Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
Nghiên cứu Y học
70
KHẢO SÁT BẤT THƯỜNG DI TRUYỀN GEN PROC
TRONG BỆNH LÝ HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH
Lê Gia Hoàng Linh*, Phạm Văn Dũng**, Nguyễn Hoài Nam***, Nguyễn Huỳnh Minh Quân*,
Mai Phương Thảo****, Hoàng Anh Vũ*, Đỗ Đức Minh*
TÓM TẮT
Mục tiêu: Huyết khối tĩnh mạch (HKTM) là một trong những bệnh lý tim mạch phổ biến với nguyên nhân
đa dạng, trong đó di truyền đóng một vai trò quan trọng. Hiện tại các công cụ khảo sát di truyền trong bệnh lý
HKTM vẫn còn hạn chế. Thông qua nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành xây dựng quy trình giải trình tự gen
PROC, một tác nhân di truyền quan trọng trong bệnh lý HKTM ở người châu Á.
Đối tượng và phương pháp: Nghiên cứu tiến hành mô tả loạt ca trên 10 đối tượng được chẩn đoán
HKTM. Các đối tượng tham gia nghiên cứu được giải trình tự toàn bộ các exon mã hoá và vùng intron lân cận
của gen PROC.
Kết quả: Chúng tôi đã khuếch đại và giải trình tự thành công gen PROC của 10 đối tượng tham gia nghiên
cứu. Chúng tôi phát hiện 2 biến thể trên gen PROC của 3 trong 10 đối tượng tham gia nghiên cứu bao gồm
c.565C>T và c.323A>C. Trong đó một biến thể đã được báo cáo là biến thể gây bệnh, còn một biến thể là các biến
thể di truyền lần đầu được mô tả.
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình giải trình tự gen PROC nhằm xác định các bất
thường di truyền có liên quan trong bệnh lý huyết khối tĩnh mạch.
Từ khóa: huyết khối tĩnh mạch, gen PROC, đột biến
ABSTRACT
GENETIC EXAMINATION OF PROC GENE IN PATIENTS DIAGNOSED WITH VENOUS
THROMBOSIS
Le Gia Hoang Linh, Pham Van Dung, Nguyen Hoai Nam, Nguyen Huynh Minh Quan,
Mai Phuong Thao, Hoang Anh Vu, Do Duc Minh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 4 - 2020: 70 - 75
Objectives: Venous thrombosis is a common cardiovascular disorder with distinct aetiologies in which
genetic factor play an important role. Currently, methods used for investigating genetic abnormalities in venous
thrombosis are inadequate. The aim of this study was to develop a direct sequencing method of PROC gene, an
critical genetic factor in venous thrombosis in Asian population.
Methods: In this case serie report, all coding exons and flanking intron regions of PROC gene were
sequenced in 10 patients diagnosed with venous thrombosis.
Results: PROC gene was sucessfully sequenced in 10 patients diagnose with venous thrombosis. Two
variants were identified in three patients including c.565C>T and c.323A>C. Among these variants, one has been
reported pathogenic and the other is novel.
*Trung tâm Y sinh học phân tử, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh
**Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất Đồng Nai
***Bộ môn Phẫu thuật lồng ngực tim mạch, Khoa Y, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh
****Bộ môn Sinh lý-Sinh lý bệnh-Miễn dịch, Khoa Y, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Đức Minh ĐT: 0932999989 Email: ducminh@ump.edu.vn
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
71
Conclusion: A procedure for direct sequencing of PROC gene was developed successfully.
Keywords: venous thrombosis, PROC gene, mutation
ĐẶT VẤN ĐỀ
Huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS - Deep
venous thrombosis) và thuyên tắc động mạch
phổi, gọi tắt là thuyên tắc phổi (TTP - Pulmonary
embolism) được xem là hai biểu hiện cấp tính có
chung một quá trình bệnh lý, gọi chung là
thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch (TTHKTM -
Venous thromboembolism)(1). TTHKTM là một
trong những bệnh lý y khoa vô cùng phổ biến, là
một trong ba bệnh lý tim mạch chủ yếu, bên
cạnh nhồi máu cơ tim và đột quỵ, với tử suất
cũng như chi phí y tế hàng năm rất lớn. Mỗi
năm tại Hoa Kỳ có khoảng 300.000 – 600.000 ca
bệnh TTHKTM, với tỉ lệ tử vong dao động trong
khoảng 10-30% tùy theo hình thái lâm sàng là
HKTMS hay TTP(2). Tại Châu Âu, tần suất mới
mắc TTHKTM hàng năm theo các nghiên cứu
dịch tễ là 104-108/100.000 dân - gần tương đương
với tần suất mới mắc của nhồi máu cơ tim, với tỉ
lệ tái phát rất cao, khoảng 30% số bệnh nhân sẽ
tái phát TTHKTM trong vòng 10 năm sau đó(3).
Tại Việt Nam, cũng có nhiều nghiên cứu cho
thấy TTHKTM là một bệnh lý vô cùng phổ biến.
Tỉ lệ HKTMS chưa có triệu chứng trên bệnh
nhân nội khoa nhập viện là 28%(4). Tỉ lệ tử vong
của TTP trong một nghiên cứu ở nước ta là
17.9%, trong đó có đến 36.4% có HKTMS trước
đó(1). Có nhiều nguyên nhân gây ra HKTM và
các nguyên nhân này thường kết hợp với nhau,
trong đó, các nguyên nhân này được chia thành
2 nhóm chính là mắc phải (bệnh lý, dùng
thuốc…) và di truyền (bất thường cấu trúc giải
phẫu, đột biến gen dẫn đến thay đổi về số lượng
cũng như chất lượng của các thành phần tham
gia quá trình đông máu…).
Các bất thường di truyền liên quan đến
bệnh lý HKTM được chia làm 3 nhóm chính là
các bất thường nguy cơ cao, nguy cơ trung
bình và nguy cơ thấp. Bất thường nguy cơ cao
do khiếm khuyết các yếu tố ức chế quá trình
đông máu như antithrombin, protein C và
protein S. Bất thường nguy cơ trung bình liên
quan đến yếu tố V Leiden, biến thể
Prothrombin 20210A và biến thể Fibrinogen
gamma 10034T; còn lại các yếu tố nguy cơ thấp
liên quan đến các gen MTHFR và gen mã hóa
cho yếu tố VIII(5). Trong các bất thường di
truyền này, yếu tố V Leiden và biến thể
Prothrombin 20210A là phổ biến nhất ở người
da trắng(6). Gần đây, Hoàng Anh Vũ đã chỉ ra
rằng tần suất mang alen đột biến của yếu tố V
Leiden trên dân số nghiên cứu tại Việt Nam là
0/520(7). Từ các kết quả trên, có thể thấy rằng
yếu tố V Leiden không phải là nguyên nhân di
truyền chính trên nhóm bệnh nhân HKTM
Việt Nam. Ở nhóm bệnh nhân HKTM Nhật
Bản và Hàn Quốc, bất thường di truyền nhiều
nhất liên quan đến protein C và protein S, các
yếu tố kháng đông tự nhiên được sản xuất tại
gan(8–10). Protein C, được mã hóa từ gen PROC,
là một enzyme serine protease tiền thân của
protein C hoạt hóa (APC). Protein C được hoạt
hóa nhờ thrombin xảy ra tại bề mặt màng
trong của tế bào và cần sự tham gia của
thrombomodulin và endothelial protein C
receptor (EPCR). Sự hoạt hóa in vivo của
protein C được tăng lên 20 lần khi protein C
gắn vào thụ thể EPCR. Cùng với sự tham gia
của protein S (như là một cofactor),
phospholipid và calcium, APC bất hoạt các
yếu tố Va và VIIIa bằng cách cắt các phân tử
này tại các vị trí amino acid arginine đặc hiệu.
Suy giảm chức năng protein C thường do đột
biến gene PROC ở trạng thái dị hợp tử và các
đột biến gene PROC được báo cáo nằm rải rác
trên toàn bộ chiều dài gene. Trên nhóm người
Châu Á, đột biến gen PROC chiếm tỷ lệ khá
cao ở các bệnh nhân HKTM do nguyên nhân
di truyền, lên đến 50,7% ở dân số Hàn Quốc(8)
và 9% ở dân số Nhật Bản(9).
Thông qua nghiên cứu này, chúng tôi muốn
tiến hành xây dựng quy trình giải trình tự trực
tiếp gen PROC để từ đó cung cấp một công cụ
hỗ trợ chẩn đoán các trường hợp HKTM do
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
Nghiên cứu Y học
72
nguyên nhân di truyền.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân HKTM thỏa tiêu chuẩn chẩn đoán
trên lâm sàng và siêu âm Doppler tĩnh mạch.
Tiêu chuẩn chọn bệnh
Bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu.
Không có các yếu tố nguy cơ môi trường (liệt
kê ở phần tiêu chuẩn loại trừ).
Tiêu chuẩn loại trừ
Có 1 trong số các yếu tố sau đây:
Gãy xương lớn (chậu, đùi....).
Thay khớp gối hay khớp háng.
Vừa trải qua phẫu thuật lớn.
Chấn thương.
Chấn thương cột sống.
Đang có bệnh lý ác tính.
Đang hóa trị.
Đang điều trị liệu pháp hormon.
Đang uống thuốc ngừa thai.
Nằm bất động trên giường > 3 ngày.
Béo phì.
Có thai.
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả loạt ca kết hợp với xây
dựng quy trình.
Chúng tôi xây dựng quy trình giải trình tự
toàn bộ các exon và vùng intron lân cận của
gen PROC trên 10 bệnh nhân được chẩn đoán
HKTM do nguyên nhân di truyền trên lâm
sàng. Kết quả chính của nghiên cứu là quy
trình giải trình tự toàn bộ gen PROC và tình
trạng đột biến gen của các bệnh nhân HKTM
tham gia nghiên cứu.
Phương pháp thực hiện
Tách chiết DNA bộ gene
Bệnh nhân được thu thập lấy 2 ml máu tĩnh
mạch, cho vào ống chống đông có EDTA, lắc
đều nhẹ nhàng. Genomic DNA của các tế bào
bạch cầu trong máu toàn phần được tách chiết
trong vòng 24 giờ bằng bộ kit GeneJetTM whole
blood genomic DNA purification (Thermo
Scientific, Mỹ) theo hướng dẫn sử dụng của nhà
sản xuất.
Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự gen mục tiêu
Cặp mồi được thiết kế và tổng hợp (IDT,
Mỹ) dựa trên trình tự DNA của gen PROC mang
mã số NG_016323.1 trong kho dữ liệu của NCBI
(Bảng 1).
Tiến hành phản ứng PCR: mỗi tube PCR có
thể tích 15µl chứa các thành phần: 1,5μl PCR
buffer 10X; 1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl cho mỗi
cặp mồi xuôi và ngược (10nM/μl) bên trong và
bên ngoài , 0,1μl TaKaRa Taq TM HotStart
Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic
DNA (20-50ng/μl) và 8,4μl nước cất 2 lần khử
ion. Các phản ứng luôn kèm theo một chứng âm
không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm.
Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực hiện
trên máy Mastercycler@Pro S (eppendorf, Đức).
Chu kỳ nhiệt khuếch đại gen PROC: khởi
đầu tại 980 C trong 3 phút, tiếp theo với 40 chu
kỳ lặp lại các bước 980C : 20 giây, 580C : 20 giây,
720C : 45 giây; kế tiếp với bước 720C : 2 phút. Trữ
sản phẩm PCR tại 160C.
Bảng 1. Bộ mồi dùng để khuếch đại các exon mã hóa và vùng intron lân cận của gen PROC
Tên mồi
Sequencing (5' → 3')
Tm (0C)
Kích thước khuếch đại (bp)
PROC-2F
GCCCTTTCATTCCGCTTCCA
55
270
PROC-2R
GAGAGATGGTGGAAGCTGTG
56
PROC-3F
AAGGCTTCGTCCTCCAACTG
58,2
487
PROC-3R
AACTCCTAAGAGGGCCTCAG
56
PROC-4F
GTCGATCCCTGTTTGTCTGG
55,3
720
PROC-6R
CTCCCTAGAAACCCTCCTGA
60
PROC-7F
CATTGGTTCCTTGAACCCTG
61,5
350
PROC-7R
TTTCTGCACCCTGAGCATAG
57
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
73
Tên mồi
Sequencing (5' → 3')
Tm (0C)
Kích thước khuếch đại (bp)
PROC-8F
GTGCATATGAAACCCAGGTG
57,5
326
PROC-8R
CTTCTGTGGAGCTCAAGAAG
58
PROC-9F
GAAAGTGCCACTGGGGAGAG
61
731
PROC-9R
GCAGGCCGGTGTGCTTGTTA
60
Kỹ thuật giải trình tự
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng
Exosap-IT glycerol solution (Affymetrix, Mỹ)
theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và
được thực hiện phản ứng cycle sequencing với
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit
(Applied Biosystems, Mỹ) cặp mồi được thiết kế
trong Bảng 2. Sản phẩm sau đó được kết tủa
bằng ethanol, hòa tan trong Hi-Di formanide,
biến tính ở 95C trước khi làm lạnh đột ngột.
Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3500
Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và
capillary 50 cm (Applied Biosystems, Mỹ). Kết
quả giải trình tự DNA được phân tích bằng phần
mềm CLC Main Workbench.
Biến số nghiên cứu
Tình trạng đột biến là biến số nhị giá bao
gồm hai giá trị có hoặc không. Có đột biến được
định nghĩa khi có sự thay đổi các nucleotide bất
thường của gen PROC khi so sánh với trình tự
chuẩn của gen này mang mã số NG_016323.1
trong kho dữ liệu của NCBI. Nếu các nucleotide
được giải trình tự hoàn toàn trùng khớp với
trình tự tham khảo thì tình trạng đột biến được
xác định là không.
Bảng 2. Trình tự mồi dùng để giải trình tự gen PROC
Tên mồi
Sequencing (5' → 3')
PROC-2F
GCCCTTTCATTCCGCTTCCA
PROC-3F
AAGGCTTCGTCCTCCAACTG
PROC-4F
GTCGATCCCTGTTTGTCTGG
PROC-6R
CTCCCTAGAAACCCTCCTGA
PROC-7F
CATTGGTTCCTTGAACCCTG
PROC-8F
GTGCATATGAAACCCAGGTG
PROC-9F
GAAAGTGCCACTGGGGAGAG
Các bệnh nhân sau khi đồng thuận tham gia
nghiên cứu sẽ được thu thập các thông tin lâm
sàng và cận lâm sàng bao gồm tuổi, giới, tiền căn
gia đình HKTM, hoạt tính protein C và mẫu
máu ngoại biên để phục vụ cho quy trình giải
trình tự gen.
Y đức
Nghiên cứu đã được sự chấp thuận của Hội
đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Đại
học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh với quyết
định số 452/ĐHYD-HĐĐĐ ngày 18 tháng 12
năm 2018.
KẾT QUẢ
Kết quả PCR
Phản ứng PCR khuếch đại các exon và vùng
lân cận của gen PROC cho sản phẩn có hình ảnh
kích thước đúng với thiết kế ban đầu khi điện di
trên gel agarose 1% (Hình 1).
Hình 1. Kết quả điện di sản phẩm PCR gen PROC
trên thạch agarose 2%
Kết quả giải trình tự
Hình 2. Kết quả giải trình tự phát hiện biến thể
c.565C>T (p.R189W)
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
Nghiên cứu Y học
74
Hình 3. Kết quả giải trình tự phát hiện biến thể
c.323A>C (p.H108P)
Kết quả giải trình tự toàn bộ các exon mã
hoá và vùng intron lân cận gen PROC của 10
bệnh nhân HKTM cho thấy có 2 biến thể bất
thường được phát hiện trên 3 bệnh nhân bao
gồm 2 bệnh nhân mang biến thể dị hợp tử
c.565C>T và một bệnh nhân mang biến thể
c.323A>C (Hình 2, 3). Các biến thể này đều là
các biến thể làm thay đổi acid amin (missense
variant) tại vị trí codon số 189 và 108.
Các đặc điểm lâm sàng và phân tử của bệnh
nhân HKTM tham gia nghiên cứu
Kết quả giải trình tự và các đặc điểm lâm
sàng, cận lâm sàng của các bệnh nhân tham gia
nghiên cứu được mô tả trong Bảng 3.
Có tổng cộng 7 bệnh nhân nữ và 3 bệnh
nhân nam tham gia nghiên cứu. Có thể thấy các
bệnh nhân có mang bất thường di truyền gen
PROC có độ tuổi xuất hiện HKTM trẻ hơn và có
hoạt tính protein C thấp hơn so với bệnh nhân
không mang đột biến. Bệnh nhân HK-03 và HK-
04 mang đột biến c.565C>T (p.R189W) có người
thân đã được chẩn đoán HKTM và bệnh nhân
HK-08 mang đột biến c.323A>C (p.H108P)
không ghi nhận tiền căn gia đình HKTM.
Bảng 3. Các đặc điểm lâm sàng và bất thường di truyền của bệnh nhân HKTM
Bệnh nhân
Tuổi chẩn
đoán HKTM
Giới
Tiền căn gia đình HKTM
Hoạt tính protein C (%)
Tình trạng đột biến gen
PROC
HK-01
34
Nữ
Có
77
Không
HK-02
45
Nữ
Không
99
Không
HK-03
18
Nữ
Có
33
Có
c.565C>T (p.R189W)
HK-04
19
Nam
Có
26
Có
c.565C>T (p.R189W)
HK-05
62
Nam
Không
58
Không
HK-06
47
Nữ
Không
71
Không
HK-07
67
Nữ
Không
68
Không
HK-08
40
Nam
Không
44
Có
c.323A>C (p.H108P)
HK-09
44
Nữ
Không
128
Không
HK-10
45
Nữ
Không
112
Không
BÀN LUẬN
Dù bệnh lý HKTM là một vấn đế lớn của sức
khỏe cộng đồng và yếu tố di truyền đóng vai trò
quan trọng trong nguyên nhân của bệnh lý này,
tuy nhiên việc xác định nguyên nhân di truyền
của bệnh lý này còn nhiều hạn chế. Kỹ thuật giải
trình tự gen PROC trong nghiên cứu này sẽ giúp
hỗ trợ chẩn đoán nguyên nhân bệnh lý HKTM ở
mức độ phân tử.
Protein C được cấu thành từ một domain
giàu γ-carboxyglutamic acid (Gla), domain EGF
(epidermal growth factor )-like, một chuỗi pep
tide kích hoạt ngắn và vùng domain serine
protease (SP) (Hình 4). Vùng Gla có chức năng
gắn với calci giúp cho phân tử protein C gấp
cuộn một cách chính xác. Ngoài ra, vùng này
cũng có chức năng gắn các phân tử
phospholipid giúp các phân tử protein C đảm
bảo được chức năng của mình (Hình 4).
Thông qua nghiên cứu này, chúng tôi đã xây
dựng thành công quy trình giải trình tự gen
PROC phục vụ cho chẩn đoán phân tử bệnh lý
HKTM. Trong tổng số 10 bệnh nhân HKTM
được giải trình tự gen, chúng tôi phát hiện các