HỘI NGHỊ KHOA HỌC THƯỜNG NIÊN LẦN THỨ 27 - HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC
28
XÁC ĐỊNH CFRNA TIỀM NĂNG TRONG HUYẾT TƯƠNG
BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG
Phạm Thị Ánh Tuyết1, Nguyễn Ánh Như2, Nguyễn Văn Thiện Chí2,
Nguyễn Hoàng Thiên Phúc2, Nguyễn Tiến Anh2, Trần Thị Trang2,
Trần Lê Sơn2, Đặng Thị Ngọc Dung2
TÓM TẮT4
Mục tiêu: Xác định một số cfRNA(cell free
RNA) lưu hành trong huyết tương và có tiềm
năng là chỉ dấu sinh học mới cho ung thư Đại
trực tràng (UTĐTT).
Đối tượng và phương pháp: 144 mẫu huyết
tương bao gồm 72 bệnh nhân UTĐTT đã được
lựa chọn từ tháng 10/2023 đến tháng 4/2024 tại
Bệnh viện Đa khoa tỉnh Tuyên Quang, Bệnh viện
Đại học Y Hà Nội và Bệnh viện Trung ương
quân đội 108 và 72 mẫu huyết tương người khỏe
mạnh tại viện Di Truyền Y Học. Nghiên cứu sử
dụng công nghệ giải trình tự gen thế hệ mới để
khảo sát mức độ biểu hiện của các RNA tự do
lưu hành trong máu (cfRNA). Dữ liệu chuẩn hóa
được phân tích bằng test Mann–Whitney U để
xác định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về mức
biểu hiện của cfRNA tiềm năng giữa các mẫu từ
bệnh nhân UTĐTT và đối tượng khỏe mạnh.
Kết quả: Nồng độ cfRNA tổng số của 144
đối trượng nghiên cứu không có sự khác biệt có ý
nghĩa thông kê giữa hai nhóm (p = 0,165). Sau
khi giải trình tự gen mẫu cfRNA, phát hiện 569
1Trường Đại học Y Hà Nội
2Viện Di truyền Y Học
Chịu trách nhiệm chính: Phạm Thị Ánh Tuyết
SĐT: 0982032389
Email: phamtuyettq@gmail.com
Ngày nhận bài: 15.8.2024
Ngày phản biện khoa học: 19.8.2024
Ngày duyệt bài: 23.8.2024
Người phản biện: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc
cfRNA biểu hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống
kê giữa hai nhóm (p < 0.05). Trong đó các
cfRNA đến từ gen (MMP9, IL1R2, PGLYRP1,
S100A8, H2AC21) có biểu hiện tăng hơn 2 lần
và các cfRNA đến từ gen (CENPQ, HIP1R,
ALB, LIMCH, CENPF) có biểu hiện giảm hơn 2
lần ở nhóm UTĐTT so với người bình thường.
Kết luận: Nghiên cứu đã bước đầu xác định
được 10 cfRNA tiềm năng đến từ gen (MMP9,
IL1R2, PGLYRP1, S100A8, H2AC21, CENPQ,
HIP1R, ALB, LIMCH1, CENPF ) lưu hành trong
huyết tương và có tiềm năng là các chỉ dấu phân
tử mới cho tầm soát UTĐTT.
Từ khóa: cfRNA huyết tương; sàng lọc
không xâm lấn; ung thư đại trực tràng;
SUMMARY
IDENTIFICATION OF POTENTIAL
cfRNA IN PLASMA OF COLORECTAL
CANCER PATIENT
Objective: Identify some cfRNAs (cell free
RNA) circulating in plasma and have potential as
new biomarkers for colorectal cancer.
Subjects and methods: 144 plasma samples
including 72 colorectal cancer patients were
selected from October 2023 to April 2024 at
Tuyen Quang Provincial General Hospital, Hanoi
Medical University Hospital and Central
Hospital. 108 military personnel and 72 healthy
human plasma samples at the Institute of Medical
Genetics. The study uses new generation gene
sequencing technology to investigate the
expression level of circulating free RNA
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 542 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
29
(cfRNA). Normalized data were analyzed using
the Mann–Whitney U test to determine
statistically significant differences in expression
levels of potential cfRNAs between samples
from colorectal cancer patients and healthy
subjects.
Results: Total cfRNA concentrations of 144
study subjects had no statistically significant
difference between the two groups (p = 0.165).
After gene sequencing of cfRNA samples, 569
cfRNAs were detected showing statistically
significant differences between the two groups (p
< 0.05). In which cfRNAs coming from genes
(MMP9, IL1R2, PGLYRP1, S100A8, H2AC21)
have increased expression more than 2 times and
cfRNAs coming from genes (CENPQ, HIP1R,
ALB, LIMCH, CENPF) have expression
decreased more than 2 times in colorectal cancer
group compared to normal people.
Conclusion: The study has initially
identified 10 potential cfRNAs coming from
genes (MMP9, IL1R2, PGLYRP1, S100A8,
H2AC21, CENPQ, HIP1R, ALB, LIMCH1,
CENPF) circulating in plasma and have potential
as New molecular markers for colorectal cancer
screening.
Keywords: plasma cfRNA; non-invasive
screening; colorectal cancer;
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư Đại trực tràng (UTĐTT) là một
trong những ung thư hay gặp nhất ở đường
tiêu hóa, chiếm 8,5% tất cả các nguyên nhân
tử vong do ung thư7. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc
đứng hàng thứ 6 và tỉ lệ chết đứng hàng thứ 5
ở cả hai giới5. Hiện nay, kỹ thuật sàng lọc
nội soi là tiêu chuẩn vàng trong chẩn đoán
UTĐTT, nhưng do khả năng xâm lấn cao nên
không khả thi. Kháng nguyên CEA được sử
dụng rộng rãi như một dấu ấn sinh học cho
bệnh UTĐTT nhưng thiếu độ nhạy và độ đặc
hiệu2. Do đó, tồn tại một nhu cầu chưa được
đáp ứng đối với các phương pháp phát hiện
không xâm lấn thay thế được phát triển để
chẩn đoán UTĐTT. Ngoài các DNA ngoại
bào có nguồn gốc từ khối u (ctDNA), có
nhiều báo cáo cho rằng các tế bào ung thư
cũng giải phóng RNA ngoại bào (cfRNA)
vào máu ngoại vi3. CfRNA mang đến cơ hội
phát hiện ung thư ở những bệnh nhân có tỷ lệ
phát tán khối u thấp, bởi sự biểu hiện quá
mức của các gen đặc hiệu của khối u có thể
dẫn đến sự khuếch đại tín hiệu RNA có
nguồn gốc từ khối u trong máu. Ngoài ra,
cfRNA có thể được giải phóng vào máu
thông qua các cơ chế khác ngoài quá trình
chết tế bào, như tín hiệu qua trung gian
exosome bởi các tế bào sống6. Nhiều nghiên
cứu gần đây về cfRNA đã tập trung khảo sát
microRNA (miRNA) và messenger RNA
(mRNA) đã chứng minh sự hiện diện của các
phân tử RNA này có liên quan đến ung thư1.
Với mong muốn đóng góp một phần nhỏ vào
sự hiểu biết về mức độ biểu hiện cfRNA lưu
hành trong máu ngoại vi ở bệnh nhân
UTĐTT. Do đó chúng tôi tiến hành nghiên
cứu nhằm: Xác định một số cfRNA lưu
hành trong huyết tương có tiềm năng là các
chỉ dấu phân tử mới cho tầm soát UTĐTT.
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Nghiên cứu mô tả quan sát được thực
hiện trên 144 mẫu huyết tương bao gồm 72
bệnh nhân UTĐTT được xác nhận qua nội
soi và mô bệnh học với giai đoạn từ I đến
IIIA (theo tiêu chuẩn của AJCC VII) đã được
lựa chọn từ tháng 10/2023 đến tháng 04/2024
HỘI NGHỊ KHOA HỌC THƯỜNG NIÊN LẦN THỨ 27 - HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC
30
tại Bệnh viện Đa khoa tỉnh Tuyên Quang,
bệnh viện Đại học Y Hà Nội và bệnh viện
Trung ương quân đội 108 và 72 mẫu huyết
tương người khỏe mạnh được xác nhận qua
nội soi và âm tính với xét nghiệm chẩn đoán
sớm ung thư, không có tiền sử mắc các bệnh
ung thư tại viện Di Truyền Y Học. Các bệnh
nhân đã qua điều trị hoặc/và có loại ung thư
khác trong cơ thể, có truyền máu trong vòng
3 tháng trước khi lấy mẫu không nằm trong
đối tượng nghiên cứu.
2.2. Phương pháp phân tích cfRNA
Mẫu máu (10ml) ngoại vi từ hai nhóm sẽ
được thu nhận trong ống Streck Cell-Free
DNA BCT. Huyết tương được tách bằng ly
tâm 2 đợt: 2.500 x g trong 10 phút và 16.000
x g trong 10 phút và được sử dụng để tách
chiết cfRNA. Sau khi tách chiết, sử dụng bộ
kit “SMARTer® Stranded Total RNA-Seq
Kit v3 - Pico Input Mammalian” để tạo thư
viện, cfRNA được chuyển đổi thành cDNA
nhờ enzyme Reverse Transcriptase. Trình tự
UMI và adapter được gắn vào các phân tử
dsDNA nhờ vào phân tử 5’ PCR primer và 3’
PCR primer. Thư viện dsDNA được tạo ra
với trình tự adapter ở hai đầu được tạo thành.
Trình tự adapter bao gồm trình tự tương
thích với giá thể giải trình tự P5 và P7; trình
tự index i5 và i7, vùng trình tự tương thích
với read primer 1 và vùng trình tự tương
thích với read primer 2. Để đánh giá mối
tương quan giữa nồng độ cfRNA đầu vào và
chất lượng thư viện, chúng tôi so sánh tỉ lệ
thay đổi lượng nucleic acid trước và sau khi
chuẩn bị thư viện dựa vào thông số log2([cf-
RNA]/[nồng độ sản phẩm sau PCR]) với các
lượng cfRNA đầu vào khác nhau. Một chu
kỳ PCR gồm 3 bước cơ bản như sau: biến
tính; bắt cặp giữa mồi và DNA khuôn mẫu;
tổng hợp tiếp tục phần còn lại của DNA
khuôn mẫu. Trong nghiên cứu này xác định
số chu kì PCR tối ưu cho quy trình chuẩn bị
thư viện. Mẫu được chạy giải trình tự trên hệ
thống giải trình tự thế hệ mới MGI
(DNBSEQ-G400)”. Thư viện sau khi được
giải trình tự, trình tự adapter được loại bỏ
bằng phần mềm Trimomatic. Sau đó các lần
đọc giải được kiểm tra chất lượng bằng phần
mềm FASTQC và Picard.
2.3. Phân tích số liệu
Dữ liệu chuẩn hóa được phân tích bằng
test Mann–Whitney U để xác định sự khác
biệt có ý nghĩa thống kê giữa các mẫu từ
bệnh nhân UTĐTT và đối tượng khỏe mạnh.
2.4. Đạo đức nghiên cứu
Nghiên cứu đã được thông qua của Hội
đồng đạo đức của Trường Đại học Y Hà Nội,
với số chứng nhận: 1016/GCN-
HĐĐĐNCSYH-ĐHYHN.
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu trên 144 đối trượng nghiên
cứu, trong đó 72 đối tượng là người khỏe
mạnh có 55,6% là nam, tuổi trung bình là
58,35±5,52 và 72 đối tương là bệnh nhân
UTĐTT trong đó bệnh nhân nam 59,7%, tuổi
trung bình là 63,82±13,89. Trong số 72 bệnh
nhân UTĐTT có 43 trường hợp u ở đại tràng
59,7% và 29 trường hợp u ở trực tràng
40,3%. Phần lớn có giai đoạn trước điều trị
thuộc giai đoạn III với tỷ lệ 88,9%, giai đoạn
II là 8,3% và giai đoạn I là 2,8% (bảng 1).
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 542 - THÁNG 9 - SỐ CHUYÊN ĐỀ - 2024
31
Bảng 1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
Đặc điểm
UTĐTT
Khỏe mạnh
n (%)
n (%)
Cỡ mẫu
72
72
Tuổi (TB±SD)
63,82±13,89
58,35±5,52
Giới tính
Nam
43 (59,7)
40 (55,6)
Nữ
29 (40,3)
32 (44,4)
Giai đoạn
Giai đoạn I
2 (2,8)
Giai đoạn II
6 (8,3)
Giai đoạn IIIA
64 (88,9)
Vị trí khối u
Đại tràng
43 (59,7)
Trực tràng
29 (40,3)
Ghi chú: n: Số lượng mẫu; TB; Trung
bình; SD: Độ lệch chuẩn; %: Tỷ lệ phần trăm
So sánh nồng độ cfRNA tổng số, nồng độ
thư viện DNA giữa nhóm bệnh nhân UTĐTT
và nhóm khỏe mạnh. Chúng tôi thấy, nồng
độ cfRNA tổng số không có sự khác biệt có
ý nghĩa thống kê giữa hai nhóm (p = 0,165),
tuy nhiên nồng độ sau khi tạo thư viện DNA
có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với (p<
0,05) (hình 1).
Hình 1: So sánh nồng độ cfRNA và nồng độ sau tạo thư viện DNA giữa hai nhóm
Để mô tả đặc điểm biểu hiện các cfRNA,
toàn bộ số lượng cfRNA thu được từ hai
nhóm đã được tiến hành giải trình tự. Chúng
tôi thu được 20066 cfRNA trong đó có 569
cfRNA có sự khác biệt về mức độ biểu hiện
với (p < 0,05); 62 cfRNA có biểu hiện tăng và
507 cfRNA có biểu hiện giảm ở nhóm
UTĐTT. Những cfRNA có biểu hiện tăng
khác biệt với log2FC > 1 được biểu diễn bằng
chấm màu xanh lá, những cfRNA có biểu
hiện giảm khác biệt có log2FC< -1 được biểu
diễn bằng chấm màu xanh dương (hình 2).
HỘI NGHỊ KHOA HỌC THƯỜNG NIÊN LẦN THỨ 27 - HỘI HÓA SINH Y HỌC HÀ NỘI VÀ CÁC TỈNH PHÍA BẮC
32
Hình 2: Mức độ biểu hiện gen giữa nhóm khỏe mạnh và UTĐTT
Để tìm hiểu những cfRNA tiềm năng,
chúng tôi lựa chọn 10 cfRNA có log2FC lớn
nhất và p-value nhỏ nhất trong số 569 gen có
(p<0,05), so sánh mức độ biểu hiện của 10
cfRNA này trên hai nhóm thấy có 5 cfRNA có
biểu hiện tăng (MMP9, IL1R2, PGLYRP1,
S100A8, H2AC21) ở nhóm bệnh nhân
UTĐTT và 5 gen có biểu hiện giảm (CENPQ,
HIP1R, ALB, LIMCH1 và CENPF) ở nhóm
bệnh nhân UTĐTT (hình 3).
Hình 3: Mức độ biểu hiện của 10 gen có Log2FC cao nhất và p-value nhỏ nhất
IV. BÀN LUẬN
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực
hiện phân tích về cfRNA huyết tương lưu
hành của 144 đối trượng nghiên cứu, trong
đó 72 đối tượng là người khỏe mạnh và 72
đối tương là bệnh nhân UTĐTT. Về độ tuổi,
so sánh với tác giả Nana Jin và cộng sự, đối
tượng nghiên cứu của chúng tôi có tuổi trung
bình thấp hơn, nhóm bệnh nhân UTĐTT có
tuổi trung bình 63,82±13,89, nhóm khỏe
mạnh có tuổi trung bình 58,35±5,52. Phân bố
về giới tính tương đối đồng đều ở cả hai
nhóm người khỏe mạnh có 55,6% là nam,
nhóm bệnh nhân UTĐTT trong đó bệnh nhân
nam 59,7%, và khá tương đồng với nghiên
cứu Nana Jin4. Trong số 72 bệnh nhân