TCNCYH 23 (3) 2003

L−u hµnh kh¸ng thÓ kh¸ng H. pylori, CagA, VacA

ë c¸c bÖnh nh©n cã bÖnh d¹ dµy - t¸ trµng

vµ ng−êi b×nh th−êng kh«ng triÖu chøng

1Häc viÖn qu©n y

2 ViÖn vÖ sinh dÞch tÔ trung −¬ng

3 Khoa vi khuÈn häc, §¹i häc Lund, Thôy §iÓn

NguyÔn Th¸i S¬n1, Phïng §¾c Cam2, Åsa Ljungh3

XÐt nghiÖm 110 mÉu huyÕt thanh bÖnh nh©n cã bÖnh d¹ dµy-t¸ trµng vµ 31 mÉu tõ ng−êi b×nh th−êng b»ng kü thuËt immunoblot cho thÊy, tû lÖ nhiÔm H. pylori cao ë c¶ hai nhãm. Tû lÖ H. pylori d−¬ng tÝnh ë c¸c bÖnh nh©n loÐt d¹ dµy, loÐt t¸ trµng vµ viªm d¹ dµy lÇn l−ît lµ 76,5; 95,8 vµ 73%. Tû lÖ huyÕt thanh häc d−¬ng tÝnh víi H. pylori ë ng−êi lµnh lµ 64,5%. Tû lÖ kh¸ng thÓ kh¸ng cagA vµ VacA lµ 86.2% vµ 60.6% ë ng−êi bÖnh vµ 70% vµ 40.0% ë ng−êi lµnh.

i. §Æt vÊn ®Ò

tiªu t×m hiÓu thªm vÒ tØ lÖ l−u hµnh kh¸ng thÓ kh¸ng H. pylori, vµ tØ lÖ mang CagA, VacA ë c¸c bÖnh nh©n cã bÖnh d¹ dµy – t¸ trµng vµ ng−êi b×nh th−êng kh«ng triÖu chøng b»ng kü thuËt Immunoblot.

ii. VËt liÖu vµ ph−¬ng ph¸p

nghiªn cøu

1. §èi t−îng

1.1. BÖnh nh©n

110 bÖnh nh©n (tuæi tõ 15 ®Õn 70, trung b×nh 39) cã viªm hoÆc loÐt d¹ dµy, t¸ trµng ®−îc chÈn ®o¸n qua néi soi t¹i BÖnh viÖn 103, Häc viÖn qu©n y tõ 3/1998 ®Õn 6/2000, gåm:

- LoÐt d¹ dµy: 17 bÖnh nh©n

- LoÐt t¸ trµng: 24 bÖnh nh©n

- LoÐt d¹ dµy kÌm loÐt t¸ trµng: 20 bÖnh nh©n

- Viªm d¹ dµy: 26 bÖnh nh©n

Sù ph¸t hiÖn ra Helicobacter pylori (H. pylori) vµ vai trß cña nã trong c¸c bÖnh vÒ d¹ dµy - t¸ trµng lµ mét trong nh÷ng ph¸t hiÖn cã ý nghÜa nhÊt trong lÜnh vùc vi khuÈn häc vµ hÖ thèng tiªu hãa cuèi thÕ kû 20. TiÕp sau ph¸t hiÖn cña Marshall vµ Warren n¨m 1983 [8], rÊt nhiÒu nghiªn cøu ®· ®−îc c«ng bè. Ngµy nay H. pylori ®· ®−îc thõa nhËn lµ nguyªn nh©n chñ yÕu g©y viªm, loÐt d¹ dµy - t¸ trµng, cã vai trß quan träng trong bÖnh sinh cña ung th− d¹ dµy [9]. Kh¶ n¨ng g©y bÖnh cña H. pylori cã liªn quan ®Õn hai yÕu tè ®éc tÝnh quan träng cña chóng lµ CagA vµ VacA [5]. Møc ®é l−u hµnh cña H. pylori qua c¸c nghiªn cøu cho thÊy kh¸c nhau gi÷a c¸c quèc gia, khu vùc vµ s¾c téc [10]. Nh×n chung, tØ lÖ nhiÔm H. pylori ë c¸c n−íc ®ang ph¸t triÓn cao h¬n h¼n ë c¸c n−íc ph¸t triÓn [10]. ViÖt Nam lµ mét n−íc ®ang ph¸t triÓn, tØ lÖ nhiÔm H. pylori t−¬ng ®èi cao qua mét sè nghiªn cøu ®−îc c«ng bè [1]; tuy nhiªn c¸c yÕu tè CagA vµ VacA vÉn ch−a ®−îc nghiªn cøu nhiÒu. §Ò tµi nµy nh»m môc

54

TCNCYH 23 (3) 2003

- Viªm d¹ dµy kÌm viªm t¸ trµng: 23 bÖnh nh©n

1.2. Ng−êi khoÎ m¹nh

Sweden). C¸c líp protein kh¸ng nguyªn ®−îc ph©n t¸ch b»ng ®iÖn di gradient trªn gel SDS- PAGE (Precast gradient gel 10-20% Tris-HCl, catalog 345-0045, Bio - Rad, CA, USA) víi bé ®iÖn di gel (Bio - Rad, Richmond, CA, USA).

31 ng−êi b×nh th−êng khoÎ m¹nh (tuæi tõ 19 ®Õn 60, trung b×nh 32), kh«ng cã tiÒn sö vµ triÖu chøng d¹ dµy- t¸ trµng tÝnh ®Õn thêi ®iÓm nghiªn cøu.

(cid:190) TÊt c¶ c¸c ®èi t−îng nghiªn cøu ®Òu ®−îc lÊy m¸u tÜnh m¹ch dïng cho xÐt nghiÖm H. pylori.

2. VËt liÖu

- Kh¸ng nguyªn t¸ch chiÕt b»ng ph−¬ng ph¸p glycine tõ chñng chuÈn H. pylori CCUG 17874 (Lund University, Sweden).

- SDS - PAGE

(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) víi Precast gradient gel 10- 20% Tris-HCl (catalog 345- 0045, Bio-Rad, CA, USA).

TiÕp theo c¸c kh¸ng nguyªn l¹i ®−îc ®iÖn di chuyÓn sang mµng PVDF. Sau khi ®iÖn di, phÇn mµng chøa c¸c marker mÉu ®−îc c¾t riªng, nhuém Amidoblack. PhÇn mµng ®· phñ kh¸ng nguyªn ®−îc ®¸nh dÊu, c¾t thµnh c¸c d¶i 3mm chiÒu réng, ®Æt vµo khay ñ, phñ huyÕt thanh bÖnh nh©n pha lo·ng 1:100, 1 ml/ d¶i, ®Ó qua ®ªm ë 8oC. H«m sau, c¸c d¶i mµng ®−îc lÊy ra röa s¹ch huyÕt thanh thõa, råi sau ®ã ®−îc ñ tiÕp víi kh¸ng thÓ kh¸ng IgG ng−êi g¾n peroxidase (Dako, Glostrup, Denmark) pha lo·ng 1/600, ñ trong 2 giê, sau ®ã röa s¹ch kh¸ng thÓ thõa. C¸c vÞ trÝ kÕt hîp ®Æc hiÖu gi÷a kh¸ng nguyªn vµ kh¸ng thÓ trªn mµng ®−îc ph¸t hiÖn sau khi ñ 30 phót víi ®Öm c¬ chÊt (gåm sodium acetate buffer, 1% 3-amino-9- ethyl Carbazole, H202 30%) [4]. - Bé ®iÖn di thÊm (electroblotter equipment, Ancos, Vig, Denmark).

- Mµng PVDF (polyvinylidene difluoride, Inc,Westborough, MA, Micron Separation USA). KÕt qu¶ d−¬ng tÝnh khi cã mét trong ba d¶i träng l−îng ph©n tö cao (120, 94 vµ 85 kDa) kÌm víi hai trong bèn d¶i träng l−îng ph©n tö thÊp (33, 30, 29, 26 kDa) ®Æc hiÖu cña H. pylori xuÊt hiÖn trªn cét kh¸ng nguyªn [4].

iii. KÕt qu¶ - Kh¸ng thÓ kh¸ng ng−êi g¾n men [horse- anti-IgG conjugated radish-peroxidase antibodies (Dako, Glostrup, Denmark)].

3. Ph−¬ng ph¸p

Trong 110 mÉu huyÕt thanh cña bÖnh nh©n cã bÖnh d¹ dµy - t¸ trµng vµ 31 mÉu huyÕt thanh cña ng−êi b×nh th−êng kh«ng triÖu chøng, tØ lÖ H. pylori d−¬ng tÝnh, CagA, VacA t×m ®−îc thÓ hiÖn trong b¶ng sau: Kh¸ng nguyªn cña vi khuÈn H. pylori ®−îc t¸ch chiÕt b»ng ph−¬ng ph¸p glycine axit tõ chñng chuÈn CCUG 17874 (Lund University,

55

TCNCYH 23 (3) 2003

Sè mÉu VacA* H. pylori CagA*

BÖnh nh©n: + % + % + %

LDD 17 13 76,5 11 84,6 6 46,2

LTT 24 23 95,8 22 95,6 17 73,9

LDD + LTT 20 18 90,0 15 83,3 11 61,1

VDD 26 19 73,0 18 94,7 11 57,9

VDD + VTT 23 21 91,3 15 71,4 12 57,1

Tæng sè 110 94 85,5 81 86,2 57 60,6

Ng−êi kháe m¹nh 31 20 64,5 14 70,0 8 40,0

LDD = LoÐt d¹ dµy LTT = LoÐt t¸ trµng

VDD = Viªm d¹ dµy VTT = Viªm t¸ trµng

* TØ lÖ % cña CagA vµ VacA ®−îc thèng kª trong sè tr−êng hîp d−¬ng tÝnh víi H. pylori.

120 kDa 94 kDa 87 kDa

33 kDa

30 kDa

29 kDa

26 kDa

C¸c kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu cña H. pylori sau khi ®iÖn di gradient SDS - PAGE.

56

TCNCYH 23 (3) 2003

iv. Bµn luËn

trµng cã H. pylori d−¬ng tÝnh [6]. Nghiªn cøu cña chóng t«i nÕu tÝnh riªng trong sè bÖnh nh©n loÐt t¸ trµng cã H. pylori d−¬ng tÝnh th× CagA lµ 95,8%, c¸c thÓ bÖnh cßn l¹i còng ®Òu ë møc cao (71,4% ®Õn 95,6%). Cßn vÒ VacA, tr−íc ®©y ch−a cã nghiªn cøu trong n−íc thèng kª vÒ marker nµy. YÕu tè VacA (liªn quan trùc tiÕp ®Õn g©y loÐt ë d¹ dµy - t¸ trµng) tíi 60 % ë nhãm bÖnh, 40 % ë nhãm lµnh. YÕu tè CagA lµm t¨ng tÝnh ®éc cña VacA vµ cßn liªn quan ®Õn mét sè biÓu hiÖn kh¸c (ung th− d¹ dµy, c¸c bÖnh ngoµi d¹ dµy), tíi 86 % ë nhãm bÖnh vµ 70 % ë nhãm lµnh trong nh÷ng tr−êng hîp H. pylori d−¬ng tÝnh. Nh− vËy, nghiªn cøu nµy gãp phÇn gióp thªm nhËn ®Þnh r»ng, c¸c bÖnh nh©n ng−êi ViÖt Nam vµ c¶ ng−êi kháe m¹nh kh«ng triÖu chøng cã tØ lÖ c¸c marker CagA vµ VacA ë møc cao trong sè c¸c tr−êng hîp nhiÔm H. pylori, ®Æc biÖt lµ yÕu tè CagA. §iÒu nµy c¶nh b¸o r»ng, c¸c chñng H. pylori ®ang l−u hµnh ë ViÖt Nam cã tiÒm n¨ng g©y loÐt cao vµ nguy c¬ cao cña c¸c tr−êng hîp nhiÔm H. pylori víi c¸c bÖnh lý cña d¹ dµy- t¸ trµng (ung th− d¹ dµy, viªm d¹ dµy- t¸ trµng..v.v.).

v. KÕt luËn

TØ lÖ l−u hµnh cao cña nhiÔm trïng H. pylori ë c¶ hai nhãm bÖnh nh©n vµ ng−êi kháe m¹nh: 85,5% trong nhãm bÖnh d¹ dµy – t¸ trµng; 64,5% trong nhãm ng−êi kháe m¹nh kh«ng triÖu chøng.

TØ lÖ xuÊt hiÖn CagA vµ VacA cao trong nh÷ng tr−êng hîp d−¬ng tÝnh víi H. pylori: 86,2 % víi CagA vµ 60,6 % víi VacA ë nhãm bÖnh d¹ dµy – t¸ trµng; 70 % víi víi CagA vµ 40 % víi VacA ë nhãm ng−êi kháe m¹nh kh«ng triÖu chøng.

Tµi liÖu tham kh¶o

1. T¹ Long: Helicobacter pylori vµ bÖnh loÐt d¹ dµy t¸ trµng. Mét sè chuyªn ®Ò néi khoa, Héi Néi khoa ViÖt Nam. 1999: 27- 34.

Trong nhãm c¸c ph−¬ng ph¸p kh«ng x©m ph¹m sö dông huyÕt thanh häc chÈn ®o¸n H. pylori, Immunoblot ®−îc coi lµ ph−¬ng ph¸p cã ®é tin cËy cao víi ®é ®Æc hiÖu gÇn nh− 100%, ®é nhËy trªn 90%. Ngoµi ra, ph−¬ng ph¸p nµy cßn cã thÓ ph¸t hiÖn nh÷ng marker g©y bÖnh quan träng nh− CagA, VacA [2]. Nh÷ng tr−êng hîp d−¬ng tÝnh víi H. pylori cã thÓ ®−îc kh¼ng ®Þnh th«ng qua nh÷ng vÞ trÝ kh¸ng nguyªn ®Æc hiÖu cña H. pylori xuÊt hiÖn trªn cét kh¸ng nguyªn (¶nh). §Ó tr¸nh nh÷ng tr−êng hîp d−¬ng tÝnh gi¶ x¶y ra sau khi H. pylori ®· ®−îc ®iÒu trÞ diÖt trõ, kÕt qu¶ d−¬ng tÝnh trong Immunoblot ®−îc qui −íc khi cã Ýt nhÊt mét d¶i kh¸ng nguyªn ë khu vùc träng l−îng ph©n tö cao kÌm theo hai d¶i ë khu vùc träng l−îng ph©n tö thÊp ®Æc hiÖu cña H. pylori xuÊt hiÖn trªn cét kh¸ng nguyªn [4]. KÕt qu¶ cña Immunoblot trªn c¸c ®èi t−îng bÖnh nh©n vµ ng−êi khoÎ m¹nh trong nghiªn cøu cña chóng t«i cho thÊy: TØ lÖ d−¬ng tÝnh víi H. pylori ë nhãm bÖnh nh©n lµ 85,5%; ë nhãm ng−êi khoÎ m¹nh kh«ng triÖu chøng lµ 64,5% (p < 0,05%). TØ lÖ H. pylori d−¬ng tÝnh ph©n bè gi÷a c¸c thÓ bÖnh trong nhãm bÖnh nh©n còng hoµn toµn phï hîp víi nh÷ng nghiªn cøu vÒ H. pylori ®· ®−îc c«ng bè trªn thÕ giíi vµ trong n−íc [1], [7]. §Æc biÖt, hai marker g©y bÖnh quan träng cña H. pylori lµ CagA vµ VacA cã tØ lÖ cao trong sè c¸c tr−êng hîp d−¬ng tÝnh víi H. pylori: CagA d−¬ng tÝnh 86,2% trong nhãm bÖnh vµ 70% trong nhãm ng−êi khoÎ kh«ng triÖu chøng nhiÔm H. pylori. VacA d−¬ng tÝnh 60,6% trong nhãm bÖnh nh©n vµ 40% trong nhãm ng−êi khoÎ m¹nh kh«ng triÖu chøng nhiÔm H. pylori qua nghiªn cøu. C¸c nghiªn cøu vÒ CagA vµ VacA trªn thÕ giíi cho biÕt tØ lÖ d−¬ng tÝnh cña hai marker nµy kho¶ng 40% - 70% trong c¸c tr−êng hîp nhiÔm H. pylori [3]. Mét nghiªn cøu tr−íc ®©y cña c¸c t¸c gi¶ Hµ V¨n M¹o vµ T¹ Long ®· cho biÕt tØ lÖ CagA lµ 80% ë c¸c bÖnh nh©n ng−êi ViÖt Nam bÞ loÐt t¸

57

TCNCYH 23 (3) 2003 patients with duodenal ulcer”, Aliment Pharmacol Ther. 1999, 13: 1 – 5.

7. Marshall BJ et al : Helicobacter pylori, Am. J. Gastroenterol. 1994, 89(8): S116-S126. 2. Bee Ling Ng, Han Chong Ng, Kee Tai Goh, Bow Ho: Helicobacter pylori in familial clusters based on antibody profile, FEMS Immunology and Microbiology. 2001, 30: 139- 142.

3. Bruce E. Dunn, Hartley Cohen, and Martin J. Blaser: Helicobacter pylori, Clinical Microbiology Reviews. 1997: 720-741. 8. Marshall BJ, Warren JR : Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration, Lancet. 1984, (1) : 1311 - 1315.

4.

9. Military Medicine : Association of infection with gastric

Helicobacter pylori cancer. 2000, 165-1(021) : 21-27.

Ingrid Nilsson, Åsa Ljungh, Pär Aleljungh, and Torkel Wadström: Immunoblot for Serodiagnosis of H. pylori Assay Infections, Journal of Clinical Microbiology. 1997: 427-432.

10. Pradip K.Bardhan: Epidemiological Features of Helicobacter pylori infection in Developing countries, Clinical Infectious Diseases. 1997, 25: 973-978.

5. Leen-Jan van Doorn, Ceu Figueiredo, and Wim Quint : Molecular Typing of Helicobacter pylori, Helicobacter pylori: Molecular and Cellular Biology, Horizon Scientific Press. 2001: 293-310.

to

6. Mao H.V, Lak B.V, Long T et al : Omeprazole or ranitidine bismuth citrate triple therapy infection: a treat H. pylori randomized, controlled trial in Vietnamese

Summary

Antibodies to Helicobacter pylori, CagA, VacA in the

patients with gastroenteropathy and in healthy persons

The results of study from the sera of 110 patients with gastro-duodenal diseases and 31 healthy persons by Immunoblot assay show that: The prevalence of H. pylori infections is high level in both patients and healthy persons. The proportion of H. pylori positive in patients with gastric ulcer, duodenal ulcer and gastritis were found 76.5%, 95.8% and 73% respectively. H. pylori seropositive was found 64.5% in healthy persons. The prevalence of anti-CagA and anti-VacA antibodies in patients who have H. pylori positive were found 86.2% and 60.6% respectively. Those prevalence were found 70% and 40.0% (respectively) in heathy persons with H. pylori seropositivity.

58