Hoạt hóa và di chuyển của tế bào gốc tủy răng người: Vai trò trong lành tổn thương tủy răng

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> HOẠT HÓA VÀ DI CHUYỂN CỦA TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI:<br /> VAI TRÒ TRONG LÀNH TỔN THƯƠNG TỦY RĂNG<br /> Trần Hùng Lâm*, Odile Téclès**, Mathieu Sylvie**, About Imad**<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Nhiều nghiên cứu đã chứng minh có sự hiện diện của tế bào gốc/chưa biệt hóa trong tủy răng. Tuy nhiên<br /> còn ít nghiên cứu về vị trí của những tế bào này trong tủy răng cũng như sự hoạt hóa và di chuyển của chúng<br /> để đáp ứng với tổn thương tủy.<br /> Mục tiêu của nghiên cứu này nhằm chứng tỏ sự hoạt hóa và di chuyển của dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa sử<br /> dụng mô hình nuôi cấy răng người. Bên cạnh đó, chúng tôi cũng đánh giá vai trò của nguyên bào sợi tủy răng<br /> khi bị tổn thương trong tân tạo mạch máu, một quá trình diễn ra sớm trong lành thương của tủy răng và có thể<br /> cần thiết cho sự di chuyển của tế bào chưa biệt hóa.<br /> Kết quả: Qua mô hình nuôi cấy răng in vitro, nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy tổn thương tủy răng<br /> đã kích thích sự tăng sinh và di chuyển của tế bào gốc/chưa biệt hóa ở vùng xung quanh mạch máu đến vùng tổn<br /> thương tủy. Khi bị tổn thương, nguyên bào sợi tủy răng tiết ra các yếu tố tăng trưởng mạch máu giúp tủy lành<br /> thương hoàn toàn.<br /> Kết luận: Tân tạo mạch máu có thể cần thiết cho các tế bào gốc/chưa biệt hóa di chuyển đến vùng có sang<br /> thương.<br /> Từ khóa: tế bào gốc/chưa biệt hóa, tủy răng, tổn thuơng tủy, tân tạo mạch máu.<br /> <br /> ABSTRACT<br /> ACTIVATION AND MIGRATION OF HUMAN DENTAL PULP STEM CELLS: ROLE IN DENTAL<br /> PULP HEALING<br /> Tran Hung Lam, Odile Téclès, Mathieu Sylvie, About Imad<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 2 - 2011: 63 - 68<br /> Several lines of evidence strongly suggest the presence of resting progenitor/stem cells in the dental pulp.<br /> However, little is known about activation and migration of these cells in response to pulp injury.<br /> The objective of this work was to investigate the activation and migration of these progenitor/stem cells in<br /> response to pulp injury in their tissue of origin. Besides, we also evaluated the role of pulp fibroblasts in<br /> angiogenesis, an early step of pulp healing and may be necessary for migration of progenitor cells.<br /> Results: Using a tooth culture model, our study demonstrated that pulp injury stimulated the proliferation<br /> and migration of perivascular progenitor/stem cells to injury site. After pulp amputation, pulp fibroblasts<br /> secreted angiogenic factors helping a complete pulp healing. Conclusion: Angiogenesis may be necessary for<br /> migration of progenitor/stem cells.<br /> Key words: progenitor/stem cells, dental pulp, pulp injury, angiogenesis.<br /> thương do bệnh lý hay điều trị, ngà phản ứng<br /> MỞ ĐẦU<br /> hoặc<br /> ngà sửa chữa có thể được thành lập tùy<br /> Trong nha khoa phục hồi, khi có những tổn<br /> <br /> *: Khoa Răng Hàm Mặt, Đại học Y Dược Tp Hồ Chí Minh<br /> **: Laboratoire IMEB, Khoa Nha, Đại học Méditerranée, Cộng hòa Pháp<br /> Tác giả liên lạc: TS. Trần Hùng Lâm ĐT. 0907773375, Email: drtranhunglam@gmail.com<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> 63<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> <br /> thuộc vào thể tích của tủy răng (Smith và cs,<br /> 1995; Tziafas và cs, 2000)(4,7). Sự hình thành này<br /> giúp giới hạn những thương tổn gây ra bên<br /> trong răng. Những nguyên bào ngà có thể sống<br /> sót khi sang thương sâu răng nhẹ, chúng sẽ tiết<br /> ra lớp ngà phản ứng. Trái lại, khi sang thương<br /> lớn và lớp nguyên bào ngà bị phá hủy, chúng sẽ<br /> được thay thế bởi một dòng tế bào mới nguồn<br /> gốc tủy răng: nguyên bào ngà thế hệ thứ 2 chế<br /> tiết ra lớp ngà sửa chữa. Nhiều nghiên cứu đã<br /> chứng minh nguyên bào ngà thế hệ thứ 2 được<br /> biệt hóa từ dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa hiện<br /> diện trong tủy răng (About và cs, 2000; Gronthos<br /> và cs, 2000)(1,2). Tuy nhiên còn ít nghiên cứu về vị<br /> trí của những tế bào gốc này trong tủy răng<br /> cũng như sự hoạt hóa và di chuyển của chúng<br /> để đáp ứng với tổn thương tủy(3). Mục tiêu của<br /> nghiên cứu này nhằm chứng tỏ sự hoạt hóa và<br /> di chuyển của dòng tế bào gốc/chưa biệt hóa sử<br /> dụng mô hình nuôi cấy răng người. Bên cạnh<br /> đó, chúng tôi cũng đánh giá vai trò của nguyên<br /> bào sợi tủy răng khi bị tổn thương trong tân tạo<br /> mạch máu, một quá trình diễn ra sớm trong lành<br /> thương của tủy răng và có thể cần thiết cho sự di<br /> chuyển của tế bào chưa biệt hóa.<br /> <br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Nghiên cứu được thực hiện tại la bô IMEB,<br /> Khoa Nha, Đại học Méditerranée, Cộng hòa<br /> Pháp từ tháng 09-2004 đến 09-2006.<br /> Răng cối thu nhận từ bệnh nhân có điều trị<br /> chỉnh nha (có sự đồng ý của bệnh nhân hay cha<br /> mẹ nếu bệnh nhân dưới 18 tuổi và phù hợp với<br /> luật pháp của Cộng hòa Pháp) được sử dụng để<br /> nghiên cứu sự hoạt hóa và di chuyển của tế bào<br /> gốc chưa biệt hóa sau khi tạo sang thương vào<br /> tủy răng.<br /> Răng nhổ được đem trực tiếp đến la bô<br /> nghiên cứu trong môi trường MEM (minimum<br /> essential medium) có thêm 300UI/ml penicillin,<br /> 300<br /> g/ml<br /> streptomycin,<br /> 0.75<br /> g/ml<br /> amphotericin B. Răng được rửa sạch với dụng<br /> cụ vô trùng sau khi đã loại bỏ dây chằng nha<br /> chu và bao mầm răng. Sang thương tủy răng<br /> được sửa soạn với mũi khoan kim cương<br /> <br /> 64<br /> <br /> (đường kính 016) và tay khoan siêu tốc (300 000<br /> vòng/phút) dưới nước bơm rửa vô trùng lạnh.<br /> Răng không có tạo xoang và tạo xoang vào ngà<br /> (không có tổn thương tủy) được sử dụng làm<br /> nhóm chứng cho nghiên cứu tăng sinh tế bào.<br /> Răng được nuôi cấy trong hộp nuôi cấy 4 lỗ<br /> (Nonclon, Nunc, Roskilde, Đan Mạch). Phần<br /> thân răng cố định trên một sợi kẽm, phần chóp<br /> ngập trong dung dịch nuôi cấy nhưng không<br /> chạm đáy hộp nuôi cấy. Môi trường nuôi cấy là<br /> MEM có thêm 10% huyết thanh phôi bò,<br /> 200UI/ml penicillin, 200 g/ml streptomycin, 0.5<br /> g/ml amphotericin B. Để khảo sát sự tăng sinh<br /> tế bào, răng được nuôi trong môi trường MEM<br /> có chứa BrdU (1mg/ml) trong 1 ngày. Sau đó, để<br /> kiểm tra sự di chuyển tế bào, răng được nuôi cấy<br /> trong môi trường có BrdU trong 1 ngày, sau đó,<br /> tiếp tục nuôi trong cùng môi trường nhưng<br /> không có BrdU trong 1 ngày, 2 tuần và 4 tuần.<br /> <br /> Khảo sát mô học và hóa mô miễn dịch<br /> Sau giai đoạn nuôi cấy, răng được cố định<br /> trong dung dịch formol 4% và khử khoáng trong<br /> dung dịch gồm sodium formiate 3,4% và acid<br /> formic 17% đến khi khử khoáng hoàn toàn cho<br /> xử lý mô học. Các răng được xử lý qua cồn và<br /> xylene và cuối cùng được nhúng trong sáp<br /> paraffin.<br /> Hóa mô miễn dịch thực hiện trên các lớp cắt<br /> bề dày 7m với kháng thể đơn dòng anti-BrdU.<br /> Nhuộm máu với kit streptavidine-biotin (LSAB,<br /> Dako Corp, CA) theo hướng dẫn của nhà sản<br /> xuất. Mẫu chứng không có kháng thể nguyên<br /> phát đều âm tính.<br /> <br /> Phương pháp đánh giá vai trò của nguyên<br /> bào sợi trong tân tạo mạch máu<br /> Nguyên bào sợi tủy răng được lấy từ các<br /> răng cối lớn thứ ba như đã mô tả trước đây<br /> (About và cs., 2000)(1). Sau khi nhổ, răng được<br /> rửa sạch và loại bỏ phần chóp. Tủy răng được<br /> cắt thành những mảnh nhỏ và nuôi trong đĩa<br /> nuôi cấy có đường kính 100mm (Becton<br /> Dickison Labware, NJ, USA). Khi hộp đầy tế<br /> bào, thực hiện chọn lọc tế bào với men<br /> <br /> Chuyên Đề Răng Hàm Mặt<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 2 * 2011<br /> Trypsine/EDTA. Tế bào được nuôi cấy trong<br /> môi trường có trộn thêm huyết thanh phôi bò<br /> nồng độ 10%, 2mM glutamine, 100UI/ml<br /> penicillin/streptomycine<br /> và<br /> 0,25<br /> μg/ml<br /> amphotericin B. Tế bào nội mô tĩnh mạch rốn<br /> của người nuôi trong môi trường chuyên biệt<br /> cung cấp bởi nhà sản xuất. Tủ nuôi cấy tế bào có<br /> nồng độ CO2 là 5%. Môi trường nuôi cấy được<br /> thay hằng ngày.<br /> Nguyên bào sợi được nuôi trong môi trường<br /> EGM. Các tổn thương nguyên bào sợi được thực<br /> hiện trực tiếp với dao mổ vô trùng trên đĩa nuôi<br /> cấy. Sau 5 giờ tiếp xúc với nguyên bào sợi bị tổn<br /> thương, môi trường này được sử dụng để nuôi<br /> tế bào nội mô trên khung ngoại bào Matrigel.<br /> Môi trường nuôi cấy không có tiếp xúc với<br /> nguyên bào sợi được sử dụng làm nhóm chứng.<br /> Sau 24 giờ, sự thành lập cấu trúc dạng ống của<br /> tế bào nội mô được đánh giá định lượng bằng<br /> cách đo chu vi của cấu trúc dạng ống thành lập<br /> trên các ảnh chụp từ kính hiển vi. Mỗi nhóm<br /> chọn 30 quang trường một cách ngẫu nhiên để<br /> thực hiện đo đạc. Chu vi cấu trúc dạng ống được<br /> phân tích với phần mềm Scion Image (Scion<br /> Corporation, Frederick, MD, USA).<br /> <br /> Thí nghiệm trung hòa các yếu tố tăng<br /> trưởng mạch máu<br /> Hai kháng thể trung hòa có nồng độ<br /> 20μg/ml (R&D Systems, Lille, France) được sử<br /> dụng là anti-VEGF và anti-FGF-2. Kháng thể<br /> trung hòa được thêm vào trong môi trường nuôi<br /> cấy có tiếp xúc với nguyên bào sợi tổn thương.<br /> Môi trường này sau đó được sử dụng để nuôi tế<br /> bào nội mô và đánh giá chu vi cấu trúc dạng ống<br /> của tế bào nội mô như mô tả trên đây.<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> KẾT QUẢ<br /> Sự tăng sinh tế bào gốc/chưa biệt hóa<br /> Sau khi tạo sang thương vào tủy và nuôi cấy<br /> với BrdU trong một ngày, nhuộm màu tập trung<br /> ở nhân tế bào vùng quanh mao mạch. Hóa mô<br /> miễn dịch sử dụng kháng thể anti-BrdU biểu<br /> hiện một thang độ: nhuộm màu BrdU rất đậm ở<br /> mạch máu bao quanh tổn thương và giảm khi xa<br /> khỏi tổn thương (hình 1).<br /> <br /> Hình 1: Tế bào gốc tăng sinh biểu hiện một thang độ<br /> sau khi tạo sang thương vào tủy răng. Sau một ngày<br /> nuôi cấy với BrdU, nhuộm màu tập trung ở nhân tế<br /> bào vùng quanh mao mạch. Nhuộm màu đậm ở mao<br /> mạch quanh sang thương (B và C) và giảm khi xa<br /> sang thương (B và D). Chú thích: c: xoang sang<br /> thương; d: ngà; p: tủy, mũi tên chỉ mạch máu. Thanh<br /> thước đo ở hình A: 1mm; hình B: 100 m; hình C và<br /> D: 50m.<br /> <br /> Sự di chuyển của tế bào gốc/chưa biệt hóa<br /> <br /> Phân tích thống kê<br /> <br /> Sau khi nuôi cấy hai tuần, nhuộm màu tế<br /> bào tách biệt khỏi mạch máu và ở gần vùng<br /> tổn thương. Tại thời điểm 4 tuần, nhuộm màu<br /> miễn dịch chỉ còn được thấy ở vùng tổn<br /> thương (hình 2).<br /> <br /> Tất cả các thí nghiệm đều được lặp lại 3 lần.<br /> Test phi tuyến tính Mann-Whitney được sử<br /> dụng để kiểm định các giả thuyết, sự khác biệt<br /> có ý nghĩa thống kê khi giá trị p