Đề tài nghiên cứu: Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro

Chia sẻ: Conan Edowa | Ngày: | Loại File: DOC | Số trang:71

Thêm vào BST

Báo xấu

227
lượt xem 76
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Đề tài nghiên cứu: Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro được thực hiện nhằm theo dõi nồng độ javel thích hợp cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp, quá trình tạo protocorm và sự phát triển rễ của lan hồ điệp in vitro khi thay đổi nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ, NAA trong môi trường nuôi cấy.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Đề tài nghiên cứu: Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro

Đề tài nghiên cứu “Xác định nồng độ nước javel cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro” được tiến hành tại phòng di truyền và chọn giống Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam, thời gian thực hiện từ tháng 2/2009 đến tháng 7/2009. Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn Đề tài nhằm theo dõi nồng độ javel thích hợp cho quá trình khử mẫu phát hoa lan hồ điệp, quá trình tạo protocorm và sự phát triển rễ của lan hồ điệp in vitro khi thay đổi nồng độ chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ, NAA trong môi trường nuôi cấy. v Phương pháp khử trùng mẫu cấy: Khử trùng mẫu phát hoa lan hồ điệp bằng cách thay đổi nồng độ javel (20%, 40%, 60%, 80%). Khử trùng ở nồng độ 80% cho kết quả tốt nhất. v Tạo protocorm trực tiếp từ mô lá: Công thức môi trường có sự kết hợp giữa BAP và TDZ thích hợp cho quá trình tạo protocorm: MS + đường (30 g/lít )+ PVP (100 mg/lít) + NAA (1 mg/lít) + agar (8 g/lít) + TDZ (5 mg/lít) + BAP (3 mg/lít) + than hoạt tính (2 g/lít), pH = 5,8. v Kích thích sự ra rễ của chồi: Sử dụng NAA để kích thích tạo rễ ở lan Hồ Điệp in vitro, các công thức môi MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8 g/lít) + BAP (ĐC) (0,05 mg/lít). MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8
g/lít) + BAP (0,05 mg/lít) + NAA (0,5 mg/lít) (cho kết quả tốt nhất). MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít)+ than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8 g/lít )+ BAP (0,05 mg/lít ) + NAA (1 mg/lít). MS + đường (30 g/lít) + nước dừa (5 ml/lít) + than hoạt tính (2 g/lít) + agar (8 g/lít) + BAP (0,05 mg/lít) + NAA (1,5 mg/lít). Trang tựa: ........................................................................................................................ i LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................. ii TÓM TẮT...................................................................................................................... iii MỤC LỤC ..................................................................................................................... iv DANH SÁCH CÁC HÌNH ........................................................................................... vii DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................................. 1 1.2 Mục tiêu và yêu cầu............................................................................................................... 2 1.2.1 Mục tiêu .......................................................................................................................... 2 1.2.2 Yêu cầu ........................................................................................................................... 2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3 2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô ............................................................................................... 3 2.1.1 Một số kết quả tiêu biểu trong lĩnh vực nuôi cấy mô thực vật trên thế giới ................. 3 2.1.2 Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam ........................ 5 2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................................... 6 2.2.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng ............................................................................................. 6 2.2.2 Nuôi cấy mô sẹo ............................................................................................................. 6 2.2.3 Nuôi cấy tế bào đơn ....................................................................................................... 6
2.2.4 Nuôi cấy protoplast – lai protoplast .............................................................................. 7 2.2.5 Nuôi cấy hạt phấn .......................................................................................................... 7 2.3 Quy trình nhân giống in vitro ................................................................................................ 7 2.3.1 Khử trùng mẫu cấy ......................................................................................................... 7 2.3.2 Tái sinh mẫu nuôi cấy .................................................................................................... 8 2.3.3 Nhân nhanh .................................................................................................................... 8 2.3.4 Tạo cây hoàn chỉnh ........................................................................................................ 8 2.3.5 Đưa cây ra đất................................................................................................................ 8 2.4 Những vấn đề còn tồn tại trong nhân giống cây trồng ......................................................... 9 2.4.1 Tính bất định về mặt di truyền ....................................................................................... 9 2.4.2 Sự hoại mẫu .................................................................................................................... 9 2.4.3 Sử dụng thuốc kháng sinh ............................................................................................ 10 2.4.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy .................................................................. 10 2.4.5 Hiện tượng thủy tinh thể ............................................................................................... 10 2.5 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nông nghiệp .................................................. 11 2.5.1 Vi nhân giống ................................................................................................................ 11 2.5.2 Sản xuất và bảo quản cây sạch bệnh ............................................................................ 12 2.5.3 Bảo quản và nhân giống in vitro................................................................................... 12 2.6 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) ................................................................. 12 2.6.1 Auxin ............................................................................................................................. 12 2.6.2 Cytokinin....................................................................................................................... 13
2.7 Sơ lược về lan hồ điệp ......................................................................................................... 13 2.7.1 Vị trí phân loại ............................................................................................................. 13 2.7.2 Nguồn gốc, xuất xứ ...................................................................................................... 14 2.7.3 Mô tả hình thái ............................................................................................................. 14 2.7.4 Trồng trọt và chăm sóc ................................................................................................ 17 2.7.5 Nhân giống truyền thống ............................................................................................. 20 2.8 Vi nhân giống Phalaenopsis ............................................................................................... 21 2.8.1 Nhân giống vô tính sử dụng chồi đỉnh......................................................................... 21 2.8.2 Tái sinh chồi từ phát hoa Phalaenopsis ...................................................................... 22 2.8.3 Tái sinh PLB từ mô lá Phalaenopsis ........................................................................... 23 2.8.4 Tăng trưởng PLB thành cây con.................................................................................. 23 2.9 Giá trị kinh tế của lan hồ điệp ............................................................................................. 24 _Toc241549069Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ...............26 3.1 Thời gian và địa điểm .......................................................................................................... 26 3.2 Phương tiện thí nghiệm ....................................................................................................... 26 3.2.1 Đối tượng thí nghiệm ................................................................................................... 26 3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ .............................................................................................. 26 3.3 Tiến hành thí nghiệm........................................................................................................... 28 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫu cấy ........................................................................................................................................ .. 28 3.3.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BA,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp .................................................................................................. 29
3.3.3 Thí nghiêm 3:Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triển của cây lan hồ điệp in vitro ................................................................................................... 30 3.4 Xử lý số liệu......................................................................................................................... 31 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................32 4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ nước javel đến độ sạch của mẫu cấy .................. 32 4.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ BAP,TDZ, điều kiện nuôi cấy tới quá trình tạo protocorm từ lá cây hồ điệp in vitro ......................................................................................... 35 4.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến sinh trưởng, phát triển của cây lan hồ điệp in vitro ................................................................................................................................ 43 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................49 5.1 Kết luận ................................................................................................................................ 49 5.2 Đề nghị................................................................................................................................. 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................50 TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT ...............................................................................................50 PHỤ LỤC ......................................................................................................................53 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT : 6 – Benzylaminopurine : Thidiazuron : α Napthylacetic acid : Đối chứng : Murashige and Skoog (1962) : Môi trường nền
: Ngày sau cấy : Nghiệm thức : Protocorm like body : Indol acetic acid : Điều hòa sinh trưởng thực vật : Polyvinylpyrolidone : Lần lặp lại DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1: Cây và hoa lan hồ điệp (http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail) ......... 14 Hình 2.2: Hoa lan hồ điệp ......................................................................................................... 15 Hình 2.3: Trái lan hồ điệp 3 tháng tuổi (ảnh chụp tại Trại lan, Viện KHNN Miền Nam) .......... 16 Hình 2.4: Keiki của lan hồ điệp (http://www.orchidshome.com) ............................................ 16 Hình 2.6: Một số giống lan hồ điệp tại Việt Nam ...................................................................... 25 Hình 3.1: Phát hoa lan hồ điệp, bộ phận lấy mẫu cấy .............................................................. 28 Hình 3.2: Mẫu lá lan hồ điệp ban đầu (a) và mẫu cấy (b) ........................................................ 29 Hình 4.1: Mẫu nảy chồi và hình thành hoa thứ cấp (20 NSC) ................................................. 34 Hình 4.2: Protocorm được tạo ra trong điều kiện tối (80 NSC) ............................................... 42
Hình 4.3: Protocorm tạo ra trong điều kiện sáng (80 NSC) ..................................................... 43 Hình 4.4: Cây lan hồ điệp ở giai đoạn 40 NSC ........................................................................ 48 DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo .....................7 Bảng 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ nhiễm nấm và vi khuẩn của mẫu ...33 Bảng 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ javel đến tỷ lệ chết và tỷ lệ sống của mẫu.............33 Bảng 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ mẫu lá hình thành protocorm .............................................................................................................35 Bảng4.4:Ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng BAP, TDZ đến phản ứng của mẫu.36 Bảng 4.5: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới tỷ lệ sống và tỷ lệ chết của mẫu lá lan hồ điệp in vitro .......................................................................................37 Bảng 4.6: Ảnh hưởng của BAP, TDZ và điều kiện nuôi cấy tới khả năng hình thành protocorm từ mẫu lá lan hồ điệp in vitro ........................................................................38 Bảng 4.7: Ảnh hưởng của BAP, TDZ, điều kiện nuôi cấy tới kích thước của protocorm .......................................................................................................................................40 Bảng 4.8: Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng tạo rễ của cây lan hồ điệp in vitro ................................................................................................................................44 Bảng 4.9: Ảnh hưởng của NAA đến số lá của lan hồ điệp in vitro ...............................45
Bảng 4.10: Ảnh hưởng của NAA đến kích thước lá và chiều cao của cây lan hồ điệp in vitro ................................................................................................................................46 Trong quá trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng ngành nông nghiệp thành phố nói riêng và của cả nước nói chung, hoa lan cây cảnh là một lĩnh vực có rất nhiều tiềm năng đem lại lợi ích kinh tế cho xã hội và phù hợp với hoàn cảnh của ngành nông Hiện nay, thú chơi hoa kiểng không những là nhu cầu thiết yếu của đời sống xã hội, mà còn là một ngành kinh doanh mang lại hiệu quả kinh tế cao. Nghề trồng lan hiện nay không còn là thú vui tiêu khiển mà đã trở thành hàng hoá. Mặt hàng này không chỉ trao đổi trong nước mà đã thâm nhập ra thị trường thế giới, tạo ra nguồn hàng xuất khẩu có giá trị, đem lại nhiều ngoại tệ cho đất nước. Những năm gần đây, ngành trồng lan ở Tp.Hồ Chí Minh có chiều hướng phát triển tốt. Phong trào này lan rộng, không những ở các cơ quan nghiên cứu, cơ sở sản xuất mà còn ở các hộ gia đình. Trong giai đoạn hiện nay, kỹ thuật nhân giống lan thông thường gần như không đủ đáp ứng cho thị trường. Do đó, nhân giống lan bằng phương pháp nuôi cấy in vitro ngày Hơn thế nữa, trên thị trường hoa cây cảnh hiện nay, lan hồ điệp là loại lan có hoa đẹp, sang trọng, đa dạng, màu sắc phong phú, lâu tàn. Chính vì thế, hoa lan hồ điệp mang ý nghĩa tinh thần và có giá trị kinh tế cao ở trong nước cũng như ở nước ngoài. Do khả năng tự sinh trong tự nhiên rất thấp, nên phương pháp gieo hạt trong môi trường in vitro được sử dụng để tạo số lượng lớn cây con của giống lan này. Tuy nhiên, những cây con mọc từ hạt thường tăng trưởng không đồng đều, lâu trổ hoa, đặc điểm hoa không thuần nhất. Người ta thường áp dụng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh
trưởng của cây để giữ nguyên những tính trạng quý về màu sắc, kích thước hoa, hình dạng cánh, kiểu phân bố hoa trên trục phát hoa. Từ nguồn nguyên liệu này, tùy theo mục đích mà áp dụng các phương pháp nhân nhanh khác nhau để cho ra số lượng lớn cây đồng nhất trong thời gian ngắn. Với lan hồ điệp, hiện nay bộ phận được sử dụng để vô mẫu phổ biến nhất là phát hoa. Nguyên nhân là do khi cắt phát hoa thì cây vẫn sinh trưởng và phát triển bình thường. Ngoài ra trên phát hoa còn chứa nhiều mầm ngủ nên tạo được nguồn vật liệu nhân giống phong phú, mang lại giá trị kinh tế cao. Xuất phát từ những điều trên, đề tài nghiên cứu được tiến hành tại phòng di truyền và chọn giống – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam gồm 2 nội dung: Xác định nồng độ nước javel và thời gian khử mẫu phát hoa của lan hồ điệp và theo dõi ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng BAP, TDZ, NAA đến quá trình sinh trưởng, phát triển của lan hồ điệp lai (Phalaenopsis sp.) in vitro. Xác định nồng độ javel thích hợp cho việc vào mẫu phát hoa cây lan hồ điệp. Xác định nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự hình thành protocorm từ lá cây lan hồ điệp. Xác định tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp cho quá trình sinh trưởng, phát triển Bố trí thí nghiệm với các mức nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (BAP, TDZ, NAA) khác nhau nhằm tìm ra nồng độ thích hợp nhất cho quá trình tạo chồi trực tiếp từ lá và quá trình tạo rễ của lan hồ điệp. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lịch sử phát triển nuôi cấy mô
2.1.1 Lịch sử nuôi cấy mô thực vật trên thế giới Năm 1838, hai nhà sinh vật học người Đức là Shleiden và Schwam đã đề xướng thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế bào hợp thành. Các tế bào phân hóa đều mang các thông tin di truyền ở trong tế bào đầu tiên, đó là trứng sau khi thụ tinh, và là những đơn vị độc lập, từ đó có thể xây Năm 1954, Skoog (Hoa Kỳ) tình cờ thấy, nếu thêm một chế phẩm đã để lâu của DNA lấy tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rõ rệt. Việc phát hiện vai trò của IAA, NAA, 2,4D và kinetin cùng với việc phát hiện những vai trò của các vitamine và nước dừa là một bước tiến rất quan trọng trong giai đoạn thứ hai của lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật, đó là tiền đề kĩ thuật cho việc xây dựng các môi trường xác định về mặt hóa học và cho việc làm các thí nghiệm ổn định dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của ngành khoa học này. Năm 1957, Skoog và Miller công bố các kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm thấp tỷ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ, ngược lại nếu tỷ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tượng này được xác định trên nhiều cây khác nhau và đóng góp rất lớn vào điều khiển sinh trưởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy. Thành công của Skoog và Miller dẫn đến nhiều phát hiện quan trọng khác, mở đầu cho giai đoạn thứ 3 của lịch sử nuôi cấy mô thực vật.
Năm 1960, Berman công bố có thể dùng phương pháp lọc đơn giản để thu được huyền phù không có tế bào dính cụm mà hầu hết là tế bào đơn. Các tế bào đơn có thể gieo trên môi trường, tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo. Cùng với kỹ thuật gieo tế bào của Bergman, nhiều tác giả đã thành công trong tạo cây hoàn chỉnh từ một tế bào, chứng minh một cách rất tốt về tính toàn năng của tế bào thực vật. Khả năng nuôi cấy tế bào thực vật trong các bình lên men dùng trong công nghiệp vi sinh và khả năng tái tạo cây làm hoàn chỉnh tế bào đã mở ra những triển vọng mới trong việc tạo các dòng tế bào đột biến, các dòng tế bào siêu sản xuất một sản phẩm thứ cấp nào đó và khả năng tăng tần suất đột biến trong di truyền đột biến ở Năm 1966, Guha và Mahes Wari công bố thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây cà độc dược (Datura inoxia). Đến nay việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn đã thành công ở rất nhiều cây (bắp, lúa,...) và đóng góp vô cùng lớn vào việc tăng thêm kiến thức di truyền và thực tiễn chọn giống. Người ta thực sự chú ý đến triển vọng của protoplast vào đầu những năm 1970, khi các tác giả Nigata và Takebe (Nhật) thành công trong việc làm cho protoplast tách từ mô thuốc lá tái tạo vỏ cellulose, phân chia và tạo nên một phần tế bào trong môi trường lỏng. Do các protoplast có khả năng dung hợp với nhau trong các điều kiện nhất định và hấp thu các phân tử lớn hoặc thậm chí các cơ quan từ bên ngoài, các nhà nuôi cấy mô thực vật đặt hy vọng lớn vào kỹ thuật protoplast để chọn giống có kết quả Năm 1965, Ledoux và cộng tác viên đề xướng vấn đề biến tính của tế bào thực vật. Ông cho rằng tế bào hạt giống thực vật có khả năng hấp thu DNA ngoại lai vào
trong tế bào. DNA ngoại lai có thể gắn với DNA tế bào và có hoạt động biểu hiện tính di truyền gây nên sự biến tính ở thực vật. Từ năm 1980 1992, hàng loạt các thành công mới trong lĩnh vực công nghệ gen thực vật đã được công bố. Nhờ có plasmid, phân tử DNA vòng thường có trong tế bào vi khuẩn, được lắp ghép, cấu trúc lại sao cho plasmid có gắn thêm một gen xác định đã thực hiện thành công với nhiều họ thực vật. Chỉ trong thời gian ngắn, các thành công này đã được các công ty cây trồng siêu quốc gia khai thác triệt để. Khả năng ứng dụng nuôi cấy mô thực vật dễ thấy nhất là trong lĩnh vực nhân giống và phục tráng giống. Ngay từ năm 1960, Morel đã nhận thấy đỉnh sinh trưởng của các loại địa lan (Cybidium) khi đem nuôi cấy sẽ hình thành các protocorm. Khi chia cắt các protocorm và tiếp tục nuôi cấy thì thu được các protocorm mới. Khi để trong điều kiện nhất định thì protocorm có thể phát triển thành cây lan con. Hơn nữa các tế bào đỉnh sinh trưởng chứa rất ít hoặc hoàn toàn không chứa virus. Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi nách cây nho và cây khoai tây, đem nuôi cấy và cấy chuyền nhiều lần trong ống nghiệm. Tiếp sau đó, nuôi cấy mô được áp dụng quy mô sản xuất thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao như chuối, cà phê, khoai tây, cây ăn quả có múi. Hiện nay, kỹ thuật nuôi cấy mô đang bước vào giai đoạn thứ 4 của quy trình phát triển. Đó là giai đoạn nuôi cấy mô thực vật được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống, nhân giống, vào việc sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và
nghiên cứu lý luận di truyền thực vật bậc cao. 2.1.2 Sơ lược quá trình phát triển nuôi cấy mô tế bào thực vật ở Việt Nam Ở Việt Nam, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật chỉ mới bắt đầu từ năm 1975. Phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đầu tiên được xây dựng tại Viện Sinh Học, Viện Khoa Học Việt Nam do tiến sĩ Lê Thị Muội đứng đầu. Ý thức được triển vọng to lớn của ngành khoa học hiện đại này trong chọn giống và nhân giống cây trồng nông nghiệp, ở các cơ sở thuộc Trung Tâm Nghiên Cứu Khoa Học Tự Nhiên và Công Nghệ Quốc Gia Hà Nội, Tp.Hồ Chí Minh, một số đơn vị nghiên cứu thuộc Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn, Bộ Lâm Nghiệp, Bộ Y Tế, Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân...đã chú ý xây dựng các phòng nuôi cấy mô thực vật, từng bước xây dựng tiềm lực khoa học và đào tạo cán bộ nghiên cứu về ngành này. Theo Nguyễn Văn Uyển và các tác giả, năm 1993, nghiên cứu nuôi cấy mô thực vật ở Việt Nam đã đạt được một số thành tựu sau: Nhân giống khoai tây (Solanum tuberosum L) bằng nuôi cấy mô thực vật (Trần Văn Ngọc,Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển). Nhân giống vô tính cây cà phê (họ Rubiacea) (Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Văn Ứng dụng nuôi cấy mô nhân giống cây cỏ ngọt (họ Compositae) (Bùi Thị Tường Thu, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển). Nhân giống chuối (Mussa spp.) bằng phương pháp cấy mô (Đoàn Thị Ái Thuyền, Nguyễn Thị Quyền, Nguyễn Đức Minh Hùng, Nguyễn Văn Uyển). Ứng dụng nuôi cấy mô trong nhân giống cây kiwi (Actinidia chinensis Planch)
Nhân giống cây bắt ruồi (Nepenthes madagascariens) bằng phương pháp cấy Nhân giống dứa Cayenene và Queen Long An bằng phương pháp nuôi cấy mô) (Nguyễn Đức Minh Hùng, Trần Văn Minh, Vũ Mỹ Liên, Thái Xuân Du). Nhân giống cây vani (Vanilla sp.) bằng nuôi cấy mô (Vũ Mỹ Liên). 2.2 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật Một trong những phương pháp để đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thực vật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và chồi bên). Sau khi vô trùng mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có chứa chất kích thích sinh trưởng thích hợp. Từ đỉnh sinh trưởng sau một khoảng thời gian nuôi cấy nhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi. Chồi tiếp tục phát triển vươn thân tạo lá để trở thành cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất để thích nghi dần Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa của tế bào đã phân hóa. Mô sẹo đã phát triển nhanh khi môi trường có sự hiện diện auxin. Khối mô sẹo có khả năng tái sinh thành một cây hoàn chỉnh trong điều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo. Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đặt trên máy lắc có tốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng rẽ gọi là tế bào đơn. Tế bào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối. Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng, tế bào đơn được tách ra và được trải trên môi trường thạch. Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào
đơn phát triển thành cụm tế bào mô sẹo. Khi trong môi trường thạch có tỉ lệ cytokinin/auxin thích hợp, tế bào đơn có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh. 2.2.4 Nuôi cấy protoplast – lai protoplast Protoplast (tế bào trần) là tế bào đã tách lớp vỏ cellulose. Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tạo lại màng tế bào, tiếp tục phân chia và tạo Khi tế bào mất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo ra tế bào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng. Sự dung hợp protoplast có thể được thực hiện trên hai đối tượng cùng loài. Hạt phấn được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp để tạo thành mô sẹo 2.3 Quy trình nhân giống in vitro Theo tài liệu của Street (1974) các chất diệt nấm khuẩn để xử lý mô cấy như Bảng 2.1: Các chất dùng khử trùng với nồng độ và thời gian khuyến cáo Nồng độ (%) 9 10 10 12 12 0,1 1 4 50 mg/l Khử trùng mẫu cấy là giai đoạn tối quan trọng quyết định toàn bộ quá trình nhân giống in vitro. Mục đích của giai đoạn này là phải tạo ra được nguyên liệu vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro. Vô trùng mô cấy là một thao tác khó, ít khi thành công ngay lần đầu tiên. Tuy
vậy, nếu kiên trì tìm được nồng độ và thời gian vô trùng thích hợp thì sau vài lần thử Mục đích của giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô cấy. Quá trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinh được đưa vào môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, bên cạnh điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non, chưa phân hóa có khả năng tái sinh cao hơn các mô trưởng thành đã chuyên hóa sâu. Người ta cũng còn nhận thấy rằng mẫu cấy trong thời kỳ sinh trưởng nhanh của cây trong mùa sinh trưởng cho kết quả rất khả quan trong tái sinh chồi. Giai đoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân, ta thường đưa thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin, gibberellin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiết nấm men,…kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vô tính. Khi đạt được kích thước nhất định, các chồi được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 sang môi trường tạo rễ. Thường từ 23 tuần, từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin là nhóm hormon thực vật quan trọng có chức năng tạo rễ Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh từ ống nghiệm ra đất là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khả năng ứng dụng quá trình này trong
Đây là giai đoạn chuyển cây con in vitro từ trạng thái sống dị dưỡng sang sống hoàn toàn tự dưỡng, do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh (nhiệt độ, ánh sáng, ẩm độ, giá thể,…) phù hợp để cây con đạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như 2.4 Những vấn đề còn tồn tại trong nhân giống cây trồng 2.4.1 Tính bất định về mặt di truyền Mặc dù kỹ thuật nhân giống vô tính đã được sử dụng nhằm mục đích tạo ra quần thể cây trồng đồng nhất với số lượng lớn, nhưng phương pháp cũng tạo ra những biến dị tế bào soma qua nuôi cấy mô sẹo và nuôi cấy tế bào đơn. Những biến dị này được nghiên cứu vận dụng vào cải thiện giống cây trồng (Evans và Sharp, 1986, 1988; Larkin, 1987) nhưng rất ít những biến dị có ích được báo cáo. Cây trồng bị biến dị tế bào soma qua nuôi cấy thường là biến dị về chất lượng, số lượng, năng suất, và biến dị này không di truyền. Những nhân tố gây ra biến dị tế Kiểu di truyền: tần số biến dị bị ảnh hưởng bởi kiểu di truyền của các loại cây Thể bội: mức độ bội thể của cây trồng ảnh hưởng đến sự biến dị tự nhiên và tần số biến dị. Cây đa bội thể biến dị nhiều hơn cây nhị bội thể. Số lần cấy chuyền: số lần cấy chuyền càng nhiều thì cho tần số biến dị càng cao. Biến dị nhiễm sắc thể nhiều hơn khi nuôi cấy kéo dài (Amstrong và Phillips, 1988). Số lần cấy chuyền ít và thời gian giữa hai lần cấy chuyền ngắn làm giảm sự biến dị. Tái sinh tế bào thông qua con đường phát sinh phôi cũng làm giảm sự biến dị, nhưng không nhiều cây trồng có khả năng tái sinh qua quá trình phát sinh phôi. Loại mô: các bộ phận của cây trồng được sử dụng trong nuôi cấy mô có bộ máy
di truyền khác nhau. Thông thường nuôi cấy bằng đỉnh sinh trưởng hay chồi bên Có hai tác nhân làm hư mẫu nuôi cấy in vitro: (1) Bị vi sinh vật hủy hoại, có thể khử trùng mẫu trước khi nuôi cấy vào môi trường. (2) Bị virus hay thể giống như virus xâm nhiễm, không hoại mẫu nhưng có ảnh hưởng về sau. Tuy nhiên có sự xâm nhiễm của vi sinh vật như Agrobacterium, Baccilus, Corynebacterium, Erwinia, Pseudomonas vào nhu mô dẫn truyền sẽ hại mẫu khi tế bào bắt đầu phân chia. Để giảm tác nhân gây nhiễm, mẫu nuôi cấy là mô phân sinh đỉnh do ở đó sự sự biệt hóa tế bào nhu mô dân truyền chưa xảy ra quá trình biệt hóa. Có nhiều loại thuốc kháng sinh trong nuôi cấy mô, nhằm hạn chế sự hoại mẫu của vi sinh vật như: AmphotericinB, Nystatin, Kanamycin, Rifambicin Vancomycin, và penicilin khử được vi khuẩn gram () và gram (+), nấm mốc... từng đơn chất hay phối hợp. Nồng độ khử trùng 5 100 g/l phụ thuộc vào vật liệu nuôi cấy như tế bào, tế bào trần hay mô. Mô thực vật rất nhạy cảm đối với tác dụng thuốc kháng sinh và phản ứng khác nhau lên kiểu di truyền do đó phải rất cẩn thận khi sử dụng. Sự hủy hoại của chất kháng sinh lên mô thực vật xảy ra ở plasmid hay mitochondria, xử lí càng lâu hay nồng độ càng cao dễ dàng dẫn đến sự thay đổi gen của tế bào chất hay DNA. Chất kháng sinh được sử dụng ngăn chặn sự lây nhiễm hoại mẫu, nhưng sau đó mẫu được cấy sang môi trường 2.4.4 Việc sản xuất các chất gây độc từ mẫu cấy Thường chúng ta hay thấy hiện tượng hóa nâu hay hóa đen mẫu, sinh trưởng của
mẫu bị ngăn chặn hay hư mẫu. Hiện tượng này là do mẫu nuôi cấy có chứa nhiều chất tanin hay hydrophenol, có nhiều trong mô già hơn mô non. Than hoạt tính được đưa vào môi trường để hấp thu hợp chất phenol ngăn chặn quá trình hóa nâu và đen. Nhiều phương pháp làm giảm sự hóa nâu được đề nghị và được nhiều nhà khoa học đồng ý. Sử dụng mẫu nhỏ của mô non. Gây ít vết thương trên mẫu khi khử trùng. Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid và citric acid vài giờ trước khi cấy. Nuôi cấy trong môi trường lỏng oxy thấp, không có đèn 1 2 tuần. Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trường có nồng độ thấp sang môi trường có nồng độ cao hơn. Nhân giống vô tính in vitro chỉ có hiệu quả khi cây con chuyển ra đồng có tỷ lệ sống cao. Có một hiện tượng trong nuôi cấy mô làm cho tỷ lệ cây sống thấp khi chuyển cây ra khỏi bình nuôi cấy, cây non dễ dàng mất nước, đó là hiện tượng thủy tinh thể. Đây là một dạng bệnh sinh lý, được gọi bằng nhiều tên khác nhau như: Translucency, Hyperhydration, Hyperhydric (Paek et al., 1991). Dạng này được nhận thấy khi nuôi cấy trên môi trường lỏng hay môi trường có hàm lượng agar thấp, đặc biệt khi có sự trao đổi không khí thấp, quá trình thoát hơi nước tập trung trong cây, hiện tượng này xảy ra ở Đặc điểm cây thủy tinh thể: cây chứa nước trong suốt. Ngăn chặn hiện tượng thủy tinh thể: qua nghiên cứu quá trình xuất hiện và đặc
điểm của những cây thủy tinh thể, có một số phương thức hạn chế sự xuất hiện như sau: Giảm sự tăng hấp thu nước bằng cách tăng nồng độ đường trong nuôi cấy và dùng các chất có áp suất thẩm thấu cao. Nhưng phương pháp này làm thay đổi sự tổng hợp cấu trúc không gian của diệp lục và ức chế hình thành chồi. Giảm gây vết thương trên mẫu qua chất khử trùng và tiếp xúc với môi trường cấy ít nhất. ABA ngăn chặn được sự hóa thủy tinh thể ở một số loài cây trồng, nhưng các chất kích thích sinh trưởng khác không có tác dụng. Giảm nồng độ đạm trong môi trường nuôi cấy. Chuyển cây in vitro thuần hóa ngoài vườn ươm không ảnh hưởng tới cây thủy tinh Giảm ethylen trong bình nuôi cấy bằng cách thông gió tốt (Paek và Han). Tăng cường độ ánh sáng và giảm nhiệt độ trong phòng cấy. Kết luận: phương thức hiệu quả nhất, ít nhất là giảm sự hóa thủy tinh của mô cấy in vitro, làm giảm ảnh hưởng của hàm lượng nước trong môi trường nuôi cấy bằng cách tăng nồng độ đường và tạo điều kiện môi trường (yếu tố vật lý, nhiệt độ, ánh sáng, trao 2.5 Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào trong nông nghiệp Kỹ thuật nhân giống in vitro có nhiều ứng dụng trong cải thiện giống cây trồng: Tạo các cây con đồng nhất và giống như cây mẹ. Nhân một số lượng cây con lớn từ một cá thể ban đầu trong một thời gian ngắn. Tạo ra các cây con sạch bệnh. Một giống cây quý có thể được nhân ra nhanh chóng để đưa vào sản xuất. Việc trao đổi giống được dễ dàng.