Phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) trên ong mật ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam

Chia sẻ: Ngọc Ngọc | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

11
lượt xem 0
download

Phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) trên ong mật ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam

Mô tả tài liệu

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Ðể định hướng cho việc nghiên cứu chế tạo bộ kit chẩn đoán virus BQCV ở ong mật, chúng tôi bước đầu thực hiện nghiên cứu phát hiện virus BQCV bằng RT-PCR. Trên các mẫu ong mật ở Việt Nam. Mời các bạn tham khảo!

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Phát hiện virus gây bệnh thối đen mũ chúa (Black queen cell virus) trên ong mật ở một số tỉnh miền bắc Việt Nam

HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6 NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH THỐI ĐEN MŨ CHÖA (BLACK QUEEN CELL VIRUS) TRÊN ONG MẬT Ở MỘT SỐ TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM HÀ THỊ QUYẾN, T g i học Công nghệ, i học Quốc gia Hà Nội HÀ THỊ THU, BÙI THỊ THÙY DƢƠNG, ĐỒNG VĂN QUYỀN Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Vệ N ố ,Vệ N Á ỉ T ậ ệ ườ T ở ệ Q ố , ờ ế ậ ứ ứ ẩ D liệu xu t khẩu ă ệ ậ ệ US ậ ế ,Vệ N ư M c dù vậy, nh ng ă ầ , ố ổ ì ì ệ ồ ư ứ ệ ậ ờ ầ , ởVệ N ong b mắc bệnh, chủ yếu do virus. Vì ậ , ườ kháng sinh ệ do virus, vi khuẩn. ứ ứ ẩ ă ệ ệ ẩ ậ ế ố trên ong mật do virus black queen cell (BQCV) ệnh ổ ế ổ ườ ởVệ N K thành tế bào ủ xu t hiện các m , ườ ố (Bailey & Wood, 1977). ế ệ N ổ ứ ệ ệ ễ Q V, ọ virus này (a) (b) Hình 1: (a) Ấu trùng chúa của ong mật bị nhiễm BQCV; (b) Nhộng bị nhiễm BQCV Q V ườ A) G k Đ ẩ ệ ệ , ươ (không ẩ ư ệ ứ ệ ọ , ế ọ và ọ Đ ứ ứ ươ ệ ệ ở ậ ư ươ ễ (ELISA, W , ) RT-PCR, multiplex RT-PCR, RFLP, (Grabensteiner et al., 2007; Mongi et al., 2001). ủ ệ ứ RNA ơ ồ ứ ọ ở ORF ORF (Kondreddy et al., 2013; Leat et al., 2000). ươ ư é 1621 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6 ươ C ế ườ ế ố ố ư ư T Hơ ư ố ư , ỹ ệ , ệ ủ ẩ ậ ẩ ậ virus ừ Đ ệ ệ RT-P R ì ơ ỉ ệ ế ì ừ ẩ ố ì ệ , ở ì ầ ế ệ ồ ệ ệ é , ừ kit mua ủ ờ ư Đ ư ng cho việc nghiên cứu chế t o b kit chẩ Q V ở ong mật, chúng ư ầu th c hiện nghiên cứu phát hiện virus BQCV b ng RT-PCR. Trên các mẫu ong mật ở Việt Nam. I. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Vật liệu Mẫ RNA ươ ẩn (tách từ ong nhiễm BQCV) và mẫu RNA âm tính chuẩn (tách từ ưởng thành kh e m ) T ậ, ậ ủ H Q ố (QIA) , ệu là BQCV(+) và BQCV(-). T ă , mẫu ưởng thành ư c thu thập t i 9 ở5 tỉnh mi n Bắc Việt Nam, ồ Đ ện Biên, Hòa Bình, Bắ G , Hư Y và Nghệ An. Mỗ ồm c mẫu ưởng thành. Mẫ ư c ký hiệu b ng các ch ư ưởng thành ký hiệu là T và u trùng ký hiệu là A. Mỗi tỉnh thu 18 mẫ ưởng thành và 18 mẫu u trùng. Mẫ ư c b o qu n trong ethanol 100% và gi ở -20o ến khi s d ng. 2. Hóa chất, sinh phẩm Bao gồm các b kit: B kit RNeasy Mini Kit 250 củ QIA tách RNA tổng số; b kit SuperSciptTMFirst-S NA S S (I ) t o cDNA; TA cloning Kit (I ) tách dòng gen; GenJETTMP R P f K (F ) tinh s ch vector tái tổ h p và s n phẩm PCR; BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) ọc trình t gen. 3. Phƣơng pháp nghiên cứu Tách chiết RNA t ng số Các mẫ ư ẫ Khuế h ưởng thành và ư ơ S , d ng b RNeasy Mini Kit 250 củ QIA ủ ố RNA ư c hòa l i trong 30 µ ư c kh ủ RNA ư ổ Nanodrop. i ẫ RNA EP Nồ DNA ặc hiệu c a BQCV (RT-PCR) a. Tổng h p cDNA từ RNA tổng số Quy trình và thành phần ph n ứ ư : Hỗn h p 1 gồm: RNA tổng số tách từ mẫu ưởng thành (30 ng–50 ng): 7 µl; Mồi ngẫu nhiên (50 ng/µl): 3 µl; Ủ hỗn h p 1 b ng máy PCR ở 650 S trên Hỗn h p 2 gồm: 5X RT Buffer(0,5M Tris-HCl pH-8,3; 0,75M KCl; 0,03M MgCl2): 4µl; dNTP mix (10 mM): 2 µl; DTT (0,1 mM): 2 µl; Inibitor Rnase (20 u/µl):1 µl; Reverse trancriptase (20 u/µl): 1µl. 1622 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6 Bổ sung 10 µl hỗn h p 2 vào hỗn h th c hiện ph n ứng RT-PCR ì ệ n ứng tổng h p cDNA từ RNA ổ ố P R o o trong 5 phút; 42 C trong 60 phút và 70 C trong 5 phút. b. Khuế ư : o C i gen từ cDNA b ng PCR C p mồi thiết kế cho việc khuế im c hiệu của virus BQCV có trình t ư sau: BQCV-F: ‟- TGGTCAGCTCCCACTACCTTAAAC - ‟ BQCV-R: ‟- GCAACAAGAAGAAACGTAAACCAC- ‟ S n phẩm sau khi khuế i sẽ có chi u dài kho ng 701bp Chu kỳ nhiệt ph n ứng khuế i: 94oC trong 3 phút; 35 chu kỳ (gồm 94oC trong 40 giây; o o 56 C trong 40 giây; 72 C trong 1 phút); 72oC trong 8 phút; gi mẫu ở 4oC. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1. Kiể ính đặc hiệ củ cặp ẫ RNA ươ NA Q V Kế ệ ồi đ Từ 1. 2. 3. 4. 5. hiế kế ẩ , ẩ ế ứ P R ế P R ư ệ ở ì NA NA ồ ệ ẫ ủ Hình 2: Điện di sản phẩm RT-PCR đ ạn DNA đặc hiệu của BQCV ~701bp Kênh 1: Chỉ th DNA chuẩn Kênh 2: Mẫu BQCV(-) Kênh 3: Mẫu BQCV(+) Theo kết qu thiết kế mồi, s n phẩ P R n DNA của BQCV sẽ có ư c kho ng 701bp. Hình ện di cho th , ện di s n phẩm RT-PCR, mẫu BQCV(+) xu t hiện m t ă ư ư c củ NA c hiệu của BQCV (kho ng 701bp), còn mẫu BQCV(-) không th y xu t hiện s n phẩm. Tuy nh , chắc chắn s n phẩm P R ư c là củ Q V, ọc trình t nucleotide và so sánh v i m t số trình t ươ ồng trên GeneBank có số ă KP119603.1, KM255694.1, JX149531.1, AF ,N _ Kế ( ì ở ) ươ ồ > 96%. N ư ậy, c p mồi mà chúng tôi thiết kế r c hiệu cho BQCV và có th s d ng c p mồ ư ì RT-P R u tra phát hiện các mẫu ong nhiễm BQCV trên th a. S n phẩ P R n DNA của BQCV nói trên ư c tách dòng trong vector tách dòng R ư cs d ối chứ ươ ứu tiếp theo. 2. Phát hiện sự có mặt của BQCV trên các mẫu ong Áp d ng quy trình RT-PCR có s d ng c p mồ ết kế ở trên, chúng tôi tiến hành phát hiện s có m t của BQCV trên các mẫu ong ở 5 tỉnh: 180 mẫu RNA tổng số ư c tách chiết 1623 HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6 từ 180 mẫ ưởng thành và ư th c hiện ph n ứng PCR. Hình 3 trình bày kết qu ưởng thành và i diện cho 5 tỉ BQCV(+). ư c thành cDNA rồi tiến hành ện di s n phẩm RT-PCR của m t số mẫu d ng mẫ ối chứ ươ Hình 3: Điện di sản phẩm RT-PCR đ ạn DNA đặc hiệu của BQCV Kênh 1, 2: Mẫ ưởng thành ở Đ ện Biên; Kênh 3: Mẫu u trùng ở Đ ện Biên Kênh 4, 5: Mẫu ưởng thành ở Hòa Bình; Kênh 6, 7, 8,: Mẫ ưởngthành ở Bắc Giang; Kênh 9: Chỉ th DNA chuẩn; Kênh 10: Mẫu BQCV(+) Kênh 11, 14: Mẫu u trùng ở Hư Y K , : Mẫ ưởng thành ở Hư Y Kênh 15, 16: Mẫ ưởng thành ở Nghệ An; Kênh 17: Mẫu u trùng ở Nghệ An V ế RT-P R ươ ươ ư quy trình RT-P R ẫ ậ . 3. Đánh giá ự ph n bố củ ì ẩ P R ủ ẫ ẫ ệ ươ ệ , ệ QCV ở 5 ỉnh ẩ ẩ P R ư Q V(+) N ư ậ , ủ Q V iền ắc Việ N Theo kết qu RT-PCR th c hiện trên 180 mẫ có 4/5 tỉnh phát hiệ Q V, Đ ện Biên, Bắ G ư c ở 5 tỉnh, chúng tôi thống kê th y , Hư Y N ệ An (hình 4). Hình 4: Phân bố tỉ lệ nhiễm BQCV ở 5 tỉnh khảo sát Có tổng số ươ Bắc Giang có 5 N ệA nhiễ N ư ậy, tỉ lệ nhiễ Q V Kế ơ ế 1624 Q V, Đệ , Hư Y , Riêng Hòa Bình không phát hiện th ì o sát chiếm >15,5%. ứ ủ T ươ A T ă HỘI NGHỊ KHOA HỌC TOÀN QUỐC VỀ SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT LẦN THỨ 6 ỉ ệ % (T ươ , ậ ễ Q Vở ỉ ắ (Đ ệ Vă T n và cs, 2012) S ệ ố ơ ệ ế ă ố ơ Q V ẫ ế ỉ ệ ễ , Sơ L , Đắk Lắk, Hư Y , H N ) ỉ ệ ễ ườ ừ ệ , ư ọ ư ẫ ư nhiễm của nh Q Vở ỉ ắ Kết qu kh o sát còn cho th y Bắ G ố ường h p ong nhiễm nhi u nh t chiếm 36%, Đ ện Biên có tỉ lệ nhiễm cao thứ %, ếp theo là Hư Y N ệ An có số ường h p nhiễm chiếm lầ ư t là 21% và 14%. BQCV có th ệ ết ong ở n nh tỉ lệ lây nhiễm của BQCV lên từ i u tr bệnh. Kết qu u tra tỉ lệ nhiễm BQCV trên th hiện ở hình 5. Hình 5: Tỉ lệ nhiễm BQCV ở ấ ng ĩ ng ưởng thành. Vì vậy việc t l n cho công tác phòng và ưở ư c ƣởng thành V i kết qu ở hình 5, trong số các mẫ ươ , ỉ phát hiệ ư c BQCV ở các mẫu ong ưởng thành mà không th y xu t hiện ở các mẫu u trùng. Kết qu pv ế nghiên cứu của Tentcheva D. và c ng s khi cho r ng BQCV lây nhiễ ưởng thành nhi ơ ở u trùng (Tentcheva D. et al., 2004). Hiệ ư ng BQCV chỉ xu t hiện ở mẫu ong ưởng thành có th trong quá trình t , ườ t thận trọng trong việc chọn e m nh nên u trùng ong ít b nhiễm bệ , ưởng thành có th b lây nhiễ Q V ường truy n nga : ĩ truy n từ cá th ưởng thành này sang cá th ưởng thành khác, ho c do ong tiếp xúc v i thứ ă , nhiễm virus ho c b nhiễ ng vật nguyên sinh Nosema apis hay ve ký sinh Varroa. III. KẾT LUẬN ệc th c hiện quy trình RT-PCR v i c p mồi t thiết kế phát hiện BQCV trên 180 mẫu ong mật ở 5 tỉnh mi n Bắc Việ N T ắc Giang có tỉ lệ nhiễ %, Đ ện Biên nhiễ %, Hư Y ễm 21% và Nghệ An nhiễm 14%. Hòa Bình 0%. T t c các mẫ ươ Q V u là các mẫ ưởng thành. V i việc phát hiện 4/5 tỉ ư 14/90 nhiễm BQCV cho th ơ ch bệnh là r ơ m d ch cần có chiế ư c phát hiện, ki m soát d ch bệnh trên các p thời. 1625