Bài 2 xác định protein thô có trong thực phẩm

Chia sẻ: Nguyễn đức Minh Triết | Ngày: | Loại File: DOCX | Số trang:13

Thêm vào BST

Báo xấu

67
lượt xem 2
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Chủ đề:

Marketing thesis c

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Bài 2 xác định protein thô có trong thực phẩm

Bài 2 XÁC ĐỊNH PROTEIN THÔ CÓ TRONG THỰC PHẨM 1. Mục đích Xác định hàm lượng protein tổng có trong thực phẩm 2. Nguyên tắc, nguyên lý Vô cơ hóa mẫu thực phẩm b ằng H 2SO4 đậm đặc và chất xúc tác. Dùng một kiềm mạnh (NaOH hoặc KOH) đ ẩy NH 3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra th ể t ự do. Định phân l ượ ng H2SO4 dư bằng dung dịch NaOH, t ừ đó xác đ ịnh đ ược l ượng H2SO4 đã phản ứng và tính đ ược hàm l ượng nit ơ t ổng có trong m ẫu. 1. Vô cơ hoá 2. Quá trình chưng cất: Sau đó lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn bằng máy chưng cất đạm và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thời H2SO4.Từ đây cho phép chúng ta xác định được lượng NH3 phóng thích ra, có nghĩa là xác định được lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu 3. Chất xúc tác 4. Quá trình chuẩn độ: 3. Hoá chất 1. Mẫu thực phẩm 2. Dung dịch
3. Mẫu vô cơ hoá 4. Chỉ thị MR 1% 5. Chỉ thị Phenolphtalein 1% 6. Dung dịch NaOH 30% 7. Nước cất 8. Giấy pH 4. Dụng cụ 1. 1 bộ MicroKejedalt 2. 1 pipet 10ml 3. 3 erlen 250 ml 4. 1erlen 100ml 5. 1 bình định mức 100 ml 6. 1 Becher 250 ml 7. 1 bóp cao su 8. 1 phễu thuỷ tinh nhỏ 5. Cách tiến hành 1. Chuẩn bị hóa chất 1. Hỗn hợp xúc tác CuSO4 : K2SO4 theo tỷ lệ 1:1 2. Chỉ thị MR 1%
2. Vô cơ hóa mẫu
3. Chưng cất:
6. Kết quả thí nghiệm Hàm lượng nitơ toàn phần tính bằng công thức: Trong đó: • T: số ml NaOH dùng để chuẩn độ mẫu trắng. • B: số ml NaOH dùng để chuẩn độ mẫu thử. • N: nồng độ đương lượng của dd NaOH dùng chuẩn độ. • m: khối lượng mẫu vô cơ hóa (mg) Số ml NaOH sử dụng Mẫu trắng 23.4 Lần 1 15,5 Lần 2 15 Vây: Số ml NaOH trung bình dùng để chuẩn độ mẫu thử: Hàm lượng protein thô (%) = (nitơ toàn phần)k Với k là hệ số qui đổi từ %N sang protein.  Hàm lượng protein thô (%) = 0,5708 = 3,5674% 7. Trả lời câu hỏi Câu 1: Vô cơ hoá mẫu là gì ? Viết phương trình phản ứng xảy ra trong quá trình vô cơ hoá mẫu Vô cơ hoá mẫu là đưa các hợp chất hữu cơ trong mẫu về dạng các hợp chất vô cơ Các phản ứng trong quá trình vô cơ hoá mẫu Câu 2: Viết phương trình phản ứng xảy ra trong quá trình chưng cất và chuẩn độ mẫu Các phản ứng trong quá trình chưng cất Các phản ứng trong quá trình chuẩn độ Câu 3
Câu 4: Protein thô có đặc tính chung là gì ? Việc kiểm tra hàm lượng Protein thô có ý nghĩ như thế noà đới với sản phẩm thực phẩm đặc điểm của Protein thô + Đặc điểm chung của protein thô là : đều có chứa hàm lượng nitơ cố định khoảng 15% – 18 % + Đều dễ bị biến tính trong quá trình chế biến bảo quản + Việc kiểm tra hàm lượng protein thô có ý nghĩa rất quan trọng đ ối với sản phẩm thực phẩm. nó cho biết chất lượng thực phẩm để từ đó ta có thể tăng giảm độ đạm cho phù hợp với từng loại thực phẩm để đảm bảo để đảm bảo giá trị dinh dưỡng, chất lượng của thực phẩm. Câu 5 : Tiêu chuẩn của FAO/WHO về hệ số protein dối với thực phẩm Hàm lượng protein thô (%) = (Nitơ tòan phần) k k là hệ số qui đổi từ %N sang Protein: k = 6.25 ứng với mẫu là nước mắm, thịt, cá… k = 5.85 ứng với mẫu là ngũ cốc, rau, quả… k = 6.38 ứng với mẫu là sữa, fomat… Câu 6 trình bày một số phương pháp xác định Protein thô khác trong thực phẩm 1. Xác định protein tổng theo phương pháp Dusma Nguyên tắc Mẫu được đốt cháy hoàn toàn bằng khí oxi tinh khiết ở nhiệt độ khoảng 950 oC. Sản phẩm khí sau quá trình đốt cháy bao gồm chủ yếu là CO 2, H2O, O2, NOx và N2. Ngoài ra trong sản phẩm đốt ở thể khí còn có halogen, hiđro halogenua, các đioxit và trioxit của lưu huỳnh. Tất cả các khí đó đều cho qua đồng kim loại và đồng oxit nóng đỏ. Các oxit của nitơ bị đồng phân huỷ thành nitơ và oxy, đồng thời oxy này cùng với oxy nằm trong các khí đốt tạo với đồng kim loại thành đồng oxit. Hợp chất cacbon oxit khi gặp đồng oxit sẽ bị oxy hoá thành cacbondioxit. Các sản phẩm của quá trình đốt cháy khi đi qua dung dịch kiềm sẽ bị hấp thụ, chỉ còn khí nit ơ thoát ra và đo được nitơ kế. Khi dùng phương pháp Dumas để khảo sát một lượng nhỏ chất thì điều đặc biệt quan trọng là phải tạo ra những điều kiện để các oxit nitơ chuyển hoàn toàn thành nitơ, còn những khí không bị hấp thụ bởi dung dịch kiềm ( ví dụ khí oxy và cacbon oxit) phải được loại hoàn toàn trước khi đi vào bình thu chứa dung dịch kiềm. Khí
nitơ sẽ được đẩy vào bình thu khí bằng khí CO2 được nén sẵn hoặc được tạo ra bởi dung dịch có tên là bình kip. Bình kip tạo ra CO2 bằng cách cho axít HCl đậm đặc vào đá vôi. Khí CO2 đẩy khí N2 vào nitơ kế và sau đó CO2 bị hấp thụ bởi dung dịch kiềm KOH (nồng độ khoảng 50%). Sau khi khí N2 đi vào khí áp kế, để cho nhiệt độ cân bằng khoảng 15 phút, sau đó đo lần lượt nhiệt độ, áp suất và thể tích khí của khí áp kế và từ đó tính ra hàm lượng nitơ Áp dụng Phương pháp đốt là lựa chọn thay thế cho phương pháp Kjeldahl và thích hợp đôi ́ với tât cả thực phẩm. Cac phương phap AOAC Method 992.15 và Method 992.23 ́ ́ ́ được áp dụng cho thịt và hạt ngũ cốc. Ưu điểm Không sử dụng hóa chất nguy hiểm Có thể hoàn thành phân tích trong 3 phút Các thiết bị tự động hiện nay có thể phân tích đến 150 mẫu mà không đoi hoi ̀ ̉ phai có người vân hanh theo theo dõi. ̉ ̣ ̀ Nhược điểm Thiết bị đắt tiền Đo nitơ hữu cơ tông, không phải chỉ nitơ protein. ̉ 2. Xác định protein bằng phương pháp phổ hồng ngoại Nguyên tắc Dựa trên khả năng hấp thu bức xạ trong vùng tử ngoại của liên kết peptic có trong phân tử protein. Phương phap phổ hồng ngoại đo độ hấp thu bức xạ trong vùng ́ cận và trung hồng ngoại. Các nhóm chức khác nhau của thực phẩm hấp thụ bức xạ ở tần số sóng khác nhau. Trong vung trung hồng ngoại các phân tử protein có khả năng ̀ hấp thu bức xạ có bước sóng khoảng 6,47 µm. Trong vùng cận hồng ngoại có khả năng hấp thu ở bước sóng 3300-3500 nm, 2080-2200 nm, 1560-1670 nm v.v… đặc trưng cho liên kết peptid. Từ độ hấp thu này có thể làm cơ sở định lượng để xác định hàm lượng protein có trong thực phẩm. Năng lượng bức xạ khi chiếu qua mẫu có thể đo bằng năng lượng phản xạ hoặc năng lượng truyền qua mẫu (có độ lớn tỷ lệ nghịch với năng lượng hấp thụ).
Phổ trung hồng ngoại được ap dụng trong thiết bị phân tích sữa Infrared Milk ́ Analyzer để xác định lượng protein có trong sữa, trong khi phổ cận hồng ngoại có thể ứng dung cho nhiều loại thực phẩm hơn (ví dụ, các hạt lúa, ngũ cốc, thịt, sản phẩm từ ̣ sữa (AOAC Methods 997.06). Ưu điểm Mẫu được phân tích rất nhanh. Người phân tích không đòi hỏi phải huấn luyện nhiều. Nhược điểm Đây là thiết bị đắt tiền và cần phải lấy chuẩn đúng. 3. Phương pháp Biuret Nguyên tắc Trong môi trường kiềm, ion đồng (II) có khả năng tạo phức với các liên kết peptid sẽ tạo màu tím hồng. Độ hấp thu của phức tạo thành được đo ở bước sóng 540 nm. Từ độ hấp thu đo được người ta có thể xác định hàm lượng protein có trong mẫu bằng phương pháp đường chuẩn. Áp dụng Phương pháp biuret được dùng để xác định hàm lượng protein có trong ngũ cốc, thịt, đậu nành cũng như để đánh giá chất lượng thức ăn chăn nuôi (AOAC Method 935.11). Ưu điểm Là phương pháp phân tích protein đơn giản nhất. So với phương pháp Kjeldahl ít tốn kém hơn; nhanh hơn (có thể hoàn thành nhanh hơn 30 phút). Ít có sự chênh lệch về màu sắc hơn so với các phương pháp Lowry, phương pháp đo hấp thụ UV hoặc đo độ đục. Rất ít các hợp chất khác có trong thực phẩm gây nhiêu đến phản ứng biuret. ̃ Giá trị đo được không tính nitơ từ các nguồn không phải từ peptid hoặc protein.
Nhược điểm Không nhạy như phương pháp Lowry, đòi hỏi lượng protein tối thiểu cho phân tích 2-4 mg. Mật độ quang đo được có thể bị tăng lên do sự có mặt của các sắc màu khác. Nồng độ muối amon cao ảnh hưởng đến phản ứng. Màu sắc khác nhau tùy loại protein: gelatin cho màu hồng tím. Dung dịch trước khi đo có thể bị đục nếu có mặt lipit và carbohydrat ở nồng đ ộ cao. Không phải là phương pháp tuyệt đối: cần phải xây dựng đường chuẩn hoặc đối chiếu với phương pháp Kjeldahl. 4. Phương pháp Lowry Nguyên tắc Phương pháp Lowry kết hợp phản ứng biuret với phản ứng khử của dung dịch Folin-Ciocalteau (phosphomolybdic/ phosphotungstic acid) với các gốc tyrosine và tryptophan của phân tử protein. Màu xanh da trời tạo ra được đo ở 750 nm hoặc 500 nm. Từ quy trình ban đầu Miller và Hartree đã có những cải tiến để cải thiện độ tuyến tính của quan hệ giữa mật độ quang với nồng độ protein. Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ protein trong một phạm vi nhất định. Dựa vào mức độ hấp thụ quang học của protein chuẩn, ta có thể xác định được hàm lượng protein trong mẫu nghiên cứu. Áp dụng Do tính đơn giản và độ nhạy cao, phương pháp Lowry được sử dụng rộng rãi trong phân tích hóa sinh. Tuy nhiên, đây không phai là phương phap được dùng rộng rãi để xác ̉ ́ định protein trong thực phẩm nếu chưa chiêt tach protein ra khoi sản phẩm. ́ ́ ̉ Ưu điểm Rất nhạy: 50-100 lần nhạy hơn so với phương pháp biuret 10-20 lần nhạy hơn so với phương pháp hấp thụ UV ở 280 nm.
Độ nhạy tương đương với phương pháp Nessler hóa, tuy nhiên tiện lợi hơn Ít bị ảnh hưởng bởi độ đục của mẫu. Có tính đặc hiệu cao hơn so với các phương pháp khác Tương đối đơn giản; có thể thực hiện trong vòng 1-1,5h. Nhược điểm Vì một số lý do sau, quy trình Lowry đòi hỏi phai xây dựng đường chuẩn cẩn ̉ thận cho từng áp dụng: Màu sắc thay đổi tùy loại protein rõ hơn so với phương pháp biuret. Cường độ màu không tỷ lệ thuận nghiêm ngặt theo nồng độ protein. Phản ứng bị ảnh hưởng ở mức độ khác nhau bởi đường sacaroza, lipit, đệm phosphat, monosacarit và hexoamin. Đường khử, sulfat amon và các hợp chất có nhóm SH- với nồng độ cao ảnh hưởng đến phản ứng. 5. Phương pháp nhuộm màu Bradford Nguyên tắc Khi thuốc nhuộm Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết với protein, màu thuốc đổi từ đỏ nhạt đến xanh nhạt và bước sóng hấp thụ cực đại của màu nhuộm dịch từ 465nm đến 595nm. Sự thay đổi mật độ quang ở bước sóng 595nm tỷ lệ thuận với nồng độ protein có trong mẫu. Cũng giống như các phương pháp nhuộm màu khác, phương pháp Bradford dựa vào bản chất lưỡng tính của protein. Khi dung dịch có chứa protein được axit hóa đến pH nhỏ hơn điểm đẳng điện của protein, thuôc nhuộm sẽ bám vào ́ protein bằng tương tác tĩnh điện. Hiệu quả nhuộm màu tăng lên do tương tác kỵ nước giữa phân tử phẩm nhuộm với bộ khung polypeptit kề bên các gốc tích điện dương của protein. Trong trường hợp của phương pháp Bradford, phẩm nhuộm sau khi bám vào protein sẽ thay đổi phổ hấp thụ so với lúc chưa liên kết. Áp dụng Phương pháp Bradford sử dụng Coomassie Brilliant Blue G-250 là phương pháp nhanh và nhạy. Phương pháp này đã thay thế hâu hêt các phương pháp nhuộm màu sử ̀ ́
dụng các phẩm nhuộm tích điện âm với gốc axit sulfonic, như acid orange 12, Orange G và Amido Black. Phương pháp Bradford đã được ứng dụng thành công khi xác định protein của cháo, bia thành phẩm trong sản xuất bia. Quy trình này cũng được cải tiến để định lượng protein ở hàm lượng µg. Do phép đo nhanh, nhạy và ít bị nhiễu hơn so với phương pháp Lowry, nó đã được sử dụng rộng rãi trong phân tích cac loai protein tinh sạch. ́ ̣ Ưu điểm Thời gian tiến hành nhanh, phản ứng có thể hoàn thành trong 2 phút. Độ lặp lại tốt Nhạy gấp nhiều lần so với phương pháp Lowry Không bị nhiễu bởi sulfat amon, polyphenol, carbohydrat như đường sacaroza hoặc các cation như K+, Na+ và Mg2+ Đo protein và các peptit có phân tử xấp xỉ hoặc lớn hơn 4000 Da. Nhược điểm Bị nhiễu bởi các chất tẩy rửa ion hoặc phi ion như Triton X-100 và sodium dodecylsulfat. Tuy nhiên, đây là các sai số nhỏ (0.1%) có thể hiệu chỉnh được băng các ̀ mẫu kiểm tra phù hợp. Phức protein-phẩm màu có thể bam dính vào cuvet thạch anh. Phân tích cần phải ́ thực hiện với cuvet thủy tinh hoặc nhựa. Màu sắc thay đổi tùy loại protein; Phải lựa chọn cẩn thận protein chuân. ̉ 6. Phương pháp Bicinchoninic Acid (BCA) Nguyên tắc Protein khử ion đồng (II) thành ion đồng (I) trong môi trường kiềm. Phức tạo ra giữa ion đồng (I) và dung dịch cơ chất BCA màu xanh táo sẽ có màu hồng nhạt. Cường độ màu tạo ra sẽ tỷ lệ thuận với nồng độ protein.
Áp dụng Phương pháp BCA được dùng cho protein đã được tách và tinh sạch. Chưa có báo cáo nào cho thấy có thể áp dụng phương pháp này để xác định protein trong thực phẩm. Ưu điểm Độ nhạy có thể so sánh được với phương pháp Lowry; độ nhạy của phương pháp micro BCA (0.5-1.0 µg) tốt hơn so với phương pháp Lowry. Việc hòa trộn các dung dịch phản ứng 1 lần thực hiện dễ dàng hơn so với phương pháp Lowry. Các dung dịch cơ chất phản ứng bền hơn so với ở phương pháp Lowry. Không bị nhiễu bởi các chất tẩy rửa phi ion và các muối đệm. Các tác nhân gây biến tính protein ở nông độ vừa phai (guanidine-HCl 4M hoăc ̀ ̉ ̣ ure 3M) không gây nhiễu. Nhược điểm Màu sắc không bền theo thời gian. Người phân tích cần chú ý cẩn thận đên th ời ́ gian đọc kêt quả đo mật độ quang. ́ Bất kỳ hợp chất nào có khả năng khử Cu2+ thành Cu+ đều góp phần làm tăng cường độ màu. Đường khử gây nhiễu ở mức độ nhiều hơn so với ở phương pháp Lowry. Sulfat amon ở nồng độ cao cũng gây nhiễu. Sự khác biệt màu sắc giữa các protein cũng tương tự như ở phương pháp Lowry. 7. Phương pháp hấp thụ tử ngoại Nguyên tắc Protein hấp thụ bức xạ UV mạnh ở bước sóng 280 nm, chủ yếu do các gốc tryptophan và tyrosine của phân tử protein. Vì hàm lượng của tryptophan và tyrosine trong phân tử protein của mỗi loại thực phẩm khá ổn định, độ hấp thụ UV ở 280 nm có thể dùng để tính nồng độ protein dựa vào định luật Lambert Beer. Vì mỗi protein có thành phần axit amin có chứa số vòng thơm khác nhau nên cần xác định độ hấp thụ phân tử (molar absorptivity hay extinction coeficient) cho từng loại protein.
Áp dụng Phương pháp hấp thụ UV được dùng để xác định protein có trong sữa và các sản phẩm thịt. Đây không phai là phương phap có ứng dụng rộng rãi đối với cac loai thực ̉ ́ ́ ̣ phẩm khac. Nó được áp dụng tốt hơn đối với các hệ protein đã được tinh sạch hoặc ́ protein được chiết tach nhờ kiềm hoặc các tác nhân gây biến tính như ure 8 M. ́ Mặc dù các liên kết peptit có trong protein hấp thụ UV ở 190-220 nm mạnh hơn so với ở 280 nm, tuy nhiên đo UV ở vùng bước sóng ngắn như vậy khó khăn hơn. Ưu điểm Nhanh và tương đối nhạy (ở 280 nm cần 100 µg protein hoặc hơn để phân tích; nhạy hơn phương pháp biuret nhiều lần). Không bị nhiễu bởi sulfat amon và các muối đệm khác. Mẫu không bị phân hủy; có thể dùng cho các phân tích khác sau khi phân tích xong protein; được áp dụng rộng rãi để xác định protein chạy qua cột sắc ký. Nhược điểm Axit nucleic cũng hấp thụ UV ở 280 nm. Tỷ số giữa độ hấp thụ ở 280 nm và 260 nm của protein tinh sạch và axit nucleic tương ứng là 1.75 và 0.5. Do đó có th ể hi ệu chỉnh phần hấp thụ của axit nucleic ở 280 nm nếu biết các tỷ số này. Có thể hiệu chỉnh độ hấp thụ của axit nucleic dựa vào sự chênh lệch độ hấp thụ ở 235 và 280 nm. Có sự chênh lêch đang kể về hàm lượng các axit amin thơm trong thanh phân câu ̣ ́ ̀ ̀ ́ tao cua protein từ các nguồn khác nhau. ̣ ̉ Dung dịch đo cần phải trong suốt và không màu. Độ đục do các hạt có trong dung dịch sẽ làm sai lêch kêt quả đo mật độ quang. ̣ ́ Đòi hòi hệ protein cân xác định phải tương đối tinh sạch ̀

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

THÔNG TIN

TRỢ GIÚP

HỖ TRỢ KHÁCH HÀNG

Theo dõi chúng tôi

Chịu trách nhiệm nội dung:

Nguyễn Công Hà - Giám đốc Công ty TNHH TÀI LIỆU TRỰC TUYẾN VI NA

LIÊN HỆ

Địa chỉ: P402, 54A Nơ Trang Long, Phường 14, Q.Bình Thạnh, TP.HCM

Hotline: 093 303 0098

Email: support@tailieu.vn