T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
377
BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ BỆNH TỒN LƯU TỐI THIỂU
TRÊN NGƯỜI BỆNH BẠCH CẦU CẤP DÒNG TỦY
MANG ĐỘT BIẾN GEN NPM1 TYPE A BẰNG KỸ THUẬT RQ-PCR
Cao Văn Động1, Châu Thúy Hà1, Võ Lâm Hoàng Vũ2,
Phù Chí Dũng1, Nguyễn Tấn Bỉnh3, Phan Thị Xinh1,2
TÓM TẮT44
Mục tiêu: Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu
trên ngưi bệnh Bạch cầu cấp dòng tủy mang đột
biến gen NPM1 type A bằng kỹ thuật RQ-PCR.
Đối tượng: Ngưi bệnh bạch cầu cấp dòng
tủy mang đột biến gen NPM1 type A lúc chẩn
đoán tại Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ
tháng 10/2022 đến tháng 10/2023.
Phương pháp nghiên cứu: Tạo dòng
plasmid từ DNA mẫu bệnh nhân bằng kit pGEM-
T Easy vector TA cloning để xây dựng đưng
cong chuẩn. Phản ứng RQ-PCR đưc thực hiện
với mẫu nồng độ chuẩn, mồi, đầu dò và 2X
PrimeTime® Gene Expression Master Mix
(Integrated DNA Technologies-Mỹ) để tối ưu
hóa. Xác định bệnh tồn lưu tối thiểu trên ngưi
bệnh bằng kỹ thuật RQ-PCR.
Kết quả: Chúng tôi đã chuẩn hóa thành công
phản ứng RQ-PCR để định lưng đột biến NPM1
type A với độ nhạy 10-5. Dựa trên kết quả động
học của bệnh tồn lưu tối thiểu, có 13/17 NB cho
thấy mức giảm 3 log10 NPM1 sau điều trị.
1Bệnh viện Truyền Máu Huyết Học
2Bộ Môn Huyết Học, Đại Học Y dược TPHCM
3Đại học Y Khoa Phạm Ngọc Thạch
Chịu trách nhiệm chính: Phan Thị Xinh
SĐT: 0932728115
Email: bsphanthixinh@ump.edu.vn
Ngày nhận bài: 30/7/2024
Ngày phản biện khoa học: 01/8/2024
Ngày duyệt bài: 17/9/2024
Kết luận: Kỹ thuật RQ-PCR đưng chuẩn có
thể xác định dng đột biến NPM1 type A ở mức
thấp, là công cụ hữu ích trong theo dõi tồn lưu tế
bào ác tnh mang đột biến NPM1 type A.
Từ khóa: NPM1 type A, RQ-PCR, Bạch cầu
cấp dòng tuỷ.
SUMMARY
INITIAL QUANTITATIVE
ASSESSMENT OF MINIMAL
RESIDUAL DISEASE IN ACUTE
MYELOID LEUKEMIA CARRYING
NPM1 TYPE A MUTATION
BY RQ-PCR
Objectives: Detection of minimal residual
disease in patients with acute myeloid leukemia
carrying NPM1 type A mutation by RQ-PCR.
Subjects: The patients with Acute Myeloid
Leukemia carrying NPM1 type A mutation at
diagnosis in the Blood Transfusion and
Hematology Hospital from October 2022 to
October 2023.
Method: Cloning of the patient sample with
pGEM-T Easy vector TA cloning kit was done to
produce plasmids for the generation of standard
curves. RQ-PCR reaction performed with
standard concentrations, primers, probes and 2X
PrimeTime® Gene Expression Master Mix
(Integrated DNA Technologies-USA) for
optimization. Detection of minimal residual
disease in patients by RQ-PCR.
Results: In this study, we developed RQ-
PCR to quantitation of NPM1 mutation A with
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
378
sensitivities of 10-5. On the basis of minimal
residual disease kinetics in 11 patients who were
monitored after treatment, 13/17 patients showed
3-log10 reduction in the NPM1mut levels after
treatment.
Conclusion: RQ-PCR with standard curves
could detect NPM1 type A mutant clone at low
level, so it will be useful device in monitoring
mesurable disease postreatment.
Keywords: NPM1 type A, RQ-PCR, AML.
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh bạch cầu cấp dng tủy (BCCDT) là
một trong những bệnh ung thư phổ biến trên
thế giới, đặc trưng bởi sự rối loạn trong tăng
sinh và biệt hóa các tế bào tạo máu đầu dng
tủy. Sự bất thưng này làm mất chức năng
bảo vệ cơ thể dẫn đến tỉ lệ tử vong cao nếu
không đưc chẩn đoán, điều trị kịp thi và
hiệu quả. Trong các phác đồ điều trị đặc hiệu
hiện nay, các ngưi bệnh sẽ đưc điều trị tấn
công trong thi gian đầu phát hiện bệnh. Tuy
nhiên, tỉ lệ bệnh tồn lưu tối thiểu cao sau
điều trị dẫn đến nguy cơ tái phát cao. Do đó,
việc tm ra các dấu ấn cho phép dự đoán tái
phát, đáp ứng điều trị và hướng dẫn can thiệp
điều trị là rất cần thiết. Các dấu ấn đưc sử
dụng để theo di điều trị (hay theo di bệnh
tồn lưu tối thiểu: BTLTT) trong bạch cầu cấp
dng tủy chủ yếu là các bất thưng di truyền
thưng gặp như PML/RARA, AML1/ETO,
CBFB/MYH11 hay MLL/AF9. Đối với
những ngưi bệnh không mang các bất
thưng di truyền thưng gặp cần có một chỉ
dấu sinh học khác để theo di hiệu quả điều
trị. Theo hướng dẫn điều trị của Mạng lưới
ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCCN: National
Comprehensive Cancer Network) từ phiên
bản 3.2022 và Mạng lưới bạch cầu Châu âu
(ELN: European Leukemia Net), Ngưi bệnh
(NB) BCCDT mang đột biến NPM1 có thể
đưc đánh giá tồn lưu bằng kỹ thuật PCR
định lưng (RQ-PCR) [5, 9].
Gen NPM1 là phối tử trong chuyển vị
NST của bệnh bạch cầu và lymphoma, kết
quả là trong các tổ hp chứa các vng NPM
đầu N, NPM xuất hiện để góp phần sinh u
bằng cách kch hoạt tiềm năng gây ung thư
của các phối tử protein tổ hp (ALK, MLF1,
hoặc RARα). VNPM đưc cho là có chức
năng ức chế u, do đó rối loạn trong chuyển
động của nó từ nhân ra tế bào chất có thể
quan trọng đối với chuyển dạng ác tnh [3]
Nhiều nghiên cứu cho thấy, hơn 90% NB
BCCDT tái phát mang đột biến NPM1 tại
thi điểm chẩn đoán vẫn còn hiện diện kiểu
đột biến này tại thi điểm tái phát [4, 8, 10].
Theo Ivey và cộng sự, sau chu kỳ hóa trị thứ
hai, kết quả đánh giá BTLTT dựa trên đột
biến NPM1 cho thấy nhóm có BTLTT dương
tính có tỷ lệ tái phát cao hơn và thi gian
sống ngắn hơn so với nhóm ngưi bệnh
không phát hiện BTLTT [8]. Hiện nay, các
phác đồ điều trị bệnh BCCDT trên thế giới
đều cho rằng theo dõi BTLTT là một phần
không thể thiếu. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra
rằng đột biến NPM1 là một tiêu chuẩn độc
lập để theo di điều trị bệnh BCCDT sau các
giai đoạn điều trị. Việc theo dõi BTLTT bằng
đột biến NPM1 đưc thực hiện bởi kỹ thuật
real time PCR. Đây là một kỹ thuật sinh học
phân tử có độ nhạy cao, chuyên biệt để xác
định chính xác số bản sao của gen. Tại Việt
Nam, các NB BCCDT trong quá trnh điều
trị đưc theo dõi bệnh tồn lưu tối thiểu bằng
các kỹ thuật như tế bào dòng chảy, PCR,
Real time PCR tổ hp gen đặc hiệu. Tuy
nhiên, hiện chưa có nghiên cứu nào khảo sát
định lưng đột biến gen NPM1 ở bệnh bạch
cầu cấp dòng tủy. Theo ghi nhận từ các
nghiên cứu trên thế giới cho thấy type A là
kiểu đột biến phổ biến nhất chiếm khoảng
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
379
80% tất cả các đột biến NPM1 trong BCCDT
[2]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
“Đánh giá bệnh tồn lưu tối thiểu trên ngưi
bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mang đột biến
gen NPM1 type A bằng kỹ thuật RQ-PCR”
nhằm đánh giá lui bệnh, phát hiện tái phát
sớm cho ngưi bệnh.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Ngưi bệnh bạch cầu cấp dòng tủy mang
đột biến gen NPM1 type A lúc chẩn đoán tại
Bệnh viện Truyền máu Huyết học từ tháng
10/2022 đến tháng 10/2023.
Địa điểm và thi gian nghiên cứu
Địa điểm: Nghiên cứu đưc thực hiện tại
Khoa Di truyền học phân tử, Bệnh viện
Truyền máu Huyết học.
Thi gian: Từ 10/2022 đến 12/2023
Thiết kế nghiên cứu: mô tả loạt ca.
Các bước tiến hành nghiên cứu
- Ly trích RNA từ mẫu tủy xương chứa
trong ống EDTA với kit Maxwell® RSC
simplyRNA Blood của hãng Promega (Mỹ).
- Thiết kế các đoạn mồi và đoạn dò cho
phản ứng RQ-PCR bằng phần mềm Oligo
4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen NPM1
mang accession number NM_002520.
- Tạo dòng bằng kít pGEM-T Easy vector
TA cloning theo hướng dẫn của nhà sản xuất
và pha loãng dòng tế bào mang đột biến gen
NPM1 type A để đưc đưng chuẩn (102 →
106) và mẫu thử giới hạn phát hiện của kỹ
thuật (10-4, 10-5, 10-6).
- Thử nghiệm điều kiện cho phản ứng
RQ-PCR với 2X PrimeTime® Gene
Expression Master Mix (Integrated DNA
Technologies-Mỹ) và các mồi, đoạn dò
huỳnh quang đã thiết kế. Khảo sát nhiệt độ
bắt cặp của mồi, đoạn dò lần lưt từ 58°C,
60°C và 62°C để tm ra điều kiện tối ưu nhất
cho phản ứng (thực hiện quy trình trong 3 lần
ở các nhiệt đột bắt cặp khác nhau).
- Thực hiện phản ứng RQ-PCR đưng
chuẩn định lưng đột biến NPM1 từ mẫu NB
mang đột biến gen type A lúc chẩn đoán ở
các giai đoạn sau điều trị. Đồng thi định
lưng gen ABL (gen giữ nhà) để đánh giá
BTLTT cho ngưi bệnh.
- Thực hiện song song mẫu BN này với
kit thương mại Qiagen định lưng đột biến
NPM1 type A với độ nhạy 10-5 và tiến hành
so sánh, đánh giá mức độ tương đồng, độ
nhạy của phản ứng RQ-PCR.
Thu thập và xử lý số liệu
Dữ liệu thu đưc sau khi thực hiện phản
ứng RQ-PCR đưc chúng tôi tiến hành tổng
hp phân tích bằng phần mềm Microsoft
Excel và kiểm định Wilcoxon. Các kết quả
đưc trình bày theo tỷ lệ hoặc dưới dạng
bảng và hình.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Chuẩn hóa điều kiện RQ-PCR định
lượng đột biến gen NPM1 type A
Dựa trên trình tự chuẩn của gen NPM1
mang accession number NM_002520, chúng
tôi đã thiết kế các mồi NPM1-F: 5’-
GGTTGTTCTCTGGAGCAGCGTTC-3’,
NPM1-R: 5’-
CCTGGACAACATTTATCAAACACGGTA
-3’ để khuếch đại gen làm nguyên liệu cho tạo
dòng và xây dựng đưng chuẩn NPM1. Các
mồi Q.NPM1-F1: 5’-
TCAAGATCTCTGTCTG-3’; Q.NPM1-R1:
5’- CACGGTAGGGAAAGTTCT-3’ và đoạn
dò NPM1-Probe1: 5’-6FAM-
ATCTGGCTGTCCTTTTTATAATGCAG-
TAMRA-3’ dng cho phản ứng RQ-PCR phát
hiện đột biến gen NPM1 type A. Sau khi thử
nghiệm, chúng tôi ghi nhận đã khuếch đại
thành công đoạn gen NPM1 (hình 1).
KỶ YẾU CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CHUYÊN NGÀNH HUYẾT HỌC - TRUYỀN MÁU
380
Hình 1. Khuếch đi thành công gen NPM1
A: khuếch đại gen NPM1 ở 60oC (giếng 2); hình B là trình tự sản phẩm giếng 2 hình A
Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại thành công đưc chúng tôi sử dụng để tạo dòng gen
NPM1 bao gồm dng WT và dng đột biến type A, kết quả thu đưc như hnh 2.
Hình 2. Kết quả kết quả to dòng T-vector gen NPM1
A: Kết quả tạo khuẩn lạc; B: Kết quả
điện di sản phẩm PCR từ khuẩn lạc
Thực hiện ly trích DNA plasmid các khuẩn
lạc thu đưc, đo mật độ quang ở bước sóng
260 nm OD (A260) và 280 nm OD (A280) cho
thấy ở các mẫu tỉ lệ A260/A280 đều đạt 1,8.
Xác định số bản sao DNA từ kết quả đo OD,
dãy nồng độ bản sao tuyến tnh đưc thiết lập
bằng cách pha loãng để có các nồng độ của
đưng chuẩn 102, 103, 104, 105, 106 và mẫu thử
giới hạn phát hiện của kỹ thuật 10-4, 10-5, 10-6.
Phản ứng RQ-PCR khảo sát nhiệt độ lai
(Ta: annealing temperatures) sử dụng dãy nồng
độ chuẩn chúng tôi ghi nhận, ở mức nhiệt độ
lai 58°C và 62°C cho tn hiệu nền nhiễu và chu
kỳ ngưỡng Ct của gen mục tiêu có nồng độ cao
là quá cao, các đưng chuẩn cho độ tuyến tnh
rất thấp với các thông số như hiệu suất PCR, ,
R2 lần lưt là 124%, 0,65, 0,94 (hnh 3A) và
66%, 0,66, 1 (hình 3B).
T¹P CHÝ Y häc viÖt nam tẬP 544 - th¸ng 11 - QuyỂN 2 - sè ĐẶC BIỆT - 2024
381
Hnh 3. Phản ứng RQ-PCR với nhit độ lai mồi và đon dò 58oC (A) và 62oC (B)
Đối với nhiệt độ lai 60°C là nhiệt độ tối
ưu mà chúng tôi ghi nhận đưc. Tại đó, các
thông số của phản ứng RQ-PCR cũng tối ưu
như hiệu suất PCR đạt 99%, = 0,16 và R2 =
0,999 (hình 4). Do đó, chúng tôi chọn
chương trnh luân nhiệt trên máy Real Time
PCR Sacycler 96 cho phản ứng RQ-PCR như
sau: biến tnh ban đầu ở 95°C trong 10 phút,
50 chu kỳ tiếp theo với các bước biến tnh
95°C trong 15 giây, bắt cặp, tổng hp chụp
hnh 30 giây ở nhiệt độ 60°C.
Hình 4. Phản ứng RQ-PCR với nhit độ lai mồi và probe 60oC
Tổng hp các thông số của phản ứng thử nghiệm tối ưu hoá điều kiện RQ-PCR, chúng tôi
đã xác định đưc nhiệt độ lai tối ưu, ngưỡng cut-off và các nồng độ chuẩn gen NPM1 cho
phản ứng RQ-PCR như sau: Nhiệt độ lai của phản ứng là 60°C, ngưỡng cut-off là Ct = 39,
các nồng độ chuẩn là 102, 103, 104, 105, 106.