KẾT QUẢ HOẠT ĐỘNG BẢO TỒN QUỸ GEN VI SINH VẬT TRỒNG TRỌT GIAI ĐOẠN 2006-2010
Nguyễn Thu Hà1
SUMMARY
Agriculture culture collection at soils and fertilizers research institute (Period 2006-2010)
The establishment of an agriculture culture collection plays an important role to significantly support for biotechnological development. The main activities of agriculture culture collection are preserving, collect, isolate, evaluate, taxonomy, document and research on application ability of microbes. 673 strains from foreign and domestic including bacteria, yeasts and filamentous fungi were collected, isolated and preserved. Slant agar, sterile distilled water, liquid paraffin, freeze-drying, methylcellulose, or liquid nitrogen freezing was used to preserve cultures to maintain the existent capacity and active biology of them. 49 strains have been screened based on biological activity. 88/183 evaluated strains (48,09%) of agriculture culture collection have multi functional biological activity (nitrogen fixing, phosphorous solubilizing, cellulose degradation, plant growth promoting, tolerant to high temperature, anti pathogenic bacteria, fungi and etc). Bergey’s key taxonomy, Kit API 20E, API 20NE, API 50CH, BIOLOG or sequence analysis of 16S rRNA genes was used for microbial taxonomy. Microbes have been researched, evaluated and utilized in agriculture such as micro-biofertilizer or microbial inoculant. 50 strains have been introduced to produce micro-biofertilizer or microbial inoculants. Keyword: Strain, collect, isolate, preserve, evaluate, utilize, biological activity, micro-biofertilizer and microbial inoculant.
1 Viện Thổ nhưỡng Nông hoá I. §ÆT VÊN §Ò
có hiệu quả nguồn gen vi sinh vật phục vụ phát triển bền vững [2, 3, 4].
II. VËT LIÖU Vµ PH¦¥NG PH¸P NGHI£N CøU
1. Vật liệu nghiên cứu
Nguồn gen vi sinh vật có vai trò vô cùng quan trọng trong chiến lược phát triển công nghệ sinh học. Đây là nguồn vật liệu khởi đầu cho các kỹ thuật di truyền, công nghệ vi sinh và công nghệ lên men.
Nguồn gen vi sinh vật.
2. Phương pháp nghiên cứu:
1. Bảo quản các chủng vi sinh vật bằng phương pháp bảo quản thạch nghiêng, trong nước cất khử trùng, trong cát, parafin, lạnh sâu, methylcellulose (MC), đông khô và nitơ lỏng, v.v... [1, 4, 5]
Công tác lưu giữ và bảo tồn nguồn gen vi sinh vật có một ý nghĩa lớn trong mọi phòng nghiên cứu và trong công nghệ vi sinh. Từ năm 1994, Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam trước đây, nay là Viện Thổ nhưỡng Nông hóa được giao nhiệm vụ bảo tồn quỹ gen vi sinh vật trồng trọt. Nhiệm vụ của công tác bảo tồn quỹ gen vi sinh vật trồng trọt là bảo quản, thu thập, tuyển chọn, đánh giá, phân loại, tư liệu hóa, nghiên cứu khai thác và sử dụng
2. Phương pháp lấy mẫu theo TCVN và TCN; mẫu đất, rễ được thu thập theo đối tượng cây trồng (rau, đậu, lạc...) và theo vùng sinh thái.
- Xác định tên vi sinh vật theo khóa
phân loại của Bergey [6].
3. Phân lập, tuyển chọn, xác định một số đặc điểm sinh học và ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật được xác định theo các phương pháp nghiên cứu vi sinh vật thông thường.
4. Phương pháp xác định mật độ vi sinh
- Xác định tên vi sinh vật bằng Kit API 20E, API 20N E, API 50CH hoặc máy BIOLOG: Dựa trên phản ứng sinh hóa của chủng vi sinh vật đối với 20, 50 hoặc 95 nguồn các bon khác nhau.
vật theo TCVN 4884:2005 [9].
5. Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng vi khuNn, nấm gây bệnh theo 10 TCN 714:2006 [11], 10 TCN 867:2006 [12].
6. Khả năng sinh tổng hợp IAA thô theo phương pháp
được xác định Salkowsky cải tiến.
- Xác định tên vi sinh vật bằng phương pháp phân loại học phân tử dựa trên cơ sở giải trình tự đoạn gen 16s ARN riboxom của các chủng vi khuNn nghiên cứu, so sánh với các trình tự có sẵn trong ngân hàng gen quốc tế EMBL bằng phương pháp FASTA 33 để định loại đến loài các chủng vi sinh vật.
3. Phương pháp xử lý số liệu theo
chương trình thống kê IRRISTAT.
7. Khả năng hình thành nốt sần được xác định bằng phương pháp trồng cây trong nhà lưới, trên cát vô trùng, thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên, 4 lần nhắc. Chỉ tiêu theo dõi: N ốt sần tổng số.
III. KÕT QU¶ Vµ TH¶O LUËN
8. Khả năng cố định nitơ được xác định
1. Bảo quản nguồn gen vi sinh vật
theo 10 TCN 299:97 [10].
9. Khả năng phân giải xenlulo được xác
định theo TCVN 6168:2002 [8].
10. Khả năng phân giải phốt phát khó tan
được xác định theo TCVN 6167:1996 [7].
11. Khả năng chuyển hóa nitrat của các chủng vi sinh vật được xác định bằng cách - trên máy quang phổ kế đo hàm lượng N O2 dựa vào phản ứng với thuốc thử Griss.
12. Phương pháp phân loại các chủng
vi sinh vật:
Quỹ gen vi sinh vật nông nghiệp hiện lưu giữ 673 chủng vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật bảo quản được định kỳ cấy chuyển sau thời gian thích hợp (1, 3, 6 hay 12 tháng), tùy thuộc vào từng nhóm chủng giống. Nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng trong bảo quản nguồn gen vi sinh vật (thạch nghiêng, nitơ lỏng, lạnh sâu (- 200C), Methylcellulose (MC), v.v... Số lượng, chủng loại, nguồn gốc và phương pháp bảo quản nguồn gen vi sinh vật trồng trọt được trình bày trong bảng 1.
Bảng 1. Số lượng, chủng loại, nguồn gốc và phương pháp bảo quản nguồn gen vi sinh vật trồng trọt
TT Đối tượng Hoạt tính sinh học Nguồn gốc Phương pháp bảo quản Số lượng
Việt Nam Nhập nội 487 101
Thạch nghiêng, Thạch bán lỏng, Methylcellulose, Lạnh sâu (-20OC), Nitơ lỏng, 1 Vi khuẩn: Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Bradyrhizobium (cho đậu tương, đậu xanh, đậu đen, lạc), Enterobacter, Pseudomonas, Burkholderia, Lactobacterium, Cố định nitơ, phân giải lân, kích thích sinh trưởng, sinh polysacharit, ức chế vi khuẩn-nấm gây bệnh héo xanh, thối rễ, phân giải xenllulo, sinh axit amin,
Flavobacteria, Klebsiella v.v... chuyển hóa nitrat, v.v... Đông khô 2 Xạ khuẩn: Streptomyces Phân giải xenlluloza Việt Nam Nhập nội 54 1 Thạch nghiêng 3 Nấm men: Candida, Việt Nam Nhập nội 11 1 Thạch nghiêng Rhodotorula, Saccharomyces, Pichia Lên men sinh khối, sinh carotenoit, lên men rượu, ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh 4 Nấm sợi: Aspergilus, Fusarium, phân vật, Thạch nghiêng Việt Nam Nhập nội 12 6 Phân giải lân, gây bệnh thực giải xenluloza Penicilium, Rhizoctonia, Chetomium, Penicilium Tổng 673
2. Thu thập, phân lập làm giàu nguồn gen
polysacharit, phân giải tinh bột, phân giải xenlulo, phân giải phốt phát khó tan và ức chế nấm-vi khuNn gây bệnh vùng rễ cây trồng, v.v...).
Thu thập, phân lập làm giàu nguồn gen là một trong các nhiệm vụ của bảo tồn quỹ gen vi sinh vật trồng trọt. Giai đoạn 2006- 2010, quỹ gen vi sinh vật đã tiến hành phân lập, tuyển chọn được 49 nguồn gen vi sinh vật từ các mẫu đất, mẫu rễ, cây lạc, đậu tương, rau, ngô, khoai tây, hồ tiêu, cà phê, v.v... thu thập từ Hà Nội, Bắc Giang, Sơn La, Hưng Yên, Nam Định, Nghệ An, Thanh Hóa, Quảng Trị, v.v...
3. Đánh giá nguồn gen
Phục vụ cho công tác tư liệu hoá, bảo quản và khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật, các chủng vi sinh vật mới phân lập được đánh giá đặc điểm vi sinh vật học (đặc điểm hình thái, tế bào), hoạt tính sinh học (cố định nitơ cộng sinh, cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng thực vật, sinh
Cùng với sự phát triển của khoa học công nghệ, nhiều nghiên cứu trong thời gian gần đây đã cho thấy nhiều vi sinh vật có khả năng đa hoạt tính. Vì vậy, việc đánh giá tính đa chức năng của nguồn gen vi sinh vật đang lưu giữ là một trong các nội dung của quỹ gen vi sinh vật trồng trọt. Kết quả đánh giá 183 nguồn gen vi sinh vật (thuộc Agrobacterium, Athrobacter, Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas và xạ khuNn) có 88 nguồn gen đa hoạt tính (chiếm 48,09%); đặc biệt nhiều chủng trong số đó có trên 3 hoạt tính sinh học. Đây là nguồn gen có giá trị, nếu được nghiên cứu khai thác sử dụng hợp lý. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của nguồn gen vi sinh vật được thể hiện trong bảng 2.
Bảng 2. Kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của nguồn gen vi sinh vật
TT Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá Nhóm vi sinh vật Số lượng 1 Agrobacterium 8
- Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA) - Khả năng sinh polysacharit - 2/8 nguồn gen Agrobacterium được đánh giá (chiếm 25%) có 2 hoạt tính sinh học; Nguồn gen Agrobacterium được đánh giá có hàm lượng IAA hình thành đạt cao nhất sau 9 ngày nuôi cấy (46,08-180,0 µg/ml), trừ nguồn gen Ag 06 đạt cao nhất sau 3 ngày nuôi cấy. - 2/8 nguồn gen Agrobacterium được đánh giá có khả năng sinh polysacharit (hàm lượng polysacharit hình thành đạt 18,5 và 49,5 g/l.
TT Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá Nhóm vi sinh vật Số lượng 2 Athrobacter 5
- Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA) - Khả năng sinh polysacharit - 1/5 nguồn gen Athrobacter được đánh giá (chiếm 20%) có 2 hoạt tính sinh học. Nguồn gen Athrobacter được đánh giá có hàm lượng IAA hình thành đạt cao nhất sau 7-9 ngày nuôi cấy (16,94-134,8 µg/ml). - 1/5 nguồn gen Athrobacter được đánh giá có khả năng sinh polysacharit (hàm lượng polysacharit hình thành đạt 6,8 g/l). 3 Azotobacter 50
- Khả năng cố định nitơ - Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật - Khả năng sinh polysacharit
- 16/50 chủng Azotobacter được đánh giá (chiếm 32%) có 3 hoạt tính sinh học (cố định nitơ, sinh hoạt chất kích thích trưởng sinh thực vật và sinh polysacharit); 24 chủng (chiếm 48%) có 2 hoạt tính sinh học và 10 chủng (chiếm 20%) có 1 hoạt tính sinh học. - 43/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả năng cố định nitơ. Hàm lượng etylen hình thành đạt từ 4,5 - 4327,6 nmol/ml/ngày; trong đó 24 chủng có hàm lượng etylen hình thành đạt >2000 nmol/ml/ngày; - 45/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng. Hàm lượng IAA hình thành đạt từ 7,61 - 95,16 µg/ml; - 18/50 chủng Azotobacter được đánh giá có khả năng sinh polysacharit. Hàm lượng polysacharit hình thành đạt 28 - 489 g/l. 4 Bacillus 46
- Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng thực vật (sinh IAA thô) - Khả năng phân giải kitin - Khả năng phân giải xenlluloza, bột giấy - Khả năng phân giải phốt phát khó tan - Khả năng ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ cây trồng
- 44/46 chủng Bacillus (chiếm 95,65%) có khả năng sinh IAA thô; trong đó 9 chủng (chiếm 19,57%) có khả năng sinh IAA thô trên 300 µg/ml. - 34/46 chủng Bacillus (chiếm 73,91%) có khả năng phân giải kitin; trong đó có 14 chủng Bacillus (chiếm 30,44%) có khả năng phân giải kitin trên 30mm. - 3/46 chủng Bacillus (chiếm 6,5%) có khả năng phân giải phốt phát canxi. - 32 chủng Bacillus (chiếm 69,57%) có khả năng phân giải bột xenlulo và bột giấy; trong đó có 13 chủng Bacillus (chiếm 28,26%) có đường kính vòng phân giải trên 30 mm. - 24/46 chủng Bacillus (chiếm 52,17%) không hoặc ức chế VKHX yếu, 22 chủng Bacillus (chiếm 47,83%) có khả năng ức chế 1, 2, 3 hoặc 4 nguồn VKHX; trong đó có 6 chủng Bacillus (chiếm 13,04%) có khả năng ức chế cả 4 nguồn vi khuẩn gây bệnh héo xanh. 5 Pseudomonas 40
- Khả năng sinh hoạt chất kích thích sinh trưởng - Khả năng phân giải lân - Khả năng ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ
- 40/40 chủng Pseudomonas (chiếm 100%) có khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng; tuy nhiên hàm lượng IAA hình thành không cao; hàm lượng IAA hình thành đạt từ 3,58 - 73,55 µg/ml. - 8/40 chủng Pseudomonas (chiếm 20%) có khả năng phân giải phốt phát canxi; đường kính vòng phân giải đạt 3,0 - 14 mm. Trong đó có 2 chủng có đường kính vòng phân giải đạt 14 và 12 mm. - 5/40 chủng Pseudomonas (chiếm 12,5%) có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây lạc (Rastonia solanacearum). 7/40 chủng Pseudomonas (chiếm 17,5%) có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh thối hành (Erunia). - 2/40 chủng Pseudomonas (chiếm 5%) có khả năng ức chế nấm Fusarium. 7/40 chủng Pseudomonas (chiếm 17,5%) có khả năng ức chế nấm Aspergillus niger và 4/40 chủng Pseudomonas (chiếm 10%) có khả năng ức chế nấm Macrophomia.
TT Chỉ tiêu đánh giá Kết quả đánh giá Nhóm vi sinh vật Số lượng 6 Xạ khuẩn 34
- Khả năng phân giải xenllulo - Khả năng ức chế nấm, vi khuẩn gây bệnh vùng rễ cây trồng - Khả năng phân giải phốt phát khó tan - Khả năng chịu nhiệt 60OC.
- 34/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 100%) có khả năng phân giải xenlulo với đường kính vòng phân giải từ 1,0-5,2 cm. Trong đó có 16 chủng xạ khuẩn (chiếm 47,06%) có đường kính vòng phân giải xenlulo trên 3,0 cm. - 5/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 14,71%) có khả năng phân giải phốt phát canxi. Tuy nhiên khả năng phân giải phốt phát canxi của các chủng xạ khuẩn hiện lưu giữ không cao, đường kính vòng phân giải đạt 0,5-0,8 cm. - 9 chủng xạ khuẩn (chiếm 26,47%) có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh cây lạc. Trong đó có 3 chủng có đường kính vòng ức chế trên 2,1 cm. - 23/34 chủng xạ khuẩn (chiếm 67,65%) có khả năng chịu nhiệt (sinh trưởng, phát triển trong được điều kiện nhiệt độ 60OC). Tổng số 183
4. Phân loại nguồn gen
chưa chính xác. Để đảm bảo tính chính xác của nguồn gen vi sinh vật, đề án đã tiến hành phân loại nguồn gen vi sinh vật bằng các kỹ thuật mới. Kết quả phân loại nguồn gen vi sinh vật được trình bày trong bảng 3.
Nguồn gen vi sinh vật hiện có được phân loại chủ yếu dựa trên khóa phân loại (đặc điểm tế bào, khuNn lạc, đặc điểm sinh hóa và nguồn gốc phân lập); kết quả phân loại do vậy chỉ ở mức độ sơ khởi ban đầu,
Bảng 3. Kết quả phân loại nguồn gen vi sinh vật
STT Phương pháp phân loại
1 Khóa phân loại (đặc điểm tế bào, khuẩn lạc, nguồn gốc...) 2 Máy định danh vi khuẩn, nấm (BIOLOG) 3 16S ARN riboxom Số lượng chủng vi sinh vật được phân loại giai đoạn 2006-2010 49 4 45
gian tới đề án phải có nhiệm vụ phân loại toàn bộ nguồn gen vi sinh vật có tiềm năng sử dụng.
Phân loại vi sinh vật là công việc cần nhiều kinh phí và thời gian. Để có đủ cơ sở khoa học cho việc khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật phục vụ sản xuất, trong thời
5. Tư liệu và thông tin
đánh giá ảnh hưởng đối với cây trồng; từ đó đề xuất và giới thiệu nguồn gen vi sinh vật có tiềm năng cho sản xuất nông nghiệp.
Tư liệu hóa nguồn gen vi sinh vật là một trong những nội dung quan trọng của bảo tồn quỹ gen vi sinh vật. Cơ sở dữ liệu nguồn gen vi sinh vật hiện lưu giữ được lập lý lịch theo mẫu quy định và được lưu giữ trong máy tính.
6. Khai thác sử dụng nguồn gen
Để có thể khuyến cáo cho các đơn vị sử dụng nguồn gen, đề án đã tiến hành nghiên cứu điều kiện sinh trưởng phát triển và
Từ các nguồn gen vi sinh vật được bảo quản tại quỹ gen vi sinh vật trồng trọt, đề án đã kết hợp với các đề tài, dự án nghiên cứu ứng dụng các chủng vi sinh vật có hoạt tính cao cho sản xuất phân bón vi sinh vật của các đơn vị nghiên cứu triển khai trong và ngoài Viện (xưởng sản xuất thử nghiệm vi sinh vật, sở Khoa học Công nghệ Đắk Lắk, công ty cổ phần Thiên sinh, Công ty Sản xuất và Thương mại Thiên
Phúc, công ty trách nhiệm hữu hạn Hữu Cơ, Viện Bảo vệ thực vật, v.v...); đồng thời quỹ gen vi sinh vật trồng trọt cũng là nguồn cung cấp vật liệu khởi đầu cho các nghiên cứu của sinh viên luận văn thực tập (trường Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Bách Khoa, Đại học Nông nghiệp Hà Nội, v.v...). N hiều sản phNm khoa học được công nhận là tiến bộ kỹ thuật (phân
bón vi sinh vật N itragin, Azogin, phân lân vi sinh, thuốc diệt chuột MIROCA, phân hữu cơ vi sinh vật, phân bón vi sinh vật chức năng) đã và đang được sử dụng rộng rãi tại nhiều địa phương trong cả nước, được đề án Quỹ gen vi sinh vật trồng trọt cung cấp chủng giống gốc. Số lượng nguồn gen vi sinh vật đang khai thác sử dụng được trình bày trong bảng 4.
Bảng 4. Số lượng và mục đích khai thác sử dụng nguồn gen vi sinh vật
Mục đích sử dụng Số lượng STT Sản xuất phân bón vi sinh vật 1 15 Xử lý phế thải hữu cơ rắn làm phân bón sinh học 2 7 Sử dụng trong kiểm soát bệnh, dịch hại cây trồng 3 8 4 Kiểm định 10 5 10 Giảng dạy, luận văn thực tập của sinh viên tại các trường đại học (Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Nông nghiệp Hà Nội) Tổng cộng: 50
