Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Nghiên cứu Y họ
c
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
158
TÌNH TRẠNG ĐỘT BIẾN GEN PROS1 VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN
TRÊN BỆNH NHÂN HUYẾT KHỐI TĨNH MẠCH SÂU VÔ CĂN
Đỗ Đức Minh
1
TÓM TẮT
Mục tiêu: Các bất thường di truyền của các yếu tố ly giải huyết khối như protein C, protein S và
antithrombin đóng vai trò sinh bệnh học chủ đạo trong bệnh lý thuyên tắc huyết khối tĩnh mạch ở người châu Á.
Thông qua nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát các bất thường của gen PROS1 và sự thay đổi nồng độ
protein S trên bệnh nhân huyết khối tĩnh mạch sâu (HKTMS) vô căn người Việt Nam.
Đối tượng và phương pháp: 50 bệnh nhân HKTMS vô căn tham gia nghiên cứu được giải trình tự vùng
khởi động, toàn bộ các exon mã hoá và vùng intron lân cận của gen PROS1 đồng thời với định lượng nồng độ
protein S trong huyết tương.
Kết quả: Chúng tôi phát hiện đột biến gen PROS1 ở 8 bệnh nhân tham gia nghiên cứu. Các đột biến này
trải dài trên toàn bộ gen với 4 đột biến vô nghĩa và 4 đột biến sai nghĩa. Trong số các đột biến này, có 4 đột biến
lần đầu được mô tả có liên quan đến HKTMS.
Kết luận: Đột biến gen PROS1 được phát hiện trên 16% bệnh nhân HKTMS vô căn tham gia nghiên cứu
và liên quan chặt chẽ với tình trạng giảm protein S huyết tương.
Từ khóa: huyết khối tĩnh mạch sâu, gen PROS1, protein S
ABSTRACT
PROS1 GENETIC MUTATIONS AND ASSOCIATED FACTORS IN PATIENTS WITH IDIOPATHIC
VENOUS THROMBOSIS
Do Duc Minh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 25 - No 1 - 2021: 158-162
Background: Hereditary disorders of hemolytic factors such as protein C, protein S and antithrombin are
major pathophysiologic alteration in venous thrombo-embolism of Asian populations. The aim of this study was to
investigate PROS1 genetic mutations and plasma protein S concentration in Vietnamese patients diagnosed with
idiopathic deep venous thrombosis.
Objectives and methods: Promoter, all coding exon and flanking intron regions of PROS1 gene were
sequenced and plasma protein S concentration was assessed in 50 Vietnamese patients diagnosed with idiopathic
deep venous thrombosis.
Results: Mutations of PROS1 were detected in eight out of 50 participants. All the mutations including
four missense and four nonsense mutations diffused along the gene. Among detectable mutations, four of them
were novel.
Conclusion: Mutations of PROS1 were identified in 18% Vietnamese patients diagnosed with idiopathic
deep venous thrombosis and the mutational status was associated with protein S level.
Keywords: venous thrombosis, PROS1 gene, mutation, protein S
1
Trung tâm Y Sinh Học Phân Tử, ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Đức Minh ĐT: 0932 999989 Email: ducminh@ump.edu.vn
Nghiên cứu Y họ
c
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
159
ĐẶT VẤN ĐỀ
Các nghiên cứu về bệnh lý huyết khối tĩnh
mạch sâu (HKTMS) ở các nước châu Á cho thấy
có nhiều đặc điểm khác biệt trong bệnh lý này so
với các nước phương Tây. Đầu tiên, tần suất
HKTMS ở dân số Trung Quốc và Hàn Quốc thấp
hơn từ 5-6 lần so với các nước phương Tây
(1)
.
Hơn nữa, bệnh nhân châu Á điều trị với
warfarin cho thấy nguy cơ biến chứng chảy máu
cao hơn so với người da trắng dù có chỉ số INR
tương đồng
(2,3)
. Vì là bệnh lý là có nhiều yếu tố
nguyên nhân, khoảng 30% số ca HKTMS được
cho là do các bất thường liên quan đến quá trình
ly giải huyết khối. Ở người da trắng, trạng thái
tăng đông di truyền phổ biến nhất là yếu tố V
Leiden và biến thể G20210A trên gen
prothrombin với tần suất lần lượt là 18,8% và
7,1% ở bệnh nhân HKTMS
(4)
. Tuy nhiên, cả hai
biến thể gen này rất hiếm khi phát hiện được ở
bệnh nhân HKTMS châu Á
(5)
. Bất thường các yếu
tố tăng đông khác bao gồm protein C, protein S
và antithrombin lại rất phổ biến ở dân số
HKTMS người châu Á. Sự khác biệt giữa người
phương Tây và người châu Á rất có ý nghĩa trên
lâm sàng vì yếu tố V Leiden và Prothrombin
G20210A là các yếu tố tăng đông yếu và do đó
các xét nghiệm khảo sát các bất thường tăng
đông không được khuyến cáo. Tuy nhiên, các
thay đổi protein C, protein S và antithrombin lại
là yếu tố tăng đông mạnh hơn và sẽ làm gia tăng
nguy cơ HKTMS tái phát ở các bệnh nhân này.
Đáng chú ý là các rối loạn các yếu tố tăng đông
không đồng nhất trong dân số người Châu Á.
Cụ thể là rối loạn protein S rất phổ biến ở dân số
Nhật Bản với đột biến chủ đạo là K196E trên gen
PROS1
(6)
, nhưng đột biến này lại không được
phát hiện ở các dân số Trung Quốc và Hàn
Quốc
(7,8)
.
Protein S là một cofactor, cùng với
phospholipid và calci sẽ giúp cho protein C hoạt
hóa bất hoạt các yếu tố Va và VIIIa bằng cách cắt
các phân tử này tại các vị trí amino acid arginine
đặc hiệu. Chỉ có protein S tự do (khoảng 40%
protein S tổng số) tham gia vào quá trình này
như một cofactor của protein C. Thiếu hụt
protein S được phân thành 3 dạng: dạng I do dự
thiếu hụt protein S tổng số cũng như protein S tự
do và hoạt tính protein S giảm, dạng II có nồng
độ protein S tổng số và protein S tự do bình
thường nhưng hoạt tính protein S bị giảm, dạng
III biểu hiện qua sự giảm nồng độ protein S tự
do và hoạt tính protein S giảm nhưng hàm
lượng protein S tổng số bình thường
(9)
.
Các đột biến trên gen PROS1 thường dẫn
đến tình trạng thiếu hụt các sản phẩm protein
đích phục vụ cho quá trình ly giải huyết khối là
protein S. Sự thiếu hụt này có liên quan đến tình
trạng tái phát HKTMS
(10)
. Sự thiếu hụt protein
này được di truyền theo kiểu di truyền trội trên
nhiễm sắc thể thường. Đối với các bất thường di
truyền liên quan đến protein S, việc xét nghiệm
di truyền và tư vấn di truyền được cho là cần
thiết vì nguy cơ tái phát cao ở những bệnh nhân
mang đột biến này nếu không được điều trị
phòng ngừa phù hợp
(11)
. Do đó, thông qua
nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành khảo sát
tình trạng đột biến gen PROS1 và các yếu tố liên
quan trên các bệnh nhân huyết khối tĩnh mạch
sâu vô căn.
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Bệnh nhân HKTMS thỏa tiêu chuẩn chẩn
đoán của hiệp hội tim mạch Châu Âu
(12)
, với các
triệu chứng lâm sàng đặc trưng như đau, đỏ,
sưng phù chi dưới được chẩn đoán xác định
bằng siêu âm Doppler mạch máu, sẽ được thu
thập các thông tin lâm sàng có liên quan đến
bệnh lý bao gồm tuổi, giới, tiền căn gia đình, vị
trí bị HKTMS.
Tiêu chuẩn loại trừ
Các bệnh nhân được ghi nhận có yếu tố
nguy cơ gây HKTMS bao gồm:
Gãy xương lớn (chậu, đùi....).
Thay khớp gối hay khớp hang.
Vửa trải qua phẫu thuật lớn.
Chấn thương.
Chấn thương cột sống.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Nghiên cứu Y họ
c
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
160
Đang có bệnh lý ác tính.
Đang hóa trị.
Đang điều trị liệu pháp hormone.
Đang uống thuốc ngừa thai.
Nằm bất động trên giường >3 ngày.
Béo phì.
Có thai.
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu:
Nghiên cứu cắt ngang mô tả
Cỡ mẫu
50 bệnh nhân HKTMS thỏa tiêu chuẩn chọn
và tiêu chuẩn loại trừ
Phương pháp thực hiện
Giải trình tự gen PROS1
Quy trình giải trình tự gen PROS1 đã được
nghiên cứu và chuẩn hóa trong nghiên cứu trước
đây của chúng tôi
(13)
với các bước:
Tách chiết DNA bộ gene:
Bệnh nhân được thu thập lấy 2 ml máu tĩnh
mạch, cho vào ống chống đông có EDTA, lắc
đều nhẹ nhàng. Genomic DNA của các tế bào
bạch cầu trong máu toàn phần được tách chiết
bằng bộ kit GeneJetTM whole blood genomic
DNA purification (Thermo Scientific, Mỹ) theo
hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất.
Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự
gen mục tiêu:
Điều kiện và cặp mồi cho phản ứng PCR và
giải trình tự gen của toàn bộ các exon và vùng
lân cận trên gen PROS1 đã được mô tả trong
nghiên cứu trước đây của chúng tôi.
Phân tích kết quả:
Kết quả giải trình tự được xem là có bất
thường khi có sự thay đổi các nucleotide so với
trình tự tiêu chuẩn của gen PROS1 mang mã số
NG_009813.1 trong kho dữ liệu của Genebank.
Định lượng nồng độ protein S huyết tương
Nồng độ protein C huyết tương được định
lượng bằng bộ kit Human Protein S ELISA Kit
(Abcam, Cambridge, Anh) bằng kỹ thuật ELISA
theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phân tích thống kê
Các số liệu sau đó sẽ được phân tích với các
phép kiểm thống kê là t-test và chi bình phương
với ngưỡng giá trị p được xem là có ý nghĩa
thống kê khi bé hơn hoặc bằng 0,05.
Y đức
Đề tài nghiên cứu đã được sự chấp thuận
của Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh
học Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh
với quyết định số 452/ĐHYD-HĐĐĐ ngày 18
tháng 12 năm 2018.
KẾT QUẢ
Các đặc điểm cơ bản của bệnh nhân tham gia
nghiên cứu
Chúng tôi đã tiến hành chọn được 50 bệnh
nhân được chẩn đoán HKTMS phù hợp với tiêu
chuẩn chọn mẫu với đầy đủ các thông tin lâm
sàng và cận lâm sàng
Các đặc điểm cơ bản của 50 bệnh nhân được
chẩn đoán HKTMS tham gia nghiên cứu được
thể hiện trong bảng 1.
Bảng 1: Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 50
bệnh nhân HKTMS
Đặc điểm Giá trị
Tuổi (TB ± ĐLC) 44,9 ± 14,9
Giới
Nam (%)
Nữ (%)
30%
70%
Chân bị HKTMS
Chân P
Chân T
Hai chân
36%
54%
10%
Tiền căn gia đình
Có
Không
8%
92%
Nồng độ protein S (mg/dL)
(TB ± ĐLC) 0,03 ± 0,01
Kết quả đột biến gen PROS1
Có
Không
16%
84%
Các đột biến gen PROS1 và nồng độ protein S
huyết tương của bệnh nhân HKTMS
Kết quả giải trình tự toàn bộ các exon mã hoá
và vùng intron lân cận gen PROS1 của 50 bệnh
Nghiên cứu Y họ
c
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
161
nhân HKTMS cho thấy có 4 đột biến sai nghĩa và
4 đột biến vô nghĩa trên 8 bệnh nhân. Trong số
này, có 2 đột biến vô nghĩa và 2 đột biến sai
nghĩa được mô tả lần đầu trong y văn, bao gồm
c.265C>T (p.L89*), c.715A>T (p.K239*), c.253T>C
(p.Y85H) và c.269G>T (p.R90L). Kết quả đột biến
và nồng độ protein S tương ứng được thể hiện
trong Bảng 2.
Bảng 2: Tình trạng đột biến gen PROS1 và nồng
độ protein S huyết tương của 8 bệnh nhân có mang
độ biến gen PROS1 nghiên cứu
Bệnh
nhân
Tình trạng đột biến
gen PROS1
Nồng độ protein S (mg/dL)
(bình thường: 0,25 – 0,75)
HK01 c.253T>C (p.Y85H) 0,0
HK02 c.233C>T (p.T78M)
0,0
HK03 c.269G>T (p.R90L) 0,0
HK11 c.265C>T (p.L89*) 0,7
HK17 c.1351 C>T (p.R451*)
0,0
HK42 c.253T>C (p.Y85H) 0,01
HK46 c.715A>T (p.K239*)
0,01
HK47 c.1351 C>T (p.R451*)
0,02
Trong số các đột biến chúng tôi phát hiện
được, có 2 đột biến vô nghĩa tại codon 451 đã
được báo cáo trước đây có liên quan đến bệnh lý
HKTMS. Bên cạnh đó, các đột biến vô nghĩa còn
lại đều xuất hiện ở các vị trí codon trước condon
451, do đó, sản phẩm protein S sẽ càng bị ảnh
hưởng và nhiều khả năng các đột biến này liên
quan với tình trang HKTMS. Đối với các đột
biến sai nghĩa.
Mối liên hệ giữa tình trạng đột biến gen
PROS1 và các yếu tố liên quan:
Bảng 3: Mối liên quan giữa tình trạng đột biến gen
và các yếu tố liên quan
Biến số Nhóm có độ
biến (N=8)
Nhóm không
đột biến (N=42)
Trị số p
Tuổi
(TB ± ĐLC) 44,1 ± 12,9 45,1 ± 15,8 0,85
Giới
Nam
Nữ
2
6
13
29
0,76
Chân bị HKTMS
Chân P
Chân T
Hai chân
4
3
1
13
25
4
0,67
Tiền căn gia đình
Có
Không
1
7
4
37
0,43
Biến số Nhóm có độ
biến (N=8)
Nhóm không
đột biến (N=42)
Trị số p
Nồng độ protein S
(g/L) (TB ± ĐLC) 0,13 ± 0,2 0,03 ± 0,02 0,04
Chúng tôi tiến hành so sánh các biến số lâm
sàng cũng như cận lâm sàng ở 2 nhóm bệnh
nhân có và không có mang đột biến gen PROS1.
Kết quả được thể hiện trong Bảng 3.
Có thể thấy các bệnh nhân có mang đột biến
gen PROS1 có nồng độ protein S thấp hơn có ý
nghĩa thống kê so với nhóm bệnh nhân không
mang độ biến gen. Ngoài ra, các biến số khác
không khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa 2
nhóm bệnh nhân.
BÀN LUẬN
Protein S là một glycoprotein phụ thuộc
vitamin K được tổng hợp tại gan, với cấu trúc
bao gồm 4 vùng chính là vùng GIa, vùng nhạy
cảm thrombin, vùng EGF-like, SHBG-like. Các
bất thường của gen PROS1 trải dài trên các vùng
gen được khảo sát và không có bất thường di
truyền K196E nào được phát hiện, mặc dù đây là
đột biến rất phổ biến trong dân số người Nhật
Bản
(6)
. Trong số các đột biến gen chúng tôi ghi
nhận được trên gen PROS1, đột biến vô nghĩa
tạo ra mã dừng ở vị trí codon 89 và 239 là đột
biến nhiều khả năng gây bệnh, do các đột biến
tạo ra mã dừng ở codon 451 đã được báo cáo là
các đột biến gây bệnh trước đây
(14)
. Ngoài ra, đột
biến tại các codon 78 cũng đã được báo cáo là các
đột biến gây giảm hoạt tính của protein S
(15)
. Các
đột biến sai nghĩa lần đầu được mô tả được
chúng tôi tiến hành dự đoán khả năng gây bệnh
bằng 2 phần mền là SIFT và Polyphen-2
(16,17)
. Kết
quả dự đoán được thể hiện trong Bảng 3.
Bảng 4: Kết quả dự đoán khả năng gây bệnh của các
đột biến sai nghĩa lần đầu được mô tả
Biến thể Chỉ số dự đoán
theo SIFT
Chỉ số dự đoán theo
Polyphen-2
c.253T>C
(p.Y85H)
0,00
Ảnh hưởng chức
năng protein
0,99
Có thể tổn thương
c.269G>T
(p.R90L)
0,17
Dung nạp
0,01
Lành tính
Cả hai đột biến được mô tả lần đầu c.253T>C
(p.Y85H) và c.269G>T (p.R90L) đều có liên quan
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 25 * Số 1 * 2021
Nghiên cứu Y họ
c
Chuyên Đề Chẩn Đoán Hình Ảnh - Sinh Học Phân Tử
162
với kiểu hình giảm nồng độ protein S trong máu.
Sự thay thế tyrosine bằng histidine ở codon 85
nằm trong vùng GIa của protein S, các thay đổi
acid amin trong vùng này đã được báo cáo làm
cho mRNA gấp cuộn sai lệch, thoái hóa và mất
tính ổn định, làm cho sản phẩm protein đích bị
giảm đáng kể
(18)
. Mặc dù kết quả dự đoán từ 2
phần mềm đều cho rằng việc thay thế arginine ở
vị trí codon 90 bằng leucine sẽ không ảnh hưởng
đến chức năng của protein S, tuy nhiên, các
nghiên cứu thực nghiệm lại cho thấy rằng
arginine tại vị trí này có tính bảo tồn cao ở các
loài động vật hữu nhũ và sự thay thế arginine
bằng histidine tại vị trí này đã được báo cáo là
ảnh hưởng rất lớn đến việc giảm sản xuất
protein S
(15,19)
.
KẾT LUẬN
Kết quả nghiên cứu này cho thấy đột biến
gây bệnh trên gen PROS1 chiếm tỷ lệ 16%
nguyên nhân gây bệnh ở các bệnh nhân HKTMS
vô căn. Tình trạng đột biến có liên hệ chặt chẽ
với sự giảm protein S trong huyết tương của các
bệnh nhân tham gia nghiên cứu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Lee LH, Gallus A, Jindal R, Wang C, Wu CC (2017). Incidence
of Venous Thromboembolism in Asian Populations: A
Systematic Review. Thromb Haemost, 117(12):2243-2260.
2. Lip GYH, Wang K-L, Chiang CE (2015). Non-vitamin K
antagonist oral anticoagulants (NOACs) for stroke prevention
in Asian patients with atrial fibrillation: time for a reappraisal.
Int J Cardiol, 180:246-254.
3. Nakamura M, Wang YQ, Wang C, et al (2015). Efficacy and
safety of edoxaban for treatment of venous thromboembolism:
a subanalysis of East Asian patients in the Hokusai-VTE trial. J
Thromb Haemost JTH, 13(9):1606-1614.
4. Seligsohn U, Lubetsky A (2001). Genetic susceptibility to
venous thrombosis. N Engl J Med, 344(16):1222-1231.
5. Angchaisuksiri P (2011). Venous thromboembolism in Asia--an
unrecognised and under-treated problem? Thromb Haemost,
106(4):585-590.
6. Kimura R, Honda S, Kawasaki T, et al (2006). Protein S-K196E
mutation as a genetic risk factor for deep vein thrombosis in
Japanese patients. Blood, 107(4):1737-1738.
7. Tang L, Guo T, Yang R, et al (2012). Genetic background
analysis of protein C deficiency demonstrates a recurrent
mutation associated with venous thrombosis in Chinese
population. PloS One, 7(4):e35773.
8. Kim HJ, Seo JY, Lee KO, et al (2014). Distinct frequencies and
mutation spectrums of genetic thrombophilia in Korea in
comparison with other Asian countries both in patients with
thromboembolism and in the general population.
Haematologica, 99(3):561-569.
9. Gupta A, Tun AM, Tuma F. Protein S Deficiency (2020). In:
StatPearls. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing, URL:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK544344/.
10. Mahmoodi BK, Brouwer J-LP, Ten Kate MK, et al (2010). A
prospective cohort study on the absolute risks of venous
thromboembolism and predictive value of screening
asymptomatic relatives of patients with hereditary deficiencies
of protein S, protein C or antithrombin. J Thromb Haemost JTH,
8(6):1193-1200.
11. Satpanich P, Rojnuckarin P (2019). Risk factors for venous
thromboembolism (VTE) recurrences in Thai patients without
cancer. Hematol Amst Neth, 24(1):159-165.
12. Mazzolai L, Aboyans V, Ageno W, et al (2018). Diagnosis and
management of acute deep vein thrombosis: a joint consensus
document from the European Society of Cardiology working
groups of aorta and peripheral vascular diseases and
pulmonary circulation and right ventricular function. Eur Heart
J, 39(47):4208-4218.
13. Lê Gia Hoàng Linh, Phạm Văn Dũng, Nguyễn Hoài Nam, et al
(2020). Khảo sát bất thường di truyền gen pros1 trong bệnh lý
huyết khối tĩnh mạch. Y học Thành Phố Hồ Chí Minh, 24(2):163.
14. Caspers M, Pavlova A, Driesen J, et al (2012). Deficiencies of
antithrombin, protein C and protein S - practical experience in
genetic analysis of a large patient cohort. Thromb Haemost,
108(2):247-257.
15. Gandrille S, Borgel D, Eschwege-Gufflet V, et al (1995).
Identification of 15 different candidate causal point mutations
and three polymorphisms in 19 patients with protein S
deficiency using a scanning method for the analysis of the
protein S active gene. Blood, 85(1):130-138.
16. Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, et al (2010). A method and
server for predicting damaging missense mutations. Nat
Methods, 7(4):248-249.
17. Kumar P, Henikoff S, Ng PC (2009). Predicting the effects of
coding non-synonymous variants on protein function using
the SIFT algorithm. Nat Protoc, 4(7):1073-1081.
18. Ikejiri M, Tsuji A, Wada H, et al (2010). Analysis three
abnormal Protein S genes in a patient with pulmonary
embolism. Thromb Res, 125(6):529-532.
19. Chu MD, Sun J, Bird P (1994). Cloning and sequencing of a
cDNA encoding the murine vitamin K-dependent protein S.
Biochim Biophys Acta, 1217(3):325-328.
Ngày nhận bài báo: 30/06/2020
Ngày nhận phản biện nhận xét bài báo: 20/02/2021
Ngày bài báo được đăng: 10/03/2021