Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CAROTENOID<br />
TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐANG LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG<br />
Võ Xuân Hoài*, Phan Thanh Dũng*, Trần Cát Đông*<br />
<br />
TÓM TẮT<br />
Đặt vấn đề: Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm giàu carotenoid đang lưu hành như: carotenoid<br />
từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua), tảo và gần đây là từ vi khuẩn, tuy nhiên trong nước chưa có quy trình định<br />
lượng cụ thể cho các chế phẩm này.<br />
Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu quy trình chiết tách<br />
carotenoid từ vi khuẩn và xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho các chế phẩm đang lưu hành bằng<br />
phương pháp HPLC với hệ thống Knauer Smarline 2500 system.<br />
Kết quả và bàn luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy, phá vỡ tế bào bằng tán trong bể siêu âm và chiết<br />
carotenoid với chloroform - methanol (2:1) cho hiệu quả chiết tách carotenoid từ vi khuẩn cao nhất (94,82%).<br />
Hàm lượng carotenoid từ vi khuẩn và các chế phẩm được xác định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ<br />
nhạy cao, trên cột RP C18 ở nhiệt độ phòng, hệ dung môi pha động là acetonitril- methanol - dichloromethal<br />
(70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với tốc độ dòng 1ml /phút, thể tích tiêm 20 μl, bước sóng phát<br />
hiện tại 450 nm. Phương pháp HPLC cho tương thích cao với các thông số sắc ký có RSD < 2%. Phương pháp<br />
được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích hợp với tỷ lệ phục hồi của carotenoid từ chế phẩm đạt 99,83%.<br />
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công trình định lượng bằng kỹ thuật HPLC để kiểm tra hàm lượng<br />
carotenoid trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường. Qui trình được thẩm định và áp dụng thành công<br />
trên một số sinh khối vi khuẩn giàu carotenoid và chế phẩm chứa carotenoid trong nước và ngoại nhập.<br />
Từ khóa: HPLC, carotenoid, betacaroten, thực phẩm chức năng,<br />
<br />
ABSTRACT<br />
ESTABLISHMENT OF A METHOD FOR CAROTENOIDS QUANTIFICATION<br />
IN SOME COMMERCIAL PRODUCTS USING HPLC METHOD<br />
Vo Xuan Hoai, Phan Thanh Dung, Tran Cat Dong<br />
* Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 182 - 187<br />
Introduction: Nowadays, there are many rich carotenoid products on the market. Carotenoids in these<br />
products come from plants: carrot, gac fruit (Momordica cochinchinensis), tomato, seaweed and recently from<br />
bacteria. Although they are popularly used but the suitable quantity method is not yet available for these products<br />
in Vietnam.<br />
Materials and methods: In this work, we studied methods for extraction of carotenoid from bacteria and<br />
developed the carotenoid quantitative method for products containing carotenoid based on HPLC with Knauer<br />
Smarline 2500 system.<br />
Results and disscussions: The result show that, cells breaking process by using ultrasonic bath and extract<br />
carotenoid with chloroform/methanol (2:1) are the most effective with performance about 94,82%. The content of<br />
carotenoids from bacteria and other products were determined by HPLC method, that is rapid and high sensitivity<br />
with RP C18, at room temperature. The mobile phase is acetonitrile – methanol - dichloromethal (70:20:10, v/v/v)<br />
* Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br />
Tác giả liên lạc: DS. Phan Thanh Dũng<br />
ĐT: 0983957158<br />
<br />
182<br />
<br />
Email: dungpharm@yahoo.com<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
supplemented with ammonium acetate 10 mM, with flow 1ml/minute, inject volume 20 μl, UV detector at 450<br />
nm. The HPLC method is highly suitable with RSD of chromatography parameters were less than 2%. The<br />
method was validated for the acceptable accuracy and precision with the recovery rate is 99.83%.<br />
Conclusion: We have succesfully established an HPLC protocol for qualification of carotenoid in commercial<br />
products. The protocol has been validated and applied to determining the carotenoid contents of several different<br />
bacterial biomasses and some domestic and imported products.<br />
Keywords: HPLC, carotenoid. Betacarotene, functional food<br />
DD1.1, Bacillus indicus HU36, Bacillus infantis<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
AT14, độ ẩm 5%, mật độ tế bào 1010 CFU/g sinh<br />
Carotenoid là nhóm sắc tố terpenoid phổ<br />
khối, được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Vi<br />
biến trong tự nhiên, nhất là trong các sinh vật<br />
sinh Công nghệ Dược – Khoa Dược – ĐH Y<br />
sống được dưới ánh nắng mặt trời bao gồm thực<br />
Dược TP HCM, 41 Đinh Tiên Hoàng Q1.<br />
vật, động vật, vi khuẩn, tảo, nấm…(3). Kể từ khi<br />
Các chế phẩm chứa carotenoid trên thị<br />
được phát hiện cho đến nay, carotenoid được<br />
trường:<br />
Dầu gấc Vinaga (Số lô 4306, hạn sử<br />
ứng dụng rộng rãi để làm phụ gia tạo màu cho<br />
dụng 6/2013), dầu gấc Gấc Việt Nam (Số lô<br />
thực phẩm, bổ sung những chất dinh dưỡng,<br />
4609, hạn sử dụng 6/2013), Super Antioxidant<br />
giúp gia tăng giá trị thẩm mỹ cho cho ngành<br />
của Holland & Barrett (Số lô 375324, hạn sử<br />
thủy sản (7). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu dịch<br />
dụng 1/2015), Mỹ, Beta-Carotene của Holland<br />
tễ học và kết quả thực nghiệm đã chứng minh<br />
& Barrett (Số lô 375221, hạn sử dụng 1/2015),<br />
các carotenoid với vai trò là chất chống oxi hóa<br />
Mỹ, Tảo Spiruline của Teva S. Switzerland (Số<br />
đã mang lại lợi ích cho sức khỏe con người bằng<br />
lô 4609, hạn sử dụng 9/2013).<br />
cách ngăn ngừa hay trì hoãn các bệnh mạn tính<br />
Khảo sát phương pháp phá vỡ màng tế bào<br />
như ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh<br />
vi khuẩn<br />
thể và một số bệnh khác. Do đó, carotenoid cũng<br />
đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều<br />
Chúng tôi tiến hành khảo sát các phương<br />
trong lĩnh vực dược, mỹ phẩm(1).<br />
pháp phá vỡ màng tế báo vi khuẩn như nghiền<br />
Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế<br />
phẩm giàu carotenoid được lưu hành như:<br />
carotenoid từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua),<br />
carotenoid từ tảo, carotenoid từ vi khuẩn<br />
(3)…tuy nhiên hàm lượng carotenoid trong các<br />
chế phẩm này thường chỉ ghi chung chung,<br />
không được xác định chính xác và không thể xác<br />
định hoạt tính của các chế phẩm này. Do đó vấn<br />
đề đặt ra là phải xây dựng một quy trình chiết<br />
tách và xác định hàm lượng carotenoid trong chế<br />
phẩm cũng như xác định các loại carotenoid có<br />
trong chế phẩm để xác định hoạt tính của chế<br />
phẩm. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề<br />
tài: “Xây dựng qui trình định lượng carotenoid<br />
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”.<br />
<br />
ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU<br />
Đối tượng nghiên cứu<br />
Bột sinh khối vi khuẩn Bacillus marisflavi<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
trong nitơ lỏng, tán siêu âm đầu dò, dùng bể<br />
siêu âm và sử dụng lysozym với lượng sinh khối<br />
khảo sát là 200 mg. dung môi chiết là cloroform<br />
và methanol với tỷ lệ 1:2 (3,4,5).<br />
<br />
Khảo sát dung môi chiết carotenoid từ bột<br />
sinh khối vi khuẩn<br />
Bảng 1: Tỉ lệ các dung môi chiết<br />
Dung môi<br />
<br />
Cloroform<br />
<br />
Methanol<br />
<br />
Tỉ lệ<br />
<br />
Thể tích (ml)<br />
<br />
2,5<br />
1,67<br />
3,33<br />
1,25<br />
3,75<br />
<br />
2,5<br />
3,33<br />
1,67<br />
3,75<br />
1,25<br />
<br />
1:1<br />
1:2<br />
2:1<br />
1:3<br />
3:1<br />
<br />
Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ dung môi<br />
chiết carotenoid với nhiều tỉ lệ khác nhau, dựa<br />
trên hai dung môi chính là methanol và<br />
cloroform, nhằm tìm ra tỉ lệ dung môi chiết tối<br />
ưu nhất. Chiết tách carotenoid theo quy trình đã<br />
<br />
183<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
khảo sát ở trên với tỉ lệ hệ dung môi bổ sung<br />
được thay đổi như Bảng 1.<br />
<br />
Phương pháp chiết carotenoid từ chế phẩm<br />
Đối với các chế phẩm có chứa carotenoid<br />
(carotenoid được chiết ở dạng bột hoặc dầu)<br />
chiết theo quy trình sau: cân 1/3 lượng dầu<br />
(bột) trong 1 viên chế phẩm vào ống Falcon 50<br />
ml. Thêm vào 10 ml NaOH 1 N pha trong<br />
methanol, lắc rung mạnh trong 1 phút. Thêm<br />
10 ml aceton, lắc rung cho đều. Để ở nhiệt độ<br />
phòng trong 15 phút. Thêm 10 ml n-hexan, lắc<br />
rung cho đều. Thêm 10 ml nước khử khoáng,<br />
lắc rung cho đều. Để ở nhiệt độ phòng trong<br />
10 phút. Ly tâm 9600 vòng /10 phút ở 4oC. Thu<br />
lớp n-hexan. Lớp n-hexan sau đó loại nước<br />
bằng Na2SO4. Dịch chiết với n-hexan được bay<br />
hơi đến cắn. Hòa lại cắn vào 1 ml cloroform và<br />
4 ml dung môi pha động(2,1).<br />
<br />
Xây dựng quy trình định lượng carotenoid<br />
bằng phương pháp HPLC và thẩm định<br />
quy trình định lượng<br />
Chúng tôi tiến hành thăm dò hệ dung môi<br />
pha động để tách tốt nhất các loại carotenoid có<br />
trong dịch chiết. Dựa vào tính chất carotenoid là<br />
chất kém phân cực nên chọn hệ dung môi pha<br />
động kém phân cực. Các hệ dung môi pha động<br />
khảo sát gồm có: acetonitril-methanol,<br />
acetonitril-methanol-dicloromethan là các hệ<br />
dung môi thường sử dụng để phân tích<br />
carotenoid với đầu dò UV, bước sóng phát hiện<br />
450 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút trên hệ thống<br />
Knauer Smarline 2500 system. Các mẫu chuẩn<br />
được chọn gồm các loại carotenoid thông dụng<br />
thuộc 2 nhóm xanthophyl và carotenoid:<br />
astaxanthin, canthaxanthin, lutein, lycopen và βcaroten để tiến hành quá trình thăm dò hệ dung<br />
môi để chọn hệ pha động tối ưu(1,3,5).<br />
<br />
chúng tôi tiến hành hẩm định quy trình định<br />
lượng và ứng dụng qui trình đã thẩm định để<br />
định lượng trên một số chế phẩm đang lưu hành<br />
trên thị trường(1-Error! Reference source not found.).<br />
<br />
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br />
Khảo sát các phương pháp chiết, tách<br />
carotenoid<br />
Qua kết quả thực nghiệm nhận thấy,<br />
phương pháp phá vỡ màng tế bào trong bể<br />
siêu âm và chiết bằng hỗn hợp cloroform methanol tỉ lệ 2:1 cho hiệu quả cao nhất với tỷ<br />
lệ hồi phục 94,82%.<br />
<br />
Xây dựng quy trình định lượng carotenoid<br />
bằng phương pháp HPLC<br />
Dựa vào tính chất phân cực của carotenoid<br />
(nhóm caroten không phân cực và nhóm<br />
xanthophyl phân cực) để thăm dò hệ dung môi<br />
phân tích bằng phương pháp HPLC. Tiến hành<br />
thăm dò hệ dung môi pha động gồm acetonitril methanol, acetonitril – methanol - dicloromethan<br />
với các tỉ lệ khác nhau để tách tốt nhất hỗn hợp 5<br />
chất chuẩn gồm: astaxanthin, canthaxanthin,<br />
zeaxanthin, lycopen và β- caroten. Kết quả khảo<br />
sát cho thấy hệ dung môi phân tích carotenoid<br />
tốt nhất là acetonitril – methanol - dicloromethan<br />
(70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM<br />
với thời gian phân tích là 12 phút (Hình 1-G).<br />
Dung môi pha động isocratic bổ sung<br />
amonium acetat 10 mM với A. ACN -MeOH<br />
(50:50,tt/tt), B. ACN -MeOH (60:40,tt.tt), C. ACN<br />
-MeOH (70:30,tt/tt), D. ACN - MeOH (80:20,tt/tt),<br />
E. ACN - MeOH (90:10,tt/tt), F. ACN –MeOH DCM (70:25:5, tt/tt/tt), G. ACN –MeOH -DCM<br />
(70:20:10, tt/tt/tt), H. ACN –MeOH -DCM<br />
(70:15:15, tt/tt/tt).<br />
<br />
Sau khi xây dựng quy trình định lượng<br />
<br />
184<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
B<br />
β-caroten<br />
<br />
Lycopen<br />
<br />
β-caroten<br />
<br />
Lycopen<br />
Lycopen<br />
<br />
Β-caroten<br />
<br />
Canthaxanthin<br />
<br />
F<br />
<br />
H<br />
<br />
Β-caroten<br />
<br />
Zeaxanthin<br />
Canthaxanthin<br />
<br />
Astaxanthin<br />
<br />
Β-caroten<br />
<br />
Lycopen<br />
<br />
β-caroten<br />
<br />
Astaxanthin<br />
<br />
Lycopen<br />
<br />
Lycopen<br />
<br />
Zeaxanthin<br />
<br />
Canthaxanthin<br />
<br />
β-caroten<br />
<br />
Astaxanthin<br />
<br />
Lycopen<br />
Zeaxanthin<br />
<br />
Zeaxanthin<br />
Astaxanthin<br />
<br />
Canthaxanthin<br />
Zeaxanthin<br />
<br />
Canthaxanthin<br />
<br />
D<br />
<br />
E<br />
<br />
G<br />
Astaxanthin<br />
<br />
Zeaxanthin<br />
<br />
β-caroten<br />
<br />
C<br />
<br />
Canthaxanthin<br />
<br />
Astaxanthin<br />
<br />
Lycopen<br />
<br />
A<br />
<br />
Hình 1: Thăm dò hệ dung môi<br />
<br />
Thẩm định quy trình phân tích<br />
Tính phù hợp hệ thống<br />
Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký (n=6)<br />
Loại carotenoid<br />
Astaxanthin<br />
Canthaxanthin<br />
Zeaxanthin<br />
Lycopen<br />
β-caroten<br />
<br />
n=6<br />
<br />
RSD %<br />
<br />
Rt<br />
0,193<br />
0,196<br />
0,318<br />
0,230<br />
0,193<br />
<br />
Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc<br />
ký chọn lựa là phù hợp cho việc phân tích định<br />
lượng carotenoid với RSD của thời gian lưu,<br />
diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết của cột sắc ký<br />
đều nằm trong giới hạn RSD ≤ 2%. Các thông số<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
S<br />
1,973<br />
1,273<br />
1,996<br />
1,786<br />
1,839<br />
<br />
(N)<br />
0,355<br />
0,852<br />
1,188<br />
1,881<br />
4,276<br />
<br />
As<br />
1,808<br />
1,908<br />
1,989<br />
1,954<br />
1,914<br />
<br />
Rs<br />
1,726<br />
1,913<br />
1,163<br />
1,779<br />
1,910<br />
<br />
như hệ số đối xứng nằm trong giới hạn từ 0,8≤<br />
As ≤1,5 và độ phân giải (Rs) lớn hơn 1,5. Như<br />
vậy phương pháp phân tích carotenoid đạt được<br />
tính phù hợp hệ thống.<br />
<br />
185<br />
<br />
Β-caroten<br />
<br />
Lycopen<br />
<br />
Zeaxanthin<br />
<br />
Astaxanthin<br />
<br />
Canthaxanthin<br />
<br />
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br />
<br />
Absorbance (mAU)<br />
<br />
Nghiên cứu Y học<br />
<br />
Time (min)<br />
<br />
Hình 2: Sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống<br />
Europher RP C18 (250 mm, 4,6 mm, 5 µm). phát<br />
Điều<br />
kiện<br />
HPLC:<br />
Pha<br />
động<br />
hiện UV 450 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. nhiệt<br />
acetonitril:Methanol:dicloromethan (70:20:10,<br />
độ phòng, Thể tích bơm mẫu: 20 µl.<br />
tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM, cột<br />
RP- C18 (250 mm, 5 µm), phát hiện UV 450<br />
nm, ở nhiệt độ phòng.<br />
<br />
Ứng dụng quy trình định lượng trên chế<br />
phẩm<br />
<br />
Bảng 3: Kết quả thẩm định phương pháp định lượng<br />
Carotenoid<br />
<br />
Bảng 4: Kiểm tra hàm lượng carotenoid của sinh khối<br />
vi khuẩn<br />
<br />
Canthaxanthin<br />
β-caroten<br />
Độ chính xác (n=6)<br />
RSD% = 4,26<br />
RSD% = 1,93<br />
Độ đúng (Tỉ lệ hồi<br />
98,53%<br />
99,83%<br />
phục, n=9)<br />
Khoảng tuyến tính Ŷ = 363,86 x – 55,953 Ŷ = 240,5 x +<br />
2<br />
37,616<br />
R = 0,9953<br />
2<br />
R = 0,9981<br />
Giới hạn định lượng<br />
0,026 µg/ml<br />
0,049 µg/ml<br />
<br />
Qui trình định lượng carotenoid đã thẩm<br />
định<br />
<br />
Hàm lượng<br />
Nhóm<br />
carotenoid trung RSD<br />
carotenoid<br />
bình (µg/g)<br />
4,133 Chưa xác định<br />
48,32 ± 0,14<br />
2,92<br />
4,833 Chưa xác định<br />
3,833 Astaxanthin<br />
78,23 ± 0,18<br />
1,34<br />
<br />
Chủng vi<br />
RT<br />
khuẩn<br />
(phút)<br />
Bacillus<br />
indicus<br />
Bacillus<br />
infantis<br />
Bacillus<br />
marisflavi<br />
<br />
2,631 Chưa xác định<br />
4,582 Canthaxanthin<br />
<br />
40,36 ± 0,21<br />
<br />
Bảng 5: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong dầu<br />
gấc<br />
<br />
Phá vỡ màng tế bào bằng tán trong bể siêu<br />
Hàm lượng βHàm lượng βâm. Chiết carotenoid với hệ dung môi<br />
Sản phẩm caroten Trên nhãn caroten định<br />
(mg %)<br />
lượng (mg%)<br />
chloroform - methanol với tỉ lệ 2:1. Tiến hành<br />
Gac<br />
Việt<br />
Nam<br />
100<br />
42,08 ± 0,52<br />
phân tích HPLC với hệ thống Knauer theo các<br />
Dầu gấc PV Không ghi trên nhãn 10,16 ± 0,13<br />
điều kiện: Dung môi pha động: acetonitril –<br />
Vinaga<br />
150<br />
126,34 ± 2,46<br />
methanol - dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ<br />
sung amonium acetat 10 mM. Cột sắc ký:<br />
Bảng 6: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong các chế phẩm ngoại nhập<br />
Sản phẩm<br />
Betacarotene<br />
Super Antioxidant<br />
Beta- carotene<br />
Lycopene<br />
Tảo Spiruline<br />
<br />
186<br />
<br />
Nhóm<br />
carotenoid<br />
β-caroten<br />
β-caroten<br />
β-caroten<br />
Lycopen<br />
Zeaxanthin<br />
β-caroten<br />
Tổng carotenoid<br />
<br />
4,14<br />
<br />
Hàm lượng<br />
Hàm lượng định lượng<br />
(mg/viên)<br />
trên nhãn (mg/viên)<br />
15<br />
14,58 ± 0,22<br />
15<br />
14,70 ± 0,31<br />
15<br />
14,52 ± 0,25<br />
10<br />
9,53 ± 0,18<br />
2<br />
1,89 ± 0,04<br />
2,4<br />
2,29 ± 0,4<br />
8<br />
7,63 ± 0,09<br />
<br />
RSD<br />
1,48<br />
2,13<br />
1,89<br />
1,75<br />
1,98<br />
1,44<br />
1,12<br />
<br />
RSD<br />
1,24<br />
1,30<br />
1,94<br />
<br />
% hàm<br />
lượng<br />
97,23<br />
98,01<br />
95,30<br />
96,79<br />
94,63<br />
95,42<br />
95,33<br />
<br />
Chuyên Đề Dược Học<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
