KẾT QUẢ HOẠT ĐỘNG BẢO TỒN QUỸ GEN
VI SINH VẬT TRỒNG TRỌT GIAI ĐOẠN 2006-2010
Nguyễn Thu Hà
1
SUMMARY
Agriculture culture collection at soils and fertilizers research institute (Period 2006-2010)
The establishment of an agriculture culture collection plays an important role to significantly support
for biotechnological development. The main activities of agriculture culture collection are
preserving, collect, isolate, evaluate, taxonomy, document and research on application ability of
microbes.
673 strains from foreign and domestic including bacteria, yeasts and filamentous fungi were
collected, isolated and preserved. Slant agar, sterile distilled water, liquid paraffin, freeze-drying,
methylcellulose, or liquid nitrogen freezing was used to preserve cultures to maintain the existent
capacity and active biology of them. 49 strains have been screened based on biological activity.
88/183 evaluated strains (48,09%) of agriculture culture collection have multi functional biological
activity (nitrogen fixing, phosphorous solubilizing, cellulose degradation, plant growth promoting,
tolerant to high temperature, anti pathogenic bacteria, fungi and etc). Bergey’s key taxonomy, Kit
API 20E, API 20NE, API 50CH, BIOLOG or sequence analysis of 16S rRNA genes was used for
microbial taxonomy.
Microbes have been researched, evaluated and utilized in agriculture such as micro-biofertilizer or
microbial inoculant. 50 strains have been introduced to produce micro-biofertilizer or microbial
inoculants.
Keyword: Strain, collect, isolate, preserve, evaluate, utilize, biological activity, micro-biofertilizer
and microbial inoculant.
I. §ÆT VÊN §Ò
Nguồn gen vi sinh vật có vai trò vô
cùng quan trọng trong chiến lược phát triển
công nghệ sinh học. Đây là nguồn vật liệu
khởi đầu cho các kỹ thuật di truyền, công
nghệ vi sinh và công nghệ lên men.
Công tác lưu giữ và bảo tồn nguồn gen
vi sinh vật có một ý nghĩa lớn trong mọi
phòng nghiên cứu và trong công nghệ vi
sinh. Từ năm 1994, Viện Khoa học Kỹ
thuật Nông nghiệp Việt Nam trước đây, nay
là Viện Thổ nhưỡng Nông hóa được giao
nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen vi sinh vật trồng
trọt. Nhiệm vụ của công tác bảo tồn quỹ
gen vi sinh vật trồng trọt là bảo quản, thu
thập, tuyển chọn, đánh giá, phân loại, tư
liệu hóa, nghiên cứu khai thác và sử dụng
có hiệu quả nguồn gen vi sinh vật phục vụ
phát triển bền vững [2, 3, 4].
II. VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU
1. Vật liệu nghiên cứu
Nguồn gen vi sinh vật.
2. Phương pháp nghiên cứu:
1. Bảo quản các chủng vi sinh vật bằng
phương pháp bảo quản thạch nghiêng, trong
nước cất khử trùng, trong cát, parafin, lạnh
sâu, methylcellulose (MC), đông khô và
nitơ lỏng, v.v... [1, 4, 5]
2. Phương pháp lấy mẫu theo TCVN và
TCN; mẫu đất, rễ được thu thập theo đối
tượng cây trồng (rau, đậu, lạc...) và theo
vùng sinh thái.
1
Viện Thổ nhưỡng Nông hoá
3. Phân lập, tuyển chọn, xác định một
số đặc điểm sinh học và ảnh hưởng của điều
kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của các
chủng vi sinh vật được xác định theo các
phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông
thường.
4. Phương pháp xác định mật độ vi sinh
vật theo TCVN 4884:2005 [9].
5. Phương pháp xác định hoạt tính đối
kháng vi khuNn, nấm gây bệnh theo 10 TCN
714:2006 [11], 10 TCN 867:2006 [12].
6. Khả năng sinh tổng hợp IAA thô
được xác định theo phương pháp
Salkowsky cải tiến.
7. Khả năng hình thành nốt sần được
xác định bằng phương pháp trồng cây trong
nhà lưới, trên cát vô trùng, thí nghiệm được
bố trí ngẫu nhiên, 4 lần nhắc. Chỉ tiêu theo
dõi: N ốt sần tổng số.
8. Khả năng cố định nitơ được xác định
theo 10 TCN 299:97 [10].
9. Khả năng phân giải xenlulo được xác
định theo TCVN 6168:2002 [8].
10. Khả năng phân giải phốt phát khó tan
được xác định theo TCVN 6167:1996 [7].
11. Khả năng chuyển hóa nitrat của các
chủng vi sinh vật được xác định bằng cách
đo hàm lượng N O
2-
trên máy quang phổ kế
dựa vào phản ứng với thuốc thử Griss.
12. Phương pháp phân loại các chủng
vi sinh vật:
- Xác định tên vi sinh vật theo khóa
phân loại của Bergey [6].
- Xác định tên vi sinh vật bằng Kit API
20E, API 20N E, API 50CH hoặc máy
BIOLOG: Dựa trên phản ứng sinh hóa của
chủng vi sinh vật đối với 20, 50 hoặc 95
nguồn các bon khác nhau.
- Xác định tên vi sinh vật bằng phương
pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở
giải trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom
của các chủng vi khuNn nghiên cứu, so
sánh với các trình tự có sẵn trong ngân
hàng gen quốc tế EMBL bằng phương
pháp FASTA 33 để định loại đến loài các
chủng vi sinh vật.
3. Phương pháp xử lý số liệu theo
chương trình thống kê IRRISTAT.
III. KÕT QU Vµ TH¶O LUËN
1. Bảo quản nguồn gen vi sinh vật
Quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp hiện
lưu giữ 673 chủng vi sinh vật. Các chủng vi
sinh vật bảo quản được định kỳ cấy chuyển
sau thời gian thích hợp (1, 3, 6 hay 12
tháng), tùy thuộc vào từng nhóm chủng
giống. Nhiều phương pháp khác nhau được
sử dụng trong bảo quản nguồn gen vi sinh
vật (thạch nghiêng, nitơ lỏng, lạnh sâu (-
20
0
C), Methylcellulose (MC), v.v... Số
lượng, chủng loại, nguồn gốc và phương
pháp bảo quản nguồn gen vi sinh vật trồng
trọt được trình bày trong bảng 1.
Bảng 1. Số lượng, chủng loại, nguồn gốc và phương pháp bảo quản nguồn gen vi sinh vật
trồng trọt
TT Đối tượng Nguồn
gốc
Số
lượng
Hoạt tính sinh học Phương pháp
bảo quản
1 Vi khuẩn: Azospirillum,
Azotobacter, Bacillus,
Bradyrhizobium (cho đậu
tương, đậu xanh, đậu đen, lạc),
Enterobacter, Pseudomonas,
Burkholderia, Lactobacterium,
Việt Nam
Nhập nội
487
101
Cố định nitơ, phân gi
ải lân,
kích thích sinh trư
ởng, sinh
polysacharit,
ức chế vi
khuẩn-n
ấm gây bệnh héo
xanh, th
ối rễ, phân giải
xenllulo, sinh axit amin,
Thạch nghiêng,
Thạch bán lỏng,
Methylcellulose,
Lạnh sâu (-20
O
C),
Nitơ lỏng,
Flavobacteria, Klebsiella v.v... chuyển hóa nitrat, v.v... Đông khô
2 Xạ khuẩn: Streptomyces Việt Nam
Nhập nội
54
1
Phân giải xenlluloza Thạch nghiêng
3 Nấm men: Candida,
Rhodotorula,
Saccharomyces, Pichia
Việt Nam
Nhập nội
11
1
Lên men sinh kh
ối, sinh
carotenoit, lên men rượu,
ức chế vi khuẩn gây bệnh
héo xanh
Thạch nghiêng
4 Nấm sợi: Aspergilus, Fusarium,
Penicilium, Rhizoctonia,
Chetomium, Penicilium
Việt Nam
Nhập nội
12
6
Phân gi
th
ực vật, phân giải
xenluloza
Thạch nghiêng
Tổng 673
2. Thu thập, phân lập làm giàu nguồn gen
Thu thập, phân lập làm giàu nguồn gen
là một trong các nhiệm vụ của bảo tồn quỹ
gen vi sinh vật trồng trọt. Giai đoạn 2006-
2010, quỹ gen vi sinh vật đã tiến hành phân
lập, tuyển chọn được 49 nguồn gen vi sinh
vật từ các mẫu đất, mẫu rễ, cây lạc, đậu
tương, rau, ngô, khoai tây, hồ tiêu, cà phê,
v.v... thu thập từ Hà Nội, Bắc Giang, Sơn
La, Hưng Yên, Nam Định, Nghệ An, Thanh
Hóa, Quảng Trị, v.v...
3. Đánh giá nguồn gen
Phục vụ cho công tác tư liệu hoá, bảo
quản và khai thác sử dụng nguồn gen vi
sinh vật, các chủng vi sinh vật mới phân lập
được đánh giá đặc điểm vi sinh vật học (đặc
điểm hình thái, tế bào), hoạt tính sinh học
(cố định nitơ cộng sinh, cố định nitơ tự do,
kích thích sinh trưởng thực vật, sinh
polysacharit, phân giải tinh bột, phân giải
xenlulo, phân giải phốt phát khó tan và ức
chế nấm-vi khuNn gây bệnh vùng rễ cây
trồng, v.v...).
Cùng với sự phát triển của khoa học
công nghệ, nhiều nghiên cứu trong thời
gian gần đây đã cho thấy nhiều vi sinh vật
có khả năng đa hoạt tính. Vì vậy, việc đánh
giá tính đa chức năng của nguồn gen vi sinh
vật đang lưu giữ là một trong các nội dung
của quỹ gen vi sinh vật trồng trọt. Kết quả
đánh giá 183 nguồn gen vi sinh vật (thuộc
Agrobacterium, Athrobacter, Azotobacter,
Bacillus, Pseudomonas và xạ khuNn) có 88
nguồn gen đa hoạt tính (chiếm 48,09%);
đặc biệt nhiều chủng trong số đó có trên 3
hoạt tính sinh học. Đây là nguồn gen có giá
trị, nếu được nghiên cứu khai thác sử dụng
hợp lý. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học
của nguồn gen vi sinh vật được thể hiện
trong bảng 2.
Bảng 2. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của nguồn gen vi sinh vật
TT
Nhóm
vi sinh vật
Số
lượng
Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá
1 Agrobacterium
8 - Khả năng sinh hoạt
chất kích thích sinh
trưởng thực vật (sinh
IAA)
- Khả năng sinh
polysacharit
- 2/8 nguồn gen Agrobacterium được đánh giá (chi
ếm
25%) có 2 hoạt tính sinh học; Nguồn gen
Agrobacterium
được đánh giá có hàm lượng IAA hình thành đ
ạt cao
nhất sau 9 ngày nuôi cấy (46,08-180,0 µg/ml), trừ ngu
ồn
gen Ag 06 đạt cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy.
- 2/8 nguồn gen Agrobacterium được đánh giá có kh
ả
năng sinh polysacharit (hàm lượng polysacharit h
ình
thành đạt 18,5 và 49,5 g/l.
TT
Nhóm
vi sinh vật
Số
lượng
Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá
2 Athrobacter 5 - Khả năng sinh hoạt
chất kích thích sinh
trưởng thực vật (sinh
IAA)
- Khả năng sinh
polysacharit
- 1/5 nguồn gen Athrobacter được đánh giá (chiếm 20%)
có 2 hoạt tính sinh học. Nguồn gen Athrobacter được
đánh giá có hàm lượng IAA hình thành đ
ạt cao nhất sau
7-9 ngày nuôi cấy (16,94-134,8 µg/ml).
- 1/5 nguồn gen Athrobacter được đánh giá có khả năng sinh
polysacharit (hàm lượng polysacharit hình thành đạt 6,8 g/l).
3 Azotobacter 50 - Khả năng cố định
nitơ
- Khả năng sinh hoạt
chất kích thích sinh
trưởng thực vật
- Khả năng sinh
polysacharit
- 16/50 chủng Azotobacter được đánh giá (chiếm 32%)
có 3 hoạt tính sinh học (cố định nitơ, sinh ho
ạt chất kích
thích trưởng sinh thực vật và sinh polysacharit); 24 ch
ủng
(chiếm 48%) có 2 hoạt tính sinh học và 10 chủng (chiếm
20%) có 1 hoạt tính sinh học.
- 43/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả năng c
ố
định nitơ. Hàm lượng etylen hình thành đạt từ 4,5 -
4327,6 nmol/ml/ngày; trong đó 24 chủng có hàm lượng
etylen hình thành đạt >2000 nmol/ml/ngày;
- 45/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả nă
ng
sinh chất kích thích sinh trưởng. Hàm lượng IAA h
ình
thành đạt từ 7,61 - 95,16 µg/ml;
- 18/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả nă
ng
sinh polysacharit. Hàm lượng polysacharit hình thành đ
ạt
28 - 489 g/l.
4 Bacillus 46 - Khả năng sinh hoạt
chất kích thích sinh
trưởng thực vật (sinh
IAA thô)
- Khả năng phân giải
kitin
- Khả năng phân giải
xenlluloza, bột giấy
- Khả năng phân giải
phốt phát khó tan
- Khả năng ức chế
nấm, vi khuẩn gây
bệnh vùng rễ cây
trồng
- 44/46 chủng Bacillus (chiếm 95,65%) có khả nă
ng sinh
IAA thô; trong đó 9 chủng (chiếm 19,57%) có khả nă
ng
sinh IAA thô trên 300 µg/ml.
- 34/46 chủng Bacillus (chiếm 73,91%) có kh
ả năng phân
giải kitin; trong đó có 14 chủng Bacillus (chiếm 30,44%)
có khả năng phân giải kitin trên 30mm.
- 3/46 chủng Bacillus (chi
ếm 6,5%) có khả năng phân giải
phốt phát canxi.
- 32 chủng Bacillus (chiếm 69,57%) có khả năng phân giải
bột xenlulo và bột giấy; trong đó có 13 chủng Bacillus (chiếm
28,26%) có đường kính vòng phân giải trên 30 mm.
- 24/46 chủng Bacillus (chiếm 52,17%) không hoặc ức
chế VKHX yếu, 22 chủng Bacillus (chi
ếm 47,83%) có khả
năng ức chế 1, 2, 3 hoặc 4 nguồn VKHX; t
rong đó có 6
chủng Bacillus (chiếm 13,04%) có khả năng
ức chế cả 4
nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh.
5 Pseudomonas
40 - Khả năng sinh hoạt
chất kích thích sinh
trưởng
- Khả năng phân giải
lân
- Khả năng ức chế
nấm, vi khuẩn gây
bệnh vùng rễ
- 40/40 chủng Pseudomonas (chiếm 100%) có khả nă
ng
sinh chất kích thích sinh trưởng; tuy nhiên hàm lượng
IAA hình thành không cao; hàm lượng IAA hình thành đ
ạt
từ 3,58 - 73,55 µg/ml.
- 8/40 chủng Pseudomonas (chiếm 20%) có khả nă
ng
phân giải phốt phát canxi; đường kính vòng phân giải đ
ạt
3,0 - 14 mm. Trong đó có 2 chủng có đường kính v
òng
phân giải đạt 14 và 12 mm.
- 5/40 chủng Pseudomonas (chiếm 12,5%) có khả nă
ng
ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây lạc (
Rastonia
solanacearum). 7/40 chủng Pseudomonas (chiếm 17,5%)
có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh thối h
ành
(Erunia).
- 2/40 chủng Pseudomonas (chiếm 5%) có khả năng ức
chế nấm Fusarium. 7/40 chủng Pseudomonas (chiếm
17,5%) có khả năng ức chế nấm Aspergillus niger
và
4/40 chủng Pseudomonas (chiếm 10%) có khả năng ức
chế nấm Macrophomia.
TT
Nhóm
vi sinh vật
Số
lượng
Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá
6 Xạ khuẩn 34 - Khả năng phân giải
xenllulo
- Khả năng ức chế
nấm, vi khuẩn gây
bệnh vùng rễ cây
trồng
- Khả năng phân giải
phốt phát khó tan
- Khả năng chịu nhiệt
60
O
C.
- 34/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 100%) có khả nă
ng phân
giải xenlulo với đường kính vòng phân giải từ 1,0-5,2 cm.
Trong đó có 16 ch
ủng xạ khuẩn (chiếm 47,06%) có
đường kính vòng phân giải xenlulo trên 3,0 cm.
- 5/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 14,71%) có khả nă
ng phân
giải phốt phát canxi. Tuy nhiên khả năng phân gi
ải phốt
phát canxi của các chủng xạ khuẩn hiện lưu gi
ữ không
cao, đường kính vòng phân giải đạt 0,5-0,8 cm.
- 9 chủng xạ khuẩn (chiếm 26,47%) có khả năng
ức chế
vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây lạc. Trong đó có 3 ch
ủng
có đường kính vòng ức chế trên 2,1 cm.
- 23/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 67,65%) có khả năng ch
ịu
nhiệt (sinh trưởng, phát triển trong được đi
ều kiện nhiệt
độ 60
O
C).
Tổng số 183
4. Phân loại nguồn gen
Nguồn gen vi sinh vật hiện có được
phân loại chủ yếu dựa trên khóa phân loại
(đặc điểm tế bào, khuNn lạc, đặc điểm sinh
hóa và nguồn gốc phân lập); kết quả phân
loại do vậy chỉ ở mức độ sơ khởi ban đầu,
chưa chính xác. Để đảm bảo tính chính xác
của nguồn gen vi sinh vật, đề án đã tiến
hành phân loại nguồn gen vi sinh vật bằng
các kỹ thuật mới. Kết quả phân loại nguồn
gen vi sinh vật được trình bày trong bảng 3.
Bảng 3. Kết quả phân loại nguồn gen vi sinh vật
STT
Phương pháp phân loại Số lượng chủng vi sinh vật được
phân loại giai đoạn 2006-2010
1 Khóa phân loại (đặc điểm tế bào, khuẩn lạc, nguồn gốc...) 49
2 Máy định danh vi khuẩn, nấm (BIOLOG) 4
3 16S ARN riboxom 45
Phân loại vi sinh vật là công việc cần
nhiều kinh phí và thời gian. Để có đủ cơ sở
khoa học cho việc khai thác sử dụng nguồn
gen vi sinh vật phục vụ sản xuất, trong thời
gian tới đề án phải có nhiệm vụ phân loại
toàn bộ nguồn gen vi sinh vật có tiềm năng
sử dụng.
5. Tư liệu và thông tin
Tư liệu hóa nguồn gen vi sinh vật là
một trong những nội dung quan trọng của
bảo tồn quỹ gen vi sinh vật. Cơ sở dữ liệu
nguồn gen vi sinh vật hiện lưu giữ được lập
lý lịch theo mẫu quy định và được lưu giữ
trong máy tính.
6. Khai thác sử dụng nguồn gen
Để có thể khuyến cáo cho các đơn vị sử
dụng nguồn gen, đề án đã tiến hành nghiên
cứu điều kiện sinh trưởng phát triển và
đánh giá ảnh hưởng đối với cây trồng; từ đó
đề xuất và giới thiệu nguồn gen vi sinh vật
có tiềm năng cho sản xuất nông nghiệp.
Từ các nguồn gen vi sinh vật được bảo
quản tại quỹ gen vi sinh vật trồng trọt, đề
án đã kết hợp với các đề tài, dự án nghiên
cứu ứng dụng các chủng vi sinh vật có
hoạt tính cao cho sản xuất phân bón vi sinh
vật của các đơn vị nghiên cứu triển khai
trong và ngoài Viện (xưởng sản xuất thử
nghiệm vi sinh vật, sở Khoa học Công
nghệ Đắk Lắk, công ty cổ phần Thiên sinh,
Công ty Sản xuất và Thương mại Thiên