Ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong định lượng tạp đồng phân đối quang dạng R của Valsartan trong dược phẩm

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

Thêm vào BST

Báo xấu

24
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Valsartan được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp. Trong cấu trúc phần tử có một cacbon bất đối xứng, nhưng chỉ có đồng phân S - valsartan có tác dụng dược lý. Đến nay chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng tạp đồng phân đối quang của valsartan trong dược phẩm. Mục tiêu của nghiên cứu nhằm: Phát triển quy trình định lượng đồng thời valsartan và đồng phân đổi quang trong dược phẩm với độ nhạy cao và thời gian phân tích nhanh.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Ứng dụng phương pháp điện di mao quản trong định lượng tạp đồng phân đối quang dạng R của Valsartan trong dược phẩm

Ứ N G D Ụ N G P H Ư Ơ N G PH ÁP ĐIỆN DI M A O Q U Ả N TR O N G ĐỊNH LƯ NG TẠP Đ N G PH ÂN Đ ỐI Q U A N G D Ạ N G R CỦA VALSARTAN TRONG D ư ợ c PHẢM Ts. Nguyễn T hị Ngọc Vân*; Ths. Kyun g R a n L ** TÓ M T T Valsartan được sử dụng trong điều trị tăng huyết áp [1]. Trong cấu trúc phân tử có một cacbon bất đổi xứng, nhưng chỉ có đồng phân Svalsartan có lấc đụng dược lý [2]. Đên nay chưa có nghiên cứu nào sử dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng tạp đồng phân đối quang của valsartan trong được phẩm. Mục tiêu của nghiên cứu nhằm: Phái triển quy írình định lượng đồng thời valsartan và đồng phân đối quang trong dược ph ầ n với độ nhạy cao và thời gian phân tích nhanh. Đối tưọng và phương pháp nghiên cún: Chế phẩm viên nén Valsarect® (160 mg valsartan) and Diovan® (160 mg valsartan) được sàn xuất bời công ty dược phẩm JW (Ansung, Hàn Quốc) và công ty Novartis (Basel, Switzerland). Phương pháp nghiên cứu: Tối ưu hóa các điều kiện điện đi tách đồng thời valsartan và đồng phân đối quang và tiến hành thẩm định quy tr nh định lượng. Từ đó, áp đụng quy tr nh định ỉượng một vài chể phầm trên thị trường. Kết quả: Điều kiện điện di tối ưu gồm dung dịch đệm phosphate 25 mM, pH 8, chứa 10 mM Acetyl(5CD làm chất điện giải nền, điện thế áp đụng là 30 kV ở 30°c. Ibuprofen được sử đụng làm chất chuẩn nội. Quy tr nh đã được thẩm định với khoảng nồng độ là 0,5 30 pg/ml của đồng phân dạng R. Giới hạn phát hiện là 0,01%, giới hạn định lượng là 0,05%, so với nồng độ valsatan 1 mg/mỉ. Tỷ lệ hồi phục của đồng phân R từ 97 99,6% trong chế phẩm chứa valsartan. Quy tr nh được áp đụng để định lượng tạp đồng phân dạng R có trong viên nén chứa valsartan. Kết luận: Quy tr nh định iượng đã thẩm định có tính đặc hiệu, cho độ đdng và độ chính xác cao. Phương pháp được tiến hành đơn giản, tiếl kiệm đung môi hoá chất, đồng then vẫn cho kết quả đáng tin cậy. * Từ khóa: Vaỉsartan; Phương pháp điện di mao quàn; Dạng đồng phân đối quang dạng R. Application o f capillary electrophoresis method fo r determination o f the R-enantiomer ofValsartan as impurity in pharmaceuticalformulation Sum m ary Valsartan is widely applied for treatment of hypertension and administrated as a single isomer (Svalsartan). To the best of our knowledge, the enantiomeric purity determination of Valsartan in commercial products has never been investigated in capillary electrophoresis (CE) method. Thus, the aim of our study is to develop a CE method for simultaneous determination of Valsartan and Renantiomer in pharmaceutical formulation with high sensitivity and short analytical time. Materials and method: Valsarect® tablets (160 mg VAL) were kindly supplied by JW pharmaceutical industries corporation (Korea). Diovan® tablets (160 mg VAL) were manufactured by Novartis (Basel, Switzerland). Method: Optimization of the electrophoretic conditions and method validation. Then apply method for determination of pharmaceutical formulation. Results: optimized conditions included 25 mM phosphate buffer, pH 8.0, containing 10 mM Acelyl(5CD as background electrolyte, an applied voltage of +30 kV and a temperature of 30°c. Ibuprofen was used as internal standard. The assay was validated for the Renantiomer in the range of 0.5 30 ng/mL. The limit of detection was 0.01%, the limit of quantitalion was 0.05%, compared to a concentration of valsartan of 1 mg/ml. Intraday precision varied between 2.57% and 5.6%. Relative standard deviations of interday precision ranged between 4.46% and 6.76% for peak area ratio. The percentage recovery of the Renantiomer ranged between 97.0 to 99.6% in valsarian product. The assay was applied to determine the Renanliomer as an impurity. * Đại học Y Dược cần Th ** Đại học Quẩc gia Kangwon, Hàn Quốc 641
Conclusion: Th basic charact ristics o f th CZEfulfil g n ral validation crit ria and thus th m thod can b us d in routin analysis. It nabl s d t ction as low as 0.01% o f impurity R- nantiom r o f valsartan in drugs. * K y words: Valsartan; Capillary l ctrophor sis m thod; R- nantiom r. LĐẶTVẨNĐẺ V alsartan có tên khoa học là N (l~oxopentyl)N [2’~(lH tetrazol5yl)[l,lb iphenyl]4yi] methyl] Lvalin. Thuốc có tác động ức chế chọn lọc thụ thể type 1 của Angiotensin II (A TI), làm giảm huyết áp và được sử đụng trong điều trị tăng huyét áp [11. Trong cấu trúc phân tử cửa valin, có một cacbon bất đối xống tuy nhiên chỉ có đồng phân Svalsarían có tác dụng được lỷ, đồng phân đối quang của nó (Rvalsartan) được xem như tạp chất trong công thức [2]. Việc nghiên cứu và thiết lập những giới hạn về các tạp chất tồn tại bên cạnh các thành phần có hoạt tính ngày càng trờ nên quan Èrọng đối với ngành dược. So với HPLC, kỹ thuật điện đi mao quản chỉ cần một lượng nhỏ dung môi, chất chọn lọc đối quang và lượng m ẫu nhỏ. Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm như hiệu năng cao, nhiều cơ chế tách khác nhau và linh hoạt trong .chọn lựa và thay đổi dung môi và các chất chọn lọc [3,4]. Cho đến nay, chưa có nghiên cửu nào sử dụng phương pháp điện di mao quản để định lượng tạp đồng phân đối quang của valsartan trong dược phẩm. V vậy, mục tiêu của nghiên cửu nhằm P hát triển m ột quy trình định lượ ng đồng thời valsartan và đồng ph â n đổi quang cửa n trong dược p h ẩ m với độ nhạy cao và ph â n tích n hanh đáp ú n g n h u cầu p h â n tích hiện tại. n> (2) (3) ' H nh 1. Cấu trúc hoá học của valsartan, Rvalsartan và Ibuprofen (chuẩn nội) II. Đ Ố I T Ư Ợ N G VÀ P H Ư Ơ N G P H Á P N G H IÊN c ứ u 2.1. Đ ố i tượng nghiên cứu Chế phẩm viên nén Valsarect® (160 mg valsartan) and Diovan®(160 m g vaỉsartan) được sản xuất bởi côag ty JW Pharmaceutical (Ansung, Hàn Quốc) và công ty Novartis (Basel, Switzerland. Thiết bị phân tích - Máy điện di mao quản Hewlett Packard313(CA, USA) với đầu dò dãy diod quang (DAĐ) sử dụng phần mềm HP3DCE Chemstation để điểu khiển thiết bị và thu thập dữ liệu. Khối phổ kế JEOL (JAPAN), JM S700 được trang bị đầu dò ion hóa điện tử hoạt động ở ché độ ion dương. Phạm vi quét từ 50 500 mỉz. Máy quét phổ đo đường bay của ion (Matrixassisted laser desorption/ionization Time of flight (MALDITOF)). M áy Brucker Avance600 (600.25 MHz, Brucker, Germany) đo phổ *HNMR dùng TMS làm chất đối chiếu. Phổ được ghi ở 600 M Hz với dung môi CD3OD. 648
H a chat, dung môi Tat cả các hóa chất và thuốc thù sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích Chuẩn valsartan được cung cấp bởi công ty dược phẩm JW (Ansung, Hàn Quốc). Chuẩn đồng phân đối “ Acetyỉpcyđodextrin (ApCD) của công ty WackerChemie GmbH (Burghausen, Đức), acyclodextrin (aCD), pcyclodẹxtrin (pCD), ycyclodextrin (yCD), 2hydroxypropylcccycỉodextrm (HP~a~CD) và methylpcyđodextrin (M “P~CD) được cung cấp bời SigmaAldrich, 2(Hyđroxypropyl)~pcyclodexirin (HP“ pCD) được mua từ công ty Fluka (Đức). Acid phosphoric và natri hydroxid được mua từ Công ty Hóa chấÊ tinh khiết Duksan, Hàn Quốc, Dikali dihyđrogenphosphat loại P.A. Nước cất khử khoáng. 2.2. Phư ơng pháp nghiên cứ u 2.2.1. Chu ẩn b ị dung dịch chuẩn đồng phân dạng R của valsartan Rvalsartan được chuẩn bị bằng phản ứng hóa học chuyển dạng đồng phân từ nguyên liệu valsartan (S valsartan). Từ mẫu phản ứng, đồng phân dạng R được phân lập tù hệ thống HPLC bán điều chế. Điều kiện sắc ký: cột Chiralcel ODH (5 Ịim, 10 X 250 mm), nhexane 2propanoI: tr íỉuoroacetic acid (92 : 8 : 0.1, tt/tt/tt) được đùng làm pha động với tốc độ dòng 2.0 ml/phút, bước sóng phát hiện là 220 nm. Sau khi thu được đồng phân dạng R, kiểm ỉra độ tinh khiết bằng hệ thống HPLC phân E ích CỘE Ch ralcel OĐH (5jim, 250 X 4.6 mm, i.d.) và pha động gồm có nhexane:2propanoỉ: trifluoroacetic acid (90:10: 0,1, tt/tưtt), tốc độ dòng ỉà 0.8 ml/phút, ờ bước sóng 220 nm, Xác định cấu trúc của chuẩn Rvaỉsartan bằng phổ MALDITOF M S, ‘H NMR: MALDITOF/EI m/z 436.1973 [M+H3+, m/z 432.1991 [M~H203; lHNMR (CD3OD) 5 7.02 7.66 (aromatic proton ), 4.66 4.76 (U H , CH2 coupling), 4.61 (NH), 4.58 (6H, CH, d), 2.63 (7H, CH, m), 2.20 2.26 (2H, c u 2, m), 1.53 1.66 (3H, CH2, m), 1.25 (4H, CH 2, m), 0.84 1 .0 2 (8,9H, CH3, dd), 0.96 (5H, CH 3,t). V o y a o o r s p a o #1 = N F 1 .0 =>NR(2 .00)=»SWB =>CtiaP = 4 sa .z , 14SSO] (A) 4 S8 .17 9 2 B .3376 4 3 8 .1 9 7 2 4 S 9 .4 24 8 Sao 440 450 4 80 4e8 M a BU(irựz) V o y u g o r S p o c #1 CO.NF1.0=»NH{2.00)=>SM5=O.CT{BP = 4 S 0 .2 , 17027] 4 S 8 .1 6 7 0 (B) 1 4-. 8 ,3 2 9 3 I Mima(m/2) H nh 2. Phổ M A L D ITOF MS của (A) valsartan và (B) đồng phân Rvalsartan So sánh với tài liệu tham khảo [2] và phổ của valsartan (công ty dược phẩm JW ) nhằm xác định chính xác chất chuẩn nhóm nghiên cứu chuẩn bị chính là đồng phân đối quang R của valsarían. 649
2.2.2. C hu ẩn b ị các dun g d ịch chuẩn gốc Dung dịch chuẩn gốc valsartan (10 mg/ml) và Rvalsartan (100 ng/ml) pha ừong dung môi methanol, dung địch chuẩn làm việc được chuẩn bị bằng cách pha loãng trong hỗn hợp methanol : nước (1:1, tt/tt). Nồng độ đung dịch chuẩn Vãlsartan, Rvalsartan và chuẩn nội tương ứng là 1 mg/ml, 10 fig/ml, 1 ịig/mJ. Nồng độ Rvalsartan trong hỗn hợp là 1% so với valsartan, phù hợp với giới hạn cho phép của tạp đồng phân quang học trong chế phẩm (theo Dược điển Mỹ ƯSP 32). 2.2.3. C hu ẩn b ị d u n g dịch th ử Cân 20 viên chế phẩm và nghiền thành bột. Cân một lượng bột tương ứng với 10 m g valsartan, cho vào b nh định mức đung tích 10 ml và hòa tan với khoảng 1 ml ethanol, đem siêu âm trong 15 phút và thêm 1 ml IS, 1 ml hỗn hợp methanol: nước (50:50, tưtt). Tiếp tục đánh siêu âm hỗn hợp trong 15 phút để các chất tan hoàn toàn. Dung dịch được lọc qua giấy lọc W hatman kích thước 0,45 p,m. Tối ưu hóa các điều kiện điện dỉ tách đồng thời vaỉsarỉan và đồng phân đổi quang Khảo sát chọn dẫn xuất cyclodextrin chọn lọc phù hợp Nồng độ dẫn xuất cyclodextrin chọn lọc Nồng độ và pH đệm Nhiệt độ cột và dòng điện thế phù hợp Thẩm định quy trình định lượng Phương pháp thầm định được thực hiện theo hướng đẫn ICH 2005 Q2 (R l) [5] với các tiêu chí gồm tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, tính tuyến tính, giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ chính xác, độ đóng và độ thô của phương pháp. Tính tuyến tính được xây dựng với 6 nồng độ khác nhau của đung dịch đồng phân dạng R. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng dựa trên tín hiệu nhiễu tương ứng 3:1 và 10:1. Quy tr nh định lượng được thẩm định vói khoảng nồng độ từ 0,05 3,0 % hàm lượng của tạp Rvalsartan so với hoạt chất valsartan trong chế phẩm. Thời gian di chuyển (phứt) Cyclođextrin N(mM ) ĨS Valsartan Rvaisartan Ss aCD 10 (ỈCD 10 Y-cD 10 MỊ5CD 10 17.234 16.847 .2.95 AI5CD 10 9.398 10.401 10.817 3.08 HPaCD 10 HPÊCD 10 15.977 16.147 1.26 III. K Ế T QUẢ 3.1- Tối ưu hóa các điều kiện điện di Khảo sát chọn đẫn xuất cyclodextrin chọn lọc phù hợp: Độ phân giải của đồng phân đối quang valsartan là 3,08 khỉ sử dụng AỊ3CD. Bảng 1: các đẫn xuất cyclodextrin chọn lọc được khảo sát cho quy tr nh tách đồng thời các đồng phân đối quang valsarían. Không tách được Nồng độ tối ưu cùa APCD được khảo sát bằng cách thay đổi từ 5 đến 35 mM. Độ phân giải tốt nhất tại nồng độ 10 mM để tách valsartan và đồng phân đạng R. Nồng độ của đệm phosphate được khảo sát trong khoảng 25 100 niM, nồng độ điện giải tối ưu là 25 mM, tại đó độ phân giải phù hợp và thòi gian phân tích 650
ngắn. Khoảng pH từ 6 9 được áp dụng để tối ưu hóa pH của chất điện giải, pH được chọn là 8. Nhiệt độ thay đổi từ 15 30°c, nhiệt độ được chọn ià 30°c. Hiệu quả của điện thế áp dụng được khảo sát bằng cách thay đổi từ 15 30 kV. Khi điện thế tăng iên đến 30 Kv, thời giạn phân tích được rút ngắn lại và pic nhọn hơn. Do đó, điện thế là 30 kV được chọn để tách các đồng phân đối quang của valsartan. Như vậy, điều kiện sắc ký tối ưu bao gồm đệm phosphat 25 mM, pH 8 chứa ApCD 10 mM là chất điện giải nền, nhiệt độ mao quàn ià 30°c và điện thế áp dụng là 30 kV. Điện di đồ đặc trưng của valsartan và đồng phân dạng R được phân tích dưới điều kiện tối ưu (hình 3). A, ,00(2012VA.t o o 1.1^010VANSJVOOto*.0> / (1) / “ (3) (2) o /ì I V . J . ..... •* 2 - é ............... a 7 T* R ' H nh 3. Điện di đồ đặc trưng của hỗn hợp gồm valsartan (1 mg/ml), đồng phân đối quang R nồng độ 0,1% và chuẩn nội nồng độ 0,1% so với nồng độ của hoạt chất chính valsartan Điều kiện tách: cột mao quản silica kích thước 64,5, chiều dài hiệu quả 56 cm, 50 Ịim i.d., đệm phosphat 25 mM, pH 8 và to mM ApCD; điện thế 30 kV; bước sóng phát hiện 205 nm; nhiệt độ cột 30°c. (1) chuẩn nội (ibuprofen); (2) vaisartan; (3) đồng phân R của vaisartan. 3.2. T h ẩm định phư oiìg pháp Khoảng tuyến tính và giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng. ____________________ Thông sổ___________________________________________________ . _______ Phương tr nh hồi quy y = 1.3812 X + 0.1724 Khoảng nồng độ khảo sát % đồng phân R so với n c ™ /™r ^ ___,___ „ //lf, valsartan (lmg/ml) ° ’5 30 ^ /m h Tưcmg ứng 0,05 3,0 (%) R2 1 L.O.D. (% đồng phân R so với vaĩsartan) 0,01 (%) L.O.Q. (% đồng phân R so với valsartan)______________ 0,05 (%) Độ chính xác Độ chính xác (%) Trong ngày (R.S.D, %) Liên ngày (R.S.D, %) 0,1 2,57 6,76 0,8 2,76 4,88 2 5,60 4.46 đúng Lượng chuẩn thêm vào (%) Lưọng t m lại (%) Độ phục hồi (%) Bias (%) 0,08 0.0855 98.04 6.9 0,1 0.1040 96.96 4.Ó 0.12 0.1268 99.61 5.7 3.3. Đ ộ thô của phư ong pháp Độ thô của phương pháp được xác định thông quạ những thay đổi nhỏ so yới điều kiện tối ưu đã khảo sát mà không làm ảnh hưởng đến kết quả định lượng. Để xác định độ thô cùa phương pháp, 4 yếu tố sau được chọn 651
để khảo sát: đệm pH 8 ± 0,2; 10 mM ApCD ± 1; 25 mM đệm phosphate ± 2; điện thé 30 ± 1 kV. Kết quả: những thay đổi nhỏ này không làm thay đổi tỷ ệ điện tích đỉnh của Rvalsartan so vói pic của chuẩn nội. 3.4. ứ n g dụng quy trình đã thẩm định để định lượng chế phẩm chứa valsarỉan Hàm lượng của đồng phân R của valsartan trong viên nén Valsarect và Diovan Chế phẩm Tạp đồng phân Rvalsartan (%) R.S.D (%) Valsarect® 0.116 1.55 L S I S J Va u v t y 0.215 £\ J . Z i IV. BÀN LUẬN Valsartan là dẫn xuất tetrazol chứa gốc aciđ (pKa = 4,73) và gốc carboxylic (pKa = 3,9). Do đó, khoảng pH trung tính được chọn cho phân tích đồng phân quang học với mục đích proton hóa hoàn toàn và hạn chế đòng điện thẩm thấu để quan sát kết quả. Kết quả khảo sát chọn dẫn xuất cycỉođextrin chọn lọc phù hợp được tr nh bày trong bảng 1, điều kiện điện đi được chọn là đệm phosphat 50 mM (pH 7) chứa các dẫn xuất CD (a ,p, y, MỊ3, AỊỈ, H P a and HPpCD). Độ phân giải của đồng phân đối quang valsartan là 2,95 khi sử đụng MỊÌCD và 3,08 khi sử dụng ApCD. Tuy có độ phân giải giống nhau so với MpCD nhưng ApCD được chọn lựa do thời gian phân tích ngắn và tín hiệu cao so với nhiễu. Do tính lưỡng tính của valsartan nên thòi gian lưu chịu ảnh hưởng nhiều bởi pH, v pH quyết định khả năng tích điện âm hay dương của hcrp chất. Khoảng pH từ 6 9 được áp dụng để tối un hóa pH của chất điện giải. Két quả, sự di chuyển của các chất tăng khi giá trị pH tăng, pH quá cao làm tăng dòng EOF do đó, không thuận lợi tách các đồng phân đối quang. Do đó, đệm phoaphat 25 mM tại pH 8 được chọn lựa làm chất điện giải nền tối ưu. Với điều kiện tối ưu vừa được khảo sát, thời gian điện di của valsartan và đồng phân đạng R tương ứng là 5,6 và 5,9 phút. Quy tr nh đã được thẩm định với khoảng nồng độ là 0,5 30 fig/ml của đồng phân dạng R. Giới hạn phát hiện là 0,01%, giới hạn định lượng là 0,05%, so với nồng độ valsatan 1 mg/ml. Độ chính xác trong ngày với giá trị RSD trong khoảng 2,57 “ 5,6%, độ chính xác liên ngày với RSD trong khoảng 4,46 6,76%. Tỷ lệ hồi phục của đồng phân R từ 97 99,6% trong chế phẩm chứa valsartan. Phương pháp đã ứng dụng để định lượng tạp đồng phân đối quang Rvalsartan trong hai chế phẩm viên nén Valsarect ® và Diovan . H àm lượng Rvalsartan được tính toán dựa vào đường chuẩn, 0,22% trong viên Diovan® và 0,12% trong viên Valsarect. Kết quả định lượng cho thấy phương pháp này có tính chọn lọc để phân tích các tạp đồng phân mà không bị ảnh hưởng bời các tá được có trong công thức. V. K É T LUẬN Các kết quả thực nghiệm cho thấy phương pháp điện di mao quản định lượng tạp đồng phân Rvalsartan với các điều kiện đã khảo sát có tính đặc hiệu, cho độ đứng và độ chính xác cao. Phương pháp điện đi mao quản tién hành đơn giản, tiết kiệm dung môi hoá chất, đồng thời vẫn cho kết quả đáng tin cậy. T À I L IỆU T H AM K H Ả O 1. G. Flesch, Ph. Muller, p. Lloyd. Absolute bioavailabiỉity and pharmacokinetics of valsartan, an angiotenin II receptor antagonist in man, Eur. J. Clin. Pharmcol. 52 (1997) 115120. 2. J. Nie, B. Xiang, Y. Feng, D. Wang. Isolation and identification of process impurities in crude valsartan by HPLC, mass spectrometry, and nuclear magnetic resonance Spectroscopy, J. Liq. Chromatogr. R lat. T chnol. 29 (2006) 553568. 3. L. Suntomsuk. Recent advances of capillary electrophoresis in pharmaceutical analysis. Anal Bioanal. Ch m. 398 (2010) 2952. 4. SánchezHernández L., GarciaRuiz c ., Luisa Marina M., Luis Crego A. Recent approaches for enhancing sensitivity in enantioseparations by CE, El ctrophor sis. 31 (2010) 2843. 5. International Conference on Harmonisation of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use, Q2(RI), Valsartaniđat on of Analytical Procedure: methodology, 2005, http://www.ich.org. 652