BIỂU HIỆN CAO LIPASE KIỀM VÀ CHỊU NHIỆT
CỦA CHỦNG RALSTONIA SP. M1 Ở E.COLI.
Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Thảo
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Quốc gia
Jung Kee Lee, Tae-Kwang Oh
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology,
Korea
MỞ ĐẦU
Lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) xúc tác
phản ứng thủy phân triglyceride ở giao diện cơ chất và
nước [1] và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
công nghiệp như bột giặt, sữa, chuẩn đoán bệnh, chế biến
dầu, chuyển hóa sinh học, và đồng phân nhờ một số đặc
tính như đặc hiệu cơ chất, vị trí, chọn lọc đồng phân, bền
nhiệt và kiềm [2].
Lipase vi khuẩn Family I được chia thành 7 Subfamily dựa
vào mức độ tương đồng trình tự amino acid [2]. Lipase
Subfamily I.1 (P. aeruginosa [3, 4], Acinetobacter sp. [5,
6], P. fragi [7], etc), và I.2 (B. glumae [8], B. cepacia [9],
C. viscosum [10], P. luteola [11], Ralstonia sp. M1 [12],
etc) có độ tương đồng trình tự amino acid cao (>33%) [13]
và hầu hết chúng còn có một đặc điểm chung khác là gene
lipase luôn luôn gắn kết với gene thứ hai nằm ngay sau [3-
5, 9, 12, 14] hoặc trước gene lipase [6]. Gene thứ hai mã
hóa một protein được gọi là lipase-specific foldase
(modulator, activator, helper protein, hoặc chaperone) cần
thiết để hoạt hóa lipase và tiết lipase ngoại bào.
Trong nghiên cứu trước, gene lipA và gene lipB lần lượt
mã hóa lipase và chaperone chủng Ralstonia sp. M1 đã
được nhân dòng, phân tích và xác định thuộc họ phụ I.2
Burkholderia lipase/chaperone [12]. Trong bài báo này,
chúng tôi biểu hiện năng suất cao lipase hoàn thiện LipA và
chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở E. coli BL21 dưới sự
điều khiển của T7 promoter. Cả hai protein được tinh sạch
và lipase được hoạt hóa với chaperone. Một số tính chất
hóa lý của lipase tái tổ hợp được nghiên cứu.
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Dầu olive được mua của Sigma (Mỹ), Bacto-tryptone và
cao nấm men của Difco (Korea). Enzyme hạn chế, CIAP,
T4 ligase do Roche (Korea) cung cấp. DNA Gel-Extraction
Kit và Ni-NTA-matrice được mua của QIAGEN, PCR mix
và Minipreps của Bioner (Korea).
Hình. 1. Các plasmid biểu hiện pELipAB và pELipB dẫn
xuất từ vector biểu hiện pET22b+ cho hệ E. coli BL21.
Phân đoạn chèn và điểm cắt hạn chế sử dụng để nhân
dòng trên hình. T7Pro, T7 promoter; PelB, PelB signal
peptide; LipA, lipase hoàn thiện; His, đuôi 6-histidine;
T7Ter, T7 terminator; (LipB, 56aa chaperone cắt 56aa;
LipB, chaperone hoàn chỉnh.
Hai plasmid pELipAB và pELipB (Hình 1) được thiết kế
trước đây [12] dẫn xuất từ pET22b+ vector dưới sự kiểm
soát của T7 promoter được sử dụng để biểu hiện cao lần
lượt lipase LipA và chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở
Escherichia coli BL21 (DE3). E. coli BL21 được nuôi cấy
trong môi trường LB với ampicillin (nồng độ cuối cùng 100
(g/ml) ở 37(C. Hai trăm ml LB chứa 200 (l ampicillin (100
mg/ml) được chủng với 2 ml dịch nuôi cấy qua đêm và
nuôi cấy ở 37°C, 220 rpm trong 3 giờ cho tới khi
OD600nm đạt 0,6, sau đó cảm ứng với 200 (l IPTG (100
mM). Dịch nuôi cấy được ủ ở 37°C, 220 rpm trong 3 giờ
cảm ứng. Tế bào tươi được thu nhận bằng ly tâm ở 6,000
rpm trong 10 phút ở 4°C, được sử dụng tinh sạch protein
hoặc bảo quản ở -20°C để tinh sạch sau.
Chaperone (LipBhis được biểu hiện ở E. coli pELipB dưới
dạng hòa mang đuôi 6-his được tinh sạch bằng kit Ni-NTA
(QIAGEN).
Lipase LipA được biểu hiện dưới dạng thể vùi. Để tinh
sạch LipA, tủa 50 ml dịnh nuôi cấy được siêu âm (3x 1
phút, nghỉ 1 phút) trong 1 ml đệm 5 mM imidazole (pH
8,0) và dịch tế bào được ly tâm 15 phút ở 4(C tại 12,000
rpm. Qui trình được lặp lại tối thiểu 5 lần cho tới khi tủa tế
bào đồng nhất với một pha trắng. Tủa trắng đồng nhất được
hòa lại vào 1 ml đệm 8 M urea (pH 8,0) và lắc ít nhất một
giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch LipA được sử dụng để hoạt hóa.
Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp
Bradford với Bio-Rad protein assay kit.
Điện di SDS gel 12,5% (w/v) polyacrylamide (SDS-PAGE)
được thực hiện theo phương pháp Laemmli [15] với thiết bị
Bio-Rad.
Hoạt hóa lipase được thực hiện như công bố trước đây [12].
Hai trăm (g lipase LipA tinh sạch được hoạt hóa trong 10
ml nước cất với 220 (g (tỷ lệ phân tử 1:1) chaperone
(LipBhis. Sau 24 giờ ở 4° C, dịch nổi lipase được sử dụng
để xác định tính chất.