intTypePromotion=3

Xây dựng qui trình định lượng carotenoid trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường

Chia sẻ: Hạnh Hoa | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:6

0
16
lượt xem
1
download

Xây dựng qui trình định lượng carotenoid trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường

Mô tả tài liệu
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong đề tài này nhằm nghiên cứu quy trình chiết tách carotenoid từ vi khuẩn và xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho các chế phẩm đang lưu hành bằng phương pháp HPLC với hệ thống knauer smarline 2500 system.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Xây dựng qui trình định lượng carotenoid trong một số chế phẩm đang lưu hành trên thị trường

Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> XÂY DỰNG QUI TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG CAROTENOID<br /> TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM ĐANG LƯU HÀNH TRÊN THỊ TRƯỜNG<br /> Võ Xuân Hoài*, Phan Thanh Dũng*, Trần Cát Đông*<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Đặt vấn đề: Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế phẩm giàu carotenoid đang lưu hành như: carotenoid<br /> từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua), tảo và gần đây là từ vi khuẩn, tuy nhiên trong nước chưa có quy trình định<br /> lượng cụ thể cho các chế phẩm này.<br /> Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài này chúng tôi nghiên cứu quy trình chiết tách<br /> carotenoid từ vi khuẩn và xây dựng quy trình định lượng carotenoid cho các chế phẩm đang lưu hành bằng<br /> phương pháp HPLC với hệ thống Knauer Smarline 2500 system.<br /> Kết quả và bàn luận: Kết quả nghiên cứu cho thấy, phá vỡ tế bào bằng tán trong bể siêu âm và chiết<br /> carotenoid với chloroform - methanol (2:1) cho hiệu quả chiết tách carotenoid từ vi khuẩn cao nhất (94,82%).<br /> Hàm lượng carotenoid từ vi khuẩn và các chế phẩm được xác định bởi phương pháp HPLC nhanh chóng và có độ<br /> nhạy cao, trên cột RP C18 ở nhiệt độ phòng, hệ dung môi pha động là acetonitril- methanol - dichloromethal<br /> (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM với tốc độ dòng 1ml /phút, thể tích tiêm 20 μl, bước sóng phát<br /> hiện tại 450 nm. Phương pháp HPLC cho tương thích cao với các thông số sắc ký có RSD < 2%. Phương pháp<br /> được thẩm định cho độ chính xác và độ đúng thích hợp với tỷ lệ phục hồi của carotenoid từ chế phẩm đạt 99,83%.<br /> Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công trình định lượng bằng kỹ thuật HPLC để kiểm tra hàm lượng<br /> carotenoid trong các chế phẩm đang lưu hành trên thị trường. Qui trình được thẩm định và áp dụng thành công<br /> trên một số sinh khối vi khuẩn giàu carotenoid và chế phẩm chứa carotenoid trong nước và ngoại nhập.<br /> Từ khóa: HPLC, carotenoid, betacaroten, thực phẩm chức năng,<br /> <br /> ABSTRACT<br /> ESTABLISHMENT OF A METHOD FOR CAROTENOIDS QUANTIFICATION<br /> IN SOME COMMERCIAL PRODUCTS USING HPLC METHOD<br /> Vo Xuan Hoai, Phan Thanh Dung, Tran Cat Dong<br /> * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 182 - 187<br /> Introduction: Nowadays, there are many rich carotenoid products on the market. Carotenoids in these<br /> products come from plants: carrot, gac fruit (Momordica cochinchinensis), tomato, seaweed and recently from<br /> bacteria. Although they are popularly used but the suitable quantity method is not yet available for these products<br /> in Vietnam.<br /> Materials and methods: In this work, we studied methods for extraction of carotenoid from bacteria and<br /> developed the carotenoid quantitative method for products containing carotenoid based on HPLC with Knauer<br /> Smarline 2500 system.<br /> Results and disscussions: The result show that, cells breaking process by using ultrasonic bath and extract<br /> carotenoid with chloroform/methanol (2:1) are the most effective with performance about 94,82%. The content of<br /> carotenoids from bacteria and other products were determined by HPLC method, that is rapid and high sensitivity<br /> with RP C18, at room temperature. The mobile phase is acetonitrile – methanol - dichloromethal (70:20:10, v/v/v)<br /> * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh<br /> Tác giả liên lạc: DS. Phan Thanh Dũng<br /> ĐT: 0983957158<br /> <br /> 182<br /> <br /> Email: dungpharm@yahoo.com<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> supplemented with ammonium acetate 10 mM, with flow 1ml/minute, inject volume 20 μl, UV detector at 450<br /> nm. The HPLC method is highly suitable with RSD of chromatography parameters were less than 2%. The<br /> method was validated for the acceptable accuracy and precision with the recovery rate is 99.83%.<br /> Conclusion: We have succesfully established an HPLC protocol for qualification of carotenoid in commercial<br /> products. The protocol has been validated and applied to determining the carotenoid contents of several different<br /> bacterial biomasses and some domestic and imported products.<br /> Keywords: HPLC, carotenoid. Betacarotene, functional food<br /> DD1.1, Bacillus indicus HU36, Bacillus infantis<br /> ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> AT14, độ ẩm 5%, mật độ tế bào 1010 CFU/g sinh<br /> Carotenoid là nhóm sắc tố terpenoid phổ<br /> khối, được cung cấp từ Phòng thí nghiệm Vi<br /> biến trong tự nhiên, nhất là trong các sinh vật<br /> sinh Công nghệ Dược – Khoa Dược – ĐH Y<br /> sống được dưới ánh nắng mặt trời bao gồm thực<br /> Dược TP HCM, 41 Đinh Tiên Hoàng Q1.<br /> vật, động vật, vi khuẩn, tảo, nấm…(3). Kể từ khi<br /> Các chế phẩm chứa carotenoid trên thị<br /> được phát hiện cho đến nay, carotenoid được<br /> trường:<br /> Dầu gấc Vinaga (Số lô 4306, hạn sử<br /> ứng dụng rộng rãi để làm phụ gia tạo màu cho<br /> dụng 6/2013), dầu gấc Gấc Việt Nam (Số lô<br /> thực phẩm, bổ sung những chất dinh dưỡng,<br /> 4609, hạn sử dụng 6/2013), Super Antioxidant<br /> giúp gia tăng giá trị thẩm mỹ cho cho ngành<br /> của Holland & Barrett (Số lô 375324, hạn sử<br /> thủy sản (7). Bên cạnh đó, nhiều nghiên cứu dịch<br /> dụng 1/2015), Mỹ, Beta-Carotene của Holland<br /> tễ học và kết quả thực nghiệm đã chứng minh<br /> & Barrett (Số lô 375221, hạn sử dụng 1/2015),<br /> các carotenoid với vai trò là chất chống oxi hóa<br /> Mỹ, Tảo Spiruline của Teva S. Switzerland (Số<br /> đã mang lại lợi ích cho sức khỏe con người bằng<br /> lô 4609, hạn sử dụng 9/2013).<br /> cách ngăn ngừa hay trì hoãn các bệnh mạn tính<br /> Khảo sát phương pháp phá vỡ màng tế bào<br /> như ung thư, xơ cứng động mạch, đục thủy tinh<br /> vi khuẩn<br /> thể và một số bệnh khác. Do đó, carotenoid cũng<br /> đã được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều<br /> Chúng tôi tiến hành khảo sát các phương<br /> trong lĩnh vực dược, mỹ phẩm(1).<br /> pháp phá vỡ màng tế báo vi khuẩn như nghiền<br /> Trên thị trường hiện nay có rất nhiều chế<br /> phẩm giàu carotenoid được lưu hành như:<br /> carotenoid từ thực vật (cà rốt, gấc, cà chua),<br /> carotenoid từ tảo, carotenoid từ vi khuẩn<br /> (3)…tuy nhiên hàm lượng carotenoid trong các<br /> chế phẩm này thường chỉ ghi chung chung,<br /> không được xác định chính xác và không thể xác<br /> định hoạt tính của các chế phẩm này. Do đó vấn<br /> đề đặt ra là phải xây dựng một quy trình chiết<br /> tách và xác định hàm lượng carotenoid trong chế<br /> phẩm cũng như xác định các loại carotenoid có<br /> trong chế phẩm để xác định hoạt tính của chế<br /> phẩm. Vì vậy chúng tôi tiến hành thực hiện đề<br /> tài: “Xây dựng qui trình định lượng carotenoid<br /> bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao”.<br /> <br /> ĐỐI TƯỢNG- PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU<br /> Đối tượng nghiên cứu<br /> Bột sinh khối vi khuẩn Bacillus marisflavi<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> trong nitơ lỏng, tán siêu âm đầu dò, dùng bể<br /> siêu âm và sử dụng lysozym với lượng sinh khối<br /> khảo sát là 200 mg. dung môi chiết là cloroform<br /> và methanol với tỷ lệ 1:2 (3,4,5).<br /> <br /> Khảo sát dung môi chiết carotenoid từ bột<br /> sinh khối vi khuẩn<br /> Bảng 1: Tỉ lệ các dung môi chiết<br /> Dung môi<br /> <br /> Cloroform<br /> <br /> Methanol<br /> <br /> Tỉ lệ<br /> <br /> Thể tích (ml)<br /> <br /> 2,5<br /> 1,67<br /> 3,33<br /> 1,25<br /> 3,75<br /> <br /> 2,5<br /> 3,33<br /> 1,67<br /> 3,75<br /> 1,25<br /> <br /> 1:1<br /> 1:2<br /> 2:1<br /> 1:3<br /> 3:1<br /> <br /> Chúng tôi tiến hành khảo sát hệ dung môi<br /> chiết carotenoid với nhiều tỉ lệ khác nhau, dựa<br /> trên hai dung môi chính là methanol và<br /> cloroform, nhằm tìm ra tỉ lệ dung môi chiết tối<br /> ưu nhất. Chiết tách carotenoid theo quy trình đã<br /> <br /> 183<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> khảo sát ở trên với tỉ lệ hệ dung môi bổ sung<br /> được thay đổi như Bảng 1.<br /> <br /> Phương pháp chiết carotenoid từ chế phẩm<br /> Đối với các chế phẩm có chứa carotenoid<br /> (carotenoid được chiết ở dạng bột hoặc dầu)<br /> chiết theo quy trình sau: cân 1/3 lượng dầu<br /> (bột) trong 1 viên chế phẩm vào ống Falcon 50<br /> ml. Thêm vào 10 ml NaOH 1 N pha trong<br /> methanol, lắc rung mạnh trong 1 phút. Thêm<br /> 10 ml aceton, lắc rung cho đều. Để ở nhiệt độ<br /> phòng trong 15 phút. Thêm 10 ml n-hexan, lắc<br /> rung cho đều. Thêm 10 ml nước khử khoáng,<br /> lắc rung cho đều. Để ở nhiệt độ phòng trong<br /> 10 phút. Ly tâm 9600 vòng /10 phút ở 4oC. Thu<br /> lớp n-hexan. Lớp n-hexan sau đó loại nước<br /> bằng Na2SO4. Dịch chiết với n-hexan được bay<br /> hơi đến cắn. Hòa lại cắn vào 1 ml cloroform và<br /> 4 ml dung môi pha động(2,1).<br /> <br /> Xây dựng quy trình định lượng carotenoid<br /> bằng phương pháp HPLC và thẩm định<br /> quy trình định lượng<br /> Chúng tôi tiến hành thăm dò hệ dung môi<br /> pha động để tách tốt nhất các loại carotenoid có<br /> trong dịch chiết. Dựa vào tính chất carotenoid là<br /> chất kém phân cực nên chọn hệ dung môi pha<br /> động kém phân cực. Các hệ dung môi pha động<br /> khảo sát gồm có: acetonitril-methanol,<br /> acetonitril-methanol-dicloromethan là các hệ<br /> dung môi thường sử dụng để phân tích<br /> carotenoid với đầu dò UV, bước sóng phát hiện<br /> 450 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút trên hệ thống<br /> Knauer Smarline 2500 system. Các mẫu chuẩn<br /> được chọn gồm các loại carotenoid thông dụng<br /> thuộc 2 nhóm xanthophyl và carotenoid:<br /> astaxanthin, canthaxanthin, lutein, lycopen và βcaroten để tiến hành quá trình thăm dò hệ dung<br /> môi để chọn hệ pha động tối ưu(1,3,5).<br /> <br /> chúng tôi tiến hành hẩm định quy trình định<br /> lượng và ứng dụng qui trình đã thẩm định để<br /> định lượng trên một số chế phẩm đang lưu hành<br /> trên thị trường(1-Error! Reference source not found.).<br /> <br /> KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN<br /> Khảo sát các phương pháp chiết, tách<br /> carotenoid<br /> Qua kết quả thực nghiệm nhận thấy,<br /> phương pháp phá vỡ màng tế bào trong bể<br /> siêu âm và chiết bằng hỗn hợp cloroform methanol tỉ lệ 2:1 cho hiệu quả cao nhất với tỷ<br /> lệ hồi phục 94,82%.<br /> <br /> Xây dựng quy trình định lượng carotenoid<br /> bằng phương pháp HPLC<br /> Dựa vào tính chất phân cực của carotenoid<br /> (nhóm caroten không phân cực và nhóm<br /> xanthophyl phân cực) để thăm dò hệ dung môi<br /> phân tích bằng phương pháp HPLC. Tiến hành<br /> thăm dò hệ dung môi pha động gồm acetonitril methanol, acetonitril – methanol - dicloromethan<br /> với các tỉ lệ khác nhau để tách tốt nhất hỗn hợp 5<br /> chất chuẩn gồm: astaxanthin, canthaxanthin,<br /> zeaxanthin, lycopen và β- caroten. Kết quả khảo<br /> sát cho thấy hệ dung môi phân tích carotenoid<br /> tốt nhất là acetonitril – methanol - dicloromethan<br /> (70:20:10, tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM<br /> với thời gian phân tích là 12 phút (Hình 1-G).<br /> Dung môi pha động isocratic bổ sung<br /> amonium acetat 10 mM với A. ACN -MeOH<br /> (50:50,tt/tt), B. ACN -MeOH (60:40,tt.tt), C. ACN<br /> -MeOH (70:30,tt/tt), D. ACN - MeOH (80:20,tt/tt),<br /> E. ACN - MeOH (90:10,tt/tt), F. ACN –MeOH DCM (70:25:5, tt/tt/tt), G. ACN –MeOH -DCM<br /> (70:20:10, tt/tt/tt), H. ACN –MeOH -DCM<br /> (70:15:15, tt/tt/tt).<br /> <br /> Sau khi xây dựng quy trình định lượng<br /> <br /> 184<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> B<br /> β-caroten<br /> <br /> Lycopen<br /> <br /> β-caroten<br /> <br /> Lycopen<br /> Lycopen<br /> <br /> Β-caroten<br /> <br /> Canthaxanthin<br /> <br /> F<br /> <br /> H<br /> <br /> Β-caroten<br /> <br /> Zeaxanthin<br /> Canthaxanthin<br /> <br /> Astaxanthin<br /> <br /> Β-caroten<br /> <br /> Lycopen<br /> <br /> β-caroten<br /> <br /> Astaxanthin<br /> <br /> Lycopen<br /> <br /> Lycopen<br /> <br /> Zeaxanthin<br /> <br /> Canthaxanthin<br /> <br /> β-caroten<br /> <br /> Astaxanthin<br /> <br /> Lycopen<br /> Zeaxanthin<br /> <br /> Zeaxanthin<br /> Astaxanthin<br /> <br /> Canthaxanthin<br /> Zeaxanthin<br /> <br /> Canthaxanthin<br /> <br /> D<br /> <br /> E<br /> <br /> G<br /> Astaxanthin<br /> <br /> Zeaxanthin<br /> <br /> β-caroten<br /> <br /> C<br /> <br /> Canthaxanthin<br /> <br /> Astaxanthin<br /> <br /> Lycopen<br /> <br /> A<br /> <br /> Hình 1: Thăm dò hệ dung môi<br /> <br /> Thẩm định quy trình phân tích<br /> Tính phù hợp hệ thống<br /> Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống sắc ký (n=6)<br /> Loại carotenoid<br /> Astaxanthin<br /> Canthaxanthin<br /> Zeaxanthin<br /> Lycopen<br /> β-caroten<br /> <br /> n=6<br /> <br /> RSD %<br /> <br /> Rt<br /> 0,193<br /> 0,196<br /> 0,318<br /> 0,230<br /> 0,193<br /> <br /> Các số liệu thu được cho thấy hệ thống sắc<br /> ký chọn lựa là phù hợp cho việc phân tích định<br /> lượng carotenoid với RSD của thời gian lưu,<br /> diện tích đỉnh, số đĩa lý thuyết của cột sắc ký<br /> đều nằm trong giới hạn RSD ≤ 2%. Các thông số<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br /> S<br /> 1,973<br /> 1,273<br /> 1,996<br /> 1,786<br /> 1,839<br /> <br /> (N)<br /> 0,355<br /> 0,852<br /> 1,188<br /> 1,881<br /> 4,276<br /> <br /> As<br /> 1,808<br /> 1,908<br /> 1,989<br /> 1,954<br /> 1,914<br /> <br /> Rs<br /> 1,726<br /> 1,913<br /> 1,163<br /> 1,779<br /> 1,910<br /> <br /> như hệ số đối xứng nằm trong giới hạn từ 0,8≤<br /> As ≤1,5 và độ phân giải (Rs) lớn hơn 1,5. Như<br /> vậy phương pháp phân tích carotenoid đạt được<br /> tính phù hợp hệ thống.<br /> <br /> 185<br /> <br /> Β-caroten<br /> <br /> Lycopen<br /> <br /> Zeaxanthin<br /> <br /> Astaxanthin<br /> <br /> Canthaxanthin<br /> <br /> Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014<br /> <br /> Absorbance (mAU)<br /> <br /> Nghiên cứu Y học<br /> <br /> Time (min)<br /> <br /> Hình 2: Sắc ký đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống<br /> Europher RP C18 (250 mm, 4,6 mm, 5 µm). phát<br /> Điều<br /> kiện<br /> HPLC:<br /> Pha<br /> động<br /> hiện UV 450 nm. Tốc độ dòng: 1 ml/phút. nhiệt<br /> acetonitril:Methanol:dicloromethan (70:20:10,<br /> độ phòng, Thể tích bơm mẫu: 20 µl.<br /> tt/tt/tt) bổ sung amonium acetat 10 mM, cột<br /> RP- C18 (250 mm, 5 µm), phát hiện UV 450<br /> nm, ở nhiệt độ phòng.<br /> <br /> Ứng dụng quy trình định lượng trên chế<br /> phẩm<br /> <br /> Bảng 3: Kết quả thẩm định phương pháp định lượng<br /> Carotenoid<br /> <br /> Bảng 4: Kiểm tra hàm lượng carotenoid của sinh khối<br /> vi khuẩn<br /> <br /> Canthaxanthin<br /> β-caroten<br /> Độ chính xác (n=6)<br /> RSD% = 4,26<br /> RSD% = 1,93<br /> Độ đúng (Tỉ lệ hồi<br /> 98,53%<br /> 99,83%<br /> phục, n=9)<br /> Khoảng tuyến tính Ŷ = 363,86 x – 55,953 Ŷ = 240,5 x +<br /> 2<br /> 37,616<br /> R = 0,9953<br /> 2<br /> R = 0,9981<br /> Giới hạn định lượng<br /> 0,026 µg/ml<br /> 0,049 µg/ml<br /> <br /> Qui trình định lượng carotenoid đã thẩm<br /> định<br /> <br /> Hàm lượng<br /> Nhóm<br /> carotenoid trung RSD<br /> carotenoid<br /> bình (µg/g)<br /> 4,133 Chưa xác định<br /> 48,32 ± 0,14<br /> 2,92<br /> 4,833 Chưa xác định<br /> 3,833 Astaxanthin<br /> 78,23 ± 0,18<br /> 1,34<br /> <br /> Chủng vi<br /> RT<br /> khuẩn<br /> (phút)<br /> Bacillus<br /> indicus<br /> Bacillus<br /> infantis<br /> Bacillus<br /> marisflavi<br /> <br /> 2,631 Chưa xác định<br /> 4,582 Canthaxanthin<br /> <br /> 40,36 ± 0,21<br /> <br /> Bảng 5: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong dầu<br /> gấc<br /> <br /> Phá vỡ màng tế bào bằng tán trong bể siêu<br /> Hàm lượng βHàm lượng βâm. Chiết carotenoid với hệ dung môi<br /> Sản phẩm caroten Trên nhãn caroten định<br /> (mg %)<br /> lượng (mg%)<br /> chloroform - methanol với tỉ lệ 2:1. Tiến hành<br /> Gac<br /> Việt<br /> Nam<br /> 100<br /> 42,08 ± 0,52<br /> phân tích HPLC với hệ thống Knauer theo các<br /> Dầu gấc PV Không ghi trên nhãn 10,16 ± 0,13<br /> điều kiện: Dung môi pha động: acetonitril –<br /> Vinaga<br /> 150<br /> 126,34 ± 2,46<br /> methanol - dichloromethan (70:20:10, tt/tt/tt) bổ<br /> sung amonium acetat 10 mM. Cột sắc ký:<br /> Bảng 6: Kiểm tra hàm lượng carotenoid trong các chế phẩm ngoại nhập<br /> Sản phẩm<br /> Betacarotene<br /> Super Antioxidant<br /> Beta- carotene<br /> Lycopene<br /> Tảo Spiruline<br /> <br /> 186<br /> <br /> Nhóm<br /> carotenoid<br /> β-caroten<br /> β-caroten<br /> β-caroten<br /> Lycopen<br /> Zeaxanthin<br /> β-caroten<br /> Tổng carotenoid<br /> <br /> 4,14<br /> <br /> Hàm lượng<br /> Hàm lượng định lượng<br /> (mg/viên)<br /> trên nhãn (mg/viên)<br /> 15<br /> 14,58 ± 0,22<br /> 15<br /> 14,70 ± 0,31<br /> 15<br /> 14,52 ± 0,25<br /> 10<br /> 9,53 ± 0,18<br /> 2<br /> 1,89 ± 0,04<br /> 2,4<br /> 2,29 ± 0,4<br /> 8<br /> 7,63 ± 0,09<br /> <br /> RSD<br /> 1,48<br /> 2,13<br /> 1,89<br /> 1,75<br /> 1,98<br /> 1,44<br /> 1,12<br /> <br /> RSD<br /> 1,24<br /> 1,30<br /> 1,94<br /> <br /> % hàm<br /> lượng<br /> 97,23<br /> 98,01<br /> 95,30<br /> 96,79<br /> 94,63<br /> 95,42<br /> 95,33<br /> <br /> Chuyên Đề Dược Học<br /> <br />

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản