intTypePromotion=1
ADSENSE

Khảo sát các điều kiện tối ưu xây dựng quy trình tách và xác định đồng thời một số kháng sinh họ b - lactam bằng phương pháp điện di

Chia sẻ: Thi Thi | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:5

34
lượt xem
0
download
 
  Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Trong nghiên cứu, thiết lập điều kiện để tách các kháng sinh họ β – lactam bởi sắc ký điện di mao quản . Được thực hiện trên hệ thống điện di 1602A 3D của hãng Agilent, mao quản có lớp phủ silica với chiều dài 75,5cm. Sử dụng dung dịch đệm Natritetraborat 15mM với 75mM SDS, pH= 6,8: Amocillin; Ampicillin; Cloxacilin; Cephacilin; Oxacillin và Penicillin-G trong đó Ampicilin được tách ra ở 16 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là ≤ 0,7 µg/ml cho mỗi kháng sinh. Rồi áp dụng phương pháp này để xác định trong mẫu dược phẩm với độ thu hồi từ 94,2- 105,8%.

Chủ đề:
Lưu

Nội dung Text: Khảo sát các điều kiện tối ưu xây dựng quy trình tách và xác định đồng thời một số kháng sinh họ b - lactam bằng phương pháp điện di

Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 89(01/2): 295 – 299<br /> <br /> KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH<br /> ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH HỌ β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI<br /> Nguyễn Thị Ánh Tuyết1, Nguyễn Văn Ri2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên<br /> 2<br /> Đại học quốc gia Hà Nội<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Trong nghiên cứu, thiết lập điều kiện để tách các kháng sinh họ β – lactam bởi sắc ký điện di mao<br /> quản . Được thực hiện trên hệ thống điện di 1602A 3D của hãng Agilent, mao quản có lớp phủ<br /> silica với chiều dài 75,5cm. Sử dụng dung dịch đệm Natritetraborat 15mM với 75mM SDS, pH=<br /> 6,8: Amocillin; Ampicillin; Cloxacilin; Cephacilin; Oxacillin và Penicillin-G trong đó Ampicilin<br /> được tách ra ở 16 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là ≤ 0,7 µg/ml cho mỗi kháng<br /> sinh. Rồi áp dụng phương pháp này để xác định trong mẫu dược phẩm với độ thu hồi từ 94,2105,8%.<br /> Từ khóa: Mao mạch phát hiện giới hạn, phục hồi<br /> <br /> MỞ ĐẦU<br /> β- lactam được dùng như các thuốc kháng<br /> khuẩn từ hơn 80 năm nay mà vẫn là một<br /> nhóm quan trọng của kháng sinh. Mỗi loại<br /> kháng sinh lại có tác dụng nhất định, có thể<br /> hạn chế hay tiêu diệt được mầm bệnh trong y<br /> học, chăn nuôi hay sản xuất[1]. Tuy nhiên<br /> liều lượng của nó cũng để lại hậu quả rất lớn<br /> đối với sức khỏe của con người, do đó việc<br /> xác định hàm lượng kháng sinh là rất cần<br /> thiết. Bên cạnh kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng<br /> cao, điện di mao quản cũng là một kỹ thuật<br /> đầy triển vọng để tách các chất phân tích có<br /> mang điện tích cũng như trung tính và được<br /> ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau.<br /> Trong những năm gần đây phương pháp này<br /> đã thu hút rất nhiều nhà khoa học bởi những<br /> ưu điểm nổi bật như kỹ thuật dể sử dụng, tính<br /> linh hoạt cao, tiết kiệm hóa chất và khả năng<br /> tách tốt hơn nữa phương pháp cũng cho độ tin<br /> cậy cao[2,3].<br /> <br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi công bố điều<br /> kiện tách và xác định một số kháng sinh họ β<br /> – lactam bằng phương pháp điện di mao quản<br /> điện động học kiểu mixen(dùng mao quản<br /> Highsensitip).<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Phương pháp tách và xác định các β-Lactam<br /> sử dụng chất hoạt động bề mặt, sodium<br /> dodecyl sunfate- SDS làm pha tĩnh, là các<br /> mixen mang điện tích âm, còn gọi là các pha<br /> tĩnh giả. Các mixen mang tính anion, được<br /> pha chế trong dung dịch đệm, chứa trong mao<br /> quản hẹp bằng silic, có đường kính 50 µm.<br /> Áp vào hai đầu mao quản trường điện áp cao<br /> (10-30KV), khi đó dung dịch đệm di chuyển<br /> từ cực dương sang cực âm, các mixen cũng di<br /> chuyển về phía cực âm nhưng có tốc độ khác<br /> với tốc độ dung dịch đệm. Các mixen có chức<br /> năng hấp thu các chất phân tích ở mức độ<br /> khác nhau tùy thuộc vào tính tương tự về độ<br /> phân cực giữa các mixen và từng chất phân tích.<br /> <br /> Hình 1. Tách các β-Lactam bằng phương pháp MEKC*<br /> *<br /> <br /> 295<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Nhờ sự phân bố khác nhau, các β-Lactam di<br /> chuyển với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau.<br /> Điều kiện rất quan trọng là giá trị pH, nồng<br /> độ đệm, thế điện di để phương pháp tách có<br /> hiệu quả cao nhất.<br /> THỰC NGHIỆM<br /> Thiết bị và hóa chất<br /> - Máy điện di model 1602A của hãng Agilent,<br /> HP3D, detector DAD, mao quản silica trần<br /> d=50µm, chiều dài 75.5 cm, hiệu dụng 70 cm.<br /> - Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat<br /> Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề mặt SDS,<br /> NaOH … của hãng Merk. Nước deion được<br /> lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore.<br /> Các chất chuẩn: amoxicillin – AMO,<br /> ampicillin – AMP, penicillin G – PENG,<br /> oxacillin – OXA, cloxacillin – CLO,<br /> cephalexin – CEP, do Viện kiểm nghiệm Bộ<br /> Y tế cung cấp<br /> Nghiên cứu điều kiện tách các β- Lactam<br /> bằng phương pháp điện di.<br /> Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di đến<br /> khả năng tách các β- Lactam<br /> Nghiên cứu này, ảnh hưởng của pH trong<br /> dung dịch đệm điện di được khảo sát với<br /> dung dịch điện di chứa các chất kháng sinh<br /> cùng nồng độ 2 µg/ml, 15mM đệm Borat +<br /> 75mM SDS. Mao quản được đặt ở nhiệt độ<br /> 280C, điện áp phân cực 22kV. Mẫu được bơm<br /> ở áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 10s.<br /> Các giá trị pH thay đổi là 6,5; 6,8; 7,0; 7,2.<br /> Trong nghiên cứu này, cặp CEP-AMP có ∆t<br /> giảm dần theo chiều tăng của pH, cặp OXACLO có ∆t thay đổi không đáng kể. Sự thay<br /> đổi pH làm thay đổi lớp điện kép của thành<br /> mao quản, do đó làm ảnh hưởng đến sự điện<br /> di của các chất.<br /> <br /> 89(01/2): 295 – 299<br /> <br /> Như vậy tăng pH của dung dịch đệm, rút ngắn<br /> thời gian phân tích, tuy nhiên khả năng tách<br /> giảm, nên phải chọn một giá tri pH phù hợp.<br /> Ở pH = 6,5 các β- Lactam tách tốt nhưng có<br /> một píc nhỏ dính vào píc của PEN-G làm cho<br /> diện tích của píc không chính xác nên chúng<br /> tôi chọn pH = 6,8 để tách các β-Lactam trong<br /> những nghiên cứu tiếp theo. Khảo sát ảnh<br /> hưởng của nồng độ đệm.<br /> Chất điện ly trong pha động cũng có vai trò<br /> quan trọng vì nó là chất dẫn điện, tạo dòng<br /> điện di thẩm thấu. Trong thực tế, người ta cố<br /> gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính<br /> là chất điện giải của sắc ký điện di. Chúng tôi<br /> chọn Natritetraborat vừa là chất đệm pH vừa<br /> là chất điện giải.<br /> Khảo sát nồng độ đệm tại 4 gía trị là 10mM;<br /> 15mM; 20 mM; 25mM với 75mM SDS, pH =<br /> 6,8. Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất<br /> 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao<br /> quản 250C Các chất kháng sinh cùng nồng độ<br /> 1µg/ml. Kết quả cho thấy tăng nồng độ đệm<br /> thì độ điện di hiệu dụng của 6 kháng sinh βLactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan<br /> tăng nhưng hiệu quả tách cũng không tốt.<br /> Theo dõi sự chênh lệch thời gian lưu (∆tR)<br /> của các cặp: CEP-AMP; PENG- OXA cho<br /> thấy quy luật biến đổi ∆tR theo nồng độ dung<br /> dịch đệm cũng không giống nhau (bảng 2).<br /> Nồng độ đệm 20mM, lực ion thấp hơn, giảm<br /> được dòng điện di, tăng sự hấp phụ của mẫu<br /> lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các<br /> chất tan nhanh hơn vì vậy hiệu quả tách kém,<br /> hai pic của CEP và AMP dính vào nhau.<br /> Chúng tôi chọn nồng độ 15mM đệm Borat là<br /> điều kiện tối ưu.<br /> <br /> Bảng 1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam<br /> pH<br /> t0<br /> 7,2<br /> 6,253<br /> Khoảng cách 2 pic, ∆tR<br /> 7,0<br /> 6,960<br /> Khoảng cách 2 pic ,∆tR<br /> 6,8<br /> 7,368<br /> Khoảng cách 2 pic, ∆tR<br /> 6,5<br /> 7,594<br /> Khoảng cách 2 pic, ∆tR<br /> <br /> Thời gian di chuyển của β-Lactam, phút<br /> AMO<br /> PENG<br /> OXA<br /> CLO<br /> 7,889<br /> 10,283<br /> 10,699<br /> 11,717<br /> 0,416<br /> 1,018<br /> 0,731<br /> 0,306<br /> 8,896<br /> 11,345<br /> 11,613<br /> 12,612<br /> 0,268<br /> 0,999<br /> 0,792<br /> 0,568<br /> 9,466<br /> 12,342<br /> 12,908<br /> 14,229<br /> 0,566<br /> 1,321<br /> 0,564<br /> 0,732<br /> 9,505<br /> 12,536<br /> 13,160<br /> 14,622<br /> 0,624<br /> 1,362<br /> 1,345<br /> 0,805<br /> <br /> CEP<br /> 12,448<br /> <br /> AMP<br /> 12,754<br /> <br /> 13,404<br /> <br /> 13,972<br /> <br /> 14,793<br /> <br /> 15,525<br /> <br /> 15,967<br /> <br /> 16,772<br /> <br /> 296<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 89(01/2): 295 – 299<br /> <br /> Bảng 2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu (phút)<br /> Nồng độ<br /> đệm<br /> <br /> t0<br /> 10 mM<br /> 6,958<br /> ∆tR của 2 β-Lactam<br /> 15 mM<br /> 7,363<br /> ∆tR của 2 β-Lactam<br /> 20 mM<br /> 7,403<br /> ∆tR của 2 β-Lactam<br /> 25 mM<br /> 7,505<br /> ∆tR của 2 β-Lactam<br /> <br /> AMO<br /> 8,896<br /> 9,375<br /> 9,576<br /> 10,012<br /> <br /> Thời gian di chuyển của β-Lactam, phút<br /> PENG<br /> OXA<br /> CLO<br /> 11,345<br /> 11,613<br /> 12,612<br /> 0,268<br /> 12,087<br /> 12,881<br /> 14,178<br /> 0,794<br /> 12,238<br /> 12,542<br /> 14,231<br /> 0,304<br /> 12,879<br /> 12,932<br /> 15,375<br /> 0,053<br /> <br /> CEP<br /> 13,404<br /> 0,586<br /> 14,990<br /> 0,835<br /> 16,013<br /> 0,069<br /> 16,873<br /> 0,061<br /> <br /> AMP<br /> 13,972<br /> 15,825<br /> 16,082<br /> 16,934<br /> <br /> Hình 2. Sắc đồ điện di của 6 kháng sinh họ β-lactam tại điều kiện tối ưu: pH = 6,8; 15 mM đệm borat,<br /> 75 mM SDS, thế 22 kV, nhiệt độ mao quản 250C, bơm mẫu 8s, nồng độ các chất 2µg/ml. Thứ tự các<br /> chất: 1- AMO; 2- PENG; 3-OXA; 4-CLO; 5-CEP và 6- AMP<br /> <br /> Khảo sát ảnh hưởng của thế điện di và các<br /> điều kiện khác<br /> Khi tăng thế điện từ 18kV đến 25kV thì thời<br /> gian di chuyển của các β-Lactam càng giảm<br /> do độ linh động điện di tỷ lệ thuận với thế.<br /> Mặt khác thế càng cao, nhiệt sinh ra trong<br /> mao quản càng tăng, làm cho sự chênh lệch<br /> nhiệt độ giữa thành mao quản và trong lòng<br /> của nó, dẫn đến độ nhớt chênh lệch đây chính<br /> là nguyên nhân làm giảm hiệu quả tách. Tại<br /> thế 18kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt,<br /> nhưng thời gian lưu lớn (20,6 phút cho AMP),<br /> nhưng thế 25kV thời gian lưu ngắn hơn<br /> nhưng hiệu quả tách kém hơn, pic CEP và<br /> CLO dính chân vào nhau. Vì vậy chúng tôi<br /> chọn thế tại 22kV là phù hợp nhất để tách các<br /> β-Lactam.<br /> Để có được píc rõ ràng và độ hấp thụ píc cao<br /> nhất thì thời gian bơm mẫu cần 8s cho nồng<br /> độ từ 0,2- 15 µg/ml ,nồng độ SDS 75mM,<br /> nhiệt độ mao quản 250C<br /> <br /> Đánh giá phương pháp phân tích.<br /> Tiến hành lập đường chuẩn của 6 chất kháng<br /> sinh β-lactam tại các nồng độ khác nhau: với<br /> AMO, CEP, CLO thì nồng độ khảo sát từ 0,210µg/ml còn các chất AMP, OXA và PEN-G<br /> nồng độ khảo sát từ 0,3-10µg/ml. Mỗi nồng<br /> độ được đo lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung<br /> bình. Sử dụng origin 8.0 xử lý, kết quả thu<br /> được trình bày ở bảng 3.<br /> Để đánh giá độ chính xác của phương pháp<br /> phân tích, chúng tôi tiến hành chọn 3 mẫu<br /> tương ứng với điểm đầu, điểm giữa và điểm<br /> cuối của khoảng tuyến tính đó là 1µg/ml;<br /> 5µg/ml và 10µg/ml. Tiến hành đo các mẫu<br /> trên với điều kiện tối ưu, mỗi mẫu đo lặp lại 5<br /> lần. Kết quả cho thấy độ chính xác nằm trong<br /> giới hạn cho phép
ADSENSE

CÓ THỂ BẠN MUỐN DOWNLOAD

 

Đồng bộ tài khoản
2=>2