Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
Nghiên cứu Y học
76
KHẢO SÁT BẤT THƯỜNG GEN SDHB, SDHC VÀ SDHD
TRONG BỆNH LÝ U SẮC BÀO THƯỢNG THẬN VÀ U CẬN HẠCH
Lâm Văn Hoàng*, Trần Viết Thắng**, Lê Gia Hoàng Linh***, Mai Phương Thảo****, Đỗ Đức Minh***
Mục tiêu: Chẩn đoán phân tử trong bệnh lý u sắc bào thượng thận/ u cận hạch ngày càng có giá trị vì
chúng giúp cung cấp các thông tin liên quan đến tiên lượng điều trị và tư vấn di truyền cho bệnh nhân và người
thân trực hệ.
Đối tượng và phương pháp: Ba bệnh nhân được chẩn đoán u sắc bào thượng thận/ u cận hạch được khảo
sát bất thường gen SDHB, SHDC và SDHD bằng phương pháp giải trình tự Sanger.
Kết quả: Chúng tôi phát hiện 1 biến thể di truyền hợp tử chưa xác định trên gen SDHB c.714C>A (p.
Phe238Leu). Biến thể này được dự đoán là có khả năng gây bệnh bằng phần mềm Polyphen-2.
Kết luận: Chúng tôi đã xây dựng thành công quy trình khảo sát bất thường các gen succinate
dehydrogenase góp phần chẩn đoán phân tử u sắc bào thượng thận/ u cận hạch.
Từ khóa: U sắc bào thượng thận/ u cận hạch (pheochromocytoma/paraganglioma), gen SDHB, SDHC,
SDHD, giải trình tự Sanger
ABSTRACT
MOLECULAR DIAGNOSIS OF SDHB, SDHC, AND SDHD GENES IN
PHEOCHROMOCYTOMAS/PARAGANGLIOMAS
Lam Van Hoang, Tran Viet Thang, Le Gia Hoang Linh, Tran Ngoc Hoang, Do Duc Minh
* Ho Chi Minh City Journal of Medicine * Vol. 24 - No. 4 - 2020: 76 - 82
Objectives: Molecular diagnosis is playing an important role in pheochromocytoma/paraganglioma as it
provides useful information not only for prognosis but also genetic counseling.
Methods: SHDB, SDHC, SDHD genetic sequencing was performed in three patients diagnosed with
pheochromocytoma/paraganglioma.
Results: A heterozygous variant of unknown significance c.714C>A (p. Phe238Leu) was reported in SDHB
gene. This variant was predicted “Probably damage” by Polyphen-2.
Conclusion: Sequencing protocols for SDHB, SDHC, SDHD genes were successfully developed and this
will provide useful information for the molecular diagnosis of pheochromocytoma/paraganglioma.
Keywords: pheochromocytoma/paraganglioma, SDHB, SDHC, SDHD gene, Sanger sequencing
ĐẶT VẤN ĐỀ
U cận hạch (PGLs: paraganglioma) là các
khối u thần kinh nội tiết có nguồn gốc từ mào
thần kinh trong giai đoạn phôi thai. Vị trí của các
khối u này có thể nằm ở các hạch thần kinh giao
cảm hoặc phó giao cảm khắp cơ thể và khi khối
u này nằm ở tủy thượng thận (được xem như
một phần của hệ thần kinh giao cảm), chúng có
tên gọi là pheochromocytomas hay u sắc bào
thượng thận (PCCs: pheochromocytoma). Triệu
chứng lâm sàng của PGLs và PCCs tương đối đa
dạng, bao gồm đau hông lưng, tăng huyết áp,
tam chứng kinh điển: nhức đầu, đánh trống
ngực, vã mồ hôi, cho đến không có triệu chứng
(khối u được phát hiện tình cờ). Nhiều công
*Khoa Nội tiết – Bệnh viện Chợ Rẫy **Bộ môn Nội tiết – Khoa Y – ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh
***Trung tâm Y sinh học phân tử - ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh
****Bộ môn Sinh lý – sinh lý bệnh – Miễn dịch, Khoa Y – ĐH Y Dược TP. Hồ Chí Minh
Tác giả liên lạc: TS. Đỗ Đức Minh ĐT: 0932 999989 Email: ducminh@ump.edu.vn
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
77
trình nghiên cứu về paragangliomas và
pheochromocytomas (gọi chung là PPGLs:
pheochromocytoma and paragangliomas) đã
đúc kết quy luật số 10 của bệnh lý này, đó là:
10% xảy ra ở trẻ em, 10% ác tính, 10% ngoài
thượng thận và 10% không chức năng. Tuy
nhiên, với các tiến bộ trong y học, đến nay, các
nhà khoa học đã xác định được cứ 3 ca PPGLs
thì có 1 ca là do nguyên nhân di truyền và chủ
yếu là do đột biến dòng mầm tại 1 trong số 14
gen bao gồm: NF1, RET, VHL, SDHD, SDHC,
SDHB, EGLN1/PHD2, KIF1B, SDH5/SDHAF2,
IDH1, TMEM127, SDHA, MAX và HIF2A(1–4).
Theo khuyến cáo của hội nội tiết Hoa Kỳ, tất cả
các bệnh nhân PPGLs cần được tư vấn để thực
hiện xét nghiệm di truyền đặc biệt là các đối
tượng có nguy cơ cao: tiền sử gia đình PPGLs,
khối u 2 bên thượng thận hoặc đa ổ, triệu chứng
di căn, biểu hiện lâm sàng hội chứng (von
Hippel-Lindau, MEN2, Neurofibromatosis típ
1)(2). Việc xác định bất thường di truyền trên các
bệnh nhân PPGLs ngày càng quan trọng vì: (i)
tần suất cao (lên đến 30%) (ii) đột biến một số
gen có nguy cơ khối u ác tính và khả năng di căn
cao (RET, SDHB) (iii) xác định nguyên nhân di
truyền sẽ quyết định kế hoạch theo dõi và điều
trị phòng ngừa phù hợp nhất cho bệnh nhân và
người thân trực hệ.
Tuy nhiên, việc tiếp cận với các xét nghiệm
di truyền đôi khi còn chưa cao ở những khu vực
có nguồn lực hạn chế như Việt Nam, do đó,
không thể tiến hành tất cả xét nghiệm di truyền
cho các bệnh nhân được chẩn đoán u sắc bào
thượng thận theo hướng dẫn của Hội nội tiết
Hoa kỳ mà xét nghiệm di truyền nên được ưu
tiên ở các bệnh nhân có các đặc điểm lâm sàng
gợi ý nguy cơ di truyền cao như: bệnh nhân trẻ
tuổi, khối u thượng thận 2 bên, khối u thượng
thận lớn, có tiền căn gia đình mắc bệnh lý u sắc
bào thượng thận, có các biểu hiện liên quan đến
các hội chứng như đa u tuyến nội tiết típ 2, hội
chứng Von Hippel Lindau, hội chứng
neurofibromatosis típ 1(1,4–6).
Việc tiếp cận thự hiện giải trình tự gen nào
cũng là một câu hỏi. Trong đó có nhiều gợi ý tiếp
cận, nhưng gợi ý tiếp cận của Hội nội tiết Hoa
Kỳ khá rõ ràng tùy thuộc vào đặc điểm lâm sàng
và cận lâm sàng của bệnh nhân u sắc bào thượng
thận như Hình 1(2).
Hình 1. Sơ đồ tiếp cận chẩn đoán phân tử PPGLs theo Hội nội tiết Hoa Kỳ(2)
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
Nghiên cứu Y học
78
Trong các gen được liệt kê tiếp cận trong
hình 1, ngoài các gen hội chứng mục tiêu như
NF1, RET, VHL thì các gen thuộc hệ Succinate
dehydrogenase (SDHx: SDHB, SDHC, SDHD)
cũng đóng vai trò quan trọng trong kiểu hình di
truyền và tiên lượng của bệnh lý u sắc bào tuyến
thượng thận/u cận hạch.
Vì vậy, thông qua nghiên cứu này, chúng tôi
muốn tiến hành xây dựng quy trình giải trình tự
gen nhằm phát hiện đột biến của các gen SDHB,
SDHC, SDHD để có thể hiểu rõ hơn về mô hình
di truyền cũng như ảnh hưởng của đột biến gen
nếu có lên kiểu hình lâm sàng của bệnh nhân
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Thời gian thu thập mẫu là từ tháng 3/2020
đến tháng 5/2020. Ba đối tượng được chẩn đoán
u sắc bào thượng thận/u cận hạch tại bệnh viện
Đại học Y Dược và bệnh viện Chợ Rẫy theo các
tiêu chuẩn chẩn đoán của Hội nội tiết Hoa Kỳ
với các xét nghiệm sinh hóa và hình ảnh học
được tư vấn và đồng ý tham gia nghiên cứu.
Chúng tôi tiến hành giải trình tự DNA để
phát hiện đột biến cho 3 đối tượng được chẩn
đoán u sắc bào thượng thận/u cận hạch tại bệnh
viện Chợ Rẫy và bệnh viện Đại học Y Dược theo
hướng dẫn của hội Nội tiết Hoa Kỳ bằng xét
nghiệm sinh hóa và hình ảnh học(2). Các bệnh
nhân này có các đặc điểm nghi ngờ di truyền:
tuổi phát bệnh sớm (dưới 40 tuổi), u thượng
thận 2 bên, khối u to (trên 4 cm cho đường kính
lớn nhất), khối u ngoài thượng thận. Tất cả các
bệnh nhân đều được tư vấn trước và sau xét
nghiệm di truyền và đều đồng ý ký vào bản
chấp thuận thực hiện xét nghiệm di truyền và
cho phép báo cáo kết quả khoa học về các thông
tin lâm sàng, cận lâm sàng, phả hệ của gia đình
dưới dạng ẩn danh.
Phương pháp nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành dưới dạng mô tả
loạt ca.
Phương pháp thực hiện
Tách chiết DNA bộ gene
Tiến hành lấy 2 ml máu tĩnh mạch, cho vào
ống chống đông có EDTA, lắc đều nhẹ nhàng.
Genomic DNA của các tế bào bạch cầu trong
máu toàn phần được tách chiết trong vòng 24
giờ bằng bộ kit GeneJetTM whole blood genomic
DNA purification (Thermo Scientific, Mỹ) theo
hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất
Phản ứng PCR khuếch đại và giải trình tự gen mục
tiêu
Cặp mồi được thiết kế và tổng hợp (IDT,
Mỹ) dựa trên trình tự DNA của gen SDHB,
SDHC, SDHD trong kho dữ liệu của NCBI với
các mã số lần lượt là NG_012340.1, NG_012767.1
và NG_012337.3 (Bảng 1).
Thiết lập điều kiện cho các PCR khuếch đại
tương ứng với bộ mồi: Mỗi tube PCR có thể tích
15µl chứa các thành phần: 1,5μl PCR buffer 10X;
1,5μl dNTP 2,5mM; 0,75μl cho mỗi mồi xuôi và
ngược (10nM/μl), 0,1μl TaKaRa TaqTM HotStart
Polymerase (Takara, Nhật Bản), 2μl genomic
DNA (20-50ng/μl) và 8,4μl nước cất 2 lần khử
ion. Các phản ứng luôn kèm theo một chứng âm
không chứa DNA để kiểm soát ngoại nhiễm.
Chu trình luân nhiệt cho PCR được thực
hiện trên máy Mastercycler@Pro S (Eppendorf,
Đức). Chu kỳ nhiệt: khởi đầu tại 980 C trong 3
phút, tiếp theo với 40 chu kỳ lặp lại các bước
980C: 20 giây, 620C: 20 giây, 720C: 1 phút; kế tiếp
với bước 720C: 2 phút. Trữ sản phẩm PCR tại
40C. Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên
gel agarose 2% và nhuộm bằng Diamond™
Nucleic Acid Dye (Promega-Mỹ).
Kỹ thuật giải trình tự
Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch bằng
Exosap-IT glycerol solution (Affymetrix-Mỹ)
theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất và
được thực hiện phản ứng cycle sequencing với
BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit
(Applied Biosystems, Mỹ) và cùng sử dụng các
cặp mồi trong phản ứng PCR ở Bảng 1. Sản
phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hòa tan
Nghiên cứu Y học
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
79
trong Hi-Di formanide, biến tính ở 95C trước
khi làm lạnh đột ngột. Trình tự DNA được đọc
bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer, với POP-7
polymer và capillary 50 cm (Applied Biosystems,
Mỹ). Kết quả giải trình tự DNA được phân tích
bằng phần mềm CLC Main Workbench.
Bảng 1: Cặp mồi được sử dụng để khuếch đại trình tự các exon và vùng intron lân cận của gen SDHB, SDHC,
SDHD
Fw Primers (5'→3')
Rv Primers (5'→3')
CCCACTTGGTTGCTCGTACG
AACTCACAAGCTGCTGCGAG
CGTTACATCTGTTGTGCCAG
ATTATAGGCGTGAGCCACCG
AAGTGTAGGGAGGTTGAACG
TGCACAGCAAGTTCACCCAG
CTGATGGCACAGCAAGGAGG
ACACTGTGGTCCTCCTCCTG
GAGTGGACGAGTAGTCAGTG
AGCTTATGTTCCCTGCCAAG
CAGCTGAAGACATAGCAGAG
TCAGAATGGCTGGCTTACAG
AGAGCTTTGAGTTGAGCCAG
GAAAGGACAGGCATATGCTG
CTTGGACACTGAACCAGCTG
CCAAGATCTTTAAAGGAACTCA
CGTCACTTCCGTCCAGACCG
CTAGGATCCCCGAGCGCTTG
CCCTTCACCCCTAAAAATAG
GGCAAAATGGTGAAACCTCG
GCTGAGATTACAGGCCTGAG
ATCTCCCTCTACCCTGAAGG
AGCCTGGGCAACAGAGCGAG
GCTGAGTTTCAAAGGAGGCG
GAATTGTATGAGGTGCCAGG
TCCCCACTCCCTTCACAGAG
TCTAGATGTGTGGTCCTGAG
TACTCTACTGCTCCAAGGAG
TTCTTTCGTCGTCGTGGGTG
GACTACAGTGGTCATTGCTG
AAGTAGGGAACATGCAGATG
GGCATGACCATTAGTGAAGG
CCTGTCAGTTTGGGTTACTG
GTGCAGGAGGAACAGATTAG
CAGTGGAGTGGCAAATGGAG
AGAAGGCTGTCCACCAATGG
Y đức
Nghiên cứu đã được sự chấp thuận của Hội
đồng đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học Đại
học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh với quyết
định số 263/ĐHYD-HĐĐĐ ngày 16/4/2020.
KẾT QUẢ
Kết quả khuếch đại và giải trình tự các gen
SDHB, SDHC, SDHD
Hình 2. Kết quả PCR khuếch đại các exon và vùng
intron lân cận của gen SDHB
Hình 3. Kết quả PCR khuếch đại các exon và vùng
intron lân cận của gen SDHC
Phản ứng PCR khuếch đại các exon và vùng
intron lân cận của gen SDHB, SDHC, SDHD cho
sản phẩn có hình ảnh kích thước đúng với thiết
kế ban đầu khi điện di trên gel agarose 1% (Hình
2, 3, 4). Kích thước của các đoạn DNA được thể
hiện trong Bảng 2.
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 24 * Số 4 * 2020
Nghiên cứu Y học
80
Hình 4. Kết quả PCR khuếch đại các exon và vùng
intron lân cận của gen SDHD
Kết quả giải trình tự các mẫu cho thấy các
vùng gen khuếch đại đúng với trình tự tham
khảo gen SDHB, SDHC, SDHD với mã số
NG_012340.1, NG_012767.1 và NG_012337.3 ở
tất cả các vị trí. Trong số các kết quả giải trình tự,
chúng tôi phát hiện biến thể di truyền dị hợp tử
chưa xác định trên gen SDHB c.714C>A (p.
Phe238Leu) ở một bệnh nhân u cận hạch (Hình
5). Đây là một bệnh nhân nữ trẻ 18 tuổi, có kiểu
hình cường giao cảm điển hình, kết quả giải
phẫu bệnh của bệnh nhân là u cận hạch.
Hình 5. Biến thể c.714C>A (p. Phe238Leu) trên gen
SDHB
Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và bất thường
phân tử của các bệnh nhân PPGLs
Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của 3
bệnh nhân đồng ý tham gia nghiên cứu được
thể hiện trong Bảng 3.
Bảng 2: Kích thước các sản phẩm PCR được khuếch đại
Gene
Fw Primers (5'→3')
Rv Primers (5'→3')
Kích thước
SDHB
CCCACTTGGTTGCTCGTACG
AACTCACAAGCTGCTGCGAG
403bp
CGTTACATCTGTTGTGCCAG
ATTATAGGCGTGAGCCACCG
376bp
AAGTGTAGGGAGGTTGAACG
TGCACAGCAAGTTCACCCAG
266bp
CTGATGGCACAGCAAGGAGG
ACACTGTGGTCCTCCTCCTG
311bp
GAGTGGACGAGTAGTCAGTG
AGCTTATGTTCCCTGCCAAG
409bp
CAGCTGAAGACATAGCAGAG
TCAGAATGGCTGGCTTACAG
259bp
AGAGCTTTGAGTTGAGCCAG
GAAAGGACAGGCATATGCTG
594bp
CTTGGACACTGAACCAGCTG
CCAAGATCTTTAAAGGAACTCA
266bp
SDHC
CGTCACTTCCGTCCAGACCG
CTAGGATCCCCGAGCGCTTG
196bp
CCCTTCACCCCTAAAAATAG
GGCAAAATGGTGAAACCTCG
789bp
GCTGAGATTACAGGCCTGAG
ATCTCCCTCTACCCTGAAGG
380bp
AGCCTGGGCAACAGAGCGAG
GCTGAGTTTCAAAGGAGGCG
308bp
GAATTGTATGAGGTGCCAGG
TCCCCACTCCCTTCACAGAG
306bp
TCTAGATGTGTGGTCCTGAG
TACTCTACTGCTCCAAGGAG
583bp
SDHD
TTCTTTCGTCGTCGTGGGTG
GACTACAGTGGTCATTGCTG
268bp
AAGTAGGGAACATGCAGATG
GGCATGACCATTAGTGAAGG
377bp
CCTGTCAGTTTGGGTTACTG
GTGCAGGAGGAACAGATTAG
501bp
CAGTGGAGTGGCAAATGGAG
AGAAGGCTGTCCACCAATGG
915bp
Bảng 3. Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân tham gia nghiên cứu
Đặc điểm
Bệnh nhân 1
Bệnh nhân 2
Bệnh nhân 3
Tuổi
30
32
18
Giới
Nữ
Nam
Nữ