vietnam medical journal n02 - APRIL - 2020
90
bệnh viện Daklak 1998 ‐ 2002", Tạp chí Y tế Công
cộng. 3(3), tr. 23-26.
3. Nguyễn Thúy Quỳnh (2004), "Mô hình chấn
thương dựa vào số liệu bệnh viện tại 6 tỉnh của
Việt Nam", Tạp chí Y tế Công cộng. 2(2), tr. 45-49.
4. Lâm Thị Thu Tâm, Susan Norwood và Trần
Thiện Trung (2013), "Kiến thức và thái độ của
người dân về sơ cứu bỏng tại quận Tân Phú, thành
phố Hồ Chí Minh", Tạp chí Y hc thành phố Hồ Chi
MInh. 17(4), tr. 223-228.
5. Nguyễn Thị Như Tú, Trần Thị Xuân Tâm và Lê
Thị Ánh Hồng (2019), "Khảo sát thực trạng và
một số yếu tố liên quan tai nạn bỏng nhập viện tại
khoa Ngoại Trung tâm Y tế An Nhơn tỉnh Bình
Định, năm 2018", Tạp chí Điều dưỡng Việt Nam.
27, tr. 42-47.
6. Adil, Syed Omair, et al. (2016), "Pattern of
unintentional burns: A hospital based study from
Pakistan", Burns. 42(6), pp. 1345-1349.
7. Chirongoma, F., Chengetanai, S., and
Tadyanemhandu, C. (2017), "First aid practices,
beliefs, and sources of information among
caregivers regarding paediatric burn injuries in
Harare, Zimbabwe: A cross-sectional study",
Malawi Med J. 29(2), pp. 151-154.
8. JS, Han Kim DH (1998), "A survey of the types
of burns in children and motherʹs preventive
attitudes to, and knowledge of burns", Korean J
Child Health Nurs. 4(1), pp. 97-104.
9. Organization, World Health (2018), Burns,
accessed 25/2/2018, from http://
www.who.int/mediacentre/factsheets/fs365/en/.
XÁC ĐỊNH CHỈ SỐ FF TRONG ĐỊNH LƯỢNG AND
PHÔI THAI TỰ DO MÁU MẸ BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR
Đặng Tiến Trường1, Nguyễn Thị Hương1, Nguyễn Duy Bắc1
TÓM TẮT22
Mục tiêu: Thiết lập kỹ thuật Real-Time PCR (qRT-
PCR) xác định chỉ số ff trong định lượng ADN phôi thai
tự do trong máu mẹ. Đối tượng và phương pháp
nghiên cứu: cfDNA được tách chiết từ mẫu huyết
tương của thai phụ. Tối ưu hóa phản ứng realtime
PCR xác định số bản copy của gen HBB và SRY. Xác
định chỉ số ff. Kết quả: Thiết lập được kỹ thuật qRT-
PCR và xây dựng được đường chuẩn để định lượng
gen SRY, HBB với R và E tối ưu. Áp dụng Đã tính được
tỷ lệ ffNI19040901 (SD2) = 14,329%. Kết luận: Xây dựng
thành công kỹ thuật qRT-PCR giúp xác định chỉ số ff
trong kiểm soát chất lượng của kỹ thuật NIPT.
Từ khóa:
realtime PCR; cfDNA; cffDNA
SUMMARY
DETERMINING FF INDEX FOR QUANTIFICATION
OF CELL-FREE FETAL DNA IN MATERNAL
BLOOD BY REAL-TIME PCR TECHNIQUE
Objective: Establishing the qRT-PCR technique to
determine the ff index which is applied for quantifying
fetal DNA in maternal blood. Subjects and
methods: cfDNA was extracted from plasma samples
of pregnant women. Realtime PCR optimization
determines the number of copies of HBB and SRY
genes. Determination of ff index. Results: establishing
qRT-PCR and the standard line to quantify SRY, HBB
gene with optimal R and E. Applied calculated ff of
clinical sample was14.329%. Conclusion: Successful
development of the qRT-PCR technique to determine ff
index in quality control of the NIPT technique.
1Hc viện Quân y
Chịu trách nhiệm chính: Nguyễn Duy Bắc,
Email: nguyenduybac@vmmu.edu.vn
Ngày nhận bài: 3.2.2020
Ngày phản biện khoa hc: 2.4.2020
Ngày duyệt bài: 10.4.2020
Keywords:
realtime PCR; cfDNA; cffDNA
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Sàng lc trước sinh không xâm lấn (Non-
invasive prenatal testing-NIPT) dựa trên DNA tự
do của thai nhi (cffDNA) trong huyết tương của
thai phụ là kỹ thuật xác định lệnh bội nhiễm sắc
thể chính xác, hạn chế được nhiều rủi ro so với
kỹ thuật xâm lấn [3]. Phương pháp này có độ
nhạy và đặc hiệu cao, an toàn cho thai nhi, thai
phụ. Đặc biệt, kỹ thuật phát hiện bất thường từ
rất sớm, từ tuần thứ 8 của thai kỳ nên là lựa
chn tin cậy của các nhà tư vấn di truyền [3].
Hiện nay, ngoài các phương pháp di truyền
phổ biến để xác định lệch bội trước sinh, NIPT
đang là sự lựa chn tin cậy đối với các trường
hợp hiếm muộn, có thai thông qua hỗ trợ sinh
sản [3]. Tuy nhiên, NIPT cần xác định chỉ số ff
(fetal faction) để kiểm soát chất lượng, hạn chế
âm tính giả. Chỉ số ff là tỷ lệ lượng DNA của thai
nhi (cell free fetal DNA) và tỷ lệ ADN tự do của
mẹ (cell free DNA-cfDNA) trong máu mẹ. Xác
định ff bằng Real-Time PCR (qRT-PCR) có độ
chính xác cao. Nó được dùng nhiều trong giai
đoạn chuẩn hóa kỹ thuật NIPT và kiểm định chất
lượng kết quả NIPT[1]. NIPT có độ chính xác cao
chỉ khi ff đạt đến ngưỡng nhất định. Một số thai
phụ có chỉ số ff thấp, kết quả NIPT sẽ không
đáng tin cậy do tỷ lệ âm tính giả tăng cao [3].
Thông thường NIPT yêu cầu ff phải lớn hơn 4%
[3]. Nghiên cứu này nhằm thiết lập kỹ thuật
qRT-PCR ứng dụng trong xác định chỉ số ff, giúp
kiểm soát chất lượng NIPT trong nghiên cứu
cũng như thực hành lâm sàng.
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 489 - THÁNG 4 - SỐ 2 - 2020
91
II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng. Các mẫu huyết tương của
thai phụ mang thai nam từ 9 đến 16 tuần được
thu từ Trung tâm Tư vấn Di truyền của Đại hc Y HN.
2.2. Phương pháp
- Tách chiết ADN: cfDNA được tách chiết
bằng bộ kít QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit
(QIAGEN), theo khuyến cáo của nhà sản xuất.
Nồng độ cfDNA được định lượng bộ kit Qu-bit
- Phản ứng qRT-PCR: mục tiêu của phản ứng
PCR nhằm định lượng cffDNA thông qua khuếch
đại vùng SRY của nhiễm sắc thể Y. Định lượng
cfDNA toàn phần thông qua vùng gen trên gen
giữ nhà HBB. Phản ứng qRT-PCR khuếch đại hai
vùng gen tương đồng. Tổng thể tích 25µl gồm
Quantitect Probe PCR Mix (1X); primer và probe
SRY lần lượt là 400, 400, 200µM đối với phản
ứng khuếch đại vùng SRY; primer và probe HBB
lần lượt là 400, 400, 200µM đối với khuếch đại
vùng HBB; ADN và nước vừa đủ.
Trình tự mồi và probe của SRY-F: 5’-
TCCTCAAAAGAAACCGTGCAT-3; SRY-R: 5’–
AGATTAATGGTTGCTAAGGACTGGAT-3’; Probe-SRY:
5’- FAM- CACCAGCAGTAACTCCCCACAACCTCTTT-
TAMRA-3’. HBB gồm: HBB-F: 5’-
GTGCACCTGACTCCTGAGGAGA-3’; HBB-R: 5’-
CCTTGATACCAACCTGCCCAG-3’ và Probe –HBB: 5’-
FAM-AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGG-TAMRA-3’.
Chu trình nhiệt phản ứng realtime PCR gồm
biến tính ở 95oC trong 15 phút; 50 chu kỳ gồm
94oC trong 15 giây và 60oC trong 60 giây trên hệ
thống RotoQ của hãng Qiagen. Sản phẩm
khuếch đại được kiểm tra kích thước bằng điện
di trên gel agarose 2%.
Chất chuẩn là trình tự tham chiếu của vùng
SRY và vùng HBB có kích thước lần lượt tương
ứng là 78bp và 102bp được tổng hợp bởi PHUSA
Bio – Chemistry. Chất chuẩn được pha loãng theo
cơ số 10 về các nồng độ 106;105;104; 103; 102.
Xác định định lượng cffDNA trong máu mẹ
dựa trên chỉ số ff (fetal faction) là lượng
cffDNA/cfDNA. Số bản copy của NST X (nx); số
bản copies NST Y (ny): Công thức tính fetal
faction (ff) dựa theo tác giả Roy Strave năm
2018 như sau: ff (%)=100*2ny/(nx- ny).[4] (1)
III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Kết quả tối ưu nồng độ và thành
phần phản ứng qRT-PCR
Phản ứng qRT-PCR cần tiến hành tối ưu
thành phần và chu trình nhiệt của phản ứng.
Trong nghiên cứu này, dựa vào thành phần và
chu trình nhiệt khuyến cáo của nhà sản xuất, sau
nhiều lần tối ưu, chúng tôi thu được chu trình
nhiệt và thành phần phản ứng đã trình bày ở
phần phương pháp. Kết quả khuếch đại vùng
SRY và HBB được thể hiện trên Hình 1 và 2.
Sản phẩm qRT-PCR được điện di trên gel
agazose 2%. Kết quả trên Hình 1 cho thấy các
băng sản phẩm 2, 3, 4 của vùng HHB có kích
thước là 102bp; băng 6, 7, 8 của vùng SRY có
kích thước là 78bp. Số 1, 5 là mẫu chứng âm
không có băng sản phẩm. Kết quả này phù hợp
với tính toán lý thuyết. Nhưng vậy chúng tôi đã
khuếch đại thành công vùng SRY và HBB.
Hình 1: Kết quả sản phẩm qRT-PCR của hai gen
HBB và SRY trên agarose
Kết quả khuếch đại vùng SRY và HBB bằng
phản ứng qRT-PCR được thể hiện trên Hình 2.
Phản ứng khuếch đại gen HBB và SRY có Ct lần
lượt là 22,36 và 21,89, là một đường cong tuyến
tính có đầy đủ 4 pha đó là pha nền, pha mũ, pha
tuyến tính và pha ổn định [5]. Do vậy, từ hình
ảnh 1 và hình ảnh 2 chúng tôi có thể khẳng định
rằng thành phần phản ứng và chu trình nhiệt của
phản ứng qRT-PCR là hoàn toàn tối ưu.
Hình 2: Kết quả tối ưu quy trình khuếch đại gen
HBB (BG) và gen SRY (NIS).
3.2. Kết quả xây dựng đường chuẩn gen
của phản ứng qRT-PCR. Theo khuyến cáo,
đường chuẩn của phản ứng qRT-PCR được cho là
tối ưu khi R2 = 0.999; E nằm trong khoảng 90%-
110% [5].
Kết quả xây dựng đường chuẩn lần 1
(SD1)
vietnam medical journal n02 - APRIL - 2020
92
A. gen SRY (NIS)- SD1
B. gen HBB(BG)- SD1
Hình 3: Hình ảnh kết quả tối ưu đường chuẩn của phản ứng qRT-PCR
Kết quả từ hình 3A và 3B cho thấy kết quả xây dựng đường chuẩn của gen HBB với R2 = 0.99229 và
E = 88%; gen SRY có R = 0.99907, R2 = 0.99814 và E= 91%. Đường chuẩn của SRY có các thông số
tối ưu [5]. Đường chuẩn của gen HHB có hiệu suất thấp hơn ngưỡng khuyến cáo. Yếu tố hiệu suất
phản ứng chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố, đặc biệt yếu tố thao tác trong trộn hóa chất, chuẩn bị mẫu.
A. gen SRY (NIS)- SD2
B. gen HBB(BG)- SD2
Hình 4: Kết quả tối ưu đường chuẩn của phản ứng qRT-PCR
Kết quả cho thấy đường chuẩn gen HBB có hệ số tương quan R2 = 0,998; hiệu suất phản ứng E =
90%. Đường chuẩn khuếch đại gen SRY có hệ số tương quan R2 = 0,99; hiệu suất phản ứng E =
112% phù hợp với tiêu chuẩn khuyến cáo[5]. Quy trình xây dựng đường chuẩn tối đã được tối ưu.
3.3. Kết quả tính tỷ lệ ff
Kết quả xác định chỉ số ff của mẫu NI19040901 trên Hình 5.
A. gen SRY (NIS)
B. gen HBB(BG)
Hình 5: Kết quả tối ưu đường chuẩn của phản ứng qRT-PCR
Để tính chỉ số ff, 01 mẫu nghiên cứu được khảo sát là NI19040901. Kết quả xác định được số bản
copies của gen HBB (BG) là 7,5*103 copies và gen SRY (NIS) là 4,7*102 copy. Tỷ lệ ff được xác định
theo công thức (1) là ffNI19040901(SD1) = 14,329%.
IV. BÀN LUẬN
Phân tích định lượng gen SRY, HBB bằng
phản ứng qRT-PCR đã được báo cáo bởi nhiều
tác giả là một kỹ thuật chính xác, nhanh chóng
và đáng tin cậy để xác định tỷ lệ ff trong sàng
lc trước sinh không xâm lấn (NIPT) [2]. Kết quả
ước lượng ff là yếu tố quan trng trong kiểm
soát chất lượng của NIPT, đặc biệt trong kiểm
soát âm tính giá. Có nhiều kỹ thuật xác định ff
nhưng kỹ thuật qRT-PCR là kỹ thuật có độ chính
TẠP CHÍ Y HỌC VIỆT NAM TẬP 489 - THÁNG 4 - SỐ 2 - 2020
93
xác cao hơn cả. Kỹ thuật có giá trị rất lớn trong
giai đoạn thiết lập phương pháp sàng lc không
xâm lấn NIPT.
Trong tối ưu phản ứng qRT-PCR, kết quả
khuếch đại gen HBB và gen SRY là những đường
cong tuyến tính, đường chuẩn có R và R2 lần
lượt là 0.99614 và R2 = 0.99229; R = 0.99907 và
R2 = 0.99814 là các thông số tối ưu. Xây dựng
đường chuẩn của kỹ thuật qRT-PCR, thông số R
và R2 quan trng. Ngoài ra, hiệu suất là thông số
rất quan trng để đánh giá một phản ứng có đạt
tối ưu hay không. Hiệu suất của một phản ứng
tốt cần thuộc khoảng từ 90%-110%[5]. Hiệu
suất của phản ứng (E) trong phản ứng khuếch
đại gen NIS ở đương chuẩn lần 1 (SD1) đạt 91%
là tối ưu. Hiệu suất phản ứng khuếch đại gen BG
ở đương chuẩn lần 1(SD1) đạt 88% thấp hơn
ngưỡng khuyến cáo. Sau khi tối ưu, hiệu suất phản
ứng khuếch đại gen SRY và HBB đã đạt tối ưu [5].
Áp dụng kỹ thuật qRT-PCR xây dựng được,
chỉ số ff xác định được trong mẫu nghiên cứu là
14,329%. Kết quả này đảm bảo nhờ chỉ số R và
E trong khuếch đại gen SRY và HBB được tối ưu
(Hình 5). Trong xét nghiệm NIPT, ff ≥ 4% là giá
trị ngưỡng quan trng, cho thấy kết quả xác
định lệch bội đáng tin cậy. Nếu ff thấp hơn, kết
quả NIPT không đáng tin cậy[6]. Chỉ số ở giai
đoạn đây là một kết quả tốt, nằm trong ngưỡng
xét nghiệm sàng lc trước sinh không xâm lấn
NIPT của Fiorentino và cộng sự năm 2016 [3].
Theo Xu-Ping Xu và cộng sự năm 2016, h
kết luận rằng đối với các phương pháp NIPT hiện
tại thì yêu cầu tỷ lệ ff ≥ 4% nếu tỷ lệ ff thấp hơn
4% thì tỷ lệ thất bại của các thí nghiệm tiếp theo
sẽ cao [6]. Đây là ngưỡng được áp dụng phổ
biến được áp dụng trong kiểm soát chất lượng
của NIPT[3]. Kỹ thuật qRT-PCR trong nghiên cứu
này nhằm kiểm soát chất lượng kết quả NIPT
trong quá trình xây dựng NIPT và kiểm soát
trong xét nghiệm.
Tuy nhiên, kỹ thuật qRT-PCR xác định ff chỉ
có thể áp dụng được trường hợp thai nam. Các
trường hợp mang thai nữ, không sử dụng được
phương pháp này. Tuy nhiên, kỹ thuật này có độ
chính xác cao hơn so với các phương pháp ước
lượng từ phân tích dữ liệu giải trình tự thế hệ
mới hiện tại. Vì vậy, xác định ff bằng kỹ thuật
này ở giai đoạn xây dựng qui trình và kiểm soát
chất lượng của NIPT [3],[1],[6].
V. KẾT LUẬN
Xây dựng thành công quy trình kỹ thuật qRT-
PCR giúp xác định chỉ số ff trong kiểm soát chất
lượng của kỹ thuật NIPT.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. S. L. Kinnings, J. A. Geis và cs. (2015),
"Factors affecting levels of circulating cell-free fetal
DNA in maternal plasma and their implications for
noninvasive prenatal testing", Prenat Diagn. 35(8),
tr. 816-22.
2. Lyn S Chitty và YM Dennis Lo (2015),
"Noninvasive prenatal screening for genetic
diseases using massively parallel sequencing of
maternal plasma DNA", Cold Spring Harbor
perspectives in medicine. 5(9), tr. a023085.
3. Francesco Fiorentino, Sara Bono và cs.
(2016), "The importance of determining the limit
of detection of non‐invasive prenatal testing
methods", Prenatal diagnosis. 36(4), tr. 304-311.
4. Roy Straver (2018), "Bioinformatic Approaches
to Detecting Copy Number Variation in Next
Generation Sequencing Data for Clinical Diagnostics".
5. Life Technologies (2012), Real-time PCR handbook.
6. Xu-Ping Xu, Hai-Yan Gan và cs. (2016), "A
method to quantify cell-free fetal DNA fraction in
maternal plasma using next generation sequencing:
Its application in non-invasive prenatal chromosomal
aneuploidy detection", PloS one. 11(1).
ĐIỀU TRỊ GÃY KÍN THÂN XƯƠNG ĐÙI NGƯỜI LỚN BẰNG ĐINH
NỘI TỦY CÓ CHỐT KHÔNG MỞ Ổ GÃY DƯỚI MÀN TĂNG SÁNG
Trần Trung Dũng1,2, Lê Văn Nam2, Phạm Sơn Tùng2
TÓM TẮT23
1Ttrường đại hc Y Hà Nội
2Bệnh viện đa khoa Saint Paul
Chịu trách nhiệm chính: Trần Trung Dũng
Email: dungbacsy@dungbacsy.com
Ngày nhận bài: 4.2.2020
Ngày phản biện khoa hc: 3.4.2020
Ngày duyệt bài: 9.4.2020
Phẫu thuật đinh nội tủy xương đùi có chốt dưới
màn tăng là sự lựa chn hàng đầu trong gãy thân
xương đùi. Từ tháng 1 năm 2017 đến tháng 12 năm
2018, 54 bệnh nhân độ tuổi từ 16 đến 55 đã được
phẫu thuật tại khoa Chấn thương Chình Hình bệnh
viện Saint Paul. Sau phẫu thuật kết quả tốt đạt 96%,
không có kết quả kém. Có thể có một số biến chứng
xảy ra trong mổ như nắn xương khó, gãy xương phức
tạp hơn, chốt không vào lỗ,…. Từ nghiên cứu này,
chúng tôi rút ra một số kinh nghiệm trong chỉ định, kỹ
thuật và điều kiện cần thiết để phẫu thuật thành công.