Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
B – Khoa học Dược
106
ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG TRÊN SỰ TĂNG SINH IN VITRO
TẾ BÀO ĐƠN NHÂN MÁU NGOẠI VI NGƯỜI
VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC CAO CHIẾT
WEDELIA CHINENSIS (OSBECK) MERR., ASTERACEAE
Nguyễn Thị Minh Thuận
*
, Lê Hoàng Hạnh Đan
*
, Nguyễn Thị Bảo Anh
*
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Cây Sài đất (Wedelia chinensis (Osbeck) Merr., Asteraceae) thường được sử dụng trực tiếp
hoặc dạng chiết xuất để điều trị nhiều bệnh ở Việt Nam.
Mục tiêu: So sánh tác động của các loại cao chiết cây Sài đất trên sự tăng sinh in vitro của tế bào đơn nhân
(TBĐN) máu ngoại vi người và hoạt tính chống oxy hóa.
Đối tượng - Phương pháp nghiên cứu: Chiết toàn bộ cây Sài đất (trừ rễ) với ba loại dung môi khác nhau
(cồn 96%, cồn 50% và nước nóng). Đánh giá hoạt động ức chế tăng sinh TBĐN được phân lập từ máu ngoại vi
người và khả năng chống oxy hóa với các cao chiết Sài đất lần lượt bằng thử nghiệm MTT và gốc tự do DPPH.
Kết quả: Cao cồn 50% có khả năng ức chế tăng sinh in vitro của TBĐN máu ngoại vi người mạnh nhất. Đối
với thử nghiệm DPPH 0,2mM, nồng độ EC
50
của cao cồn 96%, cao cồn 50% và cao nước lần lượt là 78,09; 59,51;
và 121,31 μg/mL. Điều này chứng minh cao cồn 50% của Wedelia chinensis có khả năng bắt giữ các gốc tự do
DPPH hiệu quả nhất.
Kết luận: Sài đất có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào TBĐN và chống oxy hóa. Kết quả nghiên cứu này có
thể được sử dụng cho các thử nghiệm lâm sàng khác tiếp theo.
Từ khóa: Wedelia chinensis, tế bào đơn nhân, chống oxy hóa, chống tăng sinh, in vitro
ABSTRACT
STUDY ON THE EFFECT OF WEDELIA CHINENSIS (OSBECK) MERR., ASTERACEAE:
IN VITRO PROLIFERATION OF HUMAN PERIPHERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS
AND THEIR ANTIOXIDANT ACTIVITY
Nguyen Thi Minh Thuan, Le Hoang Hanh Dan, Nguyen Thi Bao Anh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 2 - 2020: 106 - 113
Introduction: Wedelia chinensis (Osbeck) Merr., Asteraceae is often used directly or in combination with
other medicinal plants in the form of extracts to treat many diseases in Viet Nam.
Objectives: Comparison of the effect of Wedelia chinensis extracts on in vitro proliferation of human
peripheral blood mononuclear cells and their antioxidant activity.
Materials and Methods: Wedelia chinensis extracts were prepared by extracting the whole Wedelia
chinensis plant (except root) with different solvents (96% ethanol, 50% ethanol and hot water). Peripheral blood
mononuclear cells (PBMCs) that are isolated from human whole blood are used to examine the cellular
antiproliferative activity of Wedelia chinensis extracts by the MTT test at different concentrations. Moreover, the
antioxydant capacity of these extracts is evaluated using DPPH free radical method.
*
Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Nguyễn Thị Minh Thuận ĐT: 0923559973 Email: ntmthuan@ump.edu.vn
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu
B – Khoa học Dược 107
Results: The in vitro antiproliferative capacity on PBMCs of all three Wedelia chinensis extracts is
determined, of which 50% ethanol extract is the most effective. For the test of capturing 50% DPPH free radical at
0.2mM, the EC
50
of 96% ethanol extract, 50% ethanol and hot water are 78.09, 59.51 and 121.31 μg/mL,
respectively. These results showed that the 50% ethanol extract of Wedelia chinensis has the best ability to capture
the free radicals of DPPH.
Conclusion: In our study, all three extracts of Wedelia chinensis have in vitro antiproliferative
capacity on PBMCs and antioxidant activity on free radicals of DPPH. These results may be used for the
further clinical trials.
Keywords: Wedelia chinensis, peripheral blood mononuclear cells, antiproliferative, antioxydant
ĐẶT VẤN ĐỀ
Hiện nay, việc điều trị các bệnh suy giảm
miễn dịch và các bệnh tự miễn chủ yếu sử
dụng thuốc tây y. Tuy nhiên, việc sử dụng các
loại thuốc này trong thời gian dài không chỉ
gây bất lợi cho bệnh nhân mà còn làm tăng chi
phí điều trị. Ngược lại, dược liệu truyền thống
thường có tác dụng giảm đáng kể tác dụng
phụ so với thuốc tây y. Điều này đã và đang
hướng các nhà nghiên cứu đến khuynh hướng
sử dụng thuốc có nguồn gốc từ dược liệu.
Một nghiên cứu trước đây đã tìm thấy
trong cao cồn Sài đất có sự hiện diện của acid
phenolic, flavonoid và saponin
(1-3)
. Đây là
những chất này gây độc tế bào. Ngoài ra,
nhiều nghiên cứu cũng tìm thấy trong cây Sài
đất có chứa các hoạt chất như isoflavone,
wedelolactone, norwedelolactone có tác dụng
ức chế các tế bào gai
(4,5)
; oleanan, và luteolin
làm giảm sự tăng sinh của các tế bào đơn
nhân (TBĐN)
(6,7)
. Trong thực tế, cây Sài đất
thường được sử dụng đơn trị hoặc kết hợp
với các cây thuốc khác dưới dạng cao chiết
để điều trị ho, viêm họng, mụn nhọt
(8-13)
.
Tuy nhiên, hiện nay chưa có nhiều nghiên
cứu về tác động của cây Sài đất trên các
TBĐN, là phân đoạn giàu các tế bào lympho
rất quan trọng trong vấn đề bảo vệ cơ thể
chống lại các yếu tố môi trường như vi
khuẩn, virus. Mục tiêu của đề tài này là
nghiên cứu tác động của các cao chiết Sài
đất (Wedelia chinensis (Osbeck) Merr.,
Asteraceae) trên sự tăng sinh in vitro của tế
bào đơn nhân trong máu ngoại vi người
(TBĐN) và đánh giá hoạt tính chống oxy hóa
của chúng.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu máu toàn phần được thu thập từ 5
tình nguyện khỏe mạnh, cho vào ống vô khuẩn
chứa chất chống đông EDTA. Những người tình
nguyện này đều có sức khỏe tốt (dựa vào kết quả
khám sức khỏe tổng quát trong vòng 2 tháng
trước khi lấy mẫu) và thỏa mãn các tiêu chí sau:
từ 18-55 tuổi, công thức máu bình thường, không
dùng kháng sinh trong thời gian 3 tháng trước
ngày lấy máu, âm tính với các bệnh viêm gan B,
viêm gan C, HIV, không dùng thuốc kháng viêm
hoặc ức chế miễn dịch và đã ký tên vào bản
đồng thuận tình nguyện cho mẫu nghiên cứu.
Wedelia chinensis được thu hái ở huyện
Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai trong tháng 09/2018
và được xử lý sơ bộ như sau: mẫu dược liệu
được rửa sạch nhằm loại bỏ bụi và tạp cơ học,
để ráo, sấy khô ở 60
o
C trong 4 ngày liên tiếp,
bảo quản trong chai thủy tinh tránh ánh sáng,
lưu trữ mẫu tại bộ môn Hóa Sinh, khoa Dược,
Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh.
Nguyên vật liệu
Tủ đông -20
o
C (Alaska), tủ CO
2
(Memmert -Đức).
Tủ cấy vi sinh (Bộ môn vi sinh, Khoa Dược,
ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh).
Buồng đếm hemocytometer Neubauer.
Giếng 96 tiệt khuẩn có nắp (SPL Lifescience).
Màng lọc milipore PTFE-0,22µm (Sartorius).
Dimethyle sulfoxide (DMSO).
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
B – Khoa học Dược
108
RPMI-1640 (hãng Gibco).
Ficoll (hãng Hemidia).
Kháng sinh (penicilline-streptomycine)
(hãng Gibco).
Huyết thanh thai bò (FBS) (hãng Gibco).
Phytohaemagglutinin (PHA) (hãng Gibco).
Trypan blue (hãng Sigma).
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-
diphenyltetrazolium bromide (MTT) (hãng Sigma).
2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) (hãng Sigma).
Acid ascorbic (hãng Sigma).
Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát thực vật học của cây Sài đất
Khảo sát đặc điểm hình thái
Mô tả đặc điểm thực vật học dựa trên quan
sát cây tươi.
Khảo sát cấu tạo vi học của dược liệu và bột dược liệu
Nhận xét cảm quan, quan sát dưới kính hiển
vi và so sánh với tài liệu (nếu có).
Đánh giá độ tro và độ ẩm của dược liệu
Các dược liệu được đánh giá chỉ tiêu độ tro, độ ẩm
theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V.
Xác định độ ẩm: phụ lục 9.6 DĐVN V (trang
PL–203).
Xác định độ tro toàn phần: phụ lục 9.8
DĐVN V (trang PL–204).
Tất cả các chỉ tiêu thử tinh khiết nói trên đều
lấy kết quả là giá trị trung bình của 3 thử nghiệm
độc lập.
Định tính sơ bộ thành phần hóa học của
dược liệu
Phân tích sơ bộ thành phần hóa học của các
dược liệu có hoạt tính theo quy trình mô tả trong
giáo trình “Phương pháp nghiên cứu dược liệu”
của Bộ môn Dược liệu, Khoa Dược, Đại học Y
Dược TP. Hồ Chí Minh, năm 2018.
Điều chế cao toàn phần ethanol 96%, cao
ethanol 50% và cao nước
Điều chế cao toàn phần ethanol 96% và
ethanol 50%: Dược liệu khô được đem đi nghiền
và rây qua rây có đường kính 2 mm. Sau đó, bột
dược liệu được ngâm trong ethanol 96% hoặc
ethanol 50% với tỉ lệ 1:10 (kg/l) trong vòng 72
giờ. Dịch chiết được thu hồi và cô bằng máy cô
quay áp suất giảm ở nhiệt độ 50
o
C, sau đó để
trên bếp cách thủy ở 60°C
cho đến khi thu được
cao đặc.
Điều chế cao toàn phần với nước: Đun sôi
bột dược liệu khô với nước trong 30 phút với tỉ lệ
1:10 (kg/L). Lặp lại như vậy thêm 2 lần nữa. Gom
dịch chiết của 3 lần đun và cô trên bếp cách thủy
ở 60
o
C cho đến khi thu được cao đặc.
Các cao toàn phần sẽ được đem phân tích các
thành phần hóa thực vật và tính độ ẩm để xác
định hiệu suất chiết.
Phân lập TBĐN từ máu người toàn phần
Toàn bộ quá trình phân lập TBĐN trong máu
toàn phần được thực hiện trong 4 giờ kể từ thời
điểm lấy máu và trong điều kiện vô trùng. Cho 5
mL máu toàn phần đã được chống đông EDTA
vào ống Falcon
tiệt khuẩn 50 mL. Sau đó pha
loãng máu với dung dịch đệm phosphat PBS
(pH 7,2) theo tỉ lệ 1:2 (v/v). Cho dung dịch máu
pha loãng vào trong một ống falcon tiệt khuẩn
khác có sẵn dung dịch Ficoll với tỷ lệ 1: 3 (v/v)
rồi đem ly tâm với tốc độ 400 xg trong 30 phút ở
20°C. Thu lấy lớp TBĐN và rửa các tế bào hai lần
với 10 mL PBS, ly tâm với tốc độ 200 xg trong 10
phút ở 20°C. Cắn TBĐN được cho vào môi
trường nuôi cấy hoàn chỉnh (MTNCHC) chứa
RPMI 1640, kháng sinh penicillin-streptomycin
và FBS 5%. Tỷ lệ tế bào sống trong huyền phù
được xác định bằng phương pháp nhuộm tế bào
trypan blue và đếm tế bào bằng buồng đếm
hemocytometer.
Khảo sát ảnh hưởng của các cao toàn phần
ethanol trên sự tăng sinh in vitro TBĐN bằng
thử nghiệm MTT
Quy trình đánh giá sự tăng sinh TBĐN
bằng thử nghiệm MTT được thực hiện trên đĩa
nuôi cấy tế bào 96 giếng vô khuẩn có nắp với
các loại cao toàn phần của Sài đất có nồng độ
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020 Nghiên cứu
B – Khoa học Dược 109
khác nhau, được chuẩn bị bằng cách pha loãng
dung dịch cao gốc 40 mg/mL đã lọc qua màng
lọc tiệt khuẩn 0,22µm vào môi trường nuôi cấy
hoàn chỉnh để thu được các dung dịch cao có
nồng độ 0,2; 2; 20; 100; 200; 400 µg/mL. Sau khi
ủ các đĩa trong buồng nuôi cấy tế bào ở 37°C,
5% CO
2
và 90% độ ẩm trong 43 giờ và 67 giờ,
tại mỗi thời điểm đánh giá, cho 10 µL dung
dịch MTT 5 mg/mL vào tất cả các giếng, sau
đó bọc giếng bằng giấy nhôm để tránh ánh
sáng và tiếp tục ủ thêm 4 giờ. MTT bị khử tạo
thành tinh thể formazan màu tím không tan
bởi các tế bào sống, có thể được quan sát dưới
kính hiển vi. Hòa tan hoàn toàn formazan
trong mỗi giếng với 200 µL DMSO/NH
3
, sau
đó đo độ hấp thu (Abs) ở bước sóng 595 nm so
với bước sóng tham chiếu ở 655 nm. Mỗi mẫu
làm 3 lần, lấy Abs trung bình. Tính phần trăm
tế bào bị ức chế tăng sinh (%I) bởi cao chiết so
với mẫu không có cao dược liệu (chứng âm).
Abs
thử thực (chứng âm thực)
= Abs
thử (chứng âm)
- Abs
trắng thử
(trắng chứng âm)
Mẫu thử cao toàn phần dành cho thử
nghiệm ức chế sự tăng sinh in vitro PBMCs gồm
có: TBĐN (mật độ 1×10
6
tế bào/mL) + cao chiết
dược liệu ở các nồng độ khác nhau.
Mẫu chứng âm gồm có: TBĐN (mật độ 1×10
6
tế bào/mL) + MTNCHC.
Mẫu trắng thử cao chiết: cao chiết dược liệu
ở các nồng độ khác nhau + MTNCHC.
Mẫu trắng chứng âm: MTNCHC.
Từ đó tìm ra nồng độ ức chế trung bình IC
50
(µg/mL) đã ức chế 50% sự tăng sinh tế bào TBĐN.
Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các cao
chiết bằng phương pháp loại các gốc tự do
DPPH
Pha dung dịch DPPH 0,2 mM và dung dịch
đối chiếu acid ascorbic 2 µg/mL trong methanol
ngay trước khi sử dụng (để tránh ánh sáng). Các
mẫu thử được chuẩn bị bằng cách pha loãng
dung dịch cao gốc 40 mg/mL đã lọc qua màng
lọc tiệt khuẩn 0,22 µm vào MTNCHC để thu
được các dung dịch cao có nồng độ 3,125; 6,25;
12,5; 25; 50; 100; 200; 400 và 800 µg/mL.
Bảng 1. Quy trình thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa của các cao Sài đất
Mẫu thử
Mẫu chứng dương Mẫu chứng âm Mẫu trắng thử Mẫu trắng chứng âm
Dung dịch cao chiết 400 µL 400 µL
DPPH 0,2 mM 400 µL 400 µL 400 µL
Acid ascorbic 2 µg/mL 400 µL
Methanol 400 µL 400 µL 800 µL
Đĩa 96 giếng được ủ tránh ánh sáng trong
30 phút. Sau đó, đo độ hấp thu (Abs) của các
mẫu ở bước sóng 515 nm. Mỗi mẫu làm 3 lần,
lấy Abs trung bình. Tính phần trăm loại gốc tự
do DPPH (%EC) bởi dung dịch cao chiết theo
công thức:
Từ đó tìm ra nồng độ hiệu quả trung bình
EC
50
(µg/mL) đã loại 50% gốc tự do có trong
dung dịch DPPH 0,1 mM trong methanol.
Xử lý thống kê
Số liệu được xử lý bằng phần mềm
Microsoft Excel 2013.
Sử dụng thuật toán non – linear regression
của phần mềm Graphpad Prime 7.0 để tính IC
50
và EC
50
.
Kết quả được biểu diễn dưới dạng trung
bình (mean) ± độ lệch chuẩn (SD – standard
deviation). Các giá trị IC50 và EC50 được tính
toán bằng thuật toán non-linear regression.
Sự khác biệt giữa các giá trị trung bình được
phát hiện bằng phép kiểm t-test.
Sự khác biệt được coi là có ý nghĩa thống kê
Nghiên cứu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 2 * 2020
B – Khoa học Dược
110
nếu giá trị p <0,05.
KẾT QUẢ
Khảo sát thực vật học
Mô tả thực vật
Cây thân thảo, mọc thẳng hoặc leo, cao
khoảng 40 cm. Thân cây có màu xanh và được
phủ bởi bộ lông màu trắng. Lá hình bầu dục có
răng cưa lớn, nông với những sợi lông xù ở cả
hai mặt trên và dưới. Lá có một gân chính và hai
gân phụ gần như xuất phát từ một điểm của
cuống lá, nổi lên ở mặt dưới của lá. Bông hoa có
màu vàng tươi, được sắp xếp ở đầu nách của lá
hoặc ở ngọn (Hình 1A).
Vi phẫu
Vi phẫu lá có 3 bó libe-gỗ, có lông tiết và lớp
biểu bì trên không bị lõm (Hình 1B); vi phẫu thân
thấy được mô mềm khuyết to (Hình 1C).
A B C
Hình 1. Minh họa mô tả Wedelia chinensis (Osbeck) Merr. và các vi phẫu của cây
Độ tro và độ ẩm của dược liệu Wedelia
chinensis
Độ tro toàn phần trung bình và độ ẩm
trung bình của 3 mẫu dược liệu lần lượt là
13,94% 0,004% và 9,11% 0,004% (< 15%) nên
đạt theo tiêu chuẩn DĐVN V.
Hiệu suất chiết
Hiệu suất chiết Wedelia chinensis cao nhất khi
chiết với nước nóng (37%). Ngược lại, ethanol
96% cho hiệu suất chiết kém nhất (9,3%).
Xác định sơ bộ thành phần hóa thực vật trong
các cao toàn phần Sài đất
Bảng 2. Kết quả sơ bộ thành phần hóa thực vật của
cao chiết Wedelia chinensis
Phản ứng định
tính
Cao ethanol
96%
Cao ethanol
50% Cao nước
Flavonoid ++ +++ -
Tanin ++ +++ +
Coumarin ++ ++ -
Alkaloid - - -
Phản ứng định
tính
Cao ethanol
96%
Cao ethanol
50% Cao nước
Chất khử ++ ++ +
Triterpenoid + + +
Glycosid - - -
Anthraquinon - - ++
Acid polyuronic - - +++
Saponin + +++ ++
(-): không có; (+): có ít; (++): có; (+++): có nhiều
Các hoạt chất được tìm thấy nhiều và cho
phản ứng định tính rõ nhất trong cao ethanol
50%. Tuy nhiên, không tìm thấy alkaloid và
glycosid trong cả 3 loại cao chiết Wedelia chinensis
với dung môi phân cực (Bảng 2).
Kết quả đánh giá tác động của cao chiết
Wedelia chinensis lên sự tăng sinh TBĐN
Kết quả đánh giá khả năng ức chế tăng sinh các
TBĐN của các cao chiết toàn phần từ cây Sài đất
Phần trăm ức chế sự tăng sinh TBĐN in vitro
của 3 cao chiết ở các nồng độ khác nhau trong 43
giờ là từ 13,56 đến 71,23%, từ 20,22 đến 80,68%