−¬ng.

C¸c bµo quan còng thay ®æi m¹nh thÓ hiÖn râ nhÊt ë ty thÓ vµ l−íi néi bµo: Ty

thÓ: Kh«ng cßn lµ h×nh bÇu dôc, chóng thay ®æi thµnh nhiÒu h×nh th¸i kh¸c

nhau, mµng ngoµi ®øt ®o¹n ®«i khi r¸ch n¸t, mµo phång rép, dËp n¸t bªn trong

ty thÓ ®«i khi xuÊt mét sè hèc s¸ng, ty thÓ mÊt mµo.

105

¶nh 3.10. Bµo t−¬ng tÕ bµo muèi Aedes albopictus dßng C6/ 36

3.2. Nghiªn cøu qui tr×nh c«ng nghÖ biÓu hiÖn, t¸ch chiÕt,

tinh chÕ kh¸ng nguyªn Dengue t¸i tæ hîp c¸c type.

3.2.1. Kh¸ng nguyªn Dengue th«

Cã hai lo¹i kh¸ng nguyªn Dengue th« mµ Phßng thÝ nghiÖm Sèt xuÊt huyÕt-

Arbo, ViÖn VÖ sinh DÞch tÔ Trung −¬ng s¶n xuÊt:

- Kh¸ng nguyªn s¶n xuÊt trªn n·o chuét b¹ch gièng Swiss cã tuæi 24 – 48 giê.

- Kh¸ng nguyªn s¶n xuÊt trªn dßng tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36

HiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu cña c¸c type virus Dengue th« nh− sau:

B¶ng 3.3. HiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu cña c¸c type virus Dengue

Trªn n·o chuét gièng Trªn tÕ bµo muçi

Swiss 24 – 48 giê tuæi Aedes Albopictus dßng C6/36

HiÖu gi¸ Khèi l−îng HiÖu gi¸ Khèi l−îng

Dengue type I 1/ 1280 50 gram 1/ 2560 200 ml

Dengue type II 1/ 5210 70 gram 1/ 2560 250 ml

Dengue type III 1/ 1280 50 gram 1/ 1280 250 ml

Dengue type IV 1/ 320 50 gram 1/ 160 200 ml

Nh×n vµo B¶ng 3.3, chóng ta thÊy c¶ 4 type ®Òu cã hiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu

kh¸ cao....Cao nhÊt vÉn lµ virus Dengue type II vµ thÊp nhÊt lµ virus Dengue

type IV; TiÕp ®Õn lµ virus Dengue type I vµ virus Dengue type III.

H×nh 3.9 vÒ HiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu (HA) cña 4 type virus Dengue trong

n·o chuét Swiss 24 – 48 giê tuæi vµ tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36

th× thÊy: HiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu th« trªn n·o chuét gièng Swiss 24 – 48

106

giê tuæi th−êng b»ng hoÆc cao h¬n HiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu (HA) cña 4

type virus Dengue trªn tÕ bµo muçi Aedes Albopictus dßng C6/36. HiÖu gi¸

Ng−ng kÕt hång cÇu cña virus Dengue type II trªn n·o chuét Swiss vÉn cao nhÊt:

1/ 5120 vµ thÊp nhÊt vÉn lµ HiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu cña virus Dengue type

IV. Cßn hiÖu gi¸ NKHC cña virus Dengue type I vµ virus Dengue type III n»m

kho¶ng 1/ 1280 ®Õn 1/ 2560

§iÒu nµy còng ®· ®−îc Kuno,G., I. Gomez and D.Gubler. [13] ®Ò cËp ®Õn vµo

n¨m 1991 khi nghiªn cøu s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn cho kü thuËt ELISA ®Ó chÈn

®o¸n bÖnh SD/ SXHD t¹i Hoa Kú vµ c¸c n−íc trong vïng biÓn Caribe. C¸c t¸c

gi¶ còng gi¶i thÝch së dÜ hiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu trong n·o chuét cao vi

kh¸ng nguyªn s¶n xuÊt ra th−êng kh«ng ®−îc tinh khiÕt, con lÉn nhiÒu protein

6000

nªn cã hiÖn t−¬ng d−¬ng tÝnh gi¶

5120

Swiss

5000

C6/ 36

4000

A H ¸ i

3000

g u Ö i H

2000

1280

1000

320

160

D I

D II

D III

D IV

Type virus

H×nh 3.9. HiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu (HA) cña 4 type virus Dengue trong

n∙o chuét Swiss vµ tÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36

Cßn Cardosa,M., P.H. Nimmannitya,A.Nisalak and B.L.,[4] khi nghiªn cøu s¶n

107

xuÊt kh¸ng nguyªn virus Dengue c¸c type trªn tÕ bµo LLC- MK2 vµo n¨m 1992.

th× hä thÊy HiÖu gi¸ Ng−ng kÕt hång cÇu thÊp h¬n so víi trªn tæ chøc n·o chuét

Swiss. Lóc ®ã do tr×nh ®é khoa häc kü thuËt cßn h¹n chÕ, hä ch−a biÕt tinh chÕ,

t¸ch triÕt ®Ó n©ng cao hiÖu gi¸...H¬n n÷a dßng tÕ bµo LLC- MK2 kh«ng ph¶i lµ

dßng tÕ bµo thÝch hîp cho Virus Dengue nh©n lªn

Vµo n¨m 2003, Tr−¬ng Uyªn Ninh [28] ®· dïng kü thuËt MAC- ELISA ®Ó chÈn

®o¸n bÖnh SD/ SXHD t¹i Hµ Néi, Nam §Þnh, Thanh Ho¸ vµ NghÖ An...Trong

thµnh phÇn bé sinh phÈm nµy cã dïng kh¸ng nguyªn Dengue s¶n xuÊt trªn tÕ

bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/ 36. KÕt qu¶ cho thÊy viÖc dïng tÕ bµo nµy

®Ó s¶n xuÊt kh¸ng nguyªn Dengue lµ rÊt thuËn tiÖn, cho hiÖu gi¸ Ng−ng kÕt

hång cÇu kh¸ cao...

3.2.2. Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp.

Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp DxE3 (x lµ type Dengue) lµ mét protein dung hîp cã

cÊu t¹o gåm 3 phÇn: Vïng domain 3 trong protein vá cña virus Dengue (DE3),

vïng thioredoxin vµ ®u«i histag.

§· cã:

- Kh¸ng nguyªn Dengue type 1.

- Kh¸ng nguyªn Dengue type 2.

- Kh¸ng nguyªn Dengue type 3.

- Kh¸ng nguyªn Dengue type 4.

3.2.3. Quy tr×nh t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp cña virus

dengue tõ chñng E. coli cho c¶ bèn typ virus dengue

108

Bèn chñng E. coli BL21 DE3 star cã mang vector pET-TRX-FuS-DxE3 ®−îc ho¹t ho¸ ë 37oC qua ®ªm råi biÓu hiÖn trong ®iÒu kiÖn 37oC vµ c¶m øng b»ng IPTG 1mM. Thu dÞch nu«i cÊy vµ ®iÖn di kiÓm tra. TiÕp theo, kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp DE3 sÏ ®−îc biÓu hiÖn l−îng lín h¬n vµ ®−îc tinh chÕ b»ng cét s¾c ký Nikel Resin ProbondTM. Protein sau tinh chÕ ®−îc kiÓm tra ph¶n øng ®Æc hiÖu

víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù nhiªn b»ng ph−¬ng ph¸p Western blot vµ Dot blot. Qui tr×nh cô thÓ tiÕn hµnh nh− sau:

1. Protein DE3 biÓu hiÖn nhê chñng E. coli BL21(DE3 Star) t¸i tæ hîp

• Nu«i cÊy l¾c tÕ bµo qua ®ªm trong m«i tr−êng LB láng cã bæ sung

Kanamycin (50 µg/ml) víi tèc ®é 200v/phót ë nhiÖt ®é 370C.

• Passage 1% dÞch ho¹t ho¸ sang 100 ml m«i tr−êng LB láng cã bæ sung Kanamycin trong mét b×nh nãn dung tÝch 250ml, nu«i tiÕp ë ®iÒu kiÖn nh− nªu ë trªn. KiÓm tra gi¸ trÞ OD ®¹t 0,5 ®Õn 0,6 (sau kho¶ng 2 – 3 giê). LÊy 5 ml vi khuÈn sang nu«i riªng trong mét èng nghiÖm ®Ó lµm ®èi chøng kh«ng c¶m øng víi IPTG, phÇn cßn l¹i ®−îc bæ sung chÊt c¶m øng IPTG ®Ó cã nång ®é cuèi cïng lµ 0,5 mM.

• Nu«i cÊy l¾c tiªp c¶ èng ®èi chøng vµ b×nh c¶m øng ë nhiÖt ®é 370C trong kho¶ng thêi gian 3 giê. Hót 0,5 ml dÞch vi khuÈn tõ èng ®èi chøng vµ chai c¶m øng sang èng Eppendorf. Ly t©m (5000v/phót, 10 phót) thu cÆn tÕ bµo.

• Hoµ tan cÆn tÕ bµo trong 50µl H20, bæ sung thªm 50µl ®Öm SDS 2X. • ñ mÉu ë 95oC trong 10 phót ®Ó ph¸ vì tÕ bµo vµ biÕn tÝnh protein, ly t©m

12000 vßng/phót trong thêi gian 2 phót.

• Hót dÞch pha trªn ®Ó kiÓm tra kh¶ n¨ng biÓu hiÖn protein t¸i tæ hîp b»ng ®iÖn di trªn gel polyacrylamid 12,5%. NÕu kÕt qu¶ biÓu hiÖn tèt, sÏ thu phÇn tÕ bµo trong chai c¶m øng ®Ó t¸ch chiÕt vµ tinh chÕ protein t¸i tæ hîp.

2. Dïng cét Probond Nikel Resin ®Ó tinh chÕ protein dung hîp [1]

109

Protein t¸i tæ hîp ®−îc biÓu hiÖn ra ë d¹ng inclusion bodies. Sö dông ph−¬ng ph¸p tinh s¹ch b»ng Kit ProBondTM cña h·ng Invitrogen cã thÓ chuyÓn protein tõ d¹ng kh«ng hßa tan thµnh d¹ng hoµ tan. §iÒu nµy hÕt søc quan träng cho môc ®Ých t¹o ra c¸c protein t¸i tæ hîp ®Ó ph¸t triÓn c¸c kit chÈn ®o¸n. Qu¸ tr×nh tinh s¹ch ®−îc thùc hiÖn theo c¸c b−íc sau:

B−íc 1: ChuÈn bÞ dÞch tÕ bµo tr−íc khi ®−a lªn cét:

1. Lµm tan hoµn toµn Guanidinium Lysis Buffer (Gu.HCl 6M, NaH2PO4 200mM, NaHPO4 200mM, NaCl 500mM, H2O, chØnh pH 7,8 b»ng NaOH 1N hoÆc HCl 1N).

2. Ly t©m huyÒn dÞch tÕ bµo (100 ml) ®· kiÓm tra kh¶ n¨ng biÓu hiÖn ra DE3 t¸i tæ hîp ë tèc ®é 5000 vßng trong thêi gian 10 phót, thu cÆn tÕ bµo.

3. Hoµ l¹i tÕ bµo trong 8 ml Guanidinium Lysis Buffer, pH 7,8 4. Lµm tan cÆn tÕ bµo b»ng c¸ch l¾c nhÑ trªn m¸y Vortex ë nhiÖt ®é

phßng trong thêi gian 5 phót.

5. Ph¸ mµng tÕ bµo b»ng m¸y siªu ©m trong thêi gian 15 – 20 phót (®Ó huyÒn dÞch tÕ bµo trªn ®¸, ph¸ tÕ bµo b»ng m¸y Labsonic víi ®Çu ph¸ mÉu 40T ®−êng kÝnh 4-mm, dµi 127-mm ë tÇn sè 20 kHz vµ ©m l−îng 40 W theo chu kú: ch¹y m¸y 30 gi©y, dõng 20 gi©y).

Ly t©m dÞch ph¸ tÕ bµo ë tèc ®é 10.000 vßng trong thêi gian 15 phót, thu dÞch næi, lo¹i x¸c tÕ bµo.

B−íc 2: ChuÈn bÞ cét

1. L¾c ®Òu ®Ó ProBond TM Resin t¹o thµnh huyÒn dÞch ®ång nhÊt. 2.

Dïng pipet hót 2 ml huyÒn dÞch Nikel Resin ®−a lªn cét tinh s¹ch dung tÝch 10ml.

3. Röa cét b»ng 6 ml n−íc khö ion. 4.

Bæ sung 6 ml Denaturing Binding Buffer ( Urea 8M, NaCl 500mM, NaHPO4 20 mM, NaH2PO4 20mM, chØnh pH 7,8 b»ng NaOH 1N hoÆc HCl 1N).

5. Hoµ l¹i Resin b»ng c¸ch ®¶o cét b»ng tay. Sau ®ã ®Ó cét l¹i theo ph−¬ng th¼ng ®øng ®Ó Resin l¾ng xuèng vµ cho dÞch ch¶y qua cét LÆp l¹i (4) vµ (5). 6.

B−íc 3: §−a protein lªn cét vµ ®Èy ra khái cét

110

1. §−a 8 ml dÞch ph¸ tÕ bµo sau ly t©m lªn cét.

2. L¾c nhÑ cét trªn m¸y vortex trong thêi gian 15 – 30 phót ë nhiÖt ®é phßng. Sau ®ã ®Ó cét l¹i theo ph−¬ng th¼ng ®øng ®Ó huyÒn dÞch Nikel Resin l¾ng xuèng vµ cho dÞch ch¶y qua cét.

5. Röa cét b»ng 8 ml Native Wash Buffer. Dung dÞch nµy ®−îc chuÈn bÞ

3. Röa cét b»ng 4 ml Denaturing Binding Bufer pH 7,8, lÆp l¹i 3 lÇn. 4. Röa cét b»ng 4 ml Denaturing Wash Buffer (Urea 8M, NaHPO4 20mM, NaH2PO4 20mM, NaCl 500mM, chØnh pH 6,0 b»ng NaOH 1N hoÆc HCl 1N vµ läc qua mµng mµng läc khuÈn 0,45µm). LÆp l¹i 3 lÇn.

nh− sau:

+ ChuÈn bÞ dung dÞch Imidazole 3M, pH 6,0

- Imidazole 3M - NaCl 500mM - NaHPO4 20 mM - NaH2PO4 20mM - ChØnh pH 6,0 b»ng HCl 1N + ChuÈn bÞ dung dÞch Native Purification Buffer 5X

- NaH2PO4 250mM - NaCl 2,5M - ChØnh pH 8,0 b»ng NaOH 1N Tõ dung dÞch Native Puriffication Buffer 5X pha lo·ng nång ®é thµnh dung dÞch Native Puriffication Buffer 1X

+ ChuÈn bÞ dung dÞch Native Wash Buffer

- Native Puriffication Buffer 1X : 50 ml

- Imidazole 3M, pH 6,0 : 335 µl

- ChØnh pH 8,0 b»ng NaOH 1N hoÆc HCl 1N

6. §Èy protein t¸i tæ hîp ra khái cét b»ng 12 ml Native Elution Buffer, thu 12 ph©n ®o¹n, mçi ph©n ®o¹n 1 ml. Thµnh phÇn cña dung dÞch Native Elution Buffer nh− sau:

111

+ Native Purification Buffer 1X : 41,25 ml + Imidazole 3M, pH 6,0 : 3,75 ml ChØnh pH 8,0 b»ng NaOH 1N hoÆc HCl 1N 7. KiÓm tra protein sau khi tinh s¹ch b»ng ®iÖn di trªn gel polyacrylamide 12,5%.

3. §iÖn di gel polyacrylamide ®Ó kiÓm tra protein t¸i tæ hîp

Quy tr×nh: *C«ng thøc ®æ gel :

(2) C«ng thøc ®æ gel c«:

- H2O 2,46 ml - Tris-HCL 0,5M pH=8,8 1,25 ml - Glycerol 50% 2 ml

- SDS 10% 50 µl

- APS 10% 50 µl

- Bis-acrylamide 4,2 ml

- TEMED 8 µl

(3) C«ng thøc ®æ gel t¸ch:

- H2O 1,7 ml - Tris-HCL 1M pH=6,8 312,5 µl

- SDS 10% 12,5 µl

- APS 10% 25 µl

- Bis-acrylamide 425 µl

- TEMED 2 µl

(4) MÉu sau khi xö lý vµ biÕn tÝnh ®−îc tra vµo c¸c giÕng nhá trong

gel.

(5) Qu¸ tr×nh ch¹y ®iÖn di ®−îc tiÕn hµnh ë c−êng ®é dßng ®iÖn cè ®Þnh lµ 40mA, thêi gian kho¶ng 45phót (chó ý theo dâi vÖt mµu ®Ó kÕt thóc thêi gian ®iÖn di).

Nh×n vµo c¸c h×nh ¶nh vÒ c¸c protein t¸i tæ hîp Thioredoxin-E3-HisTag ®−îc h×nh thµnh bëi sù kÕt nèi 4 protein víi nhau: TrxTag, E3 vµ ®u«i His-tag. Träng l−îng ph©n tö tÝnh theo lý thuyÕt kho¶ng 30 kDa. (h×nh 3.10).

112

(6) Sau khi ch¹y xong, b¶n gel ®−îc gì ra vµ nhuém trong dung dÞch Comasie Brilliant blue, l¾c kho¶ng 2 giê trªn m¸y l¾c, sau ®ã lo¹i bá dÞch nhuém, thay b»ng dÞch tÈy, l¾c trong 30 phót. Sau ®ã lo¹i dÞch tÈy ®i cho n−íc vµo vµ cã thÓ quan s¸t trùc tiÕp.

M 1 2

kDa

H×nh 3.10. KÕt qu¶ biÓu

kDa

hiÖn protein t¸i tæ c¸c

66,2-

type dengue 1, 2, 3, 4

66,2-

®−îc kiÓm tra b»ng ®iÖn

45 -

di trªn gel

35 -

~30KDa

45 -

polyacrylamide

35 -

~30KDa

25 -

- M: Maker protein.

18,4 -

25 -

- 1: MÉu sau c¶m øng b»ng

D2

D1

IPTG 1mM.

- 2: MÉu kh«ng c¶m øng b»ng

IPTG.

M 1 2

M 2 1

kDa

66,2-

45 -

35 -

45 -

~30KDa

25 -

35 -

~30KDa

25 -

18,4 - 14,4 -

D3

D4

113

Protein DE3 t¸i tæ hîp cã ®u«i 6 histidine ®−îc tinh chÕ b»ng cét s¾c ký

M A B 1 2 3 4 5 6 7

M 1 2 3 B A

kDa

66,2-

45 - 35 -

25 -

18,4 -

Probond.

D2

M A B 1 2 3 4 5

D1 M 1 2 3 4 5 6 7 B A

kDa

66,2-

45 -

35 -

25 -

18,4 -

66,2- 45 - 35 - 25 - 18,4 - 14,4 -

D4

D3

H×nh 3.11. KÕt qu¶ tinh chÕ protein t¸i tæ hîp D1E3, D2E3, D3E3, D4E3

(cid:190) M: Maker protein.

(cid:190) 1-7: C¸c ph©n ®o¹n sau khi tinh s¹ch

(cid:190) B: MÉu sau c¶m øng b»ng IPTG 1mM ch−a tinh s¹ch.

(cid:190) A: MÉu kh«ng c¶m øng b»ng IPTG.

b»ng cét Nikel Resin ®−îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel polyacrylamide

Qu¸ tr×nh tinh s¹ch ngoµi yªu cÇu lo¹i bá c¸c thµnh phÇn kh«ng mong muèn th×

s¶n phÈm cßn cÇn ph¶i gi÷ ®−îc ho¹t tÝnh sinh häc. Trong tr−êng hîp nµy,

protein t¸i tæ hîp E3 sÏ ®−îc sö dông cho môc ®Ých chÈn ®o¸n SD/SXHD dùa

trªn c¬ së lý thuyÕt cña c¸c kü thuËt miÔn dÞch. V× vËy, protein E3 t¸i tæ hîp sau

tinh s¹ch vÉn ph¶i ph¶n øng ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù

114

nhiªn.

§Ó kiÓm tra møc ®é ph¶n øng cña protein t¸i tæ hîp D1E3, D2E3, D3E3, D4E3

víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù nhiªn g©y miÔn dÞch trªn thá b»ng kü thuËt

Western blot. KÕt qu¶ ph¶n øng cña c¶ 4 type ®Òu chØ xuÊt hiÖn 1 b¨ng ®Ëm, râ

nÐt vµ ®óng víi kÝch th−íc dù tÝnh. Nh− vËy, protein E3 t¸i tæ hîp cña virus

Dengue c¸c type 1, 2, 3, 4 ®· ph¶n øng rÊt ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus

M 1

kDa

66,2-

45 -

35 -

45 - 35 -

35 -

25 -

kDa 66,2- 45 - 35 - 25 -

25 -

18,4 -

18,4 - 14,4 -

Dengue tù nhiªn (h×nh 3.12).

D3

D4

D1

D2

14,4 -

H×nh 3.12. Kh¸ng thÓ kh¸ng virus dengue tù nhiªn ph¶n øng víi protein

t¸i tæ hîp dengue type 1, 2, 3, 4.

M: Marker protein; 1: Protein t¸i tæ hîp E3

KÕt qu¶ cña DdÒ tµi còng ®· thö nghiÖm dïng kü thuËt Dot blot ®Ó ®¸nh gi¸ kh¶

n¨ng ph¶n øng cña c¸c kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp tinh chÕ D1E3, D2E3, D3E3 vµ

D4E3 víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù nhiªn cã trong huyÕt thanh bÖnh

nh©n. C¸c kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp tinh chÕ ®−îc chÊm trùc tiÕp lªn mµng PVDF

(polyvinyl-idene-difluoride) víi 2 µl kh¸ng nguyªn (kho¶ng 100 ng protein tinh

chÕ) cho mçi ®iÓm. Mµng ®−îc nhuém víi c¸c huyÕt thanh d−¬ng tÝnh vµ ©m

tÝnh víi virus Dengue do phßng ThÝ nghiÖm Virus Dengue, ViÖn VSDTT¦ cung

cÊp. KÕt qu¶ cho thÊy c¸c kh¸ng nguyªn DE3 t¸i tæ hîp còng ph¶n øng rÊt ®Æc

hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue trong huyÕt thanh bÖnh nh©n (H×nh

115

3.13).

H×nh 3.13. Dïng protein D1E3, D2E3, D3E3, D4E3 t¸i tæ hîp

®Ó ph¸t hiÖn kh¸ng thÓ kh¸ng virus dengue tù nhiªn trong

(cid:190) 1-4, 9: C¸c mÉu huyÕt thanh ®· ®−îc x¸c ®Þnh d−¬ng tÝnh

(cid:190) 5-8, 10: C¸c mÉu huyÕt thanh ®· ®−îc x¸c ®Þnh ©m tÝnh

116

huyÕt thanh bÖnh nh©n b»ng Dot blot

3.3. T¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®äan gen PreM vµ E cña 4

type virus Dengue.

3.3.1. T¸ch RNA tæng sè cña tÕ bµo muçi C6/36

TÕ bµo muçi Aedes albopictus dßng C6/36 ®· ®−îc g©y nhiÔm bëi virus Dengue

c¸c type 1,2,3 vµ 4 vµ ®· ®−îc kiÓm tra nh− nªu ë môc 3.1 sÏ ®−îc sö dông ®Ó

t¸ch RNA tæng vµ sö dông ®Ó khuÕch ®¹i gen pre-M-E cña virus Dengue.

3.3.1.1. KiÓm tra RNA t¸ch chiÕt b»ng ph−¬ng ph¸p quang phæ kÕ

Ph−¬ng ph¸p quang phæ kÕ cho phÐp x¸c ®Þnh mét c¸ch t−¬ng ®èi nång ®é

RNA, ®ång thêi kiÓm tra ®é tinh s¹ch cña mÉu RNA t¸ch chiÕt.

Dùa vµo sè liÖu nµy cã thÓ x¸c ®Þnh ®−îc l−îng RNA thÝch hîp cho viÖc khuÕch

®¹i gen b»ng RT-PCR.

B¶ng 3.4: KÕt qu¶ ®o OD cña RNA tæng sè

A260 A280 A260/A280 Nång ®é RNA (µg/µl)

D1 0,910 0,466 1820 1,952

D2 1.676 0.856 3352 1.950

D3 0.642 0.316 1284 2.030

D4 1.130 0.566 2260 1.996

Theo kÕt qu¶ trªn th× c¶ 4 mÉu RNA ®−îc t¸ch chiÕt tõ tÕ bµo C6/36 cã tû sè A260/A280 lín h¬n 1.8 vµ nhá h¬n 2.0. Nh− vËy tÊt c¶ c¸c mÉu nµy ®Òu ®¹t yªu cÇu vÒ ®é s¹ch.

3.3.1.2. KiÓm tra RNA t¸ch chiÕt b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose

C«ng viÖc t¸ch chiÕt RNA tæng sè cã chøa ®o¹n gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn vá

117

cña virus Dengue typ 2 ngoµi yªu cÇu ®¹t ®−îc ®é tinh s¹ch (kh«ng bÞ t¹p nhiÔm

protein) cßn ph¶i ®¶m b¶o sao cho RNA cßn nguyªn vÑn, Ýt bÞ ®øt gÉy. KiÓm tra

RNA b»ng ®iÖn di trªn gel Agarose 1% cã thÓ ®¸nh gi¸ møc ®é nguyªn vÑn cña

1 2 3 4

RNA. KÕt qu¶ ®iÖn di c¸c mÉu RNA t¸ch chiÕt tõ tÕ bµo C6/36 ®−îc thÓ hiÖn ë h×nh 3.11:

H×nh 3.14. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt RNA tæng sè tõ tÕ bµo C6/36

nhiÔm virus Dengue c¸c typ D1, D2, D3 vµ D4.

1, 2, 3, 4: RNA tæng sè t¸ch chiÕt tõ tÕ bµo g©y nhiÔm víi

c¸c type virus Dengue D1, D2, D3 vµ D4.

3.3.2. KhuÕch ®¹i ®o¹n gene PreM vµ E b»ng ph−¬ng ph¸p RT-PCR [1]

RNA tæng sè t¸ch tõ tÕ vµo C6/36 ®· ®−îc kiÓm tra b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di vµ ph−¬ng ph¸p quang phæ kÕ ®−îc sö dông lµm khu«n cho ph¶n øng RT- PCR.

§o¹n gen PreM vµ E cña 4 type virus Dengue lµ mét ®o¹n gen cã ®é dµi cã kÝch

118

th−íc nh− sau (B¶ng 3.5):

B¶ng 3.5: KÝch th−íc ®o¹n gene PreM vµ E cña

c¸c type virus dengue

KÝch th−íc gene KÝch th−íc gene KÝch th−íc gene Type dengue PreM–E preM E

D1 498 bp 1485 bp 1983

D2 498 bp 1485 bp 1983

D3 498 bp 1479 bp 1977

D4 498 bp 1485 bp 1983

Nh− vËy, toµn bé ®o¹n gen preM-E cña c¸c type D1, D2 vµ D4 cã ®é dµi 1983

bp. Riªng type D3 cã ®é dµi 1977 bp, do gen E bÞ mÊt ®o¹n 6 bp.

KhuÕch ®¹i mét ®o¹n tr×nh tù cã kÝch th−íc lín h¬n 1,8kb b»ng ph¶n øng RT-

PCR khi sö dông Taq-polymerase rÊt dÔ x¶y ra sai sãt. H¬n n÷a, khi gi¶i tr×nh tù

®o¹n ADN cã ®é dµi lín h¬n 1,8kb, m¸y x¸c ®Þnh tr×nh tù sÏ kh«ng thÓ ®äc

th«ng ®−îc. V× vËy, ®Ó kh¾c phôc nh÷ng vÊn ®Ò nªu trªn, chóng t«i tiÕn hµnh

thiÕt kÕ hai cÆp måi cho mçi type dùa vµo tr×nh tù bé gene cña virus dengue ®·

®−îc c«ng bè trong Ng©n hµng D÷ liÖu Gen Quèc tÕ. CÆp thø nhÊt DxP5 vµ DxM5 ®Ó nh©n ®o¹n gen cña ®Çu 5’, cÆp thø hai DxP3 vµ DxM3 ®Ó nh©n ®o¹n gen ®Çu 3’. ViÖc thiÕt kÕ hai cÆp måi sao cho c¸c s¶n phÈm PCR thu ®−îc cã mét phÇn

lång vµo nhau (overlaping region), sau ®ã sÏ chän mét vÞ trÝ giíi h¹n thÝch hîp ë

vïng nµy ®Ó c¾t vµ nèi hai ®o¹n gene ®· ®−îc t¸ch dßng ®Ó ®−îc ®o¹n ADN

hoµn chØnh mang toµn bé gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn preM vµ E. KÕ ho¹ch t¸ch

dßng gen ®· ®−îc nªu trong phÇn ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. KÝch

119

th−íc s¶n phÈm PCR dù tÝnh ®−îc tr×nh bµy trong b¶ng 3.6.

B¶ng 3.6. KÝch th−íc dù tÝnh cña c¸c s¶n phÈm PCR

Type KÝch th−íc s¶n phÈm PCR ®Çu 5’ KÝch th−íc s¶n phÈm PCR ®Çu 3’

1357 bp 1393 bp D1

1387 bp 1480 bp D2

1458 bp 1555 bp D3

1304 bp 1324 bp D4

Ký hiÖu c¸c ®o¹n nh− sau:

- §o¹n tr×nh tù dengue type 1 ®Çu 5’ ký hiÖu lµ D1-5

- §o¹n tr×nh tù dengue type 1 ®Çu 3’ ký hiÖu lµ D1-3

- §o¹n tr×nh tù dengue type 2 ®Çu 5’ ký hiÖu lµ D2-5

- §o¹n tr×nh tù dengue type 2 ®Çu 3’ ký hiÖu lµ D2-3

- §o¹n tr×nh tù dengue type 3 ®Çu 5’ ký hiÖu lµ D3-5

- §o¹n tr×nh tù dengue type 3 ®Çu 3’ ký hiÖu lµ D3-3

- §o¹n tr×nh tù dengue type 4 ®Çu 5’ ký hiÖu lµ D4-5

120

- §o¹n tr×nh tù dengue type 4 ®Çu 3’ ký hiÖu lµ D4-3

B¶ng 3.7: Tr×nh tù cña c¸c cÆp måi

5'- TCCAGACGTTTGGATTTCTGTCGC -3'

Tr×nh tù måi Tm Tªn

D1M5

5'- GACCATGCTCCTTATGCTGCTGCC -3'

D1P5

5'- TCGAGACGAGTGGCTGATCG -3'

D1M3

5'- CGTTTGTGGACAGAGGCTGG -3'

D1P3

5’- CAAAGCTGACCAACACAACAACAGC -3’

D2P5

5’- GTTACTGAGCGGATTCCACAAATGC -3’

D2M5

5’- GCTGAACATCTTGAACAGGAGACGC -3’

D2P3

5’- TGACATCTGGATTTCCGTGGCC -3’

D2M3

5'- CCTCAGATTTCTTAGCCATTCCACC -3’

D3 P5

5'- TGCATTGCTCCCTCTTGTGATCC -3’

D3M5

5'- AAGCCCACGCTGGACATAGAGC -3’

D3P3

5'- TTCTGGTTGTTGACCTAATTCCGC -3’

D3M3

5'- CTGTGCTTGATTCCCACCGTAATGG -3’

D4P5

5'- ATGGCTCCTTCCTGAGATCCCAGC -3’

D4M5

5'- CCTCAATATCAAACATAACTACGGC -3’

D4P3

5'- CTCCATGACACCACACAACCC -3’

D4M3

Ph¶n øng RT-PCR cña mçi type dengue ®−îc tiÕn hµnh trong hai èng Eppendort

riªng biÖt, mçi èng dïng mét cÆp måi. Chóng t«i sö dông bé sinh phÈm SuperScriptTM One-Step RT-PCR with Platinum®Tag cña h·ng Invitrogen ®Ó tiÕn

hµnh ph¶n øng RT-PCR khuÕch ®¹i gen. Theo bé Kit nµy th× c¶ hai ho¹t ®éng

phiªn m· ng−îc vµ tæng hîp DNA ®−îc tiÕn hµnh chØ trong 1 ph¶n øng (One-

Step).

Thµnh phÇn vµ qui tr×nh tiÕn hµnh ph¶n øng ®· ®−îc tr×nh bµy trong phÇn ®èi

121

t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu.

S¶n phÈm RT-PCR sau khi khuÕch ®¹i ®−îc kiÓm tra b»ng ch¹y ®iÖn di trªn gel

agarose 1%. KÕt qu¶ kiÓm tra thÓ hiÖn trªn h×nh 3.11.

M 1 2 3 4 5 6 7 8

~1.5kb

M: Thang DNA (DNA lambda c¾t b»ng EcoRI vµ HindIII)

1: S¶n phÈm RT-PCR dengue type 1 ®Çu 3’

2: S¶n phÈm RT-PCR dengue type 1 ®Çu 5’

3: S¶n phÈm RT-PCR dengue type 2 ®Çu 3’

4: S¶n phÈm RT-PCR dengue type 2 ®Çu 5’

5: S¶n phÈm RT-PCR dengue type 3 ®Çu 3’

6: S¶n phÈm RT-PCR dengue type 3 ®Çu 5’

7: S¶n phÈm RT-PCR dengue type 4 ®Çu 3’

8: S¶n phÈm RT-PCR dengue type 4 ®Çu 5’

H×nh 3.15. KiÓm tra s¶n phÈm RT-PCR b»ng ®iÖn di

KÕt qu¶ trªn b¶n ®iÖn di lµ mét v¹ch duy nhÊt, s¸ng râ chøng tá ®o¹n ADN

thuéc gen PreM-E ®· ®−îc nh©n lªn mét c¸ch ®Æc hiÖu, chØ t¹o ra mét s¶n phÈm

duy nhÊt, kh«ng cã c¸c s¶n phÈm phô. §èi chiÕu víi thang DNA chuÈn chóng

t«i thÊy kÝch th−íc cña c¸c s¶n phÈm RT-PCR kho¶ng 1,5kb lµ ®óng theo dù

tÝnh. KÕt qu¶ nµy chøng tá ch−¬ng tr×nh khuÕch ®¹i gen mµ chóng t«i ®· thiÕt kÕ

122

lµ phï hîp. Tuy nhiªn vÉn cÇn ph¶i t¸ch dßng, gi¶i tr×nh tù, thu nhËn c¸c

plasmid t¸i tæ hîp mang gen ®Ó kh¼ng ®Þnh l¹i kÕt qu¶ vµ dïng c¸c gen ®· t¹o

dßng ®Ó phôc vô cho môc ®Ých thiÕt kÕ vector biÓu hiÖn s¶n xuÊt protein t¸i tæ

hîp sau nµy.

3.3.1.4. G¾n s¶n phÈm RT-PCR vµo vector t¸ch dßng pCR2.1

Sau khi khuÕch ®¹i ®o¹n gen vµ kiÓm tra s¶n phÈm RT-PCR b»ng ®iÖn di trªn

gel agarose 1%, chóng t«i ®· tiÕn hµnh t¸ch dßng hai ®o¹n ADN thuéc ®Çu 5’ vµ

3’ thuéc gen PreM-E cña virus dengue c¸c type. ViÖc t¸ch dßng ®−îc thùc hiÖn

b»ng c¸ch g¾n trùc tiÕp s¶n phÈm RT-PCR vµo vector t¸ch dßng pCR2.1 cña

h·ng Invitrogen. S¶n phÈm RT-PCR ®−îc tæng hîp nhê Tag polymerase.

Enzyme nµy cã ho¹t tÝnh terminal transferase g¾n thªm mét nucleotide A ë ®Çu

3’ cña s¶n phÈm PCR. Trong khi ®ã vector pCR2.1 ®−îc treo nucleotit T bæ

sung, do vËy ph¶n øng nèi gi÷a vector vµ s¶n phÈm PCR cã thÓ x¶y ra dÔ dµng.

Ph¶n øng dùa vµo ®Æc tÝnh xóc t¸c h×nh thµnh liªn kÕt nèi hai ®o¹n DNA cña

enzyme DNA ligase. Trong thÝ nghiÖm nµy chóng t«i sö dông enzyme T4DNA ligase. Enzyme nµy cã nguån gèc phage T4 x©m nhiÔm E. coli, nã cã kh¶ n¨ng

nèi hai tr×nh tù DNA b»ng mèi liªn kÕt phosphodiester. Sau khi g¾n, s¶n phÈm

cña ph¶n øng g¾n ®−îc biÕn n¹p vµo E. coli ®Ó chän c¸c plasmid t¸i tæ hîp mang

gen.

3.3.1.5. BiÕn n¹p vector t¸i tæ hîp vµo tÕ bµo kh¶ biÕn E. coli chñng INVαF’

Vector pCR2.1 sau khi ®−îc g¾n ®o¹n DNA cÇn t¸ch dßng ®−îc biÕn n¹p vµo tÕ

bµo vi khuÈn E. coli chñng INVαF’ theo ph−¬ng ph¸p nh− ®· nªu ë phÇn §èi

t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. Nhê bé m¸y tæng hîp cña tÕ bµo vi khuÈn,

plasmid ®−îc t¹o víi sè l−îng lín c¸c b¶n sao.

Sau khi biÕn n¹p dÞch tÕ bµo ®−îc cÊy lªn ®Üa m«i tr−êng th¹ch LB cã bæ xung

Ampicillin (100µg/ml ) vµ X-gal (40mg/ml). V× trong tÕ bµo INVαF’ kh«ng cã

123

chÊt øc chÕ cña operon lac do ®ã kh«ng cÇn bæ xung chÊt c¶m øng IPTG. Trong

m«i tr−êng chän läc nµy, theo lý thuyÕt th× c¸c khuÈn l¹c E. coli chñng INVαF’

chøa vector t¸i tæ hîp sÏ cã mµu tr¾ng, trong khi ®ã c¸c khuÈn l¹c mang vector

pCR2.1 kh«ng ®−îc g¾n xen bëi ®o¹n DNA cÇn t¸ch dßng sÏ cã mÇu xanh.

Toµn bé c¸c khuÈn l¹c ph¸t triÓn ®−îc trªn m«i tr−êng cã Ampicillin ®Òu lµ vi

khuÈn mang plasmid v× sù cã mÆt cña gen kh¸ng Ampicillin trong plasmid mang

®Õn cho vi khuÈn tÝnh kh¸ng Ampicillin. Nh÷ng khuÈn l¹c xanh xuÊt hiÖn lµ do

vector pCR2.1 mang lac-operon ho¹t ®éng b×nh th−êng tæng hîp nªn β-

galactosidase lµ emzym cã vai trß chuyÓn ho¸ c¬ chÊt X-gal thµnh hîp chÊt cã

mÇu xanh. Cßn nh÷ng khuÈn l¹c mµu tr¾ng cã thÓ lµ do nhËn ®−îc plasmid

mang lac-operon kh«ng ho¹t ®éng nªn kh«ng tæng hîp ®−îc β-galactosidase vµ

kh«ng x¶y ra sù chuyÓn ho¸ X-gal. Tuy nhiªn kh«ng ph¶i tÊt c¶ c¸c khuÈn l¹c

tr¾ng ®Òu mang plasmid t¸i tæ hîp chøa ®o¹n DNA mong muèn. MÆc dï vËy

viÖc chän c¸c khuÈn l¹c tr¾ng ®Ó t¸ch chiÕt ®· lo¹i bá ®−îc phÇn lín c¸c tr−êng

hîp kh«ng mong muèn. §Ó kh¼ng ®Þnh mét c¸ch ch¾c ch¾n kÕt qu¶ cuèi cïng

cÇn kiÓm tra c¸c plasmid ®· t¸ch chiÕt b»ng enzyme giíi h¹n, sau ®ã gi¶i tr×nh

tù cña ®o¹n DNA ®· ®Ýnh víi vector.

3.3.1.6. KÕt qu¶ t¸ch chiÕt vµ kiÓm tra c¸c plasmid t¸i tæ hîp tõ E. coli

C¸c tÕ bµo tõ thÓ biÕn n¹p ®−îc nu«i cÊy huyÒn phï qua ®ªm ®Õn giai ®o¹n æn

®Þnh, sau ®ã ly t©m thu tÕ bµo. DNA plasmid ®−îc t¸ch chiÕt tõ tÕ bµo E. coli vµ

kiÓm tra b»ng c¾t víi enzyme EcoRI. Vector pCR2.1 cã hai vÞ trÝ c¾t cña

enzyme nµy ë s¸t hai ®Çu më vßng v× vËy khi xö lý vector t¸i tæ hîp víi EcoRI

®o¹n ADN ®Ýnh chÌn sÏ bÞ t¸ch ra khái vector. Qui tr×nh tiÕn hµnh ph¶n øng c¾t

®· ®−îc nªu trong phÇn ®èi t−îng vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu. Sau khi xö lý, s¶n

phÈm c¾t ®−îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel agarose 1%. KÕt qu¶ ®−îc nªu

124

trong c¸c h×nh

M 1 2 3 1 M 2 3

H×nh 3.16A. C¾t kiÓm tra vector t¸i tæ hîp dengue type 1 b»ng Eco RI

H×nh 3.16B. C¾t kiÓm tra vector t¸i tæ hîp dengue type 2 b»ng Eco RI

M: Thang DNA 1. S¶n phÈm PCR D1-3 2. Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp D1-3 3. Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp D1-5

M: Thang DNA 1. Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp D2-3 2. S¶n phÈm PCR D2-5 3. Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp D2-5

1 2 M 3 4 M 1 2 3

H×nh 3.16 C. C¾t kiÓm tra vector t¸i tæ hîp dengue type 3 b»ng EcoR I

H×nh 3.16D: C¾t kiÓm tra vector t¸i tæ hîp dengue type 4 b»ng EcoR I

M: Thang DNA 1. S¶n phÈm PCR D4-5 2. Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp D4-3 3. Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp D4-5

125

M: Thang DNA 1. S¶n phÈm PCR D3-3 2. Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp D3-3 3. Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp D3-5 4. S¶n phÈm PCR D3-5 5

KÕt qu¶ kiÓm tra b»ng xö lý víi EcoRI ë c¸c h×nh trªn cho thÊy, sau khi xö lý,

c¸c ®o¹n ADN t−¬ng øng ®Òu ®−îc t¸ch ra tõ vector víi kÝch th−íc t−¬ng ®−¬ng

s¶n phÈm PCR. Riªng ®èi víi tr−êng hîp ®o¹n gen ®Çu 3’ cña typ 3 (®−êng ch¹y

sè 2, h×nh 3.16 C), khi xö lý víi EcoRI thÊy 2 b¨ng ®−îc t¸ch ra khái vector.

Nh− vËy cã kh¶ n¨ng trªn ®o¹n gen nµy cã thªm mét vÞ trÝ giíi h¹n cña EcoRI.

§iÒu nµy cÇn ®−îc kiÓm chøng b»ng gi¶i tr×nh tù ADN sau nµy.

3.3.1.7. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù

§Ó kh¼ng ®Þnh ch¾c ch¾n viÖc t¸ch dßng thµnh c«ng tr×nh tù PreM vµ E cña

dengue c¸c type, chóng t«i tiÕn hµnh gi¶i tr×nh tù. C¸c dßng plasmid t¸i tæ hîp

®−îc tinh s¹ch vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù DNA theo ph−¬ng ph¸p tæng hîp cña Sanger

vµ céng sù, sö dông bé Kit x¸c ®Þnh tr×nh tù BigDye Terminator 3.1 vµ m¸y x¸c

126

®Þnh tr×nh tù ABI 3100 Avant (Applied Biosystems, Mü).

ID D1-1 PCR PRELIMINARY; DNA; 1357 BP.

SQ SEQUENCE 1357 BP; 424 A; 306 C; 344 G; 283 T;

GACCATGCTC CTTATGCTGC TGCCCACAGC CTTGGCGTTT CATCTGACCA CACGAGGGGG

AGAGCCGCAT ATGATAGTTA CCAAGCAGGA AAGAGGAAAG TCACTTTTGT TTAAGACCTC

AGCTGGTGTC AACATGTGCA CCCTTATTGC GATGGATTTG GGAGAGTTAT GTGAGGACAC

AATGACTTAC AAATGCCCTC GAATCACTGA GGCGGAACCA GATGACGTTG ATTGTTGGTG

CAATGCCACA GACACATGGG TGACCTATGG AACGTGTTCC CAAACTGGCG AGCACCGACG

AGACAAACGT TCCGTCGCAC TGGCCCCACA CGTGGGACTT GGTCTAGAAA CAAGAACCGA

AACGTGGATG TCCTCTGAAG GCGCTTGGAA ACAAATACAA AGAGTGGAGA CTTGGGCCCT

GAGACATCCA GGATTCACAG TGATAGCCCT TTTTCTAGCA CATGCCATAG GAACATCCAT

CACCCAGAAA GGGATTATTT TCATCTTGTT GATGCTGGTA ACACCATCCA TGGCCATGCG

ATGTGTGGGA ATAGGCAACA GGGACTTCGT GGAAGGACTG TCAGGAGCAA CGTGGGTAGA

TGTGGTACTG GAACATGGAA GTTGCGTCAC CACCATGGCA AAAGATAAAC CAACATTGGA

CATTGAACTC TTGAAGACGG AAGTCACAAA CCCTGCCGTC CTGCGCAAAC TGTGCATCGA

AGCTAAAATA TCAAACACCA CCACCGATTC AAGATGTCCA ACACAAGGAG AAGCCACACT

GGTGGAAGAA CAAGACGCGA ATTTTGTGTG TCGACGAACG TTTGTGGACA GAGGCTGGGG

CAATGGCTGT GGGCTTTTCG GAAAAGGTAG CCTAATAACG TGTGCTAAGT TCAAGTGTGT

GACAAAACTG GAAGGAAAGA TAGTTCAATA TGAAAACTTG AAATATTCAG TAATAGTCAC

CGTCCACACT GGAGACCAGC ACCAGGTGGG AAATGAAAGC ACAGAACATG GGACAACAGC

AACTATAACA CCTCAAGCTC CCACGTCGGA AATACAGCTG ACCGACTACG GAGCTCTTAC

ATTGGATTGC TCACCTAGAA CAGGACTAGA CTTCAATGAA ATGGTGTTGT TGACAATGAA

AGAAAAATCA TGGCTAGTCC ACAAACAATG GTTTCTAGAC TTACCACTGC CTTGGACCTC

GGGAGCTACA ACGTCACAAG AGACTTGGAA CAGACAAGAT TTGCCGGTAA CATTTAAGAC

AGCTCATGCA AAGAAGCAGG AAGTAGTCGT ACTAGGATCA CAAGAAGGAG CAATGCACAC

TGCGTTGACC GGAGCGACAG AAATCCAAAC GTCTGGA

C¸c tr×nh tù hai ®Çu 5’ vµ 3’ cña dengue c¸c type:

H×nh 3.73A. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n D1-5. Vïng ch÷ in ®Ëm vµ

127

nghiªng lµ vÞ trÝ c¾t cña enzyme Dra III.

ID D1-2 PCR PRELIMINARY; DNA; 1393 BP.

SQ SEQUENCE 1393 BP; 449 A; 270 C; 368 G; 306 T;

CGTTTGTGGA CAGAGGCTGG GGCAATGGCT GTGGGCTTTT CGGAAAAGGT AGCCTAATAA

CGTGTGCTAA GTTCAAGTGT GTGACAAAAC TGGAAGGAAA GATAGTTCAA TATGAAAACT

TGAAATATTC AGTAATAGTC ACCGTCCACA CTGGAGACCA GCACCAGGTG GGAAATGAAA

GCACAGAACA TGGGACAACA GCAACTATAA CACCTCAAGC TCCCACGTCG GAAATACAGC

TGACCGACTA CGGAGCTCTT ACATTGGATT GCTCACCTAG AACAGGACTA GACTTCAATG

AAATGGTGTT GTTGACAATG AAAGAAAAAT CATGGCTAGT CCACAAACAA TGGTTTCTAG

ACTTACCACT GCCTTGGACC TCGGGAGCTA CAACGTCACA AGAGACTTGG AACAGACAAG

ATTTGCCGGT AACATTTAAG ACAGCTCATG CAAAGAAGCA GGAAGTAGTC GTACTAGGAT

CACAAGAAGG AGCAATGCAC ACTGCGTTGA CCGGAGCGAC AGAAATCCAA ACGTCTGGAA

CGACAAAAAT TTTTGCAGGA CACTTGAAAT GTAGACTAAA AATGGACAAA CTGACTCTAA

AAGGGATGTC ATATGTGATG TGCACAGGCT CATTCAAGCT AGAGAAAGGG GTGGCTGAGA

CCCAGCATGG AACCGTTCTA GTGCAGGTTA AATACGAAGG AACAGATGCA CCATGCAAGA

TCCCTTTTTC AACCCAAGAT GAAAAAGGAG TAATCCAGAA TGGGAGAGTG ATAACAGCCA

ACCCTATAGT CACTGACAAG GAAAAACCAG TCAACATTGA GGCAGAACCA CCTTTTGGTG

AGAGTTACAT CGTGGTAGGA GCAGGTGAAA AAGCTTTGAA ACTAAGCTGG TTCGAGAAAG

GAAGCACCAT AGGGAAAATG TTTGAGGCAA CTGCCCGAGG AGCACGAAGG ATGGCCATAC

TGGGAGACAC CGCATGGGAC TTTGGTTCTA TAGGAGGAGT GTTCACATCT GTGGGAAAAT

TAGTGCATCA GATTTTTGGA ACTGCATATG GAGTTTTGTT CAGCGGTGTT TCCTGGACTA

TGAAAATAGG AATAGGGGTT CTGCTGACAT GGCTAGGATT AAACTCAAGG AGCACGTCCC

TTTCGATGAC GTGCATTGCA GTTGGCCTGG TAACACTGTA CCTAGGAGTC ATGGTTCAGG

CGGATTCGGG ATGTGTAATT AATTGGAAAG GCAGAGAACT CAAATGTGGA AGTGGCATTT

TTGTCACCAA TGAAGTTCAC ACTTGGACAG AGCAATACAA ATTTCAGGCT GACTCCCCAA

AGAGACTATC AGCAGCCATC GGGAAGGCAT GGGAGGAGGG TGTGTGTGGA ATTCGATCAG

CCACTCGTCT CGA

H×nh 3.17B. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n D1-3. Vïng ch÷ in ®Ëm vµ

128

nghiªng lµ vÞ trÝ c¾t cña enzym Dra III.

ID D2-5_C4 PRELIMINARY; DNA; 1387 BP.

SQ SEQUENCE 1387 BP; 466 A; 294 C; 347 G; 280 T;

GCTGAACATC TTGAACAGGA GACGCAGAAC TGCAGGCATG ATCATTATGC TGATTCCAAC

AGTGATGGCG TTCCATTTAA CCACACGTAA CGGAGAACCA CACATGATCG TCAGTAGACA

AGAGAAAGGG AAAAGTCTTC TGTTTAAAAC AGAGGATGGT GTGAACATGT GTACCCTCAT

GGCCATGGAC CTTGGTGAAT TGTGTGAAGA TACAATCACG TACAAGTGTC CTTTTCTCAA

GCAGAATGAA CCAGAAGACA TAGATTGTTG GTGCAACTCT ACGTCCACAT GGGTAACTTA

TGGGACGTGT ACCACCACAG GAGAACACAG AAGAGAAAAA AGATCAGTGG CACTCGTTCC

ACATGTGGGA ATGGGACTGG AGACACGAAC TGAAACATGG ATGTCATCAG AAGGGGCCTG

GAAACATGCC CAGAGAATTG AAACTTGGAT CTTGAGACAT CCAGGCTTTA CCATAATGGC

AGCAATCCTG GCATACACCA TAGGAACGAC ACATTTCCAA AGAGCCCTGA TTTTCATCTT

ACTGACAGCT GTCGCTCCTT CAATGACAAT GCGTTGCATA GGAATATCAA ATAGAGACTT

TGTAGAAGGG GTTTCAGGAG GAAGCTGGGT CGACATAGTC TTAGAACATG GAAGCTGTGT

GACGACGATG GCAAAAAACA AACCAACATT GGATTTTGAA CTGATAAAAA CAGAAGCCAA

ACAACCTGCC ACTCTAAGGA AGTACTGTAT AGAGGCAAAG CTGACCAACA CAACAACAGA

TTCTCGCTGC CCAACACAAG GAGAACCCAG CCTAAATGAA GAGCAGGACA AAAGGTTCGT

CTGCAAACAC TCCATGGTGG ACAGAGGATG GGGAAATGGA TGTGGACTAT TTGGAAAAGG

AGGCATTGTG ACCTGTGCTA TGTTCACATG CAAAAAGAAC ATGAAAGGAA AAGTCGTGCA

ACCAGAAAAC TTGGAATACA CCATTGTGAT AACACCTCAC TCAGGGGAAG AGCATGCAGT

CGGAAATGAC ACAGGAAAAC ATGGCAAGGA AATCAAAATA ACACCACAGA GTTCCATCAC

AGAAGCAGAG TTGACAGGCT ATGGCACTGT CACGATGGAG TGCTCTCCGA GAACGGGCCT

CGACTTCAAT GAGATGGTGT TGCTGCAAAT GGAAAATAAA GCTTGGCTGG TGCACAGGCA

ATGGTTCCTA GACCTGCCGT TGCCATGGCT GCCCGGAGCG GACACACAAG GATCAAATTG

GATACAGAAA GAGACATTGG TCACTTTCAA AAATCCCCAT GCGAAGAAAC AGGATGTTGT

TGTTTTGGGA TCCCAAGAAG GGGCCATGCA CACAGCACTC ACAGGGGCCA CGGAAATCCA

GATGTCA

H×nh 3.73 C. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n D2-5. Vïng ch÷ in ®Ëm

129

vµ nghiªng lµ vÞ trÝ c¾t cña enzyme Taq I.

ID D2-3_C8 PRELIMINARY; DNA; 1480 BP.

SQ SEQUENCE 1480 BP; 492 A; 297 C; 372 G; 319 T;

CAAAGCTGAC CAACACAACA ACAGCATCTC GCTGCCCAAC ACAAGGAGAA CCTAGCCTAA

ATGAAGAACA GGACAAAAGA TTTGTCTGCA AACACTCCAT GGTAGACAGA GGATGGGGAA

ATGGATGCGG ATTATTTGGA AAGGGAGGCA TCGTGACCTG TGCAATGTTC ACATGCAAAA

AGAACATGGA AGGAAAAGTC GTGCAACCAG AAAACTTGGA GTACACCATT GTGATAACAC

CTCACTCAGG GGAAGAGAAT GCAGTCGGAA ATGACACAGG AAAACACGGC AAGGAAATTA

AAGTAACACC ACAGAGTTCC ATCACAGAAG CAGAACTAAC AGGCTATGGC ACTGTCACGA

TGGAATGCTC TCCGAGAACG GGCCTCGACT TCAATGAGAT GGTGTTGCTG CAAATGGAAA

ACAAGGCTTG GCTGGTGCAC AGGCAATGGT TCTTAGACCT GCCGTTACCA TGGCTGCCCG

GAGCAGACAC ACAAGGATCA AATTGGATAC AGAAGGAGAC ATTGGTCACT TTCAAAAATC

CCCATGCAAA GAAACAGGAT GTTGTTGTTT TAGGATCCCA AGAAGGGGCT ATGCATACAG

CACTCACAGG GGCCACGGAA ATCCAGATGT CATCAGGAAA CTTACTGTTC ACAGGACATC

TTAAGTGCAG GCTGAGAATG GACAAACTAC AGCTCAAAGG AATGTCATAT TCTATGTGTA

CAGGAAAGTT TAAAGTTGTG AAGGAAATAG CAGAAACACA ACATGGAACA ATAGTTATCA

GAGTACAATA TGAAGGGGAC GGTTCTCCGT GCAAGATCCC TTTTGAAATA ATGGATTTGG

AAAAAAGACA TGTCTTAGGT CGCTTGATTA CAGTCAACCC AATTGTTACA GAAAAAGACA

GCCCAGTCAA CATAGAAGCA GAACCTCCAT TCGGAGACAG CTACATCATT ATAGGAGTAG

AACCGGGACA ACTGAAGCTC AGCTGGTTTA AGAAAGGAAG TTCTATTGGC CAAATGTTTG

AGACAACAAT GAGAGGAGCG AAGAGAATGG CCATTTTAGG TGACACAGCT TGGGATTTTG

GATCCCTGGG AGGAGTGTTC ACATCTATAG GAAAGGCCCT CCACCAAGTC TTTGGAGCAA

TCTATGGGGC TGCCTTCAGT GGGGTTTCAT GGACTATGAA AATCCTCATA GGAGTCGTCA

TCACATGGAT AGGAATGAAT TCACGCAGCA CCTCACTGTC TGTGTCACTA GTATTAGTGG

GGGTCGTGAC ATTATATTTG GGAGTTATGG TGCAGGCCGA TAGTGGCTGC GTTGTGAGTT

GGAAAAACAA AGAACTGAAA TGTGGCAGTG GGATTTTTAT CACAGACAAC GTGCACACAT

GGACAGAACA ATACAAATTC CAACCAGAAT CCCCTTCAAA GCTGGCTTCA GCTATCCAGA

AGGCTCATGA AGAGGGCATT TGTGGAATCC GCTCAGTAAC

H×nh 3.73D. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n D2-3. Vïng ch÷ in ®Ëm vµ

130

nghiªng lµ vÞ trÝ c¾t cña enzym

ID D3-5 c25 PRELIMINARY; DNA; 1458 BP.

SQ SEQUENCE 1458 BP; 448 A; 316 C; 376 G; 318 T;

CCTCAGATTT CTAGCCATTC CACCGACAGC AGGAGTCTTG GCTAGATGGG GTACCTTTAA

GAAGTCGGGG GCTATTAAGG TCTTAAAAGG CTTCAAGAAG GAGATCTCAA ACATGCTGAG

CATTATCAAC AAACGGAAAA AGACATCGCT CTGTCTCATG ATGATGTTAC CAGCAACACT

TGCTTTCCAC TTAACTTCAC GAGATGGAGA GCCGCGCATG ATTGTGGGGA AGAATGAAAG

AGGAAAATCC CTACTTTTTA AGACAGCCTC TGGAATCAAC ATGTGCACAC TCATAGCCAT

GGATTTGGGA GAGATGTGTG ATGACACGGT CACTTACAAA TGCCCCCACA TTACCGAAGT

GGAGCCTGAA GACATTGACT GCTGGTGCAA CCTTACATCG ACATGGGTGA CTTATGGAAC

ATGCAATCAA GCTGGAGAGC ATAGACGCGA TAAGAGATCA GTGGCGTTAG CTCCCCATGT

CGGCATGGGA CTGGACACAC GCACTCAAAC CTGGATGTCG GCTGAAGGAG CTTGGAGACA

AGTCGAGAAG GTAGAGACAT GGGCCCTTAG GCACCCAGGG TTTACCATAC TAGCCCTATT

TCTTGCCCAT TACATAGGCA CTTCCTTGAC CCAGAAAGTG GTTATTTTTA TACTATTAAT

GCTGGTTACC CCATCCATGA CAATGAGATG TGTGGGAGTA GGAAACAGAG ATTTTGTGGA

AGGCCTATCG GGAGCCACGT GGGTTGACGT GGTGCTCGAG CACGGTGGGT GTGTGACTAC

CATGGCTAAG AACAAGCCCA CGCTGGACAT AGAGCTTCAG AAGACCGAGG CCACCCAACT

GGCGACCCTA AGGAAGCTAT GCATTGAGGG AAAAATTACC AACATAACAA CCGACTCAAG

ATGTCCCACC CAAGGGGAAG CGATTTTACC TGAGGAGCAG GACCAGAACT ACGTGTGTAA

GCATACATAC GTGGACAGAG GCTGGGGAAA CGGTTGTGGT TTGTTTGGCA AGGGAAGCTT

GGTGACATGC GCGAAATTTC AATGTTTAGA ATCAATAGAG GGAAAAGTGG TGCAACATGA

GAACCTCAAA TACACCGTCA TCATCACAGT GCACACAGGA GACCAACACC AGGTGGGAAA

TGAAACGCAG GGAGTTACGG CTGAGATAAC ATCCCAGGCA TCAACCGCTG AAGCCATTTT

ACCTGGATAT GGAACCCTCG GGCTAGAATG CTCACCACGG ACAGGTTTGG ATTTCAATGA

AATGATTTTA TTGACAATGA AGAACAAAGC ATGGATGGTA CATAGACAAT GGTTCTTTGA

CTTACCCCTA CCATGGACAT CAGGAGCTAC AACAGAAACA CCAACTTGGA ACAGGAGAGA

GCTTCTTGTG ACATTTAAAA ATGCACATGC AAAAAAGCAA GAAGTAGTTG TCCTTGGATC

ACAAGAGGGA GCAATGCA

H×nh 3.17.E. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n D3-5. Vïng ch÷ in ®Ëm

131

vµ nghiªng lµ vÞ trÝ c¾t cña enzyme Dra III.

ID D3-3 c154 PRELIMINARY; DNA; 1552 BP.

SQ SEQUENCE 1552 BP; 502 A; 313 C; 406 G; 330 T; 1 OTHER;

AAGCCCACGC TGACATAGAG CTTCAGAAGA CCGAGGCCAC CCAACTGGCG ACCCTAAGGA

AGCTATGCAT TGAGGGAAAA ATTACCAACA TAACAACCGA CTCAAGATGT CCCACCCAAG

GGGAAGCGAT TTTACCTGAG GAGCAGGACC AGAACTACGT GTGTAAGCAT ACATACGTGG

ACAGAGGCTG GGGAAACGGT TGTGGTTTGT TTGGCAAGGG AAGCTTGGTG ACATGCGCGA

AATTTCAATG TTTAGAATCA ATAGAGGGAA AAGTGGTGCA ACATGAGAAC CTCAAATACA

CCGTCATCAT CACAGTGCAC ACAGGAGACC AACACCAGGT GGGAAATGAA ACGCAGGGAG

TTACGGCTGA GATAACATCC CAGGCATCAA CCGCTGAAGC CATTTTACCT GGATATGGAA

CCCTCGGGCT AGGATGCTCA CCACGGACAG GTTTGGATTT CAATGAAATG ATTTTATTGA

CAATGAAGAA CAAAGCATGG ATGGTACATA GACAATGGTT CTTTGACTTA CCCCTACCAT

GGACATCAGG AGCTACAACA GAAACACCAA CTTGGAACAG GAGAGAGCTT CTTGTGACAT

TTAAAAATGC ACATGCAAAA AAGCAAGAAG TAGTTGTCCT TGGATCACAA GAGGGAGCAA

TGCATACAGC ACTGACAGGA GCTACAGAGA TCCAAACCTC AGGAGGCACA AGTATTTTGC

GGGCACTTAA AATGTAGACT CAAGATGGAC AAATTGGAAC TCAAGGGGAT GAGCTATGCA

ATGTGCTTGA ATACCTTTGT GTTGAAGAAA GAAGTCTCCG AAACGCAGCA TGGGACAATA

CTCATTAAGG TTGAGTACAA AGGGGAAGAT GCACCCTGCA AGATTCCTTT CTCCACGGAG

GATGGACAAG GGAAAGCTCA CAATGGCAGA CTGATCACAG CCAATCCAGT GGTGACCAAG

AAGGAGGAGC CTGTCAACAT TGAGGCTGAA CCTCCTTTTG GGGAAAGTAA TATAGTAATT

GGAATTGGAG ACAAAGCCCT GAAAATCAAC TGGTACAGGA AGGGAAGCTC GATTGGGAAG

ATGTTCGAGG CCACTGCCAG AGGTGCAAGG CGCATGGCCA TCTTGGGAGA CACAGCCTGG

GACTTTGGAT CAGTGGGTGG TGTTTTGAAT TCATTAGGGA AAATGGTCCA CCAAATATTT

GGGAGTGCTT ACACAGCCCT ATTTAGTGGA GTCTCCTGGA TAATGAAAAT TGGAATAGGT

GTCCCCTTAA CCTGGATAGG GTTGAATTCA AAAAACACTT CTATGTCATT TTCATGCATT

GCGATAGGAA TCATTACACT CTATCTGGGA GTCGTGGTGC AAGCTGACAT GGGGTGTGTC

ATAAACTGGA AAGGCAAAGA ACTCAAATGT GGAAGTGGAA TTTTCGTCAC TAATGAGGTC

CACACCTGGA CAGAGCAATA CAAATTTCAA GCAGACTCCC CCAAAAGACT GGCAACAGCC

ATTGCAGGCG CNTGGGAGAA TGGAGTGTGC GGAATTAGGT CAACAACCAG AA

H×nh 3.17F. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n D3-3. Vïng ch÷ in ®Ëm vµ

132

nghiªng lµ vÞ trÝ c¾t cña enzyme Dra III.

ID D4-5PCRSQ PRELIMINARY; DNA; 1304 BP.

SQ SEQUENCE 1304 BP; 393 A; 264 C; 359 G; 288 T;

CTGTGCTTGA TTCCCACCGT AATGGCGTTT CACTTGTCAA CCAGAGATGG CGAACCCCTT

ATGATAGTGG CAAAACACGA AAGGGGGAGA CCTCTCTTGT TTAAGACAAC AGAGGGAATC

AACAAATGCA CTCTTATTGC CATGGACCTG GGTGAAATGT GTGAGGACAC CGTCACGTAT

GAATGCCCTC TACTGGTCAA TACCGAACCT GAGGACACTG ATTGCTGGTG CAATCTCACG

TCTACCTGGG TCATGTATGG GACATGCACT CAGAGTGGGG AACGGAGACG GGAGAAGCGC

TCAGTAGCCC TAACACCACA TTCAGGAATG GGATTGGAGA CAAGGGCTGA GACATGGATG

TCATCGGAAG GGGCTTGGAA ACATGCTCAG AGGGTAGAGA GTTGGATACT CAGAAACCCA

GGATTCGCTC TCTTGGCAGG ATTTATGGCC TATATGATTG GGCAAACAGG AATCCAGCGA

ACAGTCTTCT TTGTTCTAAT GATGCTGGTC GCCCCATCCT ACGGAATGCG ATGCGTGGGA

GTGGGGAACA GAGACTTTGT GGAAGGAGTC TCAGGTGGAG CATGGGTCGA TTTGGTGCTA

GAACATGGAG GATGTGTCAC AACCATGGCC CAGGGAAAAC CAACCTTGGA TTTTGAACTG

ATCAAGACAA CAGCCAAGGA AGTGGCTCTG TTAAGAACCT ATTGCATTGA AGCCTCGATA

TCAAACATAA CCACAGCAAC AAGATGTCCA ACGCAAGGAG AACCTTATCT CAAAGAGGAA

CAAGATCAAC AGTACATTTG CCGGAGAGAT GTGGTAGACA GAGGGTGGGG CAATGGCTGT

GGCTTGTTTG GGAAAGGAGG AGTTGTGACA TGTGCGAAGT TTTCATGCTC GGGGAAGATA

ACAGGCAATT TGGTCCAAAT TGAGAACCTT GAATACACAG TAGCTGTAAC AGTCCACAAT

GGAGACACCC ATGCAGTAGG AAATGACATA CCCAACCATG GAGTGACAGC CACGATAACC

CCCAGGTCAC CATCGGTAGA AGTTAAATTA CCGGATTATG GAGAATTAAC ACTCGATTGT

GAACCCAGGT CCGGAATTGA TTTTAATGAG ATGATTCTGA TGAAAATGAA AAAGAAAACG

TGGCTTGTGC ACAAGCAATG GTTTTTGGAT CTACCTCTAC CATGGGCAGC AGGAGCAGAC

ACATCAGAAG TTCATTGGAA TCACAAAGAG AGAATGGTGA CATTCAAGGT TCCTCATGCC

AAGAGACAGG ATGTGATAGT GCTGGGATCT CAGGAAGGAG CCAT

H×nh 3.17 G. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n D4-5. Vïng ch÷ in ®Ëm

133

vµ nghiªng lµ vÞ trÝ c¾t cña enzyme BstEII.

ID D4-3COMP PRELIMINARY; DNA; 1324 BP.

SQ SEQUENCE 1324 BP; 406 A; 247 C; 354 G; 316 T; 1 OTHER;

CCTCAATATC AAACATAACT CCGGCAACAA GATGTCCAAC GCAAGGAGAA CCTTATCTCA

AAGAGGAACA AGATCAACAG TACATTTGCC GGAGAGATGT GGTAGACAGA GGGTGGGGCA

ATGGCTGTGG CTTGTTTGGG AAAGGAGGAG TTGTGACATG TGCGAAGTTT TCATGCTCGG

GGAAGATAAC AGGCAATTTG GTCCAAATTG AGAACCTTGA ATACACAGTA GTTGTAACAG

TCCACAATGG AGACACCCAT GCAGTAGGAA ATGACATACC CAACCATGGA GTGACAGCCA

CGATAACCCC CAGGTCACCA TCGGTAGAAG TTAAATTACC GGATTATGGA GAATTAACAC

TCGATTGTGA ACCCAGGTCC GGAATTGATT TTAATGAGAT GATTCTGATG AAAATGAAAA

AGAAAACGTG GCTTGTGCCC AAGCAATGGT TTTTGGATCT ACCTCTACCA TGGNCAGCAG

GAGCAGACAC ATCAGAAGTT CATTGGAATT ACAAAGAGAG AATGGTGACA TTCAAGGTTC

CTCATGCCAG GAGACAGGAT GTGATAGTGC TAGGATCTCA GGAAGGAGCC ATGCATTCTG

CCCTCACCGG AGCTACAGAA GTGGATTCCG GTGATGGAAA CCACATGTTT GCAGGACATC

TGAAATGCAA AGTTCGCATG GAGAAATTGA GAATTAAGGG AATGTCATAC ACGATGTGCT

CAGGAAAGTT CTCAATTGAC AAAGAGATGG CAGAAACACA GCATGGGACA ACAGTGGTAA

AAGTCAAGTA TGAGGGTGCT GGAGCTCCAT GTAAAGTTCC CATAGAGATA AGAGATGTGA

ACAAGGAAAA AGTGGCAGGG CGCATCATCT CATCTACCCC TTTTGCTGAG TATACCAACA

GTGTAACCAA CATAGAATTA GAACCCCCCT TTGGGGACAG CTACATAGTA ATAGGTGTTG

GAGACAGTGC ATTAACACTC CATTGGTTCA GGAAAGGGAG TTCCATTGGC AAGATGCTTG

AGTCCACATA CAGAGGCGCA AAGCGAATGG CCATTCTAGG TGAAACAGCC TGGGATTTTG

GTTCTGTTGG TGGACTGTTC ACATCATTGG GAAAGGCTGT ACACCAGGTT TTTGGTAGTG

TGTATACAAC TATGTTTGGA GGAGTCTCAT GGATGGTTAG AATCCTAATT GGGTTCTTAG

TGTTGTGGAT TGGCACGAAT TCGAGAAACA CCTCAATGGC AATGACGTGC ATAGCTGTTG

GAGGAATCAC TCTGTTTCTG GGTTTCACAG TTCACGCAGA CACGGGTTGT GTGGTGTCAT

GGAG

H×nh 3.17H. KÕt qu¶ x¸c ®Þnh tr×nh tù ®o¹n D4-3. Vïng ch÷ in ®Ëm vµ

nghiªng lµ vÞ trÝ c¾t cña enzyme BstE II.

Nh− vËy, theo lý thuyÕt còng nh− trªn thùc tiÔn cã thÓ ghÐp nèi tr×nh tù hai ®Çu

5’ vµ 3’ ®o¹n gen preM-E cña mçi type nhê ®iÓm c¾t cña c¸c enzyme nh− Dra

III ®èi víi type 1 vµ type 3, Taq I ®èi víi type 2 vµ BstE II ®èi víi type 4 ®Ó thu

®−îc tr×nh tù hoµn chØnh cña gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn PreM vµ E cña virus

134

dengue c¸c type.

1 gaccatgctc cttatgctgc tgcccacagc cctggcgttc catctgacca cccgaggggg

61 agagccgcac atgatagtta gcaaacagga aagaggaaag tcacttttgt tcaagacgtc

121 tgcaggtgtt aacatgtgta cccttattgc aatggatttg ggagagttat gtgaggacac

181 aatgacctac aaatgccccc ggatcactga gacggaacca gatgacgtcg actgttggtg

241 caatgccacg gagacatggg tgacctatgg aacatgttct aaaactggtg aacaccgacg

301 agacaaacgt tccgtcgcac tggcaccaca tgtagggctt ggtctagaaa caagagccga

361 aacgtggatg tcctctgaag gcgcttggaa acaaatacaa aaagtggaga cctgggctct

421 gagacaccca ggattcacgg tgatagccct tttcctagca catgccatag gaacatccat

481 cacccagaaa gggattattt tcattttgtt gatgctagta actccatcca tggccatgcg

541 gtgcgtggga ataggcaaca gagacttcgt agaaggactg tcaggagcta cgtgggtcga

601 tgtggtactg gagcatggaa gttgcgtcac taccatggca aaagacaaac caacactgga

661 cattgaactc ttgaagacgg aggtcacaaa ccctgccatc ctgcgcaaac tgtgcattga

721 agctaaaata tcaaacacca ccactgattc gagatgtcca acacaaggag aagccacgct

781 ggtggaagaa caagacacga actttgtgtg tcgacgaacg ttcgtggaca gaggctgggg

841 caatggttgt gggctattcg gaaaaggtag cttaataact tgtgctaagt tcaagtgtgt

901 gacaaaactg gaaggaaaga tagtccaata tgaaaactta aaatattcag taatagtcac

961 cgtccacact ggagaccagc accaagtggg aaatgagacc acagaacatg gaacaactgc

1021 aaccgtaaca cctcaagctc ccacatcgga aatacagctg acagactacg gagctctaac

1081 actggattgt tcacctagaa cagggttaga ctttaatgag atggtgttgt tgacaatgaa

1141 agaaagatca tggctcgtcc acaaacaatg gtttctagac ttaccactgc cttggaactc

1201 gggggcttca acatcccaag agatttggaa tagacaagac ttactggtca catttaagac

1261 agctcatgca aagaagcagg aagtagttgt actaggatca caagaaggag caatgcacac

1321 tgcgttgact ggagcgacag aaatccaaac gtctggaacg acaacaattt ttgcaggaca

1381 cctgaaatgc agactaaaaa tggataaact gactttaaaa gggatatcat atgtaatgtg

1441 cacaggctca ttcaagttag agaaggaagt ggctgagacc cagcatggaa ctattctagt

1501 gcaggttaaa tacgaaggaa cagatgcacc atgcaagatc cccttctcgt cccaagatga

1561 gaagggagtg acccagaatg ggagattgat aacagccaac cctatagtca ctgacaaaga

1621 aaaaccagtc aacattgagg cggagccacc ttttggtgag agctacattg tggtaggatc

1681 aggtgaaaaa gctttgaaac taagctggtt caagaaggga agcagtatag ggaaaatgtt

1741 tgaagcaact gctcgtggag cacgaaggat ggccatcctg ggagacatcg catgggactt

1801 cggttctgta ggaggagtgt tcacgtctgt gggaaaactg gtacaccaga tttttggaac

1861 tgcgtatgga gttttgttca gcggtgtttc ttggaccatg aaaataggaa tagggattct

1921 gctgacatgg ctaggattaa actcaaggag catgtccctc tcaatgacgt gtatcgcagt

1981 tggcatggtc acactgtacc taggagtcat ggttcaggcg gactcgggat gtgtaatcaa

2041 ctggaaaggc agagaactca aatgtggaag tggcattttg ttactaatga agttcacacc

2101 tggacagagc aatacaaatt ccaggccgac tccccaaaga gactatcagc agctattggg

2161 aaggcatggg aggggggtgt gtgtgggatt cgatcagcca ctcgtctcga

Tr×nh tù hoµn chØnh ®o¹n PreM-M vµ E cña dengue c¸c type:

//

H×nh 3.18A. Tr×nh tù hoµn chØnh gene m∙ ho¸ kh¸ng nguyªn vá (PreM-E)

cña dengue type 1, víi chiÒu dµi 2210 bp, ®∙ ®−îc ®¨ng ký trong Ng©n hµng

135

Gen quèc tÕ víi sè ®¨ng ký AJ574760.

1 gctgaacatc ttgaacagga gacgcagaac tgcaggcatg atcattatgc tgattccaac

61 agtgatggcg ttccatttaa ccacacgtaa cggagaacca cacatgatcg tcagtagaca

121 agagaaaggg aaaagtcttc tgtttaaaac agaggatggt gtgaacatgt gtaccctcat

181 ggccatggac cttggtgaat tgtgtgaaga tacaatcacg tacaagtgtc cttttctcaa

241 gcagaatgaa ccagaagaca tagattgttg gtgcaactct acgtccacat gggtaactta

301 tgggacgtgt accaccacag gagaacacag aagagaaaaa agatcagtgg cactcgttcc

361 acatgtggga atgggactgg agacacgaac tgaaacatgg atgtcatcag aaggggcctg

421 gaaacatgcc cagagaattg aaacttggat cttgagacat ccaggcttta ccataatggc

481 agcaatcctg gcatacacca taggaacgac acatttccaa agagccctga ttttcatctt

541 actgacagct gtcgctcctt caatgacaat gcgttgcata ggaatatcaa atagagactt

601 tgtagaaggg gtttcaggag gaagctgggt cgacatagtc ttagaacatg gaagctgtgt

661 gacgacgatg gcaaaaaaca aaccaacatt ggattttgaa ctgataaaaa cagaagccaa

721 acaacctgcc actctaagga agtactgtat agaggcaaag ctgaccaaca caacaacaga

781 ttctcgctgc ccaacacaag gagaacccag cctaaatgaa gagcaggaca aaaggttcgt

841 ctgcaaacac tccatggtgg acagaggatg gggaaatgga tgtggactat ttggaaaagg

901 aggcattgtg acctgtgcta tgttcacatg caaaaagaac atgaaaggaa aagtcgtgca

961 accagaaaac ttggaataca ccattgtgat aacacctcac tcaggggaag agcatgcagt

1021 cggaaatgac acaggaaaac atggcaagga aatcaaaata acaccacaga gttccatcac

1081 agaagcagag ttgacaggct atggcactgt cacgatggag tgctctccga gaacgggcct

1141 cgacttcaat gagatggtgt tgctgcaaat ggaaaataaa gcttggctgg tgcacaggca

1201 atggttccta gacctgccgt tgccatggct gcccggagcg gacacacaag gatcaaattg

1261 gatacagaaa gagacattgg tcactttcaa aaatccccat gcgaagaaac aggatgttgt

1321 tgttttggga tcccaagaag gggccatgca cacagcactc acaggggcca cagaaatcca

1381 gatgtcatca ggaaacttac tgttcacagg acatctcaag tgcaggctga ggatggacaa

1441 actacagctc aaaggaatgt catactctat gtgcacagga aagtttaaag ttgtgaagga

1501 aatagcagaa acacaacatg gaacaatagt tatcagagta caatatgaag gggacggttc

1561 tccatgtaag atcccttttg agataatgga tttggaaaaa agacatgttt taggtcgcct

1621 gattacagtc aacccaatcg taacagaaaa agatagccca gtcaacatag aagcagaacc

1681 tccattcgga gacagctaca tcatcatagg agtagagccg ggacaattga agctcaactg

1741 gtttaagaaa ggaagttcta tcggccaaat aattgagaca acactgaggg gagcgaagag

1801 aatggccatt ttaggtgaca cagcttggga ttttggatcc ctgggaggag tgtttacatc

1861 tataggaaag gctctccacc aagttttcgg agcaatctat ggggctgcct tcagtggggt

1921 ctcatggatt atgaaaatcc tcataggagt cattatcaca tggataggga tgaattcacg

1981 cagcacctca ctgtctgtgt cactagtatt ggtgggagtc gtgacgctgt atttgggagt

2041 tatggtgcag gccgatagtg gttgcgttgt gagctggaaa aacaaagaac tgaagtgtgg

2101 cagtgggatt ttcatcacag acaacgtgca cacatggaca gaacaataca agttccaacc

2161 agaatcccct tcaaaactag cttcagctat ccagaaagct catgaagagg gcatttgtgg

2221 aatccgctca gtaac

H×nh 3.18B. Tr×nh tù hoµn chØnh gene m∙ ho¸ kh¸ng nguyªn vá

(PreM-E) cña dengue type 2, víi chiÒu dµi 2235 bp, ®∙ ®−îc ®¨ng ký trong

136

Ng©n hµng Gen quèc tÕ víi sè ®¨ng ký AJ574886.

1 cctcagattt ctagccattc caccgacagc aggagtcttg gctagatggg gtacctttaa

61 gaagtcgggg gctattaagg tcttaaaagg cttcaagaag gagatctcaa acatgctgag

121 cattatcaac aaacggaaaa agacatcgct ctgtctcatg atgatgttac cagcaacact

181 tgctttccac ttaacttcac gagatggaga gccgcgcatg attgtgggga agaatgaaag

241 aggaaaatcc ctacttttta agacagcctc tggaatcaac atgtgcacac tcatagccat

301 ggatttggga gagatgtgtg atgacacggt cacttacaaa tgcccccaca ttaccgaagt

361 ggagcctgaa gacattgact gctggtgcaa ccttacatcg acatgggtga cttatggaac

421 atgcaatcaa gctggagagc atagacgcga taagagatca gtggcgttag ctccccatgt

481 cggcatggga ctggacacac gcactcaaac ctggatgtcg gctgaaggag cttggagaca

541 agtcgagaag gtagagacat gggcccttag gcacccaggg tttaccatac tagccctatt

601 tcttgcccat tacataggca cttccttgac ccagaaagtg gttattttta tactattaat

661 gctggttacc ccatccatga caatgagatg tgtgggagta ggaaacagag attttgtgga

721 aggcctatcg ggagccacgt gggttgacgt ggtgctcgag cacggtgggt gtgtgactac

781 catggctaag aacaagccca cgctggacat agagcttcag aagaccgagg ccacccaact

841 ggcgacccta aggaagctat gcattgaggg aaaaattacc aacataacaa ccgactcaag

901 atgtcccacc caaggggaag cgattttacc tgaggagcag gaccagaact acgtgtgtaa

961 gcatacatac gtggacagag gctggggaaa cggttgtggt ttgtttggca agggaagctt

1021 ggtgacatgc gcgaaatttc aatgtttaga atcaatagag ggaaaagtgg tgcaacatga

1081 gaacctcaaa tacaccgtca tcatcacagt gcacacagga gaccaacacc aggtgggaaa

1141 tgaaacgcag ggagttacgg ctgagataac atcccaggca tcaaccgctg aagccatttt

1201 acctggatat ggaaccctcg ggctagaatg ctcaccacgg acaggtttgg atttcaatga

1261 aatgatttta ttgacaatga agaacaaagc atggatggta catagacaat ggttctttga

1321 cttaccccta ccatggacat caggagctac aacagaaaca ccaacttgga acaggagaga

1381 gcttcttgtg acatttaaaa atgcacatgc aaaaaagcaa gaagtagttg tccttggatc

1441 acaagaggga gcaatgcata cagcactgac aggagctaca gagatccaaa cctcaggagg

1501 cacaagtatt tttgcggggc acttaaaatg tagactcaag atggacaaat tggaactcaa

1561 ggggatgagc tatgcaatgt gcttgaatac ctttgtgttg aagaaagaag tctccgaaac

1621 gcagcatggg acattactca ttaaggttga gtacaaaggg gaagatgcac cctgcaagat

1681 tcctttctcc acggaggatg gacaagggaa agctcacaat ggcagactga tcacagccaa

1741 tccagtggtg accaagaagg aggagcctgt caacattgag gctgaacctc cttttgggga

1801 aagtaatata gtaattggaa ttggagacaa agccctgaaa atcaactggt acaggaaggg

1861 aagctcgatt gggaagatgt tcgaggccac tgccagaggt gcaaggcgca tggccatctt

1921 gggagacaca gcctgggact ttggatcagt gggtggtgtt ttgaattcat tagggaaaat

1981 ggtccaccaa atatttggga gtgcttacac agccctattt agtggagtct cctggataat

2041 gaaaattgga ataggtgtcc tcttaacctg gatagggttg aattcaaaaa acacttctat

2101 gtcattttca tgcattgcga taggaatcat tacactctat ctgggagtcg tggtgcaagc

2161 tgacatgggg tgtgtcataa actggaaagg caaagaactc aaatgtggaa gtggaatttt

2221 cgtcactaat gaggtccaca cctggacaga gcaatacaaa tttcaagcag actcccccaa

2281 aagactggca acagccattg caggcgcttg ggagaatgga gtgtgcggaa ttaggtcaac

2341 aaccagaa

H×nh 3.18 C. Tr×nh tù hoµn chØnh gene m∙ ho¸ kh¸ng nguyªn vá

(PreM-E) cña dengue type 3, víi chiÒu dµi 2348 bp, ®∙ ®−îc ®¨ng ký trong

137

Ng©n hµng Gen quèc tÕ víi sè ®¨ng ký AJ563355.

1 ctgtgcttga ttcccaccgt aatggcgttt cacttgtcaa ccagagatgg cgaacccctt

61 atgatagtgg caaaacacga aagggggaga cctctcttgt ttaagacaac agagggaatc

121 aacaaatgca ctcttattgc catggacctg ggtgaaatgt gtgaggacac cgtcacgtat

181 gaatgccctc tactggtcaa taccgaacct gaggacactg attgctggtg caatctcacg

241 tctacctggg tcatgtatgg gacatgcact cagagtgggg aacggagacg ggagaagcgc

301 tcagtagccc taacaccaca ttcaggaatg ggattggaga caagggctga gacatggatg

361 tcatcggaag gggcttggaa acatgctcag agggtagaga gttggatact cagaaaccca

421 ggattcgctc tcttggcagg atttatggcc tatatgattg ggcaaacagg aatccagcga

481 acagtcttct ttgttctaat gatgctggtc gccccatcct acggaatgcg atgcgtggga

541 gtggggaaca gagactttgt ggaaggagtc tcaggtggag catgggtcga tttggtgcta

601 gaacatggag gatgtgtcac aaccatggcc cagggaaaac caaccttgga ttttgaactg

661 atcaagacaa cagccaagga agtggctctg ttaagaacct attgcattga agcctcgata

721 tcaaacataa ccacagcaac aagatgtcca acgcaaggag aaccttatct caaagaggaa

781 caagatcaac agtacatttg ccggagagat gtggtagaca gagggtgggg caatggctgt

841 ggcttgtttg ggaaaggagg agttgtgaca tgtgcgaagt tttcatgctc ggggaagata

901 acaggcaatt tggtccaaat tgagaacctt gaatacacag tagctgtaac agtccacaat

961 ggagacaccc atgcagtagg aaatgacata cccaaccatg gagtgacagc cacgataacc

1021 cccaggtcac catcggtaga agttaaatta ccggattatg gagaattaac actcgattgt

1081 gaacccaggt ccggaattga ttttaatgag atgattctga tgaaaatgaa aaagaaaacg

1141 tggcttgtgc ccaagcaatg gtttttggat ctacctctac catggncagc aggagcagac

1201 acatcagaag ttcattggaa ttacaaagag agaatggtga cattcaaggt tcctcatgcc

1261 aggagacagg atgtgatagt gctaggatct caggaaggag ccatgcattc tgccctcacc

1321 ggagctacag aagtggattc cggtgatgga aaccacatgt ttgcaggaca tctgaaatgc

1381 aaagttcgca tggagaaatt gagaattaag ggaatgtcat acacgatgtg ctcaggaaag

1441 ttctcaattg acaaagagat ggcagaaaca cagcatggga caacagtggt aaaagtcaag

1501 tatgagggtg ctggagctcc atgtaaagtt cccatagaga taagagatgt gaacaaggaa

1561 aaagtggcag ggcgcatcat ctcatctacc ccttttgctg agtataccaa cagtgtaacc

1621 aacatagaat tagaaccccc ctttggggac agctacatag taataggtgt tggagacagt

1681 gcattaacac tccattggtt caggaaaggg agttccattg gcaagatgct tgagtccaca

1741 tacagaggcg caaagcgaat ggccattcta ggtgaaacag cctgggattt tggttctgtt

1801 ggtggactgt tcacatcatt gggaaaggct gtacaccagg tttttggtag tgtgtataca

1861 actatgtttg gaggagtctc atggatggtt agaatcctaa ttgggttctt agtgttgtgg

1921 attggcacga attcgagaaa cacctcaatg gcaatgacgt gcatagctgt tggaggaatc

1981 actctgtttc tgggtttcac agttcacgca gacacgggtt gtgtggtgtc atggag

H×nh 3.18D. Tr×nh tù hoµn chØnh gene m∙ ho¸ kh¸ng nguyªn vá

(PreM-E) cña dengue type 4, víi chiÒu dµi 2036 bp, ®∙ ®−îc ®¨ng ký trong

138

Ng©n hµng Gen quèc tÕ víi sè ®¨ng ký AJ563356.

KÕt qu¶ cña viÖc t¸ch dßng lµ tiÒn ®Ò cho b−íc tiÕp theo nghiªn cøu thiÕt kÕ

vector biÓu hiÖn kh¸ng nguyªn vá dengue ®Ó thu nhËn protein t¸i tæ hîp phôc vô

cho viÖc ph¸t triÓn Kit chÈn ®o¸n vµ vaccine t¸i tæ hîp thö nghiÖm.

3.3.1.8. KiÓm tra biÓu hiÖn ®é tinh s¹ch, ®Æc hiÖu cña kh¸ng domain 3

thuéc protein vá cña virus dengue c¸c type [1]

3.3.1.8.1. ThiÕt kÕ vector biÓu hiÖn pET-TRX -DxE3

Domain 3 thuéc protein vá cña virus dengue (ký hiÖu lµ DE3) lµ vïng cã chøa

nhiÒu quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn quan träng. Theo Jaiswal S vµ cs (2004), th×

DE3 võa lµ vïng kh¸ng nguyªn cã tÝnh sinh miÔn dÞch cao võa lµ vïng ®ãng vai

trßn quan träng ®èi víi kh¶ n¨ng x©m nhiÔm cña virus. Vïng DE3 chÝnh lµ vïng

nhËn biÕt thô thÓ trªn bÒ mÆt tÕ bµo gióp cho virus b¸m trªn bÒ mÆt tÕ bµo vµ

x©m nhËp tÕ bµo. ChÝnh vÝ lý do ®ã, chóng t«i lùa chän ®o¹n gene nµy ®Ó biÓu

hiÖn trong E. coli. NÕu cã ®−îc kh¸ng nguyªn DE3 t¸i tæ hîp th× kh«ng nh÷ng

cã thÓ øng dông chÕ t¹o Kit chÈn ®o¸n mµ cßn cã thÓ sö dông kh¸ng nguyªn t¸i

tæ hîp nµy ®Ó nghiªn cøu s©u vÒ c¬ chÕ x©m nhËp cña virus dengue vµo tÕ bµo

139

c¶m nhiÔm sau nµy. KÕ ho¹ch biÓu hiÖn vïng DE3 ®−îc tr×nh bµy ë s¬ ®å sau:

BamHI

XhoI

C¾t b»ng BamHI& XhoI

pET-TRX-FuS-E3

XhoI

pET-TRX-FuS 5.7 Kb

BamHI

Nèi ®o¹n E3 vµo vector pET-TRX-FuS

C¾t b»ng Bam HI & Xho I

XhoI

Vector pCR2.1 t¸i tæ hîp 3.9 Kb

XhoI

HH××nnhh 33..1199.. SS¬¬ ®®åå qquuyy ttrr××nnhh tthhiiÕÕtt kkÕÕ vveeccttoorr bbiiÓÓuu hhiiÖÖnn ppEETT--TTRRXX--EE33

3.3.1.8.2. KhuÕch ®¹i ®o¹n gen E3 b»ng cÆp måi biÓu hiÖn

Trªn cë së tr×nh tù gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn vá cña 4 type virus dengue ph©n

lËp ë ViÖt Nam ®¨ng ký trong ng©n hµng gen quèc tÕ (AJ574760, AJ574886,

AJ563355, AJ563356), chóng t«i ®· thiÕt kÕ c¸c cÆp måi biÓu hiÖn DxE3-NdeI,

DxE3-XhoI treo hai vÞ trÝ c¾t cña Nde I vµ Xho I ®Ó khuÕch ®¹i ®o¹n gen E3. S¶n

phÈm PCR ®o¹n gen E3 cña D1, D2, D3 vµ D4 theo dù tÝnh lý thuyÕt cã chiÒu

140

dµi lÇn l−ît lµ 439, 434, 432 vµ 439 bp (b¶ng 3.8).

B¶ng 3.8: Tr×nh tù c¸c cÆp måi biÓu hiÖn vµ

kÝch th−íc c¸c s¶n phÈm PCR

KÝch th−íc

Tªn måi Tr×nh tù måi s¶n phÈm

D1E3-BamHI

5’ – TGGATCCGGATCACAAGAAGGAGCAAT – 3’

439 bp

D1E3-XhoI

5’ – TCTCGAGTCCCTTCTTGAACCAGCTTAGT – 3’

D2E3-BamHI

5’ – TGGATCCGGATCCCAAGAAGGG – 3’

434 bp

D2E3-XhoI

5’ – TCTCGAGTCCTTTCTTAAACCAGTTGAGC – 3’

D3E3-BamHI

5’ – TGGATCCCAAGAGGGAGCAATGCATAC – 3’

432 bp

D3E3-XhoI

5’ – TCTCGAGCGAGCTTCCCTTCCTGTAC – 3’

D4E3-BamHI

5’ – AGGATCCGGATCTCAGGAAGGAGCCATG – 3’

439

D4E3-XhoI

5’ – TCTCGAGCCCTTTCCTGAACCAATGGAG – 3’

PCR

Sau khi khuÕch ®¹i, s¶n phÈm PCR ®−îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel

agarose 1%. Trªn h×nh cho thÊy s¶n phÈm PCR ®−îc nh©n lªn rÊt ®Æc hiÖu víi

141

träng l−îng ph©n tö phï hîp víi dù tÝnh lý thuyÕt (h×nh 3.17).

M 1

bp

1375- 983-

1375- 983- 564-

564-

432bp

500-

439bp

434bp

1375- 983- 564-

439bp

250-

H×nh 3.20. KÕt qu¶ khuÕch ®¹i ®o¹n E3 cña virus dengue c¸c type 1, 2, 3, 4

víi c¸c cÆp måi ®Æc hiÖu ®∙ treo s½n c¸c vÞ trÝ c¾t BamHI vµ XhoI.

- §−êng ch¹y M: Thang ADN (DNA λ c¾t b»ng Hind III vµ Eco RI ).

- §−êng ch¹y 1: S¶n phÈm PCR.

§Ó cã thÓ kiÓm tra ch¾c ch¾n tr×nh tù ®o¹n gen khuÕch ®¹i còng nh− vÞ trÝ giíi

h¹n nh©n t¹o, s¶n phÈm PCR D1E3, D2E3, D3E3 vµ D4E3 ®−îc g¾n vµo vector

t¸ch dßng pCR 2.1 b»ng enzyme T4 ligase. S¶n phÈm cña ph¶n øng nèi ghÐp

®−îc biÕn n¹p vµo tÕ bµo vi khuÈn E. coli chñng DH5αT’. C¸c dßng plasmid

t¸ch ra tõ c¸c khuÈn l¹c ®−îc chän läc b»ng c¸ch c¾t víi enzyme giíi h¹n Bam

HI, Xho I vµ gi¶i tr×nh tù. Mçi type dengue chØ lÊy mét dßng plasmid duy nhÊt

cã tr×nh tù vµ c¸c vÞ trÝ giíi h¹n ®· ®−îc ph©n tÝch chÝnh x¸c.

3.3.1.8.3. ThiÕt kÕ plasmid t¸i tæ hîp pET-TRX-DxE3

Môc ®Ých lµ s¶n xuÊt ra ®−îc c¸c kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp d¹ng lai ghÐp cña

virus dengue thuéc c¶ 4 typ ®Ó dïng trong chÈn ®o¸n SD/SXHD. C¸c kh¸ng

nguyªn nµy ®−îc s¶n xuÊt ra ë d¹ng lai ghÐp vµ tinh s¹ch, mét ®Çu cã kh¶ n¨ng

ph¶n øng ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus dengue, ®Çu kia ph¶n øng víi mét

kh¸ng thÓ chung (kh¸ng thÓ 2). Kh¸ng thÓ nµy ®−îc g¾n enzyme peroxidase

142

(HRP) ®Ó ph¸t hiÖn ph¶n øng kh¸ng nguyªn kh¸ng thÓ b»ng ELISA [7; 28]. Do

®ã kh¸ng nguyªn nµy rÊt tiÖn dông trong chÈn ®o¸n SD/SXHD b»ng MAC-

ELISA hoÆc GAC-ELISA. §èi víi ph−¬ng ph¸p chÈn ®o¸n SD/SXHD b»ng

MAC-ELISA hoÆc GAC-ELISA [2] hiÖn nay, ng−êi ta th−êng dïng kh¸ng

nguyªn virus Dengue tù nhiªn d¹ng tinh chÕ. Tuy nhiªn, kh¸ng thÓ 2 kh¸ng

virus Dengue g¾n enzyme th−êng ph¶i ®−îc chän läc (th−êng lµ kh¸ng thÓ ®¬n

dßng) ®Ó kh«ng c¹nh tranh vÞ trÞ b¸m víi kh¸ng thÓ 1 trong huyÕt thanh bÖnh

nh©n. Do ®ã Kit chÈn ®o¸n SD/SXHD b»ng MAC-ELISA hoÆc GAC-ELISA

th−êng cã gi¸ thµnh rÊt cao.

§Ó ®¹t ®−îc môc ®Ých s¶n xuÊt ra ®−îc c¸c kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp d¹ng lai

ghÐp cña virus dengue nªu trªn, gen m· hãa cho kh¸ng nguyªn thuéc domain 3

cña virus dengue (DE3) thuéc kh¸ng nguyªn vá cña c¸c typ virus dengue ®−îc

lai ghÐp víi mét protein kh¸c lµ thioredoxin thuéc vector pET-TRX-FuS. C¸c

®o¹n tr×nh tù DxE3 ®−îc c¾t ra khái vector t¸ch dßng b»ng hai enzyme Bam HI

vµ Xho I vµ thu nhËn l¹i nhê kü thuËt chiÕt gel agarose. TiÕp theo, DxE3 ®−îc

g¾n vµo vector pET-TRX-FuS (vector nµy còng ®· c¾t më vßng b»ng hai enzyme

Bam HI vµ Xho I t−¬ng øng). S¶n phÈm ph¶n øng nèi ghÐp ®−îc biÕn n¹p vµo tÕ

bµo E. coli chñng DH5αT’. C¸c dßng plasmid t¸i tæ hîp ®−îc sµng läc vµ c¾t

kiÓm tra b»ng enzyme giíi h¹n Bam HI vµ Xho I. KÕt qu¶ cho thÊy chóng t«i ®·

thiÕt kÕ thµnh c«ng vector biÓu hiÖn pET-TRX-DxE3 c¸c type D1, D2, D3, D4

M 1 2 3 4 5

1375- 983- 564-

432bp

(h×nh 3.21).

H×nh 3.21. C¸c dßng plasmid t¸i tæ hîp pET-TRX-E3 ®−îc c¾t kiÓm tra b»ng enzym giíi

h¹n Bam HI vµ Xho I. M: ChØ thÞ ph©n tö (DNAλ xö lý víi Eco RI+Hind III). 1: S¶n phÈm

PCR ®o¹n E3. 2-5: C¸c plasmid t¸i tæ hîp pET-TRX-FuS-E3(D1, D2, D3, D4).

143

3.3.1.8.4. BiÓu hiÖn DxE3 trong E. coli

Sau khi ®· chän dßng thµnh c«ng c¸c vector t¸i tæ hîp pET-TRX-DxE3, sÏ ®em

no ®Ó biÕn n¹p c¸c vector nµy vµo tÕ bµo E. coli chñng biÓu hiÖn BL21 DE3

Star, c¸c khuÈn l¹c chøa vector t¸i tæ hîp sÏ mäc ®−îc trªn m«i tr−êng LB cã

kh¸ng sinh ampixilin. §Ó thu nhËn protein t¸i tæ hîp chóng t«i tiÕn hµnh nu«i

mçi dßng mét khuÈn l¹c chøa vector t¸i tæ hîp vµ c¶m øng b»ng IPTG nång ®é

cuèi lµ 0,5mM. Protein t¸i tæ hîp Thioredoxin-DXE3-HisTag ®−îc h×nh thµnh bëi sù kÕt nèi 3 chuçi polypeptide víi nhau: Thioredoxin, E3 vµ polyhistidine

víi träng l−îng ph©n tö tÝnh theo lý thuyÕt kho¶ng 30 kDa. Protein dung hîp

Thio-D1E3-HisTag cã träng l−îng ph©n tö lµ 29.914 Da; Thio-D2E3-HisTag lµ 30.314 Da; Thio-D3E3-HisTag lµ 30.014 Da vµ Thio-D4E3-HisTag lµ 29.977 kDa. KÕt qu¶ ë h×nh 3.19 cho thÊy sau khi c¶m øng c¶ 4 type ®Òu xuÊt hiÖn b¨ng

protein l¹. §èi chiÕu víi thang protein chuÈn chóng t«i nhËn thÊy kÝch th−íc cña

c¸c b¨ng míi xuÊt hiÖn sau c¶m øng lµ phï hîp víi tÝnh to¸n lý thuyÕt. Nh− vËy,

protein t¸i tæ hîp ®· ®−îc biÓu hiÖn mét c¸ch cã hiÖu qu¶ d−íi sù ®iÒu khiÓn cña

M 1 2

kDa

116.0 -

66,2 -

45 -

35 -

45 -

29.9 kDa

35 -

25 -

30.3 kDa

18,4 -

25 -

promoter T7 (h×nh 3.18).

D1

D2

144

M 1 2

M 2 1

kDa

66,2 -

45 -

35 -

45 -

30 kDa

35 -

25 -

30 kDa

25 -

18,4 - 14,4 -

D3

D4

H×nh 3.22. KÕt qu¶ biÓu hiÖn protein t¸i tæ c¸c type dengue 1, 2, 3, 4

(cid:190) M: Maker protein.

(cid:190) 1: MÉu kh«ng c¶m øng b»ng IPTG.

(cid:190) 2: MÉu sau c¶m øng b»ng IPTG 0,5mM.

®−îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel polyacrylamide

3.3.1.8.5. Tinh s¹ch kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp

§Ó cã thÓ sö dông protein t¸i tæ hîp phôc vô cho môc ®Ých chÈn ®o¸n th× tr−íc

hÕt chóng cÇn ph¶i ®−îc tinh s¹ch. Protein t¸i tæ hîp cã ®u«i 6 axit amin

Histidine nªn cã thÓ dïng cét Nikel Resin theo nguyªn lý s¾c ký ¸i lùc. DÞch tÕ

bµo biÓu hiÖn ®−îc nu«i víi l−îng 50ml, c¶m øng b»ng IPTG víi nång ®é

0,5mM trong thêi gian 3 giê. Sau khi ly t©m, cÆn tÕ bµo ®−îc hßa l¹i trong 8ml

dÞch ph¸ (Lysis Buffer) vµ ®−îc siªu ©m trong thêi gian 20 phót. DÞch ph¸ tÕ bµo

®−îc ly t©m, phÇn dÞch næi cã chøa protein t¸i tæ hîp ®−îc ®−a lªn cét. C¸c

protein cã ®u«i His-Tag cã ¸i lùc víi Ni+ vµ ®−îc b¸m chÆt chÊt gi¸ trªn cét. Sau

khi röa cét b»ng ®Öm röa (Wash Buffer) c¸c protein cña E. coli sÏ bÞ tr«i khái

cét chØ cßn c¸c protein cã ¸i lùc ®−îc gi÷ l¹i. Sau ®ã protein cã ¸i lùc ra khái cét

145

nhê buffer ®Èy (Elution Buffer) vµ ®−îc thu nhËn theo c¸c ph©n ®o¹n, mçi ph©n

®o¹n 1ml. C¸c ph©n ®o¹n ®−îc kiÓm tra ®é s¹ch b»ng ®iÖn di trªn gel

polyacrylamide. KÕt qu¶ cho thÊy r»ng protein sau khi qua cét lµ rÊt s¹ch, kh«ng

M A B 1 2 3 4 5 6 7

M 1 2 3 B A

kDa

66,2-

45 - 35 -

25 -

18,4 -

lÉn protein kh¸c cña E. coli (h×nh 3.23).

D2

M A B 1 2 3 4 5

D1 M 1 2 3 4 5 6 7 B A

kDa

66,2-

45 -

35 -

25 -

66,2- 45 - 35 - 25 -

18,4 -

18,4 - 14,4 -

D4

D3

H×nh 3.23. KÕt qu¶ tinh chÕ protein t¸i tæ hîp D1E3, D2E3, D3E3, D4E3

(cid:190) M: Maker protein.

(cid:190) 1-7: C¸c ph©n ®o¹n sau khi tinh s¹ch

(cid:190) B: MÉu sau c¶m øng b»ng IPTG 0,5mM ch−a tinh s¹ch.

(cid:190) A: MÉu kh«ng c¶m øng b»ng IPTG.

b»ng cét Nikel Resin ®−îc kiÓm tra b»ng ®iÖn di trªn gel polyacrylamide

3.3.1.8.6. KiÓm tra ph¶n øng cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp víi kh¸ng thÓ

kh¸ng kh¸ng nguyªn tù nhiªn cña virus Dengue b»ng Western Blot

Qu¸ tr×nh tinh s¹ch ngoµi yªu cÇu lo¹i bá c¸c thµnh phÇn kh«ng mong muèn th×

s¶n phÈm cßn cÇn ph¶i gi÷ ®−îc ho¹t tÝnh sinh häc. Trong tr−êng hîp nµy,

146

protein t¸i tæ hîp E3 sÏ ®−îc sö dông cho môc ®Ých chÈn ®o¸n nhanh dùa trªn c¬

së lý thuyÕt cña c¸c kü thuËt miÔn dÞch vµ xa h¬n n÷a lµ sö dông trong nghiªn

cøu t¹o ®¸p øng kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i domain 3 cña virus Dengue nhiªn vµ kh¶

n¨ng øc chÕ sù x©m nhiÔm cña virus vµo tÕ bµo. V× vËy, protein E3 t¸i tæ hîp

sau tinh s¹ch tr−íc hÕt cÇn ph¶i gi÷ ®−îc ho¹t tÝnh cña kh¸ng nguyªn, t−¬ng øng

víi chøc n¨ng kh¸ng nguyªn bÒ mÆt cña kh¸ng nguyªn dengue tù nhiªn.

KiÓm tra møc ®é ph¶n øng cña protein t¸i tæ hîp D1E3, D2E3, D3E3, D4E3 víi

kh¸ng thÓ kh¸ng virus dengue tù nhiªn g©y miÔn dÞch trªn thá b»ng kü thuËt

Western blot. KÕt qu¶ ph¶n øng cña c¶ 4 type ®Òu chØ xuÊt hiÖn 1 b¨ng ®Ëm, râ

nÐt vµ ®óng víi kÝch th−íc dù tÝnh. Nh− vËy, protein E3 t¸i tæ hîp cña virus

dengue c¸c type 1, 2, 3, 4 ®· ph¶n øng rÊt ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus

M 1

dengue tù nhiªn (h×nh 3.24).

kDa

66,2-

45 -

35 -

45 - 35 -

66,2-

35 -

25 -

35 -

25 -

18,4 -

18,4 - 14,4 -

D3

D4

D1

D2

14,4 -

H×nh 3.24. Kh¸ng thÓ kh¸ng virus dengue tù nhiªn ph¶n øng víi

protein t¸i tæ hîp dengue type 1, 2, 3, 4.

M: Marker protein; 1: Protein t¸i tæ hîp E3.

KÕt qu¶ ë h×nh 3.24 cho thÊy, c¸c kh¸ng nguyªn DE3 t¸i tæ hîp t¹o ra cã thÓ

®−îc sö dông ®Ó chÕ t¹o c¸c Kit chÈn ®o¸n SD/SXHD trªn c¬ së c¸c kü thuËt

miÔn dÞch. Qui tr×nh øng dông c¸c k¸ng nguyªn t¸i tæ hîp nµy ®Ó chÕ t¹o c¸c Kit

147

ch¶n ®o¸n SD/SXHD sÏ ®−îc nªu trong môc d−íi.

3.3.3. BiÓu hiÖn kh¸ng nguyªn mµng vµ vá cña virus Dengue type 1, 2, 3, 4

trong hÖ nÊm men Pichia pastoris

3.3.3.1. ThiÕt kÕ vector biÓu hiÖn vïng gen preM – E

Theo Sugrue R.J vµ cs (1997), nÕu biÓu hiÖn toµn bé vïng gen m· hãa cho

kh¸ng nguyªn preM vµ E (vïng preM-env) trong nÊm men Pichia pastoris th×

cã thÓ thu nhËn ®−îc protein t¸i tæ hîp gièng nh− vá cña virus Dengue tù nhiªn.

Chóng t«i lÆp l¹i thÝ nghiÖm nµy víi tham väng cã thÓ thu ®−îc toµn bé protein

vá cña virus Dengue d¹ng t¸i tá hîp. Hai nöa ®o¹n tr×nh tù PreM vµ E ®· t¸ch

dßng vµ gi¶i tr×nh tù ë phÇn trªn cÇn ph¶i ®−îc nèi l¹i thµnh ®o¹n gene hoµn

chØnh (ký hiÖu DxME) vµ ®−a vµo vector biÓu hiÖn.

§èi víi dengue type1 chóng t«i dïng enzyme Dra III ®Ó c¾t vµ nèi hai nöa nµy

M13r

Plac

M13r

Plac

pUC ori

pUC

l¹i víi nhau.

Dra III

ori

pCR D1-5' (5257 bp)

Amp

Dra III

pCR D1-3' (5292 bp )

Amp

Dra IIII

Kana

Z T 7 M13f Lac

f1 ori ori

DraIII

M13f

Kana

T7 Lac Z

f1 ori ori

M13r

Plac

pUC ori

Dra III

pCR D1

XhoI SnaBI EcoRI Avr I NotI

S 3'AOX1 t

(6210 bp) )

Amp

5'AOX 1 Am p pPIC9

(8000 bp) )

Kana

M13f

T 7 Lac Z

Dra III

f1 ori

3'AOX 1

PCR

NotI

SnaBI

HIS 4

DNA Ligase

SalI

full length D1 (1981 bp)

NotI

SnaBI

S D2

3'AOX1 t

5'AOX1 Amp

pPIC-D1 (9981bp)

HIS4

3'AOX1

StulI

H×nh 3.25 A. S¬ ®å thiÕt kÕ vector biÓu hiÖn vïng gen preM-env

148

cña virus dengue type 1.

Vïng gen preM-env cña virus Dengue 1 cã kÝch th−íc 1981 bp. Dßng vector

pCR2.1 chøa ®Çu 3’ ký hiÖu lµ pCRD1-3’ vµ dßng vector pCR2.1 chøa ®Çu ®Çu

5’ ký hiÖu lµ pCRD1-5’. Nh×n tõ s¬ ®å h×nh 3.15 ta thÊy cã c¸c ®iÓm c¾t cña

enzym giíi h¹n Dra III n»m trong gen vµ trªn vïng ®a nèi cña vector. §iÓm Dra

III n»m trong vïng gen lÆp l¹i gi÷a ®Çu 5’ vµ 3’ cña vïng gen preM-env do ®ã

enzym nµy ®−îc sö dông ®Ó thu plasmid pCRD1-3’ cã chøa gen ®Çu 3’ (4639

bp) vµ ®o¹n gen ®Çu 5’ (1571 bp) tõ plasmid pCRD-5’. Hai ®o¹n gen nµy ®−îc

ghÐp nèi víi nhau t¹o plasmid t¸i tæ hîp cã chøa ®o¹n gen hoµn chØnh preM-env

(ký hiÖu pCRD1) nhê enzym nèi ADN ligase [3].

T−¬ng tù nh− vËy, c¸c type dengue 2,3 vµ 4 còng ®−îc xö lý nèi ghÐp nh−

M13r

Plac

M13r

Plac

pUC ori

pUC

dengue type 1.

Hind III

ori

Amp

pCR D2-5' 5287 bp

Amp

Kana

T 7 M 13f

Hind III HInd IIII

Lac Z

HindIII

f1 ori ori

M13f

Kana

pCR D2-3' 5380 bp

T7 Lac Z

f1 ori ori

M13r

Plac

pUC ori pCR D2

Hind III

XhoI SnaBI EcoRI Avr I Not I

S 3'AOX1 t

(6079 bp)

Amp

5'AOX 1 Am p pPIC9

8000 bp

Kana

M13f

T 7 Lac Z

Hind III

f1 ori

3'AOX 1

HIS

PCR

NotI

SnaBI

4

DNA Ligase

SalI

full length D2 (1959 bp)

NotI

SnaBI

S D2

3'AOX1 t

5'AOX1 Amp

pPIC-D2 10.000bp

HIS4

3'AOX1

StulI

H×nh 3.25B. S¬ ®å thiÕt kÕ vector biÓu hiÖn vïng gen preM-env cña

149

virus dengue type 2

Vïng gen preM-env cña virus dengue 2 cã kÝch th−íc kho¶ng 2000 bp. Dßng

vector pCR2.1 chøa ®Çu 3’ ký hiÖu lµ pCRD2-3’ vµ dßng vector pCR2.1 chøa

®Çu ®Çu 5’ ký hiÖu lµ pCRD2-5’. Enzyme giíi h¹n sö dông ®Ó ghÐp nèi hai nöa

gene lµ Hind III. Plasmid t¸i tæ hîp cã chøa ®o¹n gen hoµn chØnh preM-env (ký

M13r

pUC ori

hiÖu pCRD2) nhê enzym nèi DNA ligase.

DraIII

M13r

PCRD3-3’ (5486bp)

DraIII

Amp

PCRD3-5’ (5389 bp)

Amp

DraIII

LacZ

Kana

f1 ori

DraIII

LacZ

f1 ori

Kana

DraIII

1127bp

5152bp

M13r

pUC ori

DraIII

XhoI SnaBI EcoRI AvrI

PCRD3

S

NotI

5'AOX1

(6288bp)

3'AOX1t

Amp

DraIII

LacZ

f1 ori

Kana

pPIC9 8000 bp

PCR

SnaBI

NotI

HIS4

3'AOX1

SalI

PrM-E [1977bp]

DNA Ligase

NotI

SnaBI

S PRM-

3'AOX1t

E

5'AOX1

pPICD3

Amp

10.000bps

HIS4

3'AOX1

SalI

H×nh 3.25C. S¬ ®å thiÕt kÕ vector biÓu hiÖn vïng gen preM-env cña

150

virus dengue type 3.

Vïng gen preM-env cña virus dengue type 3 cã kÝch th−íc kho¶ng 2000 bp.

Dßng vector pCR2.1 chøa ®Çu 3’ ký hiÖu lµ pCRD3-3’ vµ dßng vector pCR2.1

chøa ®Çu ®Çu 5’ ký hiÖu lµ pCRD3-5’. Enzyme giíi h¹n sö dông ®Ó ghÐp nèi hai

nöa gene lµ Dra III. Plasmid t¸i tæ hîp cã chøa ®o¹n gen hoµn chØnh preM-env

Plac

BstEII

Plac

pUC ori

pUC ori PCRD4.3’

PCRD4.5’

BstEII

Amp

(ký hiÖu pCRD3) nhê enzym nèi DNA ligase.

(5255bps)

(5235 bps)

Amp

XhoI

LacZ

XhoI

LacZ

f1 ori

Plac

pUC ori

BstEIII

S

XhoI SnaBI EcoRI AvrI

Amp 5'AOX1

NotI

3'AOX1t

pCRD4 (5975bp)

Amp

pPIC9

LacZ

XhoI

8000 bp

f1 ori

3'AOX1

NotI

SnaBI

HIS4

PrM-ED4 (2000bp)

DNA Ligase

SalI

SnaBI

NotI

3'AOX1t

5'AOX1

pPICD4

(10.000bp)

HIS4

SalI

3'AOX1

H×nh 3.25D. S¬ ®å thiÕt kÕ vector biÓu hiÖn vïng gen preM-env cña

151

virus dengue type 4.

Vïng gen preM - env cña virus dengue type 4 cã kÝch th−íc kho¶ng 2000 bp.

Dßng vector pCR2.1 chøa ®Çu 3’ ký hiÖu lµ pCRD4-3’ vµ dßng vector pCR2.1

chøa ®Çu ®Çu 5’ ký hiÖu lµ pCRD4-5’. Enzyme giíi h¹n sö dông ®Ó ghÐp nèi hai

nöa gene lµ Bst EII. Plasmid t¸i tæ hîp cã chøa ®o¹n gen hoµn chØnh preM - env

(ký hiÖu pCRD4) nhê enzym nèi DNA ligase.

3.3.3.2. GhÐp nèi hai nöa Dx3’ vµ Dx5’ thµnh ®o¹n Dx hoµn chØnh.

H×nh 3.22. lµ kÕt qu¶ ®iÖn di s¶n phÈm ph¶n øng c¾t enzyme giíi h¹n c¸c vector

pCRDx-3’ vµ pCRDx-5’. C¸c ®o¹n Dx5’ bÞ c¾t v¨ng ra sÏ ®−îc nèi vµo vector

cPRDx-3’ ®Ó t¹o thµnh vector pCRDx chøa ®o¹n tr×nh tù PreM-env hoµn chØnh.

5000 bp -

- 4639 bp

5000bp -

- 3686 bp

- 1571 bp

1500 bp -

1500bp -

- 553 bp

500 bp -

500bp -

1 2 3 4

H×nh 3.26A. §iÖn di s¶n phÈm c¾t plasmid pCRD1-3’ vµ pCRD1-5’ trªn gel

§−êng ch¹y 1 vµ 3 : Thang DNA chuÈn. §−êng ch¹y 2: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD1-3’

b»ng Dra III. §−êng ch¹y 4: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD1-5’ b»ng Dra III

152

agarose 0,8%.

- 5079 bp

5000 bp - 1500 bp -

- 1000 bp

750 bp -

1 2 3 H×nh 3.26B. §iÖn di s¶n phÈm c¾t

plasmid pCRD2-3’ vµ pCRD2-5’ trªn gel agarose 0,8%. - §−êng ch¹y 1 vµ 3: Thang DNA chuÈn - §−êng ch¹y 2: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD2-3’ b»ng Hind III - §−êng ch¹y 4: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD2-5’ b»ng Hind III

4000 bp -

1000 bp -

500 bp -

1 2 3

H×nh 3.26C. §iÖn di s¶n phÈm c¾t plasmid pCRD4-3’ vµ pCRD4-5’ trªn

- §−êng ch¹y 1 vµ 3: Thang DNA chuÈn

- §−êng ch¹y 2: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD4-5’ b»ng Eco RV

- §−êng ch¹y 4: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD4-3’b»ng Sac I

gel agarose 0,8%.

KÕt qu¶ h×nh 3.26.A cho thÊy c¸c s¶n phÈm c¾t vector pCRD1-3’ vµ pCRD1-5’

153

®Òu xuÊt hiÖn c¸c b¨ng cã kÝch th−íc 4700bp vµ 1700bp. Trªn h×nh 3.26 B xuÊt

hiÖn c¸c b¨ng 1000 bp vµ 5079 bp. Trªn h×nh 3.26 C xuÊt hiÖn c¸c b¨ng 580 bp

vµ 4740 bp. KÕt qu¶ nµy lµ ®óng víi tÝnh to¸n lý thuyÕt.

Ph¶n øng ghÐp nèi ®−îc thùc hiÖn sö dông enzyme T4 ligase. S¶n phÈm nèi

ghÐp ®−îc biÕn n¹p vµo E. coli chñng DH5α. KhuÈn l¹c chän läc trªn m«i

tr−êng LB bæ xung ampixilin ®−îc nu«i vµ t¸ch chiÕt plasmid.

C¸c dßng plasmid nµy ®−îc c¾t kiÓm tra b»ng c¸c enzyme gíi h¹n. Dùa trªn

tr×nh tù c¸c gene DxME vµ tr×nh tù cña vector pCR2.1 chóng t«i ®· tÝnh to¸n

chiÒu dµi c¸c ®o¹n t¹o ra sau khi c¾t b»ng c¸c enzyme giíi h¹n nhÊt ®Þnh. ý

nghÜa cña c«ng ®o¹n c¾t kiÓm tra ngoµi viÖc kh¼ng ®Þnh ®o¹n gene ®· ®ùoc ghÐp

l¹i víi nhau cßn gióp x¸c ®Þnh hai nöa ®Çu 3’ vµ 5’ cã ®−îc nèi l¹i ®óng chiÒu

hay kh«ng.

5000 bp -

- 4761 bp

- 4985 bp

5075 bp -

1500 bp -

- 1449 bp

500 bp -

1135 bp -

- 831 bp

- 394 bp

1 2 3 4 5 6

- §−êng ch¹y 1, 5: Thang ADN chuÈn

- §−êng ch¹y 2: S¶n phÈm plasmid pCRD1

- §−êng ch¹y 3: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD1 b»ng Eco RI

- §−êng ch¹y 4: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD1 b»ng Sac I

H×nh 3.27A. §iÖn di s¶n phÈm c¾t plasmid pCRD1 trªn gel agarose

154

- §−êng ch¹y 6: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD1 b»ng Xba I

Theo tÝnh to¸n, plasmid pCRD1 khi c¾t b»ng Eco RI xuÊt hiÖn 2 b¨ng cã kÝch

th−íc 1449bp vµ 4761bp, c¾t pCRD1 b»ng Sac I sÏ xuÊt hiÖn c¸c b¨ng cã kÝch

th−íc lµ 1135 vµ 5075bp, cßn khi c¾t pCRD1 b»ng Xba I th× cho 3 b¨ng víi kÝch

th−íc 394, 831 vµ 4985bp. KÕt qu¶ ®iÖn di h×nh 3.27A cho thÊy c¸c dßng ®Òu

xuÊt hiÖn b¨ng cã kÝch th−íc nh− trong tÝnh to¸n. Nh− vËy, chóng t«i ®· thu

®−îc plasmid t¸i tæ hîp pCRD1 cã chøa toµn bé vïng gen preM-env.

1 2 3

5000 bp

1000 bp

500 bp

§−êng ch¹y 1: Thang DNA chuÈn

§−êng ch¹y 2: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD2 b»ng Bam HI

H×nh 3.27B. §iÖn di s¶n phÈm c¾t plasmid pCRD2 trªn gel agarose

§−êng ch¹y 3: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD2 b»ng Hind III

Theo tÝnh to¸n, plasmid pCRD2 khi c¾t b»ng Bam HI xuÊt hiÖn 3 b¨ng cã kÝch

th−íc 400, 500 vµ 5179 bp, cßn khi xö lý pCRD2 b»ng Hind III sÏ xuÊt hiÖn c¸c

b¨ng cã kÝch th−íc lµ 1060 vµ 5019 bp. KÕt qu¶ ®iÖn di h×nh 3.27B cho thÊy c¸c

dßng ®Òu xuÊt hiÖn b¨ng cã kÝch th−íc nh− trong tÝnh to¸n. Nh− vËy, chóng t«i

155

®· thu ®−îc plasmid t¸i tæ hîp pCRD2 cã chøa toµn bé vïng tr×nh tù preM-env.

1 2 3 4 5

- 2000 bp - 1000 bp

- 500 bp

- §−êng ch¹y 1: S¶n phÈm c¾t plasmid ®èi chøng pCRD3-3’ b»ng Xho I

- §−êng ch¹y 2: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD3 b»ng Xho I

- §−êng ch¹y 3: S¶n phÈm c¾t plasmid ®èi chøng pCRD3-3’b»ng Eco RI

- §−êng ch¹y 4: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD3 b»ng Eco RI

- §−êng ch¹y 5: Thang DNA chuÈn

H×nh 3.27C. §iÖn di s¶n phÈm c¾t plasmid pCRD3 trªn gel agarose

§èi víi dßng ®èi chøng pCRD3-3’ khi c¾t b»ng Xho I chØ t¹o ra mét b¨ng ADN

cã kÝch th−íc 5480 bp vµ dßng pCRD3 xuÊt hiÖn 2 b¨ng cã kÝch th−íc 800 bp vµ

5480 bp. Cßn khi xö lý b»ng Eco RI, dßng ®èi chøng cã c¸c b¨ng 100, 250,

1170, 3900 bp, trong khi ®ã dßng pCRD3 cho c¸c b¨ng cã kÝch th−íc 100, 250,

1900, 3900 bp. Tuy nhiªn do kÝch th−íc cña b¨ng nhá h¬n 250 bp nªn ®· bÞ tr«i

ra khái gel trong qu¸ tr×nh ch¹y ®iÖn di. KÕt qu¶ ®iÖn di h×nh 3.27 C cho thÊy

c¸c dßng ®Òu xuÊt hiÖn b¨ng cã kÝch th−íc nh− trong tÝnh to¸n. Nh− vËy, chóng

156

t«i ®· thu ®−îc plasmid t¸i tæ hîp pCRD3 cã chøa toµn bé vïng gen preM-env.

1 2 3 4 5 6

bp

5000

2000 1500 1000

1500

500 1000

500

§−êng ch¹y 1, 4: Thang DNA chuÈn

§−êng ch¹y 2: S¶n phÈm c¾t plasmid ®èi chøng pCRD4-3’b»ng

EcoRV

§−êng ch¹y 3: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD4 b»ng EcoRV

§−êng ch¹y 4: S¶n phÈm c¾t plasmid ®èi chøng pCRD4-3’b»ng EcoRI

H×nh 3 .27D. §iÖn di s¶n phÈm c¾t plasmid pCRD4 trªn gel agarose

§−êng ch¹y 5: S¶n phÈm c¾t plasmid pCRD4 b»ng EcoRI

Khi c¾t b»ng Eco RV th× dßng ®èi chøng pCRD4-3’ chØ t¹o ra mét b¨ng ADN

cã kÝch th−íc 5255 bp, vµ dßng pCRD4 xuÊt hiÖn 2 b¨ng cã kÝch th−íc 700 bp

vµ 5270 bp. Cßn khi xö lý b»ng Eco RI, dßng ®èi chøng cã c¸c b¨ng 100, 1217

vµ 3900 bp trong khi ®ã dßng pCRD4 cho c¸c b¨ng cã kÝch th−íc 100, 1900 vµ

3900 bp. KÕt qu¶ ®iÖn di h×nh 3.27 D cho thÊy c¸c dßng pCRD4 ®Òu xuÊt hiÖn

c¸c b¨ng cã kÝch th−íc ®óng nh− trong tÝnh to¸n (®o¹n gen 100 bp cã kÝch th−íc

qu¸ nhá nªn ®· bÞ tr«i ra khái gel agarose 0,8%). Nh− vËy, chóng t«i ®· thu

157

®−îc plasmid pCRD4 cã chøa toµn bé vïng gen m· ho¸ preM-env.

3.3.3.3. KhuÕch ®¹i ®o¹n Dx b»ng cÆp måi biÓu hiÖn

Toµn bé vïng gen preM-env hoµn chØnh cÇn ®−îc ®−a vµo vector biÓu hiÖn

pPIC9. §Ó g¾n ®óng chiÒu vµ ®óng khung ®äc chóng t«i ®· sö dông cÆp måi biÓu

hiÖn cã treo vÞ trÝ c¾t cña 2 enzyme giíi h¹n kh¸c nhau ë ®Çu 5’ cña mçi måi.

Bªn c¹nh ®ã ®Ó thuËn lîi cho tinh s¹ch protein sau nµy, ®o¹n måi ®Çu 3’ cßn

®−îc thiÕt kÕ thªm vïng m· ho¸ cho 6 histidin n»m tr−íc bé ba kÕt thóc (B¶ng

3.9).

B¶ng 3.9. Tr×nh tù c¸c cÆp måi biÓu hiÖn preM-env

trong Pichia pastoris

Type Tr×nh tù måi Dengue

5’prM-E_SnaBI: 5’- agt tac gta ttc cat ctg acc acc cga ggg -3’

3’prM-E_NotI: 5’- a ggc ggc cgc tca atg atg atg atg atg atg cgc

ctg aac cat gac tcc tag -3’

5’PrM-E-SnaBI: 5’- agt tac gta ttc cat tta acc aca cgt aac-3’

3’PrM-E-NotI: 5’- a ggc ggc cgc tca atg atg atg atg atg atg ggc

ctg cac cat aac tcc caa- 3’

5’PrM-E-SnaBI: 5’- agt tac gta ttc cac tta act tca cga gat -3’

3’PrM-E-NotI: 5’- a ggc ggc cgc tca atg atg atg atg atg atg agc

ttg cac cac gac tcc cag -3’

5’PrM-E-SnaBI: 5’- agt tac gta ttc cac tta act tca cga gat -3’

3’PrM-E-NotI: 5’- a ggc ggc cgc tca atg atg atg atg atg atg agc

ttg cac cac gac tcc cag -3’

C¸c plasmid pCRD1,2,3,4 ®−îc sö dông lµm khu«n cho kü thuËt PCR. KÕt qu¶

158

PCR ®−îc kiÓm tra trªn gel agarose 0,8% (H×nh 3.27).

- 1981bp

2000 bp - 1500 bp -

- 1983bp

- 1875bp

- 1983bp

500 bp -

M 1 M 1 M 1 M 1

D1 D2 D3 D4

§−êng ch¹y M: Thang ADN chuÈn

§−êng ch¹y 2: S¶n phÈm PCR

H×nh 3.28. §iÖn di s¶n phÈm PCR vïng gen preM –E trªn gel agarose 0,8%.

KÕt qu¶ h×nh 3.28 cho thÊy vïng gen preM-env cã kÝch th−íc kho¶ng 2000 bp

®· ®−îc nh©n lªn thµnh c«ng cã kÝch th−íc ®óng víi tÝnh to¸n.

3.3.3.4. G¾n ®o¹n Dx vµo vector pPICvµ chän dßng pPICDx

S¶n phÈm PCR ®−îc c¾t ®ång thêi b»ng hai enzym h¹n chÕ Sna BI vµ Not I vµ

®−îc ghÐp nèi vµo vector pPIC9 còng ®−îc xö lý b»ng hai enzym nµy. C¸c

plasmid pPIC9 chøa toµn bé vïng gen preM-env cña dengue virus c¸c type

(®−îc ký hiÖu lµ pPICD1, pPICD2, pPICD3 vµ pPICD4) ®−îc c¾t kiÓm tra b»ng

enzyme h¹n chÕ EcoRI, SnaBI+NotI, Xba I. KÕt qu¶ c¾t kiÓm tra ®−îc tr×nh bµy

159

trªn h×nh 3.29.

3 4 5 1 2

- 7488 bp

1500 bp -

- 995 bp

1500 bp -

500 bp -

- 1644 bp - 831 bp

500 bp -

- 4183 bp

- §−êng ch¹y 1 vµ 3: Thang ADN chuÈn

- §−êng ch¹y 2: Plasmid pPICD1/ EcoRI

- §−êng ch¹y 4: Plasmid pPICD1/ SnaBI+NotI

- §−êng ch¹y 5: Plasmid pPICD1/ XbaI

H×nh 3.29A. S¶n phÈm c¾t kiÓm tra plasmid pPICD1 trªn gel agarose 0,8%

KÕt qu¶ h×nh 3.29A cho thÊy pPICD1 khi c¾t b»ng EcoRI xuÊt hiÖn ba b¨ng cã

kÝch th−íc 4183, 3825 vµ 995bp, cßn khi xö lý vector nµy SnaBI/NotI xuÊt hiÖn

2 b¨ng cã kÝch th−íc ®óng víi kÝch th−íc cña gen 1981bp vµ b¨ng kho¶ng

8000bp, Khi c¾t b»ng XbaI cho 3 b¨ng kÝch th−íc 831, 1644 vµ 7488bp. C¸c

b¨ng ®iÖn di trªn h×nh 5 cho thÊy c¸c s¶n phÈm c¾t kiÓm tra cho c¸c b¨ng ADN

cã kÝch th−íc ®óng nh− tÝnh to¸n. Nh− vËy chóng t«i ®· thiÕt kÕ thµnh c«ng

160

vector pPICD1 biÓu hiÖn vïng gen preM-env ®Ó ®−a vµo nÊm men P. pastoris.

1 2 3 4

8000 bp

1500 bp

500 bp

- §−êng ch¹y 1: Thang ADN chuÈn - §−êng ch¹y 2: Dßng ®èi chøng pPICD2 - §−êng ch¹y 3: Plasmid pPICD2/ BamHI - §−êng ch¹y 4: Plasmid pPICD2/ SnaBI+NotI

H×nh 3.29B. S¶n phÈm c¾t kiÓm tra plasmid pPICD1 trªn gel agarose 0,8%

KÕt qu¶ h×nh 3.29. C cho thÊy pPICD2 khi c¾t b»ng BamHI xuÊt hiÖn ba b¨ng cã kÝch th−íc 507, 1402 vµ 8000bp, cßn khi xö lý vector nµy SnaBI/NotI xuÊt hiÖn 2 b¨ng cã kÝch th−íc ®óng víi kÝch th−íc cña gen kho¶ng 2000 bp. C¸c b¨ng ®iÖn di cho thÊy c¸c s¶n phÈm c¾t kiÓm tra cho c¸c b¨ng ADN cã kÝch th−íc ®óng nh− tÝnh to¸n. Nh− vËy chóng t«i ®· thiÕt kÕ thµnh c«ng vector pPICD2.

1 2 3

4 5

6 7 8

10000bp

1980 bp

580 bp

H×nh 3.29. C S¶n phÈm c¾t kiÓm tra plasmid pPICD3 gel agarose 0,8%

- §−êng ch¹y 1, 5, 6: Thang ADN chuÈn - §−êng ch¹y 2: S¶n phÈm c¾t plasmid pPIC9 b»ng XhoI - §−êng ch¹y 3: S¶n phÈm c¾t plasmid pPICD3 b»ng XhoI - §−êng ch¹y 4: S¶n phÈm c¾t plasmid pPICD3 b»ng SnaBI+NotI

- §−êng ch¹y 7: S¶n phÈm c¾t plasmid pPIC9 b»ng SalI - §−êng ch¹y 8: S¶n phÈm c¾t plasmid pPICD3 b»ng SalI

161

Trªn h×nh 3.29. C, dßng ®èi chøng pPIC9 khi c¾t b»ng XhoI cho mét b¨ng cã

kÝch th−íc 8030 bp, dßng vector t¸i tæ hîp pPICD3 cho hai b¨ng cã kÝch th−íc

580 vµ 9500 bp. Khi c¾t b»ng SnaBI vµ NotI, vector pPICD3 t¹o hai b¨ng cã

kÝch th−íc 1980 vµ 8030 bp. Cßn vector pPICD3 khi ®−îc xö lý b»ng SalI c¾t

më vßng chØ t¹o mét b¨ng cã kÝch th−íc kho¶ng 10000 bp, trong khi vector ®èi

chøng chØ xuÊt hiÖn mét b¨ng cã kÝch th−íc 8030 bp. C¸c b¨ng ®iÖn di cho thÊy

c¸c s¶n phÈm c¾t kiÓm tra cho c¸c b¨ng ADN cã kÝch th−íc ®óng nh− tÝnh to¸n.

Nh− vËy chóng t«i ®· thiÕt kÕ thµnh c«ng vector pPICD3 biÓu hiÖn vïng gen

PrM-E ®Ó ®−a vµo nÊm men P. pastoris.

1 2 3 4 5 6 7

8000

4000

2000

500

- §−êng ch¹y 1: S¶n phÈm c¾t pPIC9 b»ng EcoRV

- §−êng ch¹y 2,3 : S¶n phÈm c¾t pPICD4 b»ng EcoRV

- §−êng ch¹y 4, 5: Thang ADN chuÈn - §−êng ch¹y 6: S¶n phÈm c¾t pPIC9 b»ng SnaBI / NotI

- §−êng ch¹y 7: S¶n phÈm c¾t pPICD4 b»ng SnaBI / NotI

H×nh 3.29D. S¶n phÈm c¾t kiÓm tra plasmit pPICD4 gel agarose 0,8%

¥ h×nh 3.29 D, dßng ®èi chøng pPIC9 khi c¾t b»ng EcoRV cho hai b¨ng cã

kÝch th−íc 3825 vµ 4200 bp, dßng pPICD4 cho ba b¨ng cã kÝch th−íc 1820,

3825 vµ 4360 bp. Khi c¾t b»ng SnaBI vµ NotI, dßng ®èi chøng pPIC9 cho mét

b¨ng duy nhÊt cã kÝch th−íc 8000 bp, trong khi ®ã dßng pPICD4 t¹o hai b¨ng cã

162

kÝch th−íc 1990 vµ 8000bp. KÕt qu¶ ®iÖn di cho thÊy c¸c s¶n phÈm c¾t kiÓm tra

cho c¸c b¨ng ADN cã kÝch th−íc ®óng nh− tÝnh to¸n lý thuyÕt. Nh− vËy chóng

t«i ®· thiÕt kÕ thµnh c«ng vector pPICD4 chøa toµn bé vïng gen m· ho¸ preM-

env cña dengue typ 4 ®Ó ®−a vµo nÊm men P. pastoris.

3.3.4. BiÓu hiÖn gen m∙ ho¸ kh¸ng nguyªn preM-E (gen preM-env) trong Pichia pastoris

Plasmid pPICDx ®−îc më vßng b»ng StuI ®Ó gióp ®Þnh h−íng cho qu¸ tr×nh tÝch

hîp vïng gen preM-env vµo vïng ®ét biÕn gen m· ho¸ histidin trong genome

cña nÊm men ®−îc dÔ dµng. Sau 2 ngµy nu«i cÊy trªn m«i tr−êng MD khuyÕt

histidin ®· xuÊt hiÖn nhiÒu khuÈn l¹c, chøng tá chñng nÊm men t¸i tæ hîp cã

kh¶ n¨ng tæng hîp histidin vµ plasmid ®· ®−îc tÝch hîp vµo genome cña nÊm

163

men.

TiÕn hµnh nu«i cÊy vµ c¶m øng chñng t¸i tæ hîp.

KÕt qu¶ ®−îc thÓ hiÖn trªn h×nh 3.30.

79 kDa

116 66

18 14

1 2 3 4 5 6

H×nh 3.30 A. §iÖn di SDS-PAGE trªn gel polyacrylamit 12,5% kiÓm tra kh¶

- §−êng ch¹y 1: Protein cña dßng ®èi chøng - §−êng ch¹y 2: Thang protein chuÈn - §−êng ch¹y 3 vµ 4: protein D1ME thu ë ngµy thø 3 - §−êng ch¹y 5: Protein D1ME thu ë ngµy thø 2 - §−êng ch¹y 6: Protein D1ME thu ë ngµy thø 1

164

n¨ng biÓu hiÖn cña vïng D1ME trong P.pastoris theo thêi gian

kDa

116

79 kDa

18 14

1 2 3 4

H×nh 3.30 B. §iÖn di SDS-PAGE trªn gel polyacrylamit 12,5% kiÓm tra kh¶ n¨ng biÓu hiÖn cña vïng D2ME trong P.pastoris sau 3 ngµy c¶m øng. - §−êng ch¹y 1: Protein cña dßng ®èi chøng - §−êng ch¹y 2: Thang protein chuÈn - §−êng ch¹y 3, 4: Protein cña c¸c dßng chøa vïng gen preM - env

1 2 3 4 5

kDa

116

79 kDa

H×nh 3.30 C. §iÖn di SDS-PAGE trªn gel polyacrylamit 12,5% kiÓm tra kh¶

- §−êng ch¹y 1: Thang protein chuÈn - §−êng ch¹y 2, 3, 4: Protein cña c¸c dßng chøa vïng gen preM-env

- §−êng ch¹y 5: Protein cña dßng ®èi chøng

165

n¨ng biÓu hiÖn cña vïng D3ME trong P.pastoris sau 3 ngµy c¶m øng.

kDa

116

1 2 3 4

H×nh 3.30D. §iÖn di SDS-PAGE trªn gel polyacrylamit 12,5% kiÓm tra kh¶

n¨ng biÓu hiÖn cña vïng D4ME trong P.pastoris sau 3 ngµy c¶m øng. - §−êng ch¹y 1: Thang Protein chuÈn - §−êng ch¹y 2: DÞch nu«i cÊy tÕ bµo nÊm men cã chøa vector ®èi chøng pPIC9 - §−êng ch¹y 3: DÞch nu«i cÊy tÕ bµo nÊm men cã chøa pPICD4

166

Trong tÕ bµo nÊm men th−êng x¶y ra qu¸ tr×nh glycozyl ho¸ c¸c protein sau khi dÞch m·, do ®ã protein ngo¹i lai ®−îc biÓu hiÖn th−êng ®−îc g¾n thªm c¸c gèc ®−êng. KÕt qu¶ ®iÖn di h×nh 3.30 cho thÊy protein t¸i tæ hîp DxME cã kÝch th−íc kho¶ng 79 kDa (cao h¬n so víi tÝnh to¸n lµ 7 kDa do qu¸ tr×nh glycozyl hãa) ®· ®−îc biÓu hiÖn trong tÕ bµo nÊm men P. pastoris sau khi ®−îc c¶m øng b»ng methanol 1%, trong khi dßng ®èi chøng chØ chøa vector pPIC9 th× kh«ng thÊy xuÊt hiÖn b¨ng protein t−¬ng øng. Tõ kÕt qu¶ trªn chóng t«i kÕt luËn ®· biÓu hiÖn thµnh c«ng toµn bé vïng gen preM - env cña virus dengue c¸c type 1,2,3,4 trong nÊm men P. pastoris. Tuy nhiªn, ®iÒu quan träng nhÊt lµ ph¶i chøng minh ®−îc kh¶ n¨ng ph¶n øng cña protein t¸i tæ hîp víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù nhiªn. Kü thuËt Western blot víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù nhiªn ®· ®−îc sö dông ®Ó chøng minh ®iÒu nµy.

1 2 1 2 1 2 1 2

kDa

79 42 37

25 18 14

D1 D2 D3 D4

- §−êng ch¹y 1: Thang protein chuÈn - §−êng ch¹y 2: Ph¶n øng cña protein t¸i tæ hîp DxME (D1ME, D2ME, D3ME, D4ME)víi

kh¸ng thÓ kh¸ng dengue c¸c type D1, D2, D3, D4 tù nhiªn.

3.3.5. KiÓm tra ph¶n øng cña kh¸ng nguyªn DxME t¸i tæ hîp víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue tù nhiªn b»ng Western Blot Protein t¸i tæ hîp DxME sau khi biÓu hiÖn trong nÊm men P.pastoris ®−îc kiÓm tra kh¶ n¨ng liªn kÕt miÔn dÞch víi kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu kh¸ng virus dengue 4 trong huyÕt thanh thá b»ng kü thuËt Western blot. 116 66 43 35 H×nh 3.31. Sù liªn kÕt cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp DxME víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus Dengue trong huyÕt thanh thá kiÓm tra b»ng Western blot.

167

Theo nh− kÕt qu¶ biÓu hiÖn protein t¸i tæ hîp cã kÝch th−íc kho¶ng 79 kDa. Riªng tr−êng hîp type 4 cã 2 b¨ng protein bÞ ®øt gÉy cã kÝch th−íc kho¶ng 37 vµ 42 kDa. C¸c protein t¸i tæ hîp DxME nµy ®−îc chuyÓn sang mµng PVDF vµ ®−îc phñ víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus dengue tù nhiªn. KÕt qu¶ h×nh 3.28 xuÊt hiÖn ®óng b¨ng kÝch th−íc 79kb (type 1,2,3) vµ ba b¨ng (type 4) víi kÝch th−íc ®óng víi kÝch th−íc cña protein biÓu hiÖn. §iÒu nµy chøng tá protein t¸i tæ hîp DxME cã kh¶ n¨ng ph¶n øng ®Æc hiÖu víi kh¸ng thÓ kh¸ng virus dengue tù nhiªn. KÕt qu¶ nµy më ra triÓn väng øng dông protein t¸i tæ hîp DxME cho môc ®Ých t¹o bé sinh phÈm chÈn ®o¸n sèt dengue vµ sèt xuÊt huyÕt dengue.

3.4. ThiÕt kÕ cÆp måi vµ x©y dùng kÕ häach t¸ch dßng gen m·

hãa kh¸ng nguyªn vá cña virus Dengue c¸c type I, II, III, IV.

C¨n cø vµo ®o¹n tr×nh tù ®· ®−îc c«ng bè trong ng©n hµng d÷ liÖu gen quèc tÕ

th× gen m· ho¸ kh¸ng nguyªn vá cña virus Dengue gåm 1983 bp. ViÖc t¸ch

dßng vµ gi¶i tr×nh tù nh÷ng ®o¹n ADN qu¸ dµi th−êng gÆp nhiÒu khã kh¨n vµ

®Æc biÖt lµ kh«ng thÓ gi¶i tr×nh tù ®−îc nÕu kh«ng t¹o c¸c dßng phô (subclones)

sau khi t¸ch dßng. V× vËy ®Ó t¸ch dßng vµ x¸c ®Þnh tr×nh tù mét c¸ch chÝnh x¸c

gen nµy, chóng t«i ®· thiÕt kÕ mét kÕ ho¹ch t¸ch dßng hai ®o¹n ®éc lËp ë ®Çu 5’

vµ 3’ cña gen, sau ®ã chän vÞ trÝ giíi h¹n thÝch hîp ®Ó nèi hai ®o¹n gen nµy vµ

t¹o ra gen hoµn chØnh. Sö dông ch−¬ng tr×nh phÇn mÒm PC/Gene, chóng t«i ®·

thiÕt kÕ c¸c cÆp måi lµ D1P1-D1M1, D2P1-D2M1, D3P1-D3M1, D4P1-D4M1

®Ó nh©n b¶n ®o¹n gen ë ®Çu 5’ vµ D1P2-D1M2, D2P2-D2M2, D3P2-D3M2,

D4P2-D4M2 ®Ó nh©n b¶n ®o¹n gen ë ®Çu 3’. Theo tÝnh to¸n lý thuyÕt c¸c ®o¹n

gen ®−îc khuÕch ®¹i ®éc lËp ë ®Çu 5’ vµ 3’ cña vïng gen m· ho¸ c¸c kh¸ng

nguyªn prM vµ E sÏ cã vïng trïng lÆp nhau vµ chøa c¸c vÞ trÝ giíi h¹n thÝch hîp

®Ó cã thÓ c¾t nèi hai ®o¹n gen ®· ®−îc t¸ch dßng ®éc lËp.

Qu¸ tr×nh tiÕn hanh nh− sau :

1. ThiÕt kÕ c¸c cÆp måi ®Ó khuÕch ®¹i c¸c ®o¹n ADN ®Çu 5’ vµ 3’ cña gen m·

ho¸ tiÒn kh¸ng nguyªn mµng (prM) vµ kh¸ng nguyªn vá (E) cña virus dengue

c¸c typ D1, D2, D3 vµ D4

C¸c cÆp måi ®−îc thiÕt kÕ ®Ó khuÕch ®¹i c¸c ®o¹n ADN ®Çu 5’ vµ 3’ cña gen m·

ho¸ tiÒn kh¸ng nguyªn mµng (prM) vµ kh¸ng nguyªn vá (E) cña virus dengue

c¸c typ D1, D2, D3 vµ D4 víi c¸c th«ng sè kü thuËt cña chóng ®−îc nªu ë b¶ng

168

3.10.

B¶ng 3.10. C¸c cÆp måi vµ th«ng sè måi dïng cho ph¶n øng RT-PCR

khuÕch ®¹i c¸c ®o¹n ADN ®Çu 5’ vµ 3’ cña gen m∙ ho¸ kh¸ng nguyªn prM

vµ kh¸ng nguyªn E cña virus dengue c¸c typ D1, D2, D3 vµ D4

D1P1

5’-GACCATGCTCCTTATGCTGCTGCC

D1M1

5’-TCCAGACGTTTGGATTTCTGTCGC

D1P2

5’-CGTTTGTGGACAGAGGCTGG

D1M2

5’-TCGAGACGAGTGGCTGATCG

D2P1

5’-GCTGAACATCTTGAACAGGAGACGC

D2M1

5’-TGACATCTGGATTTCCGTGGCC

D2P2

5’-CAAAGCTGACCAACACAACAACAGC

D2M2

5’-GTTACTGAGCGGATTCCACAAATGC

D3P1

5’-CCTCAGATTTCTAGCCATTCCACC

D3M1

5’-TGCATTGCTCCCTCTTGTGATCC

D3P2

5’-AAGCCCACGCTGGACATAGAGC

D3M2

5’-TTCTGGTTGTTGACCTAATTCCGC

D4P1

5’-CTGTGCTTGATTCCCACCGTAATGG

D4M1

5’-ATGGCTCCTTCCTGAGATCCCAGC

D4P2

5’-CCTCAATATCAAACATAACTACGGC

D4M2

5’-CTCCATGACACCACACAACCC

169

Måi Tr×nh tù måi Tm %CG

H×nh 3.32. S¬ ®å thiÕt kÕ c¸c cÆp måi dïng cho t¸ch dßng gen m∙ ho¸ kh¸ng nguyªn prM vµ kh¸ng nguyªn E cña virus dengue c¸c typ D1, D2, D3 vµ D4.

2. KhuÕch ®¹i c¸c ®o¹n ADN ®Çu 5’ vµ 3’ cña gen m· ho¸ tiÒn kh¸ng nguyªn

mµng (prM) vµ kh¸ng nguyªn vá (E) cña virus dengue c¸c typ D1, D2, D3 vµ D4

b»ng RT-PCR

Kü thuËt RT-PCR ®−îc thùc hiÖn nhê mét hçn hîp gåm hai enzym trong bé Kit

One step RT-PCR cña h·ng Invitrogen. Qu¸ tr×nh tæng hîp cDNA sîi ®¬n ®−îc

tiÕn hµnh ë 50oC nhê enzym Super ScriptTMII Reverse transcriptase, sau b−íc

biÕn tÝnh 940C trong thêi gian 2 phót, Super ScriptTMII Reverse transcriptase bÞ

bÊt ho¹t, sau ®ã Platinum Taq DNA polymerase trong hçn hîp sÏ tiÕn hµnh tæng

hîp ®o¹n ADN ®Ých. Ph¶n øng ®Ó khuÕch ®¹i ®o¹n ADN ®Çu 5’ vµ 3’ cña gen

m· ho¸ kh¸ng nguyªn prM vµ kh¸ng nguyªn E cña virus dengue cã thµnh phÇn

170

nh− sau:

Thµnh phÇn ThÓ tÝch / 50 µl

2X Reaction Mix 25

Khu«n RNA x

1 Måi xu«i 10µM

1 Måi ng−îc 10µM

RT/platinum Taq Mix 1

N−íc ®· xö lý DEPC Bæ xung ®Õn tæng thÓ tÝch 50 µl

* Chu kú nhiÖt cña ph¶n øng:

T¹o cDNA: 50oC – 30 phót, 94oC – 2 phót

94 oC – 15 gi©y, X oC* – 50gi©y, 72 oC – 1phót 30gi©y, lÆp l¹i 30 chu kú

72oC – 8phót, 4 oC – ∞

* NhiÖt ®é b¾t cÆp phô thuéc vµo nhiÖt ®é b¾t cÆp cña tõng cÆp måi dïng

cho mçi typ virus dengue.

3. Ph−¬ng ph¸p t¹o dßng c¸c ®o¹n gen ®· khuÕch ®¹i

Sau khi khuÕch ®¹i, s¶n phÈm PCR ®−îc t¹o dßng nhê bé sinh phÈm TA

cloning Kit (Invitrogen). Ph¶n øng nèi ghÐp s¶n phÈm PCR vµo vector t¹o dßng

®−îc tiÕn hµnh víi tæng thÓ tÝch lµ 10µl.

Thµnh phÇn ph¶n øng:

Dung dÞch ®Öm (10X) cho enzyme : 1 µl

Vector pCR 2.1 : 2 µl

Enzyme ligase : 1µl

S¶n phÈm PCR : 3µl

N−íc v« trïng : 3µl

Tæng thÓ tÝch : 10µl

171

Hçn hîp ph¶n øng ®−îc ñ ë nhiÖt ®é 14 oC qua ®ªm.

4. Ph−¬ng ph¸p biÕn n¹p plasmid vµo tÕ bµo E. coli kh¶ biÕn b»ng sèc nhiÖt

Sau khi g¾n ®o¹n ADN khuÕch ®¹i vµo plasmid, s¶n ph¶m g¾n ®−îc biÕn

n¹p vµo E. coli, qu¸ tr×nh biÕn n¹p ®−îc tiÕn hµnh qua c¸c b−íc sau:

+ T¹o tÕ bµo kh¶ biÕn:

- TÕ bµo E. coli ®−îc nu«i qua ®ªm trong 5 ml m«i tr−êng LB láng.

- Pha lo·ng huyÒn dÞch tÕ bµo ®· nu«i cÊy theo tû lÖ 1/100 trong 5 ml m«i

tr−êng LB.

Nu«i l¾c ë 37 0C, 200 vßng/phót. Sau 2 giê tiÕn hµnh kiÓm mËt ®é tÕ bµo ë

b−íc sãng 600 nm. OD600 ®¹t gi¸ trÞ tõ 0,6 ®Õn 1 lµ ®¹t yªu cÇu. - ChuyÓn 1 ml dÞch tÕ bµo sang èng Eppendorf s¹ch.

- §Ó trªn ®¸ 10 phót.

- Ly t©m thu sinh khèi ë 40C, tèc ®é 5000 vßng /phót trong 10 phót. - Hßa l¹i cÆn tÕ bµo thµnh huyÒn dÞch trong 1 ml CaCl2 100 mM ë 4 0C. - Ly t©m thu tÕ bµo, lo¹i bá dÞch næi.

- Hoµ cÆn tÕ bµo thµnh huyÒn dÞch trong 50 µl CaCl2 100 mM. §Ó huyÒn dÞch tÕ

bµo trªn ®¸ 1 giê tr−íc khi tiÕn hµnh biÕn n¹p.

+ BiÕn n¹p:

- Trén s¶n phÈm g¾n (kho¶ng 10-50 ng) víi tÕ bµo kh¶ biÕn sau ®ã ®Ó ®¸ 30

phót.

- Sèc nhiÖt ë 42 0C, 1 phót 30 gi©y.

- §Æt trong ®¸ 2 phót.

0C trong 1 giê. Cuèi cïng cÊy tr¶i trªn 2 ®Üa petri chøa m«i tr−êng LB ®Æc + víi

- Bæ sung 450µl m«i tr−êng LB láng, sau ®ã nu«i l¾c ë tèc ®é 200 vßng/phót, 37

chÊt kh¸ng sinh ampixilin (nång ®é 100µl /ml), ®Üa thø nhÊt 50 µl vµ ®Üa thø hai

0C qua ®ªm .

172

150 µl huyÒn dÞch vi khuÈn ®· biÕn n¹p, ®Ó c¸c ®Üa ®· cÊy vi khuÈn ë tñ Êm 37

3.5. ChÕ t¹o céng hîp (Gold monoclonal antibodies) g¾n

kh¸ng nguyªn vµo gi¸ thÓ (mµng thÊm Nitrocellulo

membrane)

Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp DE3 lµ kh¸ng nguyªn ®−îc t¹o ra ë d¹ng lai ghÐp cã 2

nöa (moety), mét nöa lµ kh¸ng nguyªn DE3 dµnh riªng cho kh¸ng thÓ kh¸ng

virus dengue, nöa cßn l¹i dµnh riªng cho kh¸ng thÓ ph¸t hiÖn (kh¸ng thÓ 2).

Thioredoxin

DE3

Kh¸ng thÓ kh¸ng Thioredoxin g¾n vµng

Kh¸ng thÓ kh¸ng DE3

H×nh 3.33. M« h×nh kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp d¹ng lai ghÐp

DE3-Thioredoxin (DE3-TRX).

Nh− vËy sÏ cã lîi thÕ lµ c¸c kh¸ng thÓ kh¸ng phÇn thioredoxin sÏ kh«ng c¹nh

tranh vÞ trÝ b¸m cña kh¸ng thÓ kh¸ng dengue vµ chØ ph¶n øng ®Æc hiÖu víi c¸c

quyÕt ®Þnh kh¸ng nguyªn thuéc thioredoxin. Do dã kh«ng cÇn cã kh¸ng thÓ ®¬n

dßng kh¸ng virus dengue mµ vÉn cã ®−îc kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu cao dïng trong s¶n

xuÊt que thö chÈn ®o¸n nhanh SD/SXHD - §©y lµ s¸ng t¹o cña ®Ò tµi. §Ó cã

®−îc kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu chØ ph¶n øng víi nöa thø hai cña kh¸ng nguyªn t¸i tæ

hîp lai ghÐp (thioredoxin), chóng t«i thiÕt kÕ vector biÓu hiÖn ®Ó thu nhËn riªng

thioredoxin t¸i tæ hîp, sau ®ã g©y miÔn dÞch cho thá ®Ó t¹o kh¸ng thÓ kh¸ng l¹i

thioredoxin. §Ó cã ®−îc thioredoxin t¸i tæ hîp cã ®u«i His-tag dïng trong tinh

173

chÕ b»ng cét s¾c ký Nikel chelating Resin, chóng t«i ®· tiÕn hµnh biÕn ®æi

vector ®Ó khi biÓu hiÖn sÏ cho ra thioredoxin t¸i tæ hîp cã ®u«i His-tag.

Thioredoxin t¸i tæ hîp lµ mét protein chøa 143 axit amin víi khèi l−îng ph©n tö

lµ kho¶ng 15,6 kDa. Thioredoxin t¸i tæ hîp ®−îc tinh s¹ch qua cét Nikel

chelating Resin. Dïng Thioredoxin t¸i tæ hîp tinh s¹ch g©y miÔn dÞch cho thá

®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ anti-thioredoxin. Kh¸ng thÓ kh¸ng Thioredoxin ®−îc tinh

chÕ tõ huyÕt thanh thá g©y miÔn dÞch, sau ®ã g¾n víi nhò vµng (gold colloid) ®Ó

t¹o céng hîp kh¸ng thÓ kh¸ng Thioredoxin-Gold colloid vµ dïng sinh phÈm nµy

®Ó chÕ t¹o que thö nhanh. B−íc cuèi cïng lµ nghiªn cøu g¾n c¸c sinh phÈm lªn

mµng Nitrocellulose ®Ó t¹o que thö.

Qu¸ tr×nh ®−îc thùc hiÖn nh− sau :

1. S¶n xuÊt thioredoxin t¸i tæ hîp vµ kh¸ng thÓ kh¸ng thioredoxin t¸i tæ hîp g¾n

peroxidase (HRP)

§Ó cã ®−îc kh¸ng thÓ ®Æc hiÖu chØ ph¶n øng víi nöa thø hai cña kh¸ng nguyªn

t¸i tæ hîp lai ghÐp (thioredoxin), chóng t«i thiÕt kÕ vector biÓu hiÖn ®Ó thu nhËn

riªng thioredoxin t¸i tæ hîp, sau ®ã g©y miÔn dÞch cho thá ®Ó t¹o kh¸ng thÓ

kh¸ng l¹i thioredoxin. Cã thÓ dïng trùc tiÕp vector pET-TRX-Fus biÓu hiÖn ®Ó

thu nhËn thioredoxin t¸i tæ hîp, tuy nhiªn thioredoxin t¸i tæ hîp sÏ kh«ng cã

®u«i His-tag v× vËy kh«ng thÓ tinh chÕ ®−îc b»ng cét s¾c ký Nikel chelating

Resin. §Ó kh¾c phôc nh−îc ®iÓm nµy, chóng t«i ®· tiÕn hµnh biÕn ®æi vector ®Ó

khi biÓu hiÖn sÏ cho ra thioredoxin t¸i tæ hîp cã ®u«i His-tag.

TiÕn hµnh nh− sau: ThiÕt kÕ mét Adaptor sao cho mét ®Çu cã vÞ trÝ c¾t cña

enzyme h¹n chÕ BamHI, ®Çu thø hai cã vÞ trÝ c¾t cña XhoI. Ngoµi ra, Adaptor

cßn cã thªm mét sè vÞ trÝ c¾t cña c¸c enzyme h¹n chÕ quan träng nh− EcoRI,

SacI, SalI, HindIII ®Ó tiÖn cho viÖc thao t¸c sau nµy:

174

GATCCGAATTCGAGCTCGTCGACAAGCTTC |||||||||||||||||||||||||| GCTTAAGCTCGAGCAGCTGTTCGAAGAGCT BamHI EcoRI SacI SalI HindIII XhoI

Vector pET-TRX-Fus ®−îc xö lý phèi hîp víi 2 enzyme BamHI vµ XhoI ®Ó lo¹i

bá vïng c¾t g¾n ®a vÞ (MCS), vector ®· xö lý ®−îc g¾n víi Adaptor nhê T4-

ligase. Sau khi g¾n, vector ®−îc biÕn n¹p vµo E. coli chñng DH5α ®Ó chän läc

c¸c vector ®¹t yªu cÇu. C¸c vector ®¹t yªu cÇu ph¶i lµ c¸c vector ®−îc thay b»ng

vïng c¾t g¾n ®a vÞ míi sao cho cã khung ®äc míi ®Ó t¹o ra ®−îc Thioredoxin t¸i

tæ hîp cã g¾n ®u«i 6 Histidine (His-tag). Vector ®−îc kiÓm tra l¹i tr×nh tù b»ng

c¶ hai måi xu«i vµ ng−îc sau ®ã biÕn n¹p vµo tÕ bµo E. coli chñng BL21 DE3

Star ®Ó biÓu hiÖn vµ thu nhËn thioredoxin t¸i tæ hîp. Thioredoxin t¸i tæ hîp lµ

mét protein chøa 143 axit amin víi khèi l−îng ph©n tö lµ kho¶ng 15,6 kDa.

Thioredoxin t¸i tæ hîp ®−îc tinh s¹ch qua cét Nikel chelating Resin nh− ®· tiÕn

hµnh víi protein lai ghÐp TRX-DE3-His. Sau khi tinh s¹ch Thioredoxin t¸i tæ

hîp ®−îc x¸c ®Þnh nång ®é b»ng Bradford Protein Assay. Dïng Thioredoxin t¸i

tæ hîp tinh s¹ch g©y miÔn dÞch cho thá ®Ó s¶n xuÊt kh¸ng thÓ anti-thioredoxin,

qui tr×nh ®−îc tiÕn hµnh nh− sau:

G©y miÔn dÞch cho thá 4 lÇn, mçi lÇn 150 µg Thioredoxin t¸i tæ hîp tinh s¹ch

trén t¸ chÊt Freund toµn phÇn, ba lÇn ®Çu mçi lÇn c¸ch nhau mét tuÇn, lÇn thø t−

c¸ch lÇn thø nhÊt mét th¸ng. Sau 9 ngµy kÓ tõ lÇn g©y miÔn dÞch cuèi cïng lÊy

m¸u thá tõ ®éng m¹ch cæ. M¸u thu ®−îc ñ 1 giê trong tñ Êm 370C, sau ®ã

chuyÓn sang tñ l¹nh 40C trong thêi gian 2 giê, ch¾t huyÕt thanh sang èng ly t©m,

vµ ly t©m víi tèc ®é 2000v/ph trong thêi gian 10 phót, thu huyÕt thanh ®Ó thùc

hiÖn c¸c b−íc tiÕp theo.

Tinh chÕ IgG tõ huyÕt thanh: Tinh chÕ IgG tõ huyÕt thanh thá ®−îc tiÕn hµnh

b»ng ph−¬ng ph¸p kÕt tña víi sulphat amon vµ ®−a qua cét s¾c ký ¸i lùc Protein

A- Sepharose. C¸c b−íc tiÕn hµnh nh− sau:

175

- Pha lo·ng huyÕt thanh thá 1/2 trong ®Öm PBS trong nåi ®¸.

- Nhá tõ tõ sulphat amon b·o hoµ vµo huyÕt thanh ®Ó cã nång ®é

30% b·o hoµ. KhuÊy ë nhiÖt ®é 40C trong 30 phót, sau ®ã ly t©m

5000g trong thêi gian 15 phót ë 40C.

- Röa phÇn kÕt tña b»ng sulphat amon 30% b·o hoµ vµ li t©m 5000g,

15 phót ë 40C.

- Hoµ phÇn kÕt tña vµo 2ml ®Öm g¾n cét (Protein A Sepharose), sau

®ã thÈm tÝch trong 2 lÝt ®Öm g¾n cét ë 40C qua ®ªm.

- Li t©m 5000g trong thêi gian 15 phót ë 40C ®Ó lo¹i bá chÊt th«

kh«ng hoµ tan.

ChuÈn bÞ cét Protein A Sepharose:

- Hoµ 300 mg Protein A Sepharose trong 2 ml n−íc khö ion v« trïng

trong èng Falcon 50 ml.

- ChuyÓn toµn bé sang cét.

- Röa cét Protein A Sepharose b»ng 20 ml n−íc khö ion v« trïng.

- C©n b»ng cét Protein A Sepharose b»ng 20 ml dung dÞch ®Öm g¾n

cét (Tris-HCl, 50 mM, pH = 7,0).

- §−a toµn bé dÞch næi chøa IgG thá ®· thÈm tÝch vµ ly t©m lªn lªn

cét Protein A Sepharose.

- Röa l¹i cét b»ng 10 ml dung dÞch ®Öm g¾n cét ®Ó lo¹i bá toµn bé

protein kh«ng g¾n cét.

- §Èy Immunoglobulin b»ng dung dÞch ®Öm glycine 0,1M; pH = 3,0.

Thu 10 ph©n ®o¹n vµo èng Eppendorf, mçi èng 1ml.

- Bæ sung 100 µl 0,5M Tris-HCl pH8 vµo mçi ph©n ®o¹n.

- X¸c ®Þnh hµm l−îng protein trong c¸c ph©n ®o¹n b»ng m¸y quang

phæ ë b−íc sãng 280 nm (OD280) vµ kiÓm tra møc ®é s¹ch b»ng ph−¬ng ph¸p ®iÖn di protein.

- Chia nhá vµ b¶o qu¶n ë -850C.

176

2. Quy tr×nh g¾n Gold Colloid

Hãa chÊt sinh phÈm:

1. Kh¸ng thÓ kh¸ng Thioredoxin ®· ®−îc tinh chÕ qua cét Con A Sepharose.

2. Dung dÞch Gold Colloidal (h¹t kÝch th−íc 20 nm) cña Sigma.

3. Dung dÞch thÈm tÝch Borate buffer 2mM, pH 9.

4. NaCl 10%.

5. Dung dÞch chØnh pH Gold Colloidal: + K2CO3 0,2M & HCL 0,1 M

6. BSA 10% ( pha xong läc b»ng mµng läc 0,45 µm).

7. TBS ( pH 8,2) víi 1% BSA, 0,02% NaN3.

Quy tr×nh:

- Kh¸ng thÓ kh¸ng Thioredoxin ®· ®−îc tinh chÕ qua cét Con A Sepharose ®−îc

pha lo·ng xuèng nång ®é 0,2mg/ml b»ng Borate Buffer 2mM, pH 9 (dung dÞch

thÈm tÝch).

- ThÈm tÝch kh¸ng thÓ (0,2mg/ml)/ 12 giê ë 4oC b»ng Borate Buffer 2mM, pH 9

- X¸c ®Þnh nång ®é kh¸ng thÓ sau thÈm tÝch b»ng Bradford protein assay.

- ChØnh Gold Colloidal ®Õn pH 9 b»ng K2CO3 0,2 M hoÆc HCl 0,1M.

- ChuÈn ®é:

Trén c¸c dung dÞch víi thÓ tÝch nh− b¶ng sau:

B¶ng 3.11. B¶ng thÓ tich dung dÞch

TT Kh¸ng thÓ (µl) Borate Buffer (µl) Gold Colloid (µl) NaCl 10% (µl)

50 1 500 100 0

45 .. 500 100 5

40 .. . .. 10

.. .. . . ..

177

0 11 500 100 50

ñ 5 phót, quan s¸t xem cã sù chuyÓn mµu kh«ng?

X¸c ®Þnh nång ®é kh¸ng thÓ thÊp nhÊt trong dung dÞch Gold Colloidal mµ cã sù

æn ®Þnh vµng (kh«ng cã sù chuyÓn mµu thµnh mµu xanh). Sö dông nång ®é

kh¸ng thÓ nµy trong Gold Colloidal ®Ó thùc hiÖn quy tr×nh g¾n vµng.

G¾n gold colloid

+ 10ml Gold Colloid, chuÈn pH b»ng K2CO3 0,2 M hoÆc HCl 0,1M.

+ Bæ sung kh¸ng thÓ (®Ó ®¹t ®−îc nång ®é ®· x¸c ®Þnh ë trªn), võa bæ

sung võa khuÊy ®Òu, khuÊy thªm 10 phót n÷a.

+ Sau 10 phót, bæ sung BSA 10% ®Ó nång ®é cuèi cïng cña BSA trong

dung dÞch lµ 1%, khuÊy thªm 10 phót n÷a.

+ Ly t©m 8000 g/ 1h/ 4 ®é C ( ®èi víi kÝch th−íc h¹t vµng lµ 20nm)

+ Hót dÞch næi sang èng facol kh¸c, thu cÆn (cÆn láng nªn cÈn thËn khi

lo¹i dÞch næi).

+ Hßa cÆn trong 500 µl TBS 1X+ 1% BSA + 0,02 % NaN3.

+ Läc dÞch qua mµng läc 0,2µm( mµng läc cellulose axetat).

Gi÷ dÞch ë 4 ®é C.

+ LÊy dÞch thö Dot blot.

3. Qui tr×nh chÕ t¹o b¶n thö

C¸c sinh phÈm:

- Kh¸ng thÓ kh¸ng Thioredoxin g¾n Gold Colloid ®· s¶n xuÊt

- Kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp d¹ng lai ghÐp DE3- Thioredoxin ®· s¶n xuÊt

- Kh¸ng thÓ kh¸ng IgM cña ng−êi (Bio Rad)

- Kh¸ng thÓ kh¸ng IgG thá (Bio Rad)

- Mµng Nitrocellulose (Bio Rad)

Sö dông m¸y tr¶i mÉu lªn mµng cña h·ng Arista (ViÖn Hãa sinh vµ tµi liÖu

nghiÖp vô, Tæng côc kü thuËt, Bé C«ng an) ®Ó ®−a kh¸ng thÓ thá kh¸ng IgM vµ

IgG cña ng−êi lªn que thö theo h×nh 2, l−îng kh¸ng thÓ ®−a lªn mçi b¨ng trªn

178

mét que thö lµ kho¶ng 500 ng/d¶i.

3.6. Nghiªn cøu dung dÞch ®Öm buffer tèi −u

dïng trong ph¶n øng

3.6.1. Dung dÞch ®Öm Borat

3.6.1.1. Dung dÞch gèc

1,5 M NaCL Natri clorua 87,675 gr

N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1.000,00 ml

axit Boric 30,92 gr

0,5 M H3 BO3 N−íc cÊt nãng 700,00 ml

N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1.000,00 ml

1 N NaOH Natri hidroxit 40,00 gr

N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1.000,00 ml

3.6.1.2. Dung dÞch ®Öm Borat pH 9,0

80,00 ml - 1,5 M NaCL

100.00 ml

24,00 ml - 0,5 M H3 BO3 - 1 N NaOH

1.000,00 ml - N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ

3.6.1.3. Dung dÞch ®Öm Phèt ph¸t

C¸c dung dÞch gèc

Nh− trªn - 1,5 M NaCl

179

283,96 gr Na2 HPO4 (khan) - 2 M Na2 HPO4

N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1.000,00 ml

276,02 gr NaH2 PO4. H2O

312,02 gr - 2M NaH2 PO4

NaH2 PO4. 2 H2O N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1.000,00 ml

Dung dÞch A: 1,5 M NaCl 100,00 ml

100,00 ml

2 M Na2 HPO4 N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 800,00 ml

Dung dÞch B: 1,5 M NaCl 100,00 ml

100,00 ml

2M NaH2 PO4 N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 800,00 ml

3.6.1.4. Dung dÞch ®Öm pH cã c¸c ®é pH kh¸c nhau

Trén hai phÇn b»ng nhau cña ®Öm Phèt ph¸t (A+B) víi ®Öm Borat pH 9,0.

Dung dÞch A (ml) Dung dÞch B (ml) §é pH

97,0 5,75 3,0

87,5 6,0 12,5

78,0 6,2 22,0

68,0 6,4 32,0

55,0 6,6 45,0

45,0 6,8 55,0

36,0 7,0 64,0

KiÓm tra pH b»ng pH kÕ, hoÆc thang pH mÉu.

Muèn kiÒm dïng 0,1N NaOH; Muèn toan dïng 0,1M axit axetic.

180

SÊy −ít 110 0C/ 30 phót.

3.6.1.5. Dung dÞch ®Öm phèt ph¸t (dïng cho c¸c ph¶n øng miÔn dÞch huúnh

quang, ELISA, röa tÕ bµo...)

a. Dung dÞch gèc

I. 1,5 M NaCl 87,68 gr/ lit/ NC

70,99 gr/ lit/ NC

69,01 gr/ lit/ NC

II. 0,5 M Na2 HPO4 III. 0,5 M NaH2 PO4

+ Dung dÞch A

Dung dÞch gèc I 80 ml

Dung dÞch gèc II 40 ml

N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1.000,00 ml

+ Dung dÞch B: Dung dÞch gèc I 80 ml

Dung dÞch gèc III 40 ml

N−íc cÊt 2 lÇn võa ®ñ 1.000,00 ml

b. Dung dÞch ®Öm Phèt ph¸t cã c¸c ®é pH theo yªu cÇu

10 phÇn dung dÞch A pH 7,95

01 phÇn dung dÞch B

08 phÇn dung dÞch A pH 7,5

01 phÇn dung dÞch B

07 phÇn dung dÞch A pH 7,4

01,5 phÇn dung dÞch B

04 phÇn dung dÞch A pH 7,2

01 phÇn dung dÞch B

SÊy −ít 110 0C/ 15 phót.

181

3.6.1.6. Trypsin

2,5 gr - Trypsin

1,0 gr - Veczen

1.000 ml - PBS pH 7,95 v®

3.6.1.7. Thuèc nhuém Napthonbleu black

1,0 gr - Napthonbleu black

13,6 gr - axit axetic

60,0 gr - Glacial axit axetic

1.000,0 ml - N−íc cÊt võa ®ñ

3.6.1.8. §Öm Carbonat pH 9,6

1,59 gr - Na2 CO3

2,39 gr

182

1.000,0 ml - NaH CO3 - N−íc cÊt võa ®ñ

3.7. Hoµn thiÖn Bé sinh phÈm

Do tû lÖ tö vong g¾n liÒn víi c¸c tr−êng hîp nhiÔm thø ph¸t, nªn viÖc sö dông

c¸c xÐt nghiÖm chÈn ®o¸n lµ rÊt quan träng, c¸c xÐt nghiÖm nµy cã kh¶ n¨ng

ph©n biÖt gi÷a hai d¹ng nhiÔm virus dengue. Trong c¸c vïng cã l−u hµnh dÞch,

nhiÔm thø ph¸t lµ phæ biÕn nhÊt, v× phÇn lín trÎ em ®Òu cã kh¸ng thÓ kh¸ng

dengue tõ khi chóng 5 tuæi . Do c¸c d¹ng nhiÔm virus dengue tiªn ph¸t vµ thø

ph¸t thÓ hiÖn c¸c ®¸p øng miÔn dÞch kh¸c biÖt ®Æc tr−ng, nªn sù ph¸t hiÖn c¸c

kh¸ng thÓ lµ mét quy tr×nh cã gi¸ trÞ ®Ó chÈn ®o¸n vµ ph©n biÖt c¸c d¹ng nhiÔm

virus dengue. Tr−íc ®©y, xÐt nghiÖm HAI ®· tõng ®−îc dïng nh− mét xÐt

nghiÖm huyÕt thanh häc “tiªu chuÈn vµng”; Cßn gÇn ®©y, ELISA ®· ®−îc øng

dông trong hÇu hÕt c¸c phßng thÝ nghiÖm do hiÖu qu¶ vµ thuËn tiÖn khi chÈn

®o¸n sµng läc.

§Ó ®¬n gi¶n ho¸ viÖc x¸c ®Þnh c¸c æ dÞch, nhiÒu kü thuËt chÈn ®ãan nhanh huyÕt

thanh nhiÔm virus dengue trªn thÞ tr−êng hiÖn nay còng ®−îc sö dông (tõ PanBio

Ltd.; Cortez Diagnostics, Calabasas, Calif.; Glysby, Arcore, Italy; vµ AmeriTek,

Scattle, Wash.). C¸c kü thuËt nµy kh¸ thuËn lîi v× thêi gian ñ kh¸ ng¾n (tõ 5 ®Õn

30 phót) kh«ng cÇn trang thiÕt bÞ ®¾t tiÒn kÓ c¶ ®iÖn vµ thuËn tiÖn khi tiÕn hµnh

xÐt nghiÖm..... Kü thuËt chÈn ®ãan nhanh lµ kü thuËt ®Çu tiªn cã sö dông c¸c

protein t¸i tæ hîp. Bèn lo¹i protein ®−îc sö dông (tõ c¸c virus dengue type 1,

type 2, type 3 vµ virus Dengue type 4); Mçi lo¹i ®Æc tr−ng cho 80% ®Çu N cña

c¸c glycoprotein t¸i tæ hîp, theo thø tù. Sù biÓu hiÖn vµ tiÕt ra cña c¸c phÇn d−íi

®¬n vÞ trong c¸c tÕ bµo S2 ®· t¹o ra c¸c ph©n tö ®−îc gi÷ l¹i ®−îc nh÷ng ®Æc

®iÓm gièng víi ph©n tö tù nhiªn.

Trong PanBio Rapid Test, IgM vµ IgG ®−îc ph¸t hiÖn ®ång thêi b»ng c¸ch chØ

cÇn thªm vµo duy nhÊt huyÕt thanh pha lo·ng. V× thÕ, sù ph©n biÖt gi÷a c¸c d¹ng

nhiÔm tiªn ph¸t vµ thø ph¸t cã thÓ ®−îc thùc hiÖn th«ng qua duy nhÊt mét huyÕt

183

thanh pha lo·ng chø kh«ng ph¶i mét d·y c¸c ®é pha lo·ng, nh− ®· ®−îc thùc

hiÖn trong xÐt nghiÖm Ng¨n ng−ng kÕt hång cÇu (HAI). §é nh¹y cña test nhanh

nµy ®· ®−îc Ên ®Þnh, v× thÕ ë c¸c bÖnh nh©n sèt xuÊt huyÕt tiªn ph¸t, IgM lµ

d−¬ng tÝnh trong khÝ ®ã IgG l¹i ©m tÝnh. Ng−îc l¹i, c¸c bÖnh nh©n bÞ nhiÔm thø

ph¸t sÏ cho kÕt qu¶ IgG d−¬ng tÝnh vµ cã thÓ cã hoÆc kh«ng cã kÕt qu¶ IgM

d−¬ng tÝnh.

C¸c nghiªn cøu so s¸nh theo nhãm gi÷a toµn bé c¸c virus víi c¸c kh¸ng nguyªn

t¸i tæ hîp trong kü thuËt ph¸t hiÖn IgM vµ IgG ®· cho thÊy kÕt qu¶ kh¸ cao. C¸c

sè liÖu thu ®−îc ®−a ra gi¶ thuyÕt r»ng c¸c protein nµy sÏ cã thÓ cã Ých trong c¸c

xÐt nghiÖm chÈn ®o¸n ph¸t hiÖn IgM vµ IgG [2] ®èi víi virus dengue. Trong

nghiªn cøu nµy, Kü thuËt chÈn ®ãan nhanh ®· thùc hiÖn ®èi chiÕu víi ELISA. Kü

thuËt chÈn ®ãan nhanh ®· ph¸t hiÖn 85% c¸c tr−êng hîp nhiÔm dengue tiªn ph¸t

vµ 86% tr−êng hîp nhiÔm dengue thø ph¸t (so víi 93 vµ 69% , theo thø tù, khi

xÐt nghiÖm b»ng kü thuËt ELISA). Kh«ng cã mét sù kh¸c biÖt ®¸ng kÓ nµo vÒ ®é

nh¹y trong c¸c tr−êng hîp nhiÔm virus dengue tiªn ph¸t (P = 1,0000), mÆc dï

vËy l¹i cã mét kh¸c biÖt quan träng vÒ ®é nh¹y trong c¸c tr−êng hîp nhiÔm virus

dengue thø ph¸t (P = 0,0063).

Kh«ng cã sù kh¸c biÖt quan träng nµo gi÷a kÕt qu¶ cña kü thuËt chÈn ®ãan

nhanh vµ kü thuËt ELISA ®Ó ph¸t hiÖn c¸c tr−êng hîp nhiÔm tiªn ph¸t b»ng c¸ch

chØ sö dông mÉu cÊp tÝnh (90 so víi 85% theo thø tù; P = 1,0000). Dùa trªn c¸c

kÕt qu¶ nµy, kü thuËt chÈn ®ãan nhanh cã kh¶ n¨ng chÈn ®o¸n 90% trong sè tÊt

c¶ c¸c tr−êng hîp nhiÔm tiªn ph¸t nhËp viÖn.

Sù kh¸c biÖt ®¸ng kÓ vÒ ®é nh¹y lµ kh«ng cã khi sö dông mÉu huyÕt thanh ë giai

®o¹n cÊp tÝnh hay phôc håi ®Ó ph¸t hiÖn IgM trong sèt xuÊt huyÕt tiªn ph¸t hay

thø ph¸t. Sù kh¸c biÖt quan träng duy nhÊt thu ®−îc kÕt qu¶ gi÷a c¸c mÉu huyÕt

thanh thø nhÊt vµ thø hai lµ ®é nh¹y cña IgM trong sèt xuÊt huyÕt thø ph¸t. §é

nh¹y sÏ lµ kháang 25% ®· thu ®−îc b»ng c¸ch sö dông mÉu huyÕt thanh thø

184

nhÊt, vµ ®é nh¹y nµy ®· t¨ng lªn 88% khi dïng mÉu thø hai. §é nh¹y nµy ®·

chøng minh gi¶ thuyÕt cho r»ng IgM trong sèt xuÊt huyÕt thø ph¸t th−êng ®−îc

sinh ra víi møc ®é Ýt h¬n vµ cã thÓ mÊt nhiÒu thêi gian ®Ó ®¹t tíi kh¶ n¨ng ph¸t

hiÖn h¬n lµ IgM trong nhiÔm tiªn ph¸t.

Do c¸c protein t¸i tæ hîp bao gåm 80% protein vá, nªn chóng cã kh¶ n¨ng cã

mét møc ph¶n øng ngang t−¬ng tù víi kh¶ n¨ng ph¶n øng cña virus nguyªn vÑn.

Kh¶ n¨ng ph¶n øng ngang duy nhÊt ®−îc quan s¸t thÊy t¹i v¹ch test IgG trong

test nhanh lµ víi c¸c huyÕt thanh cña c¸c bÖnh nh©n bÞ nhiÔm virus JE. Bëi vËy,

test nhanh nµy sÏ cã Ých trong nh÷ng vïng ®Æc h÷u sèt xuÊt huyÕt vµ viªm n·o

NhËt B¶n (JE), khi ®ã, mét kÕt qu¶ IgM d−¬ng tÝnh trong xÐt nghiÖm nµy nh−ng

do nhiÔm virus JE l¹i lµ mét kÕt qu¶ kh«ng ®−îc mong ®îi. Kh¶ n¨ng ph¶n øng

ngang gi÷a c¸c Flavivirus t¹i møc IgG lµ phæ biÕn vµ ®· tõng ®−îc b¸o c¸o trong

c¸c xÐt nghiÖm chÈn ®o¸n.

C¸c protein t¸i tæ hîp ®· ®−îc chän lùa v× chóng t−¬ng øng víi phÇn lín bé

phËn ho¹t ®éng cña protein vá - ®Ých cña c¸c epitope trung tÝnh, vµ v× vËy chóng

cã kh¶ n¨ng b¾t ch−íc virus nguyªn vÑn trong c¸c xÐt nghiÖm huyÕt thanh.

Ngoµi ra, protein vá ®· ®−îc b¸o c¸o cßn ®Ó suy ra sù ®¸p øng miÔn dÞch ®Çu

tiªn trong nhiÔm tiªn ph¸t. Do c¸c ®¸p øng nµy còng gi÷ l¹i kh¸ l©u, nªn c¸c

protein t¸i tæ hîp trong mét xÐt nghiÖm sèt xuÊt huyÕt lµ mét sù lùa chän logic.

§Ó cã thÓ t¹o ra bé kit chÈn ®o¸n SD/SXHD, chóng t«i ®· sö dông c¸c kh¸ng

nguyªn t¸i tæ hîp thuéc domain 3 (D1E3, D2E3, D3E3, D4E3). §©y lµ lo¹i kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp víi gi¸ thµnh rÊt h¹ v× ®−îc biÓu hiÖn víi n¨ng suÊt cao trong

E.coli (®¹t 20 mg protein t¸i tæ hîp/lÝt m«i tr−êng nu«i cÊy), rÊt dÔ tinh chÕ. H¬n

n÷a, protein nµy ®−îc biÓu hiÖn ra ë d¹ng lai ghÐp cã hai nöa, mét nöa mang

kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu cña virus Dengue, nöa kia chøa Thioredoxin v× vËy cã

185

thÓ dÔ dµng t¹o ra kh¸ng thÓ kh¸ng Thioredoxin ®Ó lµm kh¸ng thÓ 2, sau ®ã g¾n

enzyme ®Ó ph¸t hiÖn phøc hîp kh¸ng thÓ 1 (trong huyÕt thanh bÖnh

nh©n)+kh¸ng nguyªn t¸i tæ hîp.

Tuy nhiªn, muèn chÕ t¹o ®−îc bé Kit chÈn ®o¸n SD/SXHD b»ng MAG-ELISA

hoÆc GAG-ELISA chóng t«i cÇn ph¶i cã kh¸ng thÓ kh¸ng Thioredoxin g¾n

enzyme. §Ó thùc hiÖn ®−îc môc ®Ých nµy, tr−íc hÕt ph¶i cã Thioredoxin t¸i tæ

hîp tinh s¹ch. Muèn thÕ, ph¶i t¸ch vµ biÓu hiÖn riªng vµ tinh s¹ch Thioredoxin.

3.7.1. ThiÕt kÕ vector biÓu hiÖn vµ tinh s¹ch Thioredoxin

§Ó cã ®−îc Thioredoxin t¸i tæ hîp cã ®u«i His-tag dïng cho viÖc tinh chÕ b»ng

cét s¾c ký ¸i lùc Nikel chelating Resin. Chóng t«i ®· tiÕn hµnh biÕn ®æi vector

nh− sau:

ThiÕt kÕ mét Adaptor sao cho mét ®Çu cã vÞ trÝ c¾t cña enzyme h¹n chÕ BamHI,

®Çu thø hai cã vÞ trÝ c¾t cña XhoI. Ngoµi ra, Adaptor cßn cã thªm mét sè vÞ trÝ c¾t

cña c¸c enzyme h¹n chÕ quan träng nh− EcoRI, SacI, SalI, HindIII ®Ó tiÖn cho

viÖc thao t¸c sau nµy.