B C Đ U XÁC Đ NH Đ C TR NG PHÂN T VÀ CH C NĂNG CÁC GENE NGƯỚ Ầ Ị Ặ Ư Ử Ứ Ứ
VIÊN LIÊN QUAN Đ N TÍNH KHÁNG B NH GH C DO VI KHU NẾ Ệ Ẻ Ủ Ẩ
STREPTOMYCES SCABIES KHOAI TÂY B NG TIN SINH H C VÀ CÔNG NGHỞ Ằ Ọ Ệ
MIRNA
Nguy n Th Thùy Linh, Nguy n Th Ph ng Th o*, Nguy n Th Th yễ ị ễ ị ươ ả ễ ị ủ
Đ i h c Nông Nghi p Hà N iạ ọ ệ ộ
*Liên h : B môn Công ngh sinh h c Th c v t, Khoa CNSH, ĐH NNHN; Email:ệ ộ ệ ọ ự ậ
ntpthao@hua.edu.vn
TÓM T TẮ
Gene TXR1 ởArabidopsis thaliana mã hóa cho m t protein có vai trò trong s đi u hòa v nộ ự ề ậ
chuy n thaxtomin A - tác nhân chính gây ra b nh gh c khoai tây vào trong t bào. Proteinể ệ ẻ ủ ế
TXR1 có các trình t t ng đ ng cao trên các loài th c v t khác nhau, th m chí trên c đ ng v tự ươ ồ ự ậ ậ ả ộ ậ
và ng i. Tườ rình t b o t n c a ự ả ồ ủ TXR1 (t v trí 204 đ n v trí 554 trên mRNA ừ ị ế ị TXR1) đã đ cượ
nhân dòng và xác đ nh trình t trên gi ng khoai tây Atlantic, đ ng th i xác đ nh trình t này cũngị ự ố ồ ờ ị ự
có 3 intron và 4 exon. Bên c nh đó, m t trình t khác cũng có kh năng liên quan đ n c chạ ộ ự ả ế ơ ế
kháng/nhi m b nh gh c khoai tây là CV470003.1 cũng đã đ c nhân dòng. AmiRNA là côngễ ệ ẻ ủ ượ
c hi u qu cho vi c làm câm gene, ng d ng trong nghiên c u ch c năng th c v t. D a vàoụ ệ ả ệ ứ ụ ứ ứ ở ự ậ ự
khung ath-miR319a precursor, c u trúc vector mang trình t amiRNA-1 đ c hi u cho gene m cấ ự ặ ệ ụ
tiêu là CV470003.1 đã thi t k . C u trúc này sau đó đ c chuy n vào khoai tây đ đánh giá tácế ế ấ ượ ể ể
đ ng c a amiRNA-1 đ n s bi u hi n c a gen m c tiêu. ộ ủ ế ự ể ệ ủ ụ
T khóaừ: amiRNA, common scab, miRNA, thaxtomin A, TXR1 gene.
Đ T V N ĐẶ Ấ Ề
Trong s nhi u b nh gây h i trên khoai tây, ố ề ệ ạ b nh gh gây h i b i vi khu n ệ ẻ ạ ở ẩ Streptomyces
scabies là m t trong nh ng b nh nghiêm tr ng, phân b r ng và x y ra h u h t các vùng tr ngộ ữ ệ ọ ố ộ ả ở ầ ế ồ
khoai tây trên th gi i ế ớ (Lambert và Loria, 1989). B nh gây nh h ng nghiêm tr ng đ n năngệ ả ưở ọ ế
su t và ph m ch t c . Theo đi u tra c a Đ ng Th Dung và c ng s (2003), h u h t các vùngấ ẩ ấ ủ ề ủ ặ ị ộ ự ầ ế
tr ng khoai tây Vi t Nam đ u b nh h ng b i b nh này. Thaxtomin A đ c cho là nguyênồ ở ệ ề ị ả ưở ở ệ ượ
nhân gây b nh gh c khoai tây ệ ẻ ủ ở (Delserone và c ng s , 1991; ộ ự Acuna và c ng s , 2001ộ ự ). Năm
2003, Scheible và c ng s công b phát hi n c a h v đ t bi n kháng v i thaxtomin A ộ ự ố ệ ủ ọ ề ộ ế ớ ở
Arabidopsis, g i là ọtxr1. Ông cũng tìm đ c gen t ng ng v i đ t bi n này là ượ ươ ứ ớ ộ ế TXR1, gen này mã
hoá cho m t protein m i có trình t b o th t ng đ ng v i t t các các sinh v t nhân th t.ộ ớ ự ả ủ ươ ồ ớ ấ ậ ậ
Protein đ c mã hóa b i gene ượ ở TXR1 đ c gi thuy t là có vai trò đi u hòa ho c tham gia vào quáượ ả ế ề ặ
trình v n chuy n thaxtomins vào trong t bào. D a vào các thông tin đã công b , nghiên c u nàyậ ể ế ự ố ứ
đ c ti n hành nh m xác đ nh ượ ế ằ ị ở khoai tây có gene TXR1 hay không và gene này có vai trò như
th nào trong c ch kháng hay nhi m b nh gh c khoai tây?ế ơ ế ễ ệ ẻ ủ ở
Công ngh miRNA đ c phát tri n g n đây đã và đang t ra ệ ượ ể ầ ỏ là công c hi u qu đ đi uụ ệ ả ể ề
hoà c ch các gen đ n ho c các nhóm gen khác nhau trên c s các trình t đ c hi u. Vi c sứ ế ơ ặ ơ ở ự ặ ệ ệ ử
d ng thành công các miRNA nhân t o đ đi u hoà c ch các gen cũng đã đ c công b trên cácụ ạ ể ề ứ ế ượ ố
cây hai lá m m nh Arabidopsis, cà chua và thu c lá và cây m t lá m m nh lúa (Parizotto vàầ ư ố ộ ầ ư
c ng s , 2004; Alvarez và c ng s , 2006; Schwab và c ng s , 2006; Warthmann và c ng s ,ộ ự ộ ự ộ ự ộ ự
2008). Trong đ tài này, chúng tôi đã s d ng các công c tin sinh h c, nhân dòng và miRNAề ử ụ ụ ọ
nh m b c đ u tìm hi u v trình t và ch c năng c a các gen ng viên cho TXR1. Các phátằ ướ ầ ể ề ự ứ ủ ứ
hi n v gene ệ ề TXR1 khoai tây s góp ph n cung c p thông tin v c s di truy n c a tínhở ẽ ầ ấ ề ơ ở ề ủ
kháng, làm sáng t c ch ho t đ ng c a thaxtomins khoai tây m c phân t và t đó s gópỏ ơ ế ạ ộ ủ ở ở ứ ử ừ ẽ
ph n phát tri n các chi n l c phòng ch ng b nh m i trên khoai tây và các cây tr ng khác. ầ ể ế ượ ố ệ ớ ồ
V T LI U VÀ PH NG PHÁP NGHIÊN C UẬ Ệ ƯƠ Ứ
V t li u:ậ ệ
DNA chi t tách t mô lá gi ng atlanticế ừ ố
Các vector
Vector khung- pRS300 ch a ứath-miR319a precursor (cung c p b i Detlef Weigel, Departmentấ ở
of Molecular Biology, Max Planck Institute for Developmental Biology, Germany). Vector nhân
dòng pZET1.2/blunt (Fermentas). Vector bi u hi n pPS1 (cung c p b i Walter de Jong, Cornellể ệ ấ ở
University, USA).
Tìm ki m, phân tích các trình t t ng đ ngế ự ươ ồ
S d ng công c BLAST trên NCBI v i các c s d li u khác nhau (EST, HTGS) và côngử ụ ụ ớ ơ ở ữ ệ
c ORF Finder đ phân tích các đ c tr ng c a trình t .ụ ể ặ ư ủ ự
Nhân dòng gene và đ c trình tọ ự
S d ng vector pZET1.2/blunt (Fermentas). Xác đ nh trình t nhân dòng theo b kit Bigdyeử ụ ị ự ộ
terminator v3.1 và k t qu gi i trình t đ c x lý b ng ph n m m DNAstar (Lasergene v7.1).ế ả ả ự ượ ử ằ ầ ề
Thi t k vector bi u hi n th c v t mang amiRNAế ế ể ệ ở ự ậ (miRNA nhân t o)ạ
S d ng WMD3 đ thi t k amiRNA đ c thù cho trình t mRNA m c tiêu. Nhân dòng cácử ụ ể ế ế ặ ự ụ
amiRNA s d ng vector RS300 theo quy trình c a Rebecca Schwab và c ng s (2006). S nử ụ ủ ộ ự ả
ph m nhân dòng đ c tái t h p vào vector pPSI đ t o nên vector bi u hi n th c v t ẩ ượ ổ ợ ể ạ ể ệ ở ự ậ
K T QU VÀ TH O LU NẾ Ả Ả Ậ
Tìm ki m, phân tích các trình t t ng đ ngế ự ươ ồ
K t qu tìm ki m trình t các gene ng viên ế ả ế ự ứ TXR1 khoai tây cho th y có tính đ ng nh tở ấ ồ ấ
cao gi a CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1 v i trình t gene ữ ớ ự TXR1 (NM_115790) ở
Arabidopsis (l n l t là 72%, 72%, 71%) và v i trình t gene ng viên ầ ượ ớ ự ứ TXR1 cà chuaở
(AI781901.1) (l n l t là 96%, 96%, 95%). K t qu căn trình t m c đ nucleotide và aminoầ ượ ế ả ự ở ứ ộ
acid cho th y: vùng b o th n m v trí 138-482 trên CX161514.1, v trí 114-458 trênấ ả ủ ằ ở ị ị
DN849236.1 và 112-156 trên CK852098; t ng ng v i v trí 204-554 trên trình t mRNA c aươ ứ ớ ị ự ủ
gene TXR1 (NM_115790.2) Arabidopsis và v trí 158-502 trên trình t gene ng viênở ị ự ứ TXR1 càở
chua (AI781901.1).
K t qu tìm ki m trình t gene ng viên ế ả ế ự ứ TXR1 khoai tây cũng cho th y, trình tở ấ ự
CV470003.1 cũng có tính đ ng nh t cao v i trình t ồ ấ ớ ự TXR1 (NM_115790.2) Arabidopsis (71%)ở
và v i trình t gene ng viên ớ ự ứ TXR1 cà chua (95%). Đây là trình t cDNA thu đ c khi c khoaiở ự ượ ủ
tây b nhi m b nh gh . B i v y r t có th trình t này cũng có liên quan đ n s c m ngị ễ ệ ẻ ở ậ ấ ể ự ế ự ả ứ
kháng/nhi m b nh gh trên khoai tây.T các trình t t ng đ ng trên, 2 nhóm trình t đ c l aễ ệ ẻ ừ ự ươ ồ ự ượ ự
ch n nh sau:ọ ư
- Nhóm 1: g m các trình t CX161514.1, DN849236.1, CK852098.1. ồ ự
- Nhóm 2: g m trình t CV470003.1ồ ự
Trên Arabidopsis thaliana, d a vào s so sánh trình t cDNA (NM_115790.2) v i trình tự ự ự ớ ự
genome (At3g59280, mã s genbank: AI112727.1) đã ch ng t r ng gene ố ứ ỏ ằ TXR1 bao g m 3 và 4ồ
exon (Scheible và c ng s , 2003). K t qu phân tích các trình t gene ng viên ộ ự ế ả ự ứ TXR1 khoai tâyở
cho th y các trình t này cũng mang 3 intron và 4 exon.ấ ự
Nhân dòng các gene ng viênứ
11 c p m i khác nhau đ c thi t k cho nhóm trình t thặ ồ ượ ế ế ự ứ
nh t đ th c hi n nhân dòng b ng PCR, trong đó c p m i F7-ấ ể ự ệ ằ ặ ồ
R7 thi t k cho v trí vùng b o th , các c p m i còn l i đ cế ế ị ả ủ ặ ồ ạ ượ
thi t k nh m nhân toàn b chi u dài c a gene. ế ế ằ ộ ề ủ
K t qu PCR cho th y, ch có c p m i F1-R5, F1-R6 và F7-ế ả ấ ỉ ặ ồ
R7 cho s n ph m, trong đó ch có s n ph m nhân b ng c p m iả ẩ ỉ ả ẩ ằ ặ ồ
F7-R7 cho s n ph m có kích th c nh d đoán (900-950 bp)ả ẩ ướ ư ự
(Hình 1). V i kích th c này có th trình t nhân đ c có ch aớ ướ ể ự ượ ứ
2 intron (intron s 2, 3) và 3 exon (s 2, 3, 4).ố ố
Đ ki m ch ng d đoán v c u trúc c a trình t v a nêu, cácể ể ứ ự ề ấ ủ ự ừ
s n ph m này đ c xác đ nh trình t . K t qu cho th y, ch có s nả ẩ ượ ị ự ế ả ấ ỉ ả
Hình 1 : S n ph m ả ẩ PCR v iớ
c p m i F7-R7ặ ồ trên gi ngố
Atlantic
ph m đ c nhân lên b ng c p m i F7-R7 (g i là At-F7R7) liên quan đ n trình t m c tiêu. S n ph mẩ ượ ằ ặ ồ ọ ế ự ụ ả ẩ
này có kích th c 917 nts, đúng nh d đoán c a v kích th c c a s n ph m. K t qu BLAST choướ ư ự ủ ề ướ ủ ả ẩ ế ả
th y trình t này có tính đ ng nh t cao nh t v i các trình t ng viên ấ ự ồ ấ ấ ớ ự ứ TXR1 khoai tây là 100%. Phânở
tích trình t cũng cho th y trình t này đ ng nh t v i các trình t EST c a các gene ng viên ự ấ ự ồ ấ ớ ự ủ ứ TXR1 c aủ
khoai tây 3 vùng, ch ng t trình t này có ch a 3 exon (exon 2, 3, 4) và 2 intron (intron 2, 3). ở ứ ỏ ự ứ
Nh v y , có th k t lu n đo n At-F7R7 nhân đ c chính là môt ph n c a gene ư ậ ể ế ậ ạ ượ ầ ủ TXR1 m c tiêu.ụ
Trình t At-F7R7 đ c thi t k n m trên vùng b o th và đ c đ t tên TXR1-potato-1.ự ượ ế ế ằ ả ủ ượ ặ
K t qu BLAST và k t qu căn trình t nucleotide và amino acid d đoán, cùng v i thông tinế ả ế ả ự ự ớ
d đoán c u trúc polypeptide c a ự ấ ủ TXR1-potato-1 cho th y, đo n ấ ạ TXR1-potato-1 có ch a 2 intronứ
(intron 2 và 3) có kích th c l n l t là 412, 104 nts và 3 exon (exon 2, 3, 4) có kích th c l n l tướ ầ ượ ướ ầ ượ
là 91, 131, 119 nts. Chúng tôi đ a ra mô hình c u trúc đo n ư ấ ạ TXR1-potato-1 nh hình 2.ư
M c tiêu ti p theo là thi tụ ế ế
k các amiRNA d a vào thôngế ự
tin chính xác v trình t vùngề ự ở
b o th c a gene đã có đả ủ ủ ể
nghiên c u ch c năng c a geneứ ứ ủ
TXR1 trong tính kháng/nhi mễ
b nh gh khoai tây. ệ ẻ ở
T ng t đ i v i trình tươ ự ố ớ ự
CV470003.1, chúng tôi đã thi tế
k c p m i nhân dòng F3-R3.ế ặ ồ
K t qu PCR (hình 3) choế ả
th y, kích th c c a s n ph mấ ướ ủ ả ẩ
phù h p v i d đoán là đo n nhân dòng có th mang c 3 intron ho c mang 2 intron (intron 2+3).ợ ớ ự ạ ể ả ặ
Thi t k vector bi u hi n mang amiRNA đ c hi u cho trình t CV470003.1ế ế ể ệ ặ ệ ự
Ph n mêm WMD3 đã đ a ra 28 amiRNA ti m năng choầ ư ề
trình t CV470003.1. Trong đó amiRNA1 có trình tự ự
UAUCAUUCGUGCAGUUUGCAU đ c l a ch n đ th c hi n cácượ ự ọ ể ự ệ
nghiên c u ti p theo. ứ ế
S d ng công c blast trong WMD3, phát hi n amiRNA-1ử ụ ụ ệ
còn có kh năng “làm câm” m t trình t m c tiêu khác làả ộ ự ụ
DN589430.1 là m t cDNA đ c t o ra t c a khoai tây b nhi mộ ượ ạ ừ ủ ị ễ
b nh m c s ng. M c đ ng nh t c a trình t CV470003.1 vàệ ố ươ ứ ồ ấ ủ ự
DN589430.1 là 91% (BLAST). Do v y, các trình t này có thậ ự ể
cùng liên quan đ n c ch kháng/nhi m tr c tác nhân gây b nhế ơ ế ễ ướ ệ
b t kỳ. ấamiRNA-1 đã đ c nhân dòng và đã thi t k thành côngượ ế ế
vector bi u hi n th c v t pPS1 có mang amiRNA-1. Vectorể ệ ở ự ậ
này sau đó đ c chuy n vào cây khoai tây đ đánh giá tác đ ngượ ể ể ộ
c a nó đ n s bi u hi n c a gen ủ ế ự ể ệ ủ TXT1.
K T LU NẾ Ậ
1. S d ng các công c tin sinh, đã mô ph ng đ c c u trúc c a gene ng c viên ử ụ ụ ỏ ượ ấ ủ ứ ử TXR1 ở
khoai tây có ch a 4 exon v i đ l n l n l t là 61, 91, 131, 119 nts và 3 intron v i kích th cứ ớ ộ ớ ầ ượ ớ ướ
t ng ng là 3053, 412, 104 nts. ươ ứ
2. B ng th c nghi m, đã nhân dòng và xác đ nh trình t thành công trình t b o t n c a ằ ự ệ ị ự ự ả ồ ủ TXR1
(t v trí 204 đ n v trí 554 c a mRNA ừ ị ế ị ủ TXR1) trên gi ng khoai tây Atlantic; đo n nhân đ cố ạ ượ
có kích th c 917 bp, mã hóa cho 114 aa, đ c d đoán là mang 2 intron (kích th c t ngướ ượ ự ướ ươ
ng 412, 104 nts) và 3 exon (kích th c t ng ng 91, 131, 119 nts).ứ ướ ươ ứ
3. Đã nhân dòng thành công b ng PCR trình t CV470003.1 t khoai tây gi ng Atlantic v i kíchằ ự ừ ố ớ
th c kho ng 4255 bp và d đoán gene quy đ nh trình t này có 4 exon và 3 intron.ướ ả ự ị ự
4. Thi t k thành công vector nhân dòng mang trình t amiRNA-1 đ c hi u v i m c tiêu làế ế ự ặ ệ ớ ụ
CV470003.1.
Hình 2: Mô hình c u trúc đo n ấ ạ TXR1-potato-1 nhân dòng t Atlanticừ
3’ UTR: trình t 3’ không mã hóaự
E2, E3, E4: exon 2, exon 3, exon 4
I2, I3: intron 2, intron 3
Các v trí đ c đánh s theo trình t ị ượ ố ự TXR1-potato-1
Hình 3: K t qu nhân ế ả PCR
trình tự CV470003.1
trên gi ng Atlantic b ng c pố ằ ặ
m i F3, R3ồ
TÀI LI U THAM KH OỆ Ả
1. Acuna, I.A., Strobel, G.A., Jacobsen, B.L., and Corsini, D.L. (2001). Glucosylation as a
mechanism of resistance to thaxtomin A in potatoes. Plant Sci. 161:77–88.
2. Alvarez, J.P., Pekker, I., Goldshmidt, A., Blum, E., Amsellem, Z. and Eshed, Y. (2006).
Endogenous and synthetic microRNAs stimulate simultaneous, efficient, and localized
regulation of multiple targets in diverse species. Plant Cel. 18:1134–1151.
3. Delserone, L.M., Loria, R., and Arias, I. (1991). Correlation between susceptibility of potato
cultivars to Streptomyces scabies and sensitivity to thaxtomin A. Phytopathol. 81:1193–1200.
4. Dung, D.T., Yoshida. H., and Suyama, K. (2003). Susceptibility of different potato varieties
against potato common scab in vietnam. J. ISAAS. 9(2):40-46.
5. Lambert, D.H., and Loria, R. (1989). Streptomyces scabies sp. nov., nom. rev. Intern. J. Syst.
Bacteriol. 39:387-392.
6. Parizotto, E.A., Dunoyer, P., Rahm, N., Himber, C., and Voinnet, O. (2004). In vivo
investigation of the transcription, processing, endonucleolytic activity, and functional relevance
of the spatial distribution of a plant miRNA. Genes Dev. 18:2237–2242.
7. Scheible, W.R., Barbara, F., Kochevenko, A., Schindelasch, D., Zimmerli, L., Somerville, S.,
Loria, R., and Somerville, C.R. (2003). An Arabidopsis Mutant Resistant to Thaxtomin A, a
Cellulose Synthesis Inhibitor from Streptomyces Species. Plant Cel. 15(8):1781–1794.
8. Schwab, R., Ossowski, S., Riester, M., Warthmann, N., and Weigel, D. (2006). Highly specific
gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis. Plant Cel. 18:1121–1133.
9. Warthmann, N., Chen, H., Ossowski, S., Weigel, D., and Herve, P. (2008). Highly Specific
Gene Silencing by Artificial miRNAs in Rice. PLoS ONE 3(3):e1829.
INITIALLY DETERMINE MOLECULAR CHARACTERISTICS AND FUNCTION OF
CANDIDATE GENES RELATED TO RESISTANCE OF POTATOES TO COMMON SCAB
CAUSED BY STREPTOMYCES SCABIES VIA BIOINFORMATICS AND MIRNA
TECHNOLOGY
Nguyen Thi Thuy Linh, Nguyen Thi Phuong Thao*, Nguyen Thi Thuy
Hanoi university of Agriculture
*For correspondence: Department of Plant Biotechnology, Faculty of Biotechnology, HUA;
email: ntpthao@hua.edu.vn
Summary
TXR1 gene of Arabidopsis thaliana encodes a novel protein with homologs in all fully
sequenced eukaryotes and this protein regulates the transport of thaxtomin A – the major toxin
which causes common scab into plant cells. The conserved sequence of TXR1 gene (nucleotides 204
to 554 on mRNA of TXR1 gene) of the potato variety Atlantic was cloned and sequenced
successfully. This sequence contains three introns and four exons. Additionally, another sequence
potentially related to the genetic mechanism of resistance/susceptibility to common scab,
CV470003.1 was amplified by PCR successfully. AmiRNAs have been proved to be an effective
tool for specific gene silencing in plants and amiRNA technology has become a powerful tool for
functional genomics research. An amiRNA vector that contains amiRNA-1 which is specific for
CV470003.1 was generated based on the structure of ath-miR319a. This vector was used to transform to
potato in order to determine the affect of designed amiRNA-1 contruct on the target TXR1 gene.
Keywords: amiRNA, common scab, miRNA, thaxtomin A, TXR1 gene.