Định lượng acid Homovanillic (Hva) và acid Vanillylmandelic (Vma) trong nước tiểu bằng sắc ký khí khối phổ

TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> ĐỊNH LƯỢNG ACID HOMOVANILLIC (HVA)<br /> VÀ ACID VANILLYLMANDELIC (VMA) TRONG NƯỚC TIỂU<br /> BẰNG SẮC KÝ KHÍ KHỐI PHỔ<br /> Trần Thị Chi Mai1, Trần Thị Thu Trang2, Hoàng Trung Kiên2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Hà Nội, 2Bệnh viện Nhi Trung ương<br /> <br /> Nghiên cứu này nhằm xây dựng và hiệu chuẩn quy trình kỹ thuật định lượng đồng thời acid homovanillic<br /> (HVA) và acid vanillylmandelic (VMA) niệu bằng sắc ký khí khối phổ. Phương pháp định lượng đồng thời HVA và<br /> VMA niệu bằng sắc ký khí khối phổ (GCMS) được xây dựng dựa trên phương pháp phân tích acid hữu cơ: tách<br /> chiết HVA và VMA trong nước tiểu, tạo dẫn xuất di - và tri (trimethylsilyl), phân tách và định lượng bằng phương<br /> pháp SIM trên GCMS. Giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,9 µmol/L cho HVA và VMA. Khoảng tuyến tính<br /> của HVA là 5,68 đến 192,9 µmol/L, của VMA là 3,2 đến 221 µmol/L. Sai số toàn bộ tính toán của phương pháp nhỏ<br /> hơn sai số cho phép. Qui trình kỹ thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu bằng phương pháp GCMS xây dựng<br /> được là chính xác và xác thực, có thể sử dụng để phục vụ chẩn đoán và theo dõi điều trị u nguyên bào thần kinh.<br /> Từ khoá: acid homovanillic, acid vanillylmandelic, sắc ký khí khối phổ, u nguyên bào thần kinh<br /> <br /> I. ĐẶT VẤN ĐỀ<br /> Các khối u có nguồn gốc từ mào thần kinh<br /> như u nguyên bào thần kinh (UNBTKNeuroblastoma) hay u tuỷ thượng thận<br /> (Pheochrocytomas) có đặc điểm là tăng bài<br /> tiết catecholamin. Do vậy, việc định lượng<br /> catecholamin (noradrenalin, adrenalin) và các<br /> sản phẩm chuyển hoá của chúng như acid<br /> homovanillic (HVA) và acid vanillylmandelic<br /> (VMA) đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán<br /> và theo dõi điều trị các bệnh nhân u nguyên<br /> bào thần kinh, u tuỷ thượng thận [1; 2].<br /> Trên thế giới, phương pháp sắc ký lỏng<br /> hiệu năng cao (High Performance liquid choromatography- HPLC) thường được sử dụng<br /> định lượng HVA và VMA trong nước tiểu.Tại<br /> Việt Nam, có rất ít phòng xét nghiệm định<br /> lượng VMA niệu và phương pháp sử dụng là<br /> đo quang sau khi đã tiến hành tinh sạch một<br /> <br /> Địa chỉ liên hệ: Trần Thị Chi Mai, Khoa Kỹ thuật Y học,<br /> Trường Đại học Y Hà Nội<br /> Email: mai.duong2@yahoo.com<br /> Ngày nhận: 08/01/2013<br /> Ngày được chấp thuận: 26/4/2013<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> phần VMA bằng sắc ký trao đổi ion. Phương<br /> pháp này rẻ tiền, đơn giản nhưng độ chính<br /> xác không cao vì nhiều yếu tố nhiễu. Trước<br /> khi định lượng VMA niệu bệnh nhân không<br /> được ăn một số thực phẩm như chuối, sô cô<br /> la. Hiện tại chưa có phòng xét nghiệm nào ở<br /> Việt Nam triển khai kỹ thuật định lượng HVA<br /> niệu. Việc định lượng đồng thời HVA và VMA<br /> niệu bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ là<br /> một phương pháp nhạy và đặc hiệu, được<br /> nhiều tác giả trên thế giới phát triển và sử<br /> dụng trong sàng lọc và chẩn đoán u nguyên bào<br /> thần kinh [1; 2]. Việc chuẩn hóa kỹ thuật này và<br /> đưa vào ứng dụng trong điều kiện phòng xét<br /> nghiệm của nước ta nhằm cải thiện việc chẩn<br /> đoán và theo dõi u nguyên bào thần kinh là<br /> cần thiết. Vì vậy đề tài này được tiến hành với<br /> mục tiêu: xây dựng và hiệu chuẩn qui trình kỹ<br /> thuật định lượng đồng thời VMA và HVA niệu<br /> bằng phương pháp sắc ký khối phổ.<br /> <br /> II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP<br /> 1. Chất liệu nghiên cứu<br /> Thiết bị: GCMS (GC 7890A - MS 5975)<br /> của Agilent. Cột sắc ký HP- 5MS 30m x 0,25<br /> 1<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> mm internal diameter x 0,25 um film thickness<br /> (Agilent).Hệ thống làm bay hơi dung môi bằng<br /> khí nitơ.<br /> Hóa chất: Acid 3-phenylbutyric của hãng<br /> Sigma- Aldrich, BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl)<br /> trifluoroacetamide) của hãng Supelco, Ethyl<br /> acetate của Fluka. Lyphocheck Quantitative<br /> Urine Control level 1 và level 2 của hãng<br /> Bio-Rad. Chuẩn HVA/VMA (Calibrator for<br /> HVA/VMA urine) của hãng Recipe. Các dung<br /> môi và hoá chất khác của hãng Merck đều có<br /> độ tinh khiết ở mức phân tích.<br /> Bệnh phẩm: Mẫu nước tiểu ngẫu nhiên<br /> của trẻ khoẻ mạnh và trẻ bị u nguyên bào thần<br /> kinh, được acid hoá bằng HCl 6M ngay sau<br /> khi thu thập và được bảo quản ở -20oC cho<br /> đến khi phân tích.<br /> 2. Phương pháp<br /> 2.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật định<br /> lượng đồng thời HVA và VMA niệu<br /> Chuẩn bị mẫu: cho 50 µl nội chuẩn acid<br /> 3- phenyl butyric vào 1 ml nước tiểu, hỗn hợp<br /> trên được bão hòa bằng NaCl và được chiết<br /> tách bằng ethyl acetate trong môi trường acid<br /> (pH < 1). Làm khô mẫu được tách chiết bằng<br /> khí nitơ. Ủ mẫu với BSTFA trong 75 phút ở<br /> 80°C để gắn các nhóm trimethylsilyl (trong<br /> BSTFA) với 2 nhóm -OH của phân tử HVA,<br /> với 3 nhóm -OH của VMA.<br /> Phân tích GCMS được tiến hành trên cột<br /> sắc ký HP - 5MS 30m x 0,25 mm internal<br /> diameter x 0,25 um film thickness (Agilent).<br /> Mẫu được bơm bằng bộ bơm mẫu tự động<br /> Agilent 7693. Chương trình nhiệt độ lò từ<br /> 160oC đến 280oC trong vòng 15,8 phút. Tốc<br /> độ khí He qua cột là 1 ml/ phút. HVA và VMA<br /> được phát hiện bằng phổ khối theo phương<br /> pháp SIM (selected ion monitoring). Các ion<br /> đặc hiệu cho mỗi chất được lựa chọn. Đường<br /> chuẩn được xây dựng bằng chạy các hỗn hợp<br /> <br /> 2<br /> <br /> chuẩn chứa một lượng HVA và VMA chuẩn đã<br /> biết và chuẩn nội. Ba mức chuẩn được phân<br /> tích trên sắc ký khối phổ mỗi khi chạy mẫu<br /> thử, các đỉnh tạo ra được đo bằng phương<br /> pháp SIM và đường chuẩn ba điểm được<br /> thiết lập cho mỗi chất phân tích. Sau khi thiết<br /> lập đường chuẩn ba điểm cho HVA và VMA,<br /> định lượng HVA và VMA trong mẫu thử bằng<br /> phần mềm Chemstation. Sử dụng chuẩn nội<br /> để hiệu chỉnh sự mất mát trong quá trình<br /> chuẩn bị mẫu. Hai mức vật liệu kiểm tra chất<br /> lượng (QC- Quality Control material) được<br /> chạy cùng với bệnh phẩm trong mỗi lần làm<br /> xét nghiệm định lượng HVA và VMA trong<br /> nước tiểu.<br /> 2.2. Các thực nghiệm đánh giá kỹ thuật<br /> Xác định giới hạn phát hiện: Tiến hành pha<br /> loãng 2, 4, 8, 16, 32 và 64 lần dung dịch<br /> chuẩn có nồng độ cao nhất bằng HCl 0,2 M<br /> (dung môi dùng pha chuẩn). Các chuẩn pha<br /> loãng được chạy 5 lần trong một đợt phân tích<br /> theo quy trình chuẩn (standard operation procedures- SOP), tính SD và CV tại các nồng độ<br /> để xác định nồng độ thấp nhất định lượng<br /> được có độ chính xác chấp nhận (giới hạn<br /> phát hiện).<br /> Thực nghiệm đánh giá độ tuyến tính:<br /> Chuẩn bị hai hỗn hợp nước tiểu của bệnh nhân.<br /> Hỗn hợp thứ nhất là các mẫu đã phân tích có<br /> nồng độ thấp. Hỗn hợp thứ hai là các mẫu đã<br /> phân tích có nồng độ cao gần với hoặc cao hơn<br /> giá trị trên dự đoán của khoảng phân tích. Trộn<br /> hai mẫu bệnh phẩm trên với các tỷ lệ như sau<br /> 1/0, 3/1, 1/1, 1/3 và 0/1. Tiến hành phân tích<br /> định lượng HVA và VMA trong 5 mẫu trên.<br /> Mỗi mẫu làm lặp lại 03 lần. Tính giá trị trung<br /> bình thu được của mỗi mẫu. Vẽ đồ thị để đánh<br /> giá độ tuyến tính bằng phần mềm Linchecker<br /> của Philippe Marquis: trục hoành là nồng độ<br /> tính toán lý thuyết, trục tung là nồng độ trung<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> bình đo được. Tính toán độ dốc (slope) và<br /> giao điểm với trục Y (intercept). So sánh độ<br /> dốc và giao điểm tính toán được với độ dốc và<br /> giao điểm mong muốn (là 1 và 0,0).<br /> Xác định độ chính xác: Hai loại vật liệu<br /> kiểm tra chất lượng (QC) bình thường và<br /> bệnh lý được phân tích trong một lần chạy,<br /> mỗi mẫu được chạy 15 lần (n = 15) để thu<br /> thập dữ liệu và đánh giá độ chính xác trong<br /> một lần chạy. Hai loại QC nước tiểu bình<br /> thường và bệnh lý được chạy trong 20 mẻ<br /> khác nhau trong vòng 3 tháng (n = 20). Tính<br /> giá trị trung bình, độ lệch chuẩn, và CV để<br /> đánh giá độ chính xác trong một lần chạy và<br /> giữa các lần chạy. Tiêu chuẩn chấp nhận: Độ<br /> chính xác trong một lần chạy: SD < 0,25 sai<br /> <br /> số toàn bộ cho phép. Độ chính xác giữa các<br /> lần chạy: SD < 0,33 sai số toàn bộ cho phép.<br /> Thực nghiệm so sánh phương pháp:<br /> Các vật liệu ngoại kiểm amin sinh học của<br /> chương trình ngoại kiểm Úc (RCPA) được<br /> chạy trong vòng 6 tháng liên tục: mỗi tháng 02<br /> mẫu tuyến tính và 01 mẫu bệnh phẩm ngoại<br /> kiểm. Kết quả được so sánh với trung bình và<br /> SD của ngoại kiểm. Độ lệch (bias) của mỗi giá<br /> trị so với trung bình chung của ngoại kiểm<br /> được biểu diễn dưới dạng đồ thị để đánh giá<br /> độ lệch hệ thống (systemic bias) và độ không<br /> xác thực (inaccuracy).<br /> Đạo đức nghiên cứu: Nghiên cứu được<br /> chấp thuận bởi Hội đồng Y đức bệnh viện Nhi<br /> Trung ương.<br /> <br /> III. KẾT QUẢ<br /> <br /> Hình 1. Sắc ký đồ tổng số chạy bằng phương pháp SIM<br /> Với chương trình chạy sắc ký khí như sau: nhiệt độ lò ban đầu là 160oC, tốc độ tăng nhiệt giai<br /> đoạn đầu là 8oC/phút, tiếp theo là 50oC/phút, tổng thời gian phân tích cho một mẫu là 15,8 phút;<br /> kết quả sắc ký đồ (hình 1) cho thấy nội chuẩn có thời gian lưu là 4,95, HVA là 9,13 và VMA là<br /> 10,6 phút. Khi qua detector khối phổ, với cơ chế ion hóa bằng điện (electron impact mass<br /> spectrometry), nội chuẩn và các chất cần phân tích bị bắn phá thành các mảnh ion đặc trưng.<br /> Trong phương pháp này, nội chuẩn và hai chất cần phân tích được lựa chọn một mảnh ion đích<br /> và một ion định lượng.<br /> Tại nồng độ pha loãng thấp nhất của HVA và VMA là 0,9 µmol/L, CV lần lượt là 5,9% và 6,3%,<br /> như vậy có thể xem 0,9 µmol/L là giới hạn phát hiện của HVA và VMA.<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> 3<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> <br /> B<br /> <br /> A<br /> <br /> Hình 2. Đồ thị tuyến tính của HVA (a) và MA (b)<br /> Phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ HVA đo được với nồng độ HVA tính toán<br /> theo lý thuyết là y= 0,998 x – 0,3985. Như vậy, độ dốc là 0,998 và giao điểm với trục tung<br /> là - 0,3985. Khoảng nồng độ HVA trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính là từ 5,68 đến<br /> 192,9 µmol/L. Phương trình thể hiện mối tương quan giữa nồng độ VMA đo được với nồng độ<br /> VMA tính toán theo lý thuyết là y = 0,9974 x + 0,2151. Như vậy, độ dốc là 0,9974 và giao điểm<br /> với trục tung là 0,2151. Khoảng nồng độ VMA trong thử nghiệm đánh giá độ tuyến tính là từ 3,2<br /> đến 221 µmol/L.<br /> Bảng 1. Độ chính xác của phương pháp<br /> <br /> Mẫu<br /> <br /> Độ chính xác<br /> trong một lần chạy<br /> (n = 15)<br /> Độ chính xác<br /> giữa các lần chạy<br /> (n = 20)<br /> <br /> HVA<br /> <br /> VMA<br /> <br /> QC mức 1<br /> <br /> QC mức 2<br /> <br /> QC mức 1<br /> <br /> QC mức 2<br /> <br /> X (µmol/L)<br /> <br /> 10,9<br /> <br /> 87,8<br /> <br /> 18,2<br /> <br /> 90,6<br /> <br /> SD<br /> <br /> 0,27<br /> <br /> 1,06<br /> <br /> 0,54<br /> <br /> 1,61<br /> <br /> CV (%)<br /> <br /> 2,45<br /> <br /> 1,2<br /> <br /> 2,97<br /> <br /> 1,79<br /> <br /> X (µmol/L)<br /> <br /> 10,2<br /> <br /> 84,7<br /> <br /> 16,9<br /> <br /> 85,4<br /> <br /> SD<br /> <br /> 0,37<br /> <br /> 1,77<br /> <br /> 0,75<br /> <br /> 2,48<br /> <br /> CV (%)<br /> <br /> 3,6<br /> <br /> 2,1<br /> <br /> 6,6<br /> <br /> 2,6<br /> <br /> Độ biến thiên (CV) trong một lần chạy của cả hai thông số HVA và VMA đều dưới 5%. Độ biến<br /> thiên (CV) giữa các lần chạy của HVA đều nhỏ hơn 5%. Với VMA, CV của QC mức 1 là 6,6%,<br /> của QC mức 2 nhỏ hơn 5%.<br /> <br /> 4<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> TẠP CHÍ NGHIÊN CỨU Y HỌC<br /> GCMS<br /> <br /> 120<br /> <br /> 200<br /> <br /> GCMS<br /> <br /> 100<br /> 160<br /> <br /> 80<br /> <br /> 120<br /> <br /> 60<br /> <br /> 80<br /> <br /> 40<br /> <br /> 40<br /> <br /> 20<br /> <br /> A<br /> 0<br /> <br /> B<br /> Ngoai kiem<br /> <br /> 0<br /> <br /> 20<br /> <br /> 40<br /> 60<br /> 80<br /> Unweighted linear regression N = 12<br /> Slope : 0.971 [ 0.898 to 1.043 ]<br /> Intercept : 0.0 [ -5.4 to 5.4 ]<br /> <br /> 100<br /> <br /> 120<br /> <br /> 0<br /> 0<br /> <br /> Ngoai kiem<br /> 40<br /> <br /> 80<br /> 120<br /> Unweighted linear regression N = 6<br /> Slope : 1.021 [ 0.936 to 1.107 ]<br /> Intercept : 1.4 [ -5.7 to 8.4 ]<br /> <br /> 160<br /> <br /> 200<br /> <br /> Hình 3. Đồ thị so sánh kết quả của các mẫu HVA tuyến tính (a) và<br /> bệnh phẩm (b) với kết quả ngoại kiểm<br /> Trong vòng 6 tháng, 12 mẫu ngoại kiểm HVA tuyến tính của chương trình ngoại kiểm các<br /> amin sinh học của Úc đã được phân tích bằng phương pháp sắc ký khối phổ xây dựng tại phòng<br /> xét nghiệm. Kết quả cho thấy, không có mẫu nào ở ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị có độ dốc là<br /> 0,971 và giao điểm là 0. Các thông số tính toán độ chính xác là: SD = 4, CV = 6,4%. Thông số<br /> tính toán độ xác thực là độ lệch (bias) = 1,9. Sáu mẫu ngoại kiểm HVA bệnh phẩm (nước tiểu của<br /> bệnh nhân) của chương trình ngoại kiểm các amin sinh học của Úc đã được phân tích bằng<br /> phương pháp GCMS xây dựng tại phòng xét nghiệm. Kết quả cho thấy không có mẫu nào ở<br /> ngoài giới hạn cho phép. Đồ thị có độ dốc là 1,021 và giao điểm là 1,4. Các thông số tính toán độ<br /> chính xác là: SD = 4,2, CV = 4,7%. Thông số tính toán độ xác thực là độ lệch (bias) = 3,2.<br /> <br /> IV. BÀN LUẬN<br /> Phương pháp định lượng HVA và VMA<br /> được phát triển dựa trên phương pháp kinh<br /> điển để xác định thành phần của acid hữu cơ<br /> niệu: chiết tách bằng ethyl acetate/tạo dẫn<br /> xuất trimethylsilyl/phân tách và định lượng<br /> HVA và VMA được thực hiện bằng phương<br /> pháp SIM (selected ion monitoring) trên máy<br /> sắc ký khối phổ. Đường chuẩn được chạy mỗi<br /> lần với các mẫu thử và được đánh giá tính<br /> hợp thức bằng vật liệu kiểm tra chất lượng<br /> (QC hai mức của Bio- Rad). Kết quả của các<br /> mẫu bệnh phẩm chỉ chấp nhận được khi QC<br /> nằm trong giới hạn cho phép. Phương pháp<br /> định lượng đồng thời HVA và VMA bằng sắc<br /> ký khối phổ là kỹ thuật được thực hiện lần đầu<br /> tiên tại phòng xét nghiệm (in-house development), do vậy cần phải được đánh giá trước<br /> <br /> TCNCYH 82 (2) - 2013<br /> <br /> khi đưa vào sử dụng. Các thực nghiệm nhằm<br /> đánh giá các sai số của phương pháp.<br /> Phương pháp có thể chấp nhận được khi các<br /> sai số không ảnh hưởng đến việc phân tích<br /> diễn giải kết quả xét nghiệm, không ảnh<br /> hưởng đến việc chẩn đoán và theo dõi điều trị<br /> bệnh. Giá trị 0,9 µmol/L có thể xem là giới hạn<br /> định lượng của HVA và VMA trong phương<br /> pháp này. Nghiên cứu của Kaluzna và cộng<br /> sự có giới hạn định lượng của HVA là 1,26<br /> µmol/L, VMA là 0,76 µmol/L [4].<br /> Khoảng tuyến tính của HVA được xác định<br /> là 5,36 - 194 µmol/L, VMA là 3,2 - 222 µmol/L.<br /> Độ dốc của cả hai đồ thị đều xấp xỉ 1 và giao<br /> điểm xấp xỉ 0 (hình 2). Như vậy, khoảng tuyến<br /> tính của hai thông số định lượng trong<br /> phương pháp này bao phủ cả vùng các giới<br /> hạn có ý nghĩa quyết định chẩn đoán bệnh.<br /> <br /> 5<br /> <br />