Giám sát dịch tễ học phân tử virus dengue týp 4 lưu hành ở khu vực phía Nam Việt Nam, năm 2011

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 2 * 2012<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> GIÁM SÁT DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ VIRUS DENGUE TÝP 4 LƯU HÀNH<br /> Ở KHU VỰC PHÍA NAM VIỆT NAM, NĂM 2011<br /> Vũ Thị Quế Hương*, Đặng Anh Tuấn*, Vũ Đình Luân*, Trần Ngọc Hữu*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Năm 2011, virus dengue týp 4 (DENV-4) tái xuất hiện sau một thời gian dài lưu hành ở tần<br /> suất thấp ở khu vực phía Nam từ 2003 đến 2010. Kết quả phân tích phân tử trước đây của cả bốn týp virus<br /> dengue gây bệnh sốt xuất huyết dengue (SXHD) ở khu vực phía nam Việt Nam từ 2001 đến 20107 đã dự đoán<br /> sự gia tăng nhanh của DENV-4 trong giai đoạn sắp tới so với các týp virus dengue còn lại. Vì thế, việc nghiên<br /> cứu dịch tễ học phân tử các DENV-4 gây bệnh SXHD năm 2011 là cần thiết.<br /> Mục tiêu nghiên cứu: Xác định tỷ lệ tiến triển di truyền của DENV-4 lưu hành ở khu vực phía Nam Việt<br /> Nam năm 2011.<br /> Phương pháp nghiên cứu: ARN của 21 DENV-4 khảo sát được tách chiết từ nước nổi tế bào muỗi gây<br /> nhiễm và từ huyết thanh bệnh nhân SXHD, giải trình tự toàn bộ vùng gen vỏ (E) và phân tích so sánh di truyền<br /> với 39 DENV-4 trên thế giới và khu vực. 83 trình tự gen vỏ của DENV-4 phân lập từ người ở 12 quốc gia và<br /> trong khoảng 55 năm được nghiên cứu phân tích tốc độ tiến hóa.<br /> Kết quả: Có 4 genotype của các DENV-4 trên thế giới với ngưỡng khác biệt 6% nucleotide. Vùng gen vỏ E<br /> của các chủng DENV-4 khu vực phía Nam Việt Nam năm 2011 khác biệt di truyền (từ 0,1 đến 4,9) gia tăng so<br /> với các chủng DENV-4 Việt Nam năm 2001-2010 (từ 0,1 đến 4,2) và cùng nhóm genotype lớn với các chủng<br /> DENV-4 lưu hành ở khu vực Đông Nam Á. Tốc độ tiến hóa của các chủng DENV-4 Việt Nam năm 2011 là 12,7<br /> x 10-4± 1,01 x 10-4, tương tự như các chủng DENV-4 trong 10 năm trước.<br /> Kết luận: Các DENV-4 gây dịch ở khu vực phía nam Việt Nam năm 2011 vẫn thuộc các genotype I, nhưng<br /> đã biểu lộ sự tích lũy đột biến và gia tăng khác biệt di truyền.<br /> Từ khóa: sốt xuất huyết-4, dịch tễ học phân tử, kiểu gen, miền Nam Việt Nam.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> MOLECULAR EPIDEMIOLOGICAL SURVEILLANCE OF DENGUE VIRUS SEROTYPE 4<br /> CIRCULATING IN SOUTHERN VIETNAM IN 2011<br /> Vu Thi Que Huong, Dang Anh Tuan, Vu Dinh Luan, Tran Ngoc Huu<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 16 - Supplement of No 2 - 2012: 191 - 199<br /> Background: After a low frequent circulation during 2003-2010, Dengue virus serotype 4 (DENV-4) has<br /> been reemerging in southern Vietnam in 2011. The previous result on genetic analysis of four DENV serotypes<br /> causing dengue hemorrhagic fever (DHF) in southern Vietnam from 2001 to 20107 has estimated the rapid<br /> increase of DENV-4 in coming years in comparison with other serotypes. Therefore, the molecular epidemiological<br /> study of DENV-4 causing DHF in 2011 was necessary.<br /> Objective: To determine the genetic evolutionary rate of DENV-4 isolates circulating in southern Vietnam<br /> in 2011.<br /> Method: The ARN of 21 studied DENV-4 strains was extracted from DHF patients’ sera and infected<br /> mosquito culture surnageants, then its envelope (E) gene was sequenced and analyzed in comparison with other<br /> * Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên hệ: PGS.TS. Vũ Thị Quế Hương ĐT: 0903678809<br /> <br /> Chuyên Đề Nhi Khoa<br /> <br /> Email: huongpasteur@hotmail.com<br /> <br /> 191<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 2 * 2012<br /> <br /> 39 DENV-4 isolated in the region and the world. However, 83 E gene sequences of DENV-4 isolated from<br /> patients in 12 countries during 55 years were analyzed its genetic evolutionary speed.<br /> Results: There are 4 genotypes of DENV-4 isolates in the world with 6% nucleotide difference. E gene<br /> sequence of DENV-4 isolates from Southern Vietnam in 2011 have had nucleotide difference from 0.1 to 4.9 that<br /> has increasing in comparison with ones of 2001-2010 (from 0.1 to 4.2) and belong to same genotype group with<br /> DENV-4 isolates circulating in Southeast Aisa region. The evolutionary speed of 2011 Vietnamese DENV-4<br /> isolates was 12.7 x 10-4± 1.01 x 10-4, that is the same of ones circulating in southern Vietnam during ten previous<br /> years.<br /> Conclusion: The analyzed result has showed that epidemic DENV-4 isolates in southern Vietnam in 2011<br /> still belong to genotype I, but has had its mutation accumulation and increasing genetic difference.<br /> Keywords: dengue-4, molecular epidemiology, genotype, southern Vietnam.<br /> <br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> <br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> <br /> Các virus Dengue (DENV) lây truyền từ<br /> người sang người, chủ yếu do muỗi Aedes aegypti<br /> và lưu hành dịch ở hầu hết các vùng nhiệt đới<br /> trên thế giới. Ở Việt Nam, có sự lưu hành của cả 4<br /> týp huyết thanh DENV với tỷ lệ chiếm ưu thế<br /> thay đổi theo từng giai đoạn. Với tỷ lệ lưu hành<br /> 74%, DENV-3 trở thành týp virus gây dịch chủ<br /> yếu của dịch sốt xuất huyết dengue (SXHD) lớn<br /> trong cả nước năm 1998. Sau đó, lần lượt chuyển<br /> sang DENV-4 năm 1999-2002, rồi DENV-2 từ<br /> 2003-2006 và DENV-1 từ 2007 đến nay(2,6). Phân<br /> tích trình tự nucleotide và di truyền phả hệ cho<br /> phép xếp loại các DENV thành các genotype<br /> khác nhau. Vì là kháng nguyên quan trọng tạo<br /> miễn dịch thể dịch, có vai trò trong quá trình gắn<br /> kết vào tế bào ký chủ và đóng gói virus, nên<br /> vùng gen vỏ (E) của DENV thường được sử dụng<br /> trong các nghiên cứu dịch tễ học phân tử(3). Kết<br /> quả khảo sát sự biến động di truyền DENV gây<br /> bệnh SXHD trên cả 4 týp DENV phân lập ở khu<br /> vực phía nam Việt Nam từ 2001 đến 2010(7) đã dự<br /> đoán sự gia tăng nhanh của DENV-4 so với các<br /> týp DENV còn lại trong giai đoạn sắp tới. Vì thế,<br /> việc nghiên cứu dịch tễ học phân tử các DENV-4<br /> trong mùa dịch SXHD năm 2011 là cần thiết.<br /> <br /> Vật liệu nghiên cứu<br /> <br /> Mục tiêu nghiên cứu<br /> Xác định tỷ lệ tiến triển di truyền của DENV-4<br /> lưu hành ở khu vực phía Nam Việt Nam năm<br /> 2011.<br /> <br /> 192<br /> <br /> 21 chủng DENV-4 nghiên cứu được phân lập<br /> từ bệnh phẩm bệnh nhân SXHD ở khu vực phía<br /> Nam Việt Nam trong năm 2011 (bảng 1), lưu trữ<br /> tại phòng thí nghiệm Arbovirus – viện Pasteur<br /> thành phố Hồ Chí Minh trong khuôn khổ hoạt<br /> động giám sát virus-huyết thanh học bệnh SXHD<br /> thường xuyên của Dự án phòng chống các bệnh<br /> lây nhiễm – thành phần phòng chống Sốt xuất<br /> huyết khu vực phía Nam. 39 trình tự gen vỏ của<br /> các DENV-4 phân lập từ khu vực và trên thế giới<br /> thu thập từ GenBank được đưa vào phân tích so<br /> sánh di truyền (Phụ lục 1).<br /> Bảng 1: Danh sách các chủng DENV-4 nghiên cứu ở<br /> khu vực phía Nam năm 2011 (đang đăng ký trên<br /> GenBank)<br /> TT<br /> 1<br /> 2<br /> 3<br /> 4<br /> 5<br /> 6<br /> 7<br /> 8<br /> 9<br /> 10<br /> 11<br /> TT<br /> 12<br /> 13<br /> 14<br /> 15<br /> <br /> Tên chủng<br /> ST-1855-11<br /> CT-2712-11<br /> CT-2714-11<br /> DT-2723-11<br /> KG-2794-11<br /> AG-2864-11<br /> BL-2904-11<br /> KG-2917-11<br /> DN-3253-11<br /> VT-3540-11<br /> DT-3576-11<br /> Tên chủng<br /> AG-3537-11<br /> ST-3664-11<br /> BD-3831-11<br /> SG-3847-11<br /> <br /> Thời gian<br /> 06/2011<br /> 07/2011<br /> 07/2011<br /> 07/2011<br /> 07/2011<br /> 07/2011<br /> 08/2011<br /> 08/2011<br /> 08/2011<br /> 08/2011<br /> 08/2011<br /> Thời gian<br /> 09/2011<br /> 09/2011<br /> 09/2011<br /> 09/2011<br /> <br /> Địa phương<br /> Sóc Trăng<br /> Cần Thơ<br /> Cần Thơ<br /> Đồng Tháp<br /> Kiên Giang<br /> An Giang<br /> Bạc Liêu<br /> Kiên Giang<br /> Đồng Nai<br /> Vũng Tàu<br /> Đồng Tháp<br /> Địa phương<br /> An Giang<br /> Sóc Trăng<br /> Bình Dương<br /> TP.HCM<br /> <br /> Chuyên Đề Nhi Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 2 * 2012<br /> TT<br /> 16<br /> 17<br /> 18<br /> 19<br /> 20<br /> 21<br /> <br /> Tên chủng<br /> CM-3870-11<br /> LA-3890-11<br /> BL-3893-11<br /> TG-3894-11<br /> BT-3976-11<br /> VL-4397-11<br /> <br /> Thời gian<br /> 09/2011<br /> 09/2011<br /> 09/2011<br /> 09/2011<br /> 09/2011<br /> 10/2011<br /> <br /> Địa phương<br /> Cà Mau<br /> Long An<br /> Bạc Liêu<br /> Tiền Giang<br /> Bến Tre<br /> Vĩnh Long<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Bioedit and Blast (NCBI). Phương pháp<br /> Maximum Likelihood được dùng để xây dựng<br /> cây phả hệ với phân tích bootstrap của 100 bản<br /> sao(6). Tốc độ tiến hóa và phân tích dự đoán xu<br /> hướng tiến hóa được xác định bằng phần mềm<br /> PAML 4.4 và BEAST v1.6.1(4,9,10).<br /> <br /> Phương pháp nghiên cứu<br /> <br /> KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU.<br /> <br /> Xác định týp DENV-4 bằng nuôi cấy tế bào và<br /> miễn dịch huỳnh quang với kháng thể đơn<br /> dòng đặc hiệu týp.<br /> DENV-4 được phân lập trên nuôi tế bào muỗi<br /> Aedes albopictus dòng C6/36 trong môi trường<br /> Eagle’s MEM (= Minimum Essential Medium) bổ<br /> sung 2% huyết thanh bào thai bê và các acid<br /> amine không thiết yếu, ủ ở 28ºC trong 7 ngày và<br /> định danh týp huyết thanh bằng phương pháp<br /> miễn dịch huỳnh quang gián tiếp với kháng thể<br /> đơn dòng đặc hiệu týp(2).<br /> <br /> So sánh trình tự nucleotide và xác định<br /> genotype các DENV-4 ở khu vực phía Nam<br /> Việt Nam năm 2011.<br /> <br /> Giải trình tự nucleotide và phân tích so sánh<br /> di truyền<br /> Sau đó, toàn bộ vùng gen E được giải trình tự.<br /> Sản phẩm PCR được tinh chế và trình tự<br /> nucleotide được xác định bằng bộ sinh phẩm Big<br /> Dye Terminator Cycle Sequencing Reaction và<br /> máy xác định trình tự tự động ABI 310 (Applied<br /> Biosystems). Các trình tự gen E của DENV-4<br /> nghiên cứu đang được đăng ký trên GenBank.<br /> Phân tích so sánh chuỗi trình tự nucleotide<br /> bằng phần mềm MEGA5, CLC Workbench,<br /> <br /> Chuyên Đề Nhi Khoa<br /> <br /> Bảng 2: Kết quả so sánh trình tự nucleotide vùng<br /> gen E của các DENV-4 Việt Nam<br /> CHỦNG NGHIÊN<br /> CỨU<br /> <br /> Chiết xuất ARN của chủng DENV-4 và khuếch<br /> đại vùng gen vỏ bằng RT-PCR.<br /> ARN của DENV-4 được chiết xuất từ hỗn dịch<br /> nước nổi tế bào gây nhiễm DENV-4 và từ huyết<br /> thanh bệnh nhân bằng kít Qiagen (QIAampR<br /> Viral RNA Mini Kit) và khuếch đại vùng gen vỏ<br /> E bằng RT-PCR với mồi tương ứng(7).<br /> <br /> Trình tự gen vỏ E của 60 DENV phân lập từ<br /> người và động vật linh trưởng được phân tích di<br /> truyền và xác định sự khác biệt trình tự<br /> nucleotide.<br /> <br /> CHỦNG<br /> GENOTYPE<br /> CHỦNG<br /> DENV-4<br /> DENV-4<br /> #<br /> (2000I*<br /> II<br /> III<br /> IV<br /> DEN 2011<br /> 2010)<br /> -4<br /> 0.1-4.2 1.6- 8.1- 10.5- 15.70.1-4.9<br /> 7.9 11.5 12.2 17.7<br /> <br /> Kết quả so sánh được thể hiện bằng phần<br /> trăm khác biệt giữa các trình tự nu. #: các<br /> genotype của DENV-4 được phân theo thứ tự<br /> sau: I, II, III và IV (gồm các chủng phân lập trên<br /> động vật linh trưởng); * sự biến động di truyền gia<br /> tăng trên 6% chủ yếu ở các chủng thu thập ở Mã<br /> Lai, Sri Lanka, Ấn Độ và Philippines, còn lại toàn<br /> bộ các chủng trong khu vực Đông Nam Á đều có<br /> ngưỡng dưới 6%.<br /> Theo quy chuẩn phân loại genotype của<br /> Rico-Hesse, các genotype được xác định dựa trên<br /> sự khác biệt về trình tự nucleotide với giá trị<br /> ngưỡng 6%, nghĩa là trình tự nucleotide của các<br /> DENV-4 thuộc cùng genotype có mức độ khác<br /> biệt với nhau < 6%.<br /> <br /> 193<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 2 * 2012<br /> <br /> Hình 1: Phân tích so sánh trình tự nucleotide vùng gen E (1,479 Kbp) của các DENV-4<br /> 1956-1978) lại có độ sai biệt lớn hơn 6%. Đồng<br /> Kết quả phân tích di truyền phả hệ các chủng<br /> thời, nhằm mô hình hóa và xác định rõ hơn mối<br /> DENV-4 theo phương pháp Maximum<br /> quan hệ di truyền giữa các DENV-4 nghiên cứu,<br /> Likelihood dựa trên toàn bộ trình tự vùng gen E.<br /> phân tích di truyền phả hệ đã được tiến hành dựa<br /> Số ghi ở nút cuối mỗi nhánh biểu hiện phần trăm<br /> trên phương pháp ML.<br /> kết quả lặp lại với độ tin cậy Bootstrap 100, chiều<br /> dài mỗi nhánh biểu hiện ở dạng thập phân, chỉ<br /> biểu hiện bootstrap >70%. Các chủng sử dụng để<br /> so sánh đều được tham chiếu trên GenBank (bảng<br /> 1). : các chủng DENV-4 Việt Nam trong nghiên<br /> cứu (hiện đang đăng ký GenBank).<br /> Kết quả so sánh cho thấy các chủng DENV-4<br /> lưu hành ở khu vực phía nam Việt Nam năm<br /> 2011 trong nghiên cứu được xác định thuộc về<br /> genotype I (bảng 2 và hình 1). Trong khi đó, các<br /> chủng DENV-4 ở khu vực Châu Á (như Ấn Độ,<br /> Sri Lanka, Mã Lai và Philippines trong giai đoạn<br /> <br /> 194<br /> <br /> Kết quả phân tích tốc độ tiến hóa dựa trên<br /> vùng gen E của các DENV-4 Việt Nam trong<br /> thời gian 2001-2011.<br /> Tổng số 83 trình tự vùng gen E của các chủng<br /> DENV-4 phân lập từ người ở 12 quốc gia trong<br /> khoảng thời gian 55 năm được đưa vào phân tích<br /> nhằm khảo sát sự biến động di truyền của các<br /> DENV-4 lưu hành ở khu vực phía Nam Việt<br /> Nam trong suốt khoảng thời 2001-2011 (Phụ lục<br /> 1). Tốc độ tiến hóa được xác định dựa trên phần<br /> mềm PAML 4.4, sau đó được xác nhận lại bằng<br /> <br /> Chuyên Đề Nhi Khoa<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 16 * Phụ bản của Số 2 * 2012<br /> phần mềm BEASTv 1.6.1 theo phương pháp<br /> Bayesian<br /> Markov chain Monte Carlo<br /> (MCMC)(10). Nhằm đảm bảo độ tin cậy của kết quả<br /> phân tích, các giả thuyết về đồng hồ phân tử và<br /> tính bão hòa của các trình tự được đưa vào trong<br /> phân tích đều được xác định lại với các phần mềm<br /> như MEGA5, DAMBE(4,9). Kết quả phân tích được<br /> trình bày cụ thể ở bảng 3.<br /> Bảng 3: Kết quả phân tích tốc độ tiến hóa và kiểm tra<br /> giả thuyết đồng hồ phân tử.<br /> SEROTYPE<br /> DEN-4<br /> <br /> Tổ tiên Tốc độ tiến Mô hình Giả thuyết<br /> gần nhất<br /> hóa<br /> tiến hóa đồng hồ<br /> 1953<br /> 12,7x10-4<br /> (1951-4 TN93 +G Strick clock<br /> ± 1,01x10<br /> 1955)<br /> <br /> Tốc độ tiến hóa được xác định theo đơn vị<br /> thay đổi/vị trí/năm<br /> <br /> BÀN LUẬN<br /> Theo kết quả phân tích genotype trên cây di<br /> truyền phả hệ, các chủng DENV-4 lưu hành ở<br /> khu vực phía Nam Việt Nam năm 2011 đều tập<br /> trung vào một nhóm chung với các chủng<br /> DENV-4 đại diện cho khu vực Đông Nam Á. Kết<br /> quả phân tích genotype của các chủng DENV-4<br /> Việt Nam đều thuộc genotype 1, phù hợp với kết<br /> quả đã công bố ở những công trình nghiên cứu<br /> trước(7) và cho thấy sự tương quan rõ rệt về mặt<br /> thời gian. Riêng các chủng DENV-4 lưu hành ở<br /> khu vực phía Nam Việt Nam, mặc dù thuộc cùng<br /> genotype 1 nhưng đã cho thấy xu hướng chia<br /> làm hai cụm riêng biệt, cụm 1 bao gồm các chủng<br /> phân lập từ 1990 đến 1997; và cụm 2 gồm các<br /> chủng còn lại phân lập từ 1998 đến 2011 (hình 1).<br /> Ngoài ra, kết quả còn gợi ý sự tương quan giữa<br /> khác biệt di truyền và phân bố địa lý. Việt Nam<br /> gần với Thái Lan nên có tỷ lệ khác biệt tương đối<br /> thấp (< 6%, trung bình là 3,563%), trong khi đó tỷ<br /> lệ khác biệt đã gia tăng (5,8%-7,9%) đối với chủng<br /> ở Srilanka, Mã Lai và Ấn độ.<br /> Phân tích sâu hơn trong nhóm genotype I<br /> cho thấy có sự phân hoá thành hai nhóm riêng<br /> biệt: nhóm 1 gồm các chủng của Việt Nam và<br /> Thái Lan; nhóm 2 gồm các chủng của Ấn Độ, Mã<br /> Lai, Sri Lanka. Điều này gợi ý sự tiến hoá phân<br /> kỳ mạnh mẽ trong các các chủng DENV-4 thuộc<br /> <br /> Chuyên Đề Nhi Khoa<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> genotype I theo trục địa lý từ Tây sang Đông ở<br /> khu vực Ấn độ dương, có khả năng xuất hiện<br /> genotype mới ở khu vực Châu Á trong tương lai.<br /> Xu hướng tiến hóa này của các chủng DENV4 ở khu vực phía Nam Việt Nam được xác định rõ<br /> hơn trong phân tích về tốc độ tiến hóa. Việc xác<br /> đinh xu hướng tiến hóa và tốc độ tiến hóa hoàn<br /> toàn phụ thuộc vào giả thuyết đồng hồ phân tử<br /> (molecular clock). Nói một cách khác đế xác đinh<br /> được tốc độ tiến hóa phải bảo đảm được rằng tất cả<br /> các chủng loài đưa vào phân tích phải có cùng<br /> một tốc độ tiến hóa. Đây chính là giả thuyết của<br /> đồng hồ phân tử. Điều này hầu như là không thể<br /> xảy ra trong tự nhiên nhất là khi quan sát trên<br /> các loài sinh vật bậc cao trong một khoảng thời<br /> gian dài. Trong trường hợp đối tượng nghiên cứu<br /> là virus với thời gian nghiên cứu tương đối ngắn<br /> thì ước lượng đồng hồ phân tử sẽ chính xác hơn.<br /> Tuy nhiên, nhằm bảo đảm độ tin cậy của phân<br /> tích, giả thuyết đồng hồ phân tử cần được kiểm<br /> chứng lại bằng các công cụ thống kê. Trong<br /> khuôn khổ nghiên cứu này, Likelihood ratio test<br /> (LRT) được sử dụng như một công cụ kiểm chứng.<br /> Test LRT dựa trên sự so sánh xác xuất<br /> “Likelihood” giữa hai giả thuyết H0 “tốc độ tiến<br /> hóa giữa các chủng nghiên cứu là như nhau” và<br /> H1 “tốc độ tiến hóa giữa các chủng nghiên cứu là<br /> khác nhau”. Dựa trên kết quả nghiên cứu trước<br /> đây, các chủng DENV-4 được xác định có xu<br /> hướng tiến hóa nhanh nhất trong 4 serotype là<br /> 12,7x10-4 ± 1,01x10-4 (hình 2), phù hợp với kết quả<br /> phân tích của nghiên cứu trước đó(7).<br /> Đồ thị được xây dựng bằng phân tích tuyến<br /> tính trên phần mềm Micro-Origin 6.0, với hệ số<br /> tuyến tính R2 với p-value là xác suất xu hướng<br /> tuyến tính xảy ra một các ngẫu nhiên.<br /> Hơn nữa, kết quả nghiên cứu cho thấy sự<br /> tương đồng cao với nghiên cứu DENV-4 trước đó<br /> ở Thái Lan trong 30 năm (1976-2002) với 109<br /> chủng(1) có tốc độ tiến hóa là 10,7x10-4 ± 2,46x10-4.<br /> Đây là tỷ lệ tiến hóa nhanh nhất của genotype 1 ở<br /> các chủng DENV-4 từng được xác định, cao hơn<br /> gần 35% so với nghiên cứu của Lanciotti(5) năm<br /> 1997 là 8,3x10-4. Điều này được giải thích dựa trên<br /> <br /> 195<br /> <br />