Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 3 * 2021
Nghiên cứu Y học
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy
87
NGHIÊN CỨU ĐỘT BIẾN GEN ATP7B
TRÊN BỆNH NHÂN WILSON NGƢỜI LỚN
Lê Hữu Phước1
TÓM TẮT
Mục tiêu: Xác định các dạng đột biến trên toàn bộ 21 exon của gen ATP7B và tỉ lệ của các đột biến này ở
bệnh nhân Wilson người lớn.
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Nghiên cứu cắt ngang, thực hiện ở 56 bệnh nhân được chẩn đoán
bệnh Wilson theo tiêu chuẩn Ferenci. Gen ATP7B được phân tích bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp từ exon 1-
21. Phân tích trình tự gen trên các exon và so sánh với hệ thống dữ liệu của NCBI (National Center for
Biotechnology Information) để xác định các dạng đột biến của gen ATP7B và tỉ lệ của các đột biến này.
Kết quả: Tuổi trung bình 26,91 ± 7,24, tuổi nhỏ nhất là 18, lớn nhất là 51, nam chiếm 42,9%, nữ 57,1%. Tỉ
lệ phát hiện đột biến gen trong nghiên cứu này là 96,4%. Dạng đột biến c.525 – 526 insA và Thr 850 Ile thường
gặp nhất, chiếm tỉ lệ 15,8%; Ser 105 Stop 14,6% và đột biến Arg 778 Leu 7,3%.
Kết luận: Có 4 dạng đột biến gen thường gặp ở bệnh nhân Wilson người lớn là đột biến c.525-526insA, Thr
850 Ile, Ser 105 Stop và Arg 778Leu. Trong đó tỉ lệ đột biến c.525-526insA và Thr 850 Ile là 15,8%, Ser 105 Stop
14,6% và đột biến Arg 778 Leu 7,3%
Từ khóa: bệnh Wilson, genATP7B, đột biến gen
ABSTRACT
STUDY OF ATP7B GENE MUTATION IN THE ADULT PATIENTS WITH WILSON DISEASE
Le Huu Phuoc
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No. 3 - 2021: 87 - 91
Objectives: The objective of this study was to determine all kinds of mutation on 21 exons of ATP7B gene
and the rate of these mutations in the adult patients with Wilson disease.
Methods: A cross-sectional study was conducted on 56 patients with Wilson disease diagnosed basing on
standards of Ferenci criteria. ATP7B gene were analyzed by direct sequencing of exon 1-21. Analysing sequence
on exons and comparison of these exons to database from NCBI (National Center for Biotechnology Information)
to determine all kinds of mutations of ATP7B gene and the rate of these mutations.
Results: The average age was 26.91 ± 7.24, 42.9% male, 57.1% female. The youngest patient was 18 years
old, the oldest one was 51. The rate of gene mutations in this study was 96.4%. The c.525 – 526 insA and Thr 850
Ile mutation was common, accounted for 15.8%, Ser 105 Stop mutation accounted for 14.6% and Arg 778 Leu
mutation accounted for 7.3%.
Conclusions: There were four kinds of gene mutations commonly in the adult patients with Wilson disease
including c.525 – 526 insA mutation, Thr 850 Ile mutation, Ser 105 Stop mutation and Arg 778 Leu mutation.
The rate of these mutations was 15.8%, 15.8% and 14.6% and 7.3% respectively.
Keywords: Wilson disease, ATP7B gene, gene mutation
1Khoa Viêm Gan, bệnh viện Chợ Rẫy
Tác giả liên lạc: ThS.BS. Lê Hữu Phước ĐT: 0978133180 Email: huuphuocbnd@yahoo.com
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 3 * 2021
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy
88
ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh Wilson là một bệnh di truyền lặn trên
nhiễm sắc thể thường, do đột biến gen ATP7B.
Gen này có vai trò điều hòa quá trình hấp thu,
phân bố và thải trừ đồng (Cu) trong cơ thể. Khi
gen ATP7B bị đột biến, quá trình đào thải Cu bị
rối loạn, Cu sẽ lắng đọng trong mô. Tùy theo
thời gian, vị trí mà lâm sàng có những biểu hiện
khác nhau như tốn thương não, gan, mắt,
xương, khớp, thận. Nếu không được điều trị,
bệnh diễn tiến nặng dần và tử vong(1).
Chẩn đoán bệnh có thể dựa trên triệu chứng
lâm sàng và các chỉ số sinh hóa như ceruloplas-
min máu giảm, đồng trong nước tiểu tăng... Việc
phát hiện bệnh ở giai đoạn sớm rất khó khăn
nếu chỉ dựa vào lâm sàng và sinh hóa. Hiện nay,
phân tích đột biến gen là một xét nghiệm đặc
hiệu giúp chẩn đoán sớm, chính xác bệnh
Wilson. Từ đó mở đường cho việc tầm soát
những người nghi ngờ mắc bệnh, nhất là các
thành viên trong gia đình bệnh nhân. Do đó,
chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu này nhằm
mục tiêu: Xác định các dạng đột biến trên toàn
bộ 21 exon của gen ATP7B và tỉ lệ của các đột
biến này ở bệnh nhân Wilson người lớn.
ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Các bệnh nhân được chẩn đoán bệnh Wilson
tại bệnh viện Chợ Rẫy từ 9/2015 9/2020.
Tiêu chuẩn chọn mẫu
Tất cả bệnh nhân ≥16 tuổi, đủ tiêu chuẩn
chẩn đoán bệnh Wilson của Ferenci.
Tiêu chuẩn loại trừ
Bệnh nhân (BN) không đồng ý tham gia
nghiên cứu.
Không thu thập đủ số liệu cho nghiên cứu.
Phƣơng pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu cắt ngang mô tả. Thu thập số
liệu theo mẫu bệnh án những bệnh nhân Wilson
đủ tiêu chuẩn chọn lựa.
Cỡ mẫu
Toàn bộ, gồm 56 bệnh nhân thỏa tiêu chuẩn
chẩn đoán Wilson theo Ferenci R(2).
Bảng 1: Bảng điểm chẩn đoán bệnh Wilson của Ferenci
Triệu chứng
Điểm
Vòng Kayser-Fleischer
2
0
Triệu chứng thần kinh
2
1
0
Ceruloplasmin máu
0
1
2
Cu trong gan (đã loại trừ
tắc mật)
2
1
-1
Cu trong nước tiểu 24h
0
1
2
Thiếu máu tán huyết
coomb test (-)
1
0
Đột biến gen ATP7B
4
1
0
Tổng số điểm
≥ 4: chẩn đoán xác định bệnh Wilson
= 3: có thể mắc bệnh Wilson
≤ 2: loại trừ bệnh Wilson
Phương pháp chọn mẫu
Chọn mẫu theo phương pháp thuận tiện,
liên tục dựa theo tiêu chuẩn chẩn đoán của
Ferenci R.
Các bước tiến hành
Các bệnh nhân nghi ngờ mắc bệnh Wilson
được đưa vào quy trình tầm soát bao gồm: khám
mắt tìm vòng Kayser-Fleischer, ceruloplasmin
máu, đồng niệu 24 giờ và phân tích đột biến gen
ATP7B.
Phân tích đột biến gen ATP7B:
Các bệnh nhân đủ tiêu chuẩn chẩn đoán
bệnh Wilson theo Ferenci được tiến hành lấy 2ml
máu tĩnh mạch, phân tích đột biến gen theo quy
trình giải trình tự DNA toàn bộ 21 exon và vùng
promoter của gen ATP7B bằng kỹ thuật Sanger.
Giải trình tự bằng phương pháp Sanger: Sản
phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện
phản ứng cylce sequencing với BigDye®
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 3 * 2021
Nghiên cứu Y học
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy
89
Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied
Biosystems, Mỹ) theo hai chiều xuôi và ngược.
Sản phẩm sau đó được kết tinh bằng ethanol,
hòa tan tyrong Hi-Di formanide, biến tính ở 950C
trước khi làm sạch đột ngột. Trình tự DNA được
đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với
POP-7 polymer và capillary 50cm (Applied
Biosystems, Mỹ).
Phân tích kết quả giải trình tự: Kết quả giải
trình tự sẽ được phân tích bằng phần mềm CLC
Main Wordbench, so sánh với trình tự chứa gen
ATP7B mang mã số NG-008806 trong Gen-Bank
để xác định đột biến gen.
Biến số nghiên cứu
Tuổi: biến liên tục (năm).
Giới: biến nhị giá (nam/nữ).
Ceruloplasmin: biến liên tục (mg%).
Đồng niệu 24 giờ: biến liên tục (mcg%).
Vòng Kayser-Fleischer: biến nhị giá
(dương, âm).
Đột biến gen: là biến phân loại, gồm các giá
trị tương ứng tên đột biến và giá trị không
(không phát hiện đột biến).
Kiểu đột biến: là biến phân loại, gồm các giá
trị: chèn vào, thay thế.
Phương pháp thu thập số liệu
Bệnh án nghiên cứu ghi nhận dấu hiệu lâm
sàng, cận lâm sàng.
Khám mắt tìm vòng Kayser-Fleischer: thực
hiện tại khoa mắt, bệnh viện Chợ Rẫy.
Ceruloplasmin máu, đồng niệu 24 giờ thực
hiện tại khoa sinh hóa, bệnh viện Chợ Rẫy.
Phân tích đột biến gen ATP7B được thực
hiện tại trung tâm sinh học phân tử, đại học Y
Dược thành phố Hồ Chí Minh.
Phân tích và xử lý số liệu
Xử lý số liệu bằng phần mềm SPSS 18.0. Các
biến liên tục được kiểm định bằng t độc lập; các
biến phân loại được phân tích và trình bày theo
tần suất (%); so sánh giữa 2 nhóm sẽ dung test
chính xác Fisher.
KẾT QUẢ
Tuổi
Bảng 1: Phân bố đặc điểm theo tuổi và giới
Đặc điểm
Số BN
Tỷ lệ (%)
Tuổi
< 20
7
12,5
20-29
34
60,7
30-39
11
19,6
40-49
2
3,6
≥ 50
2
3,6
Giới
Nam
24
42,9
Nữ
32
57,1
Tổng
56
100,0
Tuổi trung bình 26,91 ± 7,24, nhỏ nhất 18, lớn
nhất 51. Nữ chiếm ưu thế (57,1%), nam 42,9%
(Bảng 1).
Thể lâm sàng
Bảng 2: Thể lâm sàng
Thể lâm sàng
Số BN
Tỷ lệ (%)
Gan đơn thuần
35
62,5
Gan – thần kinh
16
28,6
Gan – huyết học
5
8,9
Tổng
56
100,0
Thể gan đơn thuần chiếm tỉ lệ cao nhất
(62,5%), tiếp theo là thể gan – thần kinh (Bảng 2).
Đột biến gen ATP7B
Bảng 3: Số lượng đột biến gen trên một bệnh nhân
Số lượng đột biến gen
Số BN
Tỷ lệ (%)
0
2
3,6
1
26
46,4
2
28
50,0
Tổng
56
100,0
Bảng 4: Đột biến gen
Đột biến gen
Gen đột biến
Tỷ lệ (%)
ala 1231 thr
1
1,2
ala 1295 val
1
1,2
ala 874 val
1
1,2
arg 771 leu
1
1,2
arg 778 gln
1
1,2
arg 778 leu
6
7,3
arg 919 gly
1
1,2
asp 1027 his
3
3,7
asp 765 gly
5
6,1
c 2304 - 2305 insC
3
3,7
c 525-526 insA
13
15,8
gle 1173 lys
1
1,2
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 3 * 2021
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy
90
Đột biến gen
Gen đột biến
Tỷ lệ (%)
gly 943 asp
1
1,2
ile 1148 thr
4
4,9
leu 1209 val
1
1,2
leu 1371 pro
2
2,4
leu 792 pro
1
1,2
leu 902 pro
3
3,7
p asp 765 gly
1
1,2
pro 1052 leu
2
2,4
pro 1273 gln
1
1,2
pro 992 leu
1
1,2
ser 105 stop
12
14,6
ser 1356 pro
1
1,2
thr 762 pro
1
1,2
thr 850 ile
13
15,8
val 1297 ile
1
1,2
Tổng
82
100,0
Có 4 dạng đột biến gen thường gặp là: c 525-
526 insA (15,8%), thr 850 ile (15,8%), ser 105 stop
(14,6%) và arg 778 leu (7,3%) (Bảng 3, 4).
Bảng 5: Vị trí đột biến
Vị trí đột biến
Gen đột biến
Tỷ lệ (%)
exon 10
13
15,9
exon 11
4
4,9
exon 12
2
2,4
exon 13
1
1,2
exon 14
5
6,1
exon 16
5
6,1
exon 17
2
2,4
exon 18
3
3,7
exon 2
25
30,5
exon 20
3
3,7
exon 8
18
22,0
exon 9
1
1,2
Tổng
82
100,0
Đột biến thường xảy ra ở exon 2 (30,5%),
exon 8 (22,0%) và exon 10 (15,9%) (Bảng 5).
BÀN LUẬN
Bệnh Wilson là một bệnh hiếm gặp. Theo
Gollan JL(1), tỉ lệ bệnh khoảng 1/30.000-1/100.000
trẻ mới sinh và tần suất gen bệnh khoảng 0,56%.
Bệnh tuy hiếm nhưng có thể gặp ở mọi nơi, mọi
chủng tộc trên thế giới. Ngày nay người ta đã
biết được nguyên nhân do đột biến gen ATP7B
nằm trên nhiễm sắc thể 13ql4.3 của bệnh nhân.
Tần suất, kiểu đột biến gen cũng khác nhau
tùy theo chủng tộc. Các nghiên cứu trên thế giới
đã chứng minh rằng đột biến Hisl069Gln trên
exon 14 của gen ATP7B thường gặp ở Châu Âu;
trong khi đó, đột biến Arg778Leu trên exon 8 rất
phổ biến trong quần thể Châu Á(3). Trong nghiên
cứu của chúng tôi, tỉ lệ phát hiện đột biến gen là
96,4%. Chúng tôi phát hiện 4 dạng đột biến
thường gặp là: c.525-526insA, Thr 850 Ile, Ser 105
Stop và Arg 778 Leu.
Đột biến c.525-526insA là loại đột biến
thường gặp nhất, chiếm tỉ lệ 15,8% (Bảng 5). Đây
là đột biến chèn thêm nucleotide (insertion), tạo
thêm 27 acid amin lạ và kết thúc giải mã sớm ở
codon 203. Kết quả nghiên cứu này phù hợp so
với một số tác giả khác. Năm 2012, Hoàng Lê
Phúc và cộng sự(4) thực hiện đề tài “Nghiên cứu
phát hiện đột biến trên exon 2 của gen ATP7B ở
bệnh nhân Wilson Việt Nam”. Nghiên cứu thực
hiện trên 15 bệnh nhân Wilson tại bệnh viện Nhi
Đồng 1, thành phố Hồ Chí Minh. Kết quả nghiên
cứu như sau: đột biến c.525-526 insA chiếm tỉ lệ
26,7%. Như vậy, tỉ lệ đột biến c.525- 526insA
trong nghiên cứu của chúng tôi khá cao, phù
hợp tác giả Hoàng Lê Phúc.
Đột biến Thr 850 Ile chiếm tỉ lệ 15,8% (Bảng
5). Đây là đột biến thay thế nucleotide,
Threonine ở vị trí 850 bị thay thế bằng
Isoleucine, kéo theo thay đổi Threonin ở vị trí
850 thành Isoleucine. Theo các nghiên cứu trên
thế giới, đột biến Thr 850 Ile thường gặp ở Châu
Á. Nghiên cứu của Lei và cộng sự tại Đài Loan,
bằng phương pháp khuếch đại chuỗi và cắt
enzyme giới hạn ở nhiệt độ 37°C, cho thấy đột
biến Thr 850 Ile là (20,0%)(5). Như vậy, kết quả
nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các tác giả
Châu Á.
Năm 2007, Đỗ Thanh Hương(6) tiến hành
nghiên cứu đột biến gen ở bệnh nhân Wilson
bằng phương pháp giải trình tự gen. Đối tượng
nghiên cứu bao gồm 23 bệnh nhân tại khoa thần
kinh, bệnh viện Bạch Mai. Tác giả chỉ tập trung
khảo sát một loại đột biến duy nhất là
Arg778Leu. Kết quả: tỉ lệ đột biến Arg778Leu
dạng dị hợp là 8,7%. Trong nghiên cứu của
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 3 * 2021
Nghiên cứu Y học
Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy
91
chúng tôi, đột biến Arg778Leu chiếm tỉ lệ 7,3%
(Bảng 5), tương tự giả Đỗ Thanh Hương.
Trong nghiên cứu này có 2 bệnh nhân không
phát hiện đột biến gen (Bảng 4), chiếm 3,6%, mặc
dù đủ tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh Wilson theo
Ferenci R(2). Gen ATP7B được cấu tạo bởi các
exon, intron, promoter và vùng tiếp nối. Chúng
ta cũng chưa biết rõ hoàn toàn cấu trúc, chức
năng của các vùng này. Với các kỹ thuật xét
nghiệm hiện nay, chúng ta cũng chỉ phát hiện
đột biến ở các exon và intron, còn các vị trị khác
chưa thực hiện được. Điều đó giải thích vì sao có
2 bệnh nhân không phát hiện được đột biến. Hy
vọng trong tương lai không xa, chúng ta hiểu
biết đầy đủ hơn, trọn vẹn hơn sự biến đổi gen
của căn bệnh phức tạp này.
Về vị trí đột biến, thường xảy ra ở exon 2
(30,5%) và exon 8 (22%) (Bảng 6). Kết quả nghiên
cứu này cũng phù hợp với Hoàng Lê Phúc(4), Đỗ
Thanh Hương(6) cũng như các tác giả Châu Á.
Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất khảo sát những
exon này đầu tiên trong những nghiên cứu tiếp
theo nhằm tiết kiệm chi phí cho bệnh nhân.
KẾT LUẬN
Có 4 dạng đột biến gen thường gặp ở bệnh
nhân Wilson người lớn là đột biến c.525-
526insA, Thr 850 Ile, Ser 105 Stop và Arg 778Leu.
Trong đó tỉ lệ đột biến c.525-526insA và Thr 850
Ile là 15,8%, Ser 105 Stop 14.6% và đột biến Arg
778 Leu 7,3%.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Gollan JL (1998). “Wilson disease in 1998: genetic, diagnostic
and therapeutic aspects”. J Hepatol, 28:28-36.
2. Ferenci P, et al (2006). "Regional distribution of mutations of the
ATP7B giene in patients with Wilson disease: impact on gienetic
testing". Hum Gienet, 120:151-159.
3. Maier T, Ferenci R, Polli C, et al (1997). “Detection of the
Hisl069Glu mutation in Wilson disease by rapid polymerase
chain reaction”. Ann Intern Med., 127:21-26.
4. Hoàng Lê Phúc và cộng sự (2012). “Nghiên cúu phát hiện đột
biến trên exon 2 của gen ATP7B ở bệnh nhân Wilson Việt
Nam”. Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 16(4):1-4.
5. Wan L, Tsai CH, Hsu CM, et al (2006). “Mutation analysis of
Taiwanese Wilson disease patients”. Biochemical and Bio-physical
Research Communication, 345:734-738.
6. Đỗ Thanh Hương (2007). Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận
lâm sàng và bước đầu phát hiện đột biến gen của bệnh Wilson.
Luận Văn Bác sĩ Nội Trú, Đại Học Y khoa Hà Nội.
Ngày nhận bài báo: 04/04/2021
Ngày nhận phản biện nhận xét bài báo: 05/05/2021
Ngày bài báo được đăng: 25/05/2021