Khảo sát các điều kiện tối ưu xây dựng quy trình tách và xác định đồng thời một số kháng sinh họ b - lactam bằng phương pháp điện di

Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 89(01/2): 295 – 299<br /> <br /> KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁCH VÀ XÁC ĐỊNH<br /> ĐỒNG THỜI MỘT SỐ KHÁNG SINH HỌ β-LACTAM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI<br /> Nguyễn Thị Ánh Tuyết1, Nguyễn Văn Ri2<br /> 1<br /> <br /> Trường Đại học Y Dược – Đại học Thái Nguyên<br /> 2<br /> Đại học quốc gia Hà Nội<br /> <br /> TÓM TẮT<br /> Trong nghiên cứu, thiết lập điều kiện để tách các kháng sinh họ β – lactam bởi sắc ký điện di mao<br /> quản . Được thực hiện trên hệ thống điện di 1602A 3D của hãng Agilent, mao quản có lớp phủ<br /> silica với chiều dài 75,5cm. Sử dụng dung dịch đệm Natritetraborat 15mM với 75mM SDS, pH=<br /> 6,8: Amocillin; Ampicillin; Cloxacilin; Cephacilin; Oxacillin và Penicillin-G trong đó Ampicilin<br /> được tách ra ở 16 phút. Giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp là ≤ 0,7 µg/ml cho mỗi kháng<br /> sinh. Rồi áp dụng phương pháp này để xác định trong mẫu dược phẩm với độ thu hồi từ 94,2105,8%.<br /> Từ khóa: Mao mạch phát hiện giới hạn, phục hồi<br /> <br /> MỞ ĐẦU<br /> β- lactam được dùng như các thuốc kháng<br /> khuẩn từ hơn 80 năm nay mà vẫn là một<br /> nhóm quan trọng của kháng sinh. Mỗi loại<br /> kháng sinh lại có tác dụng nhất định, có thể<br /> hạn chế hay tiêu diệt được mầm bệnh trong y<br /> học, chăn nuôi hay sản xuất[1]. Tuy nhiên<br /> liều lượng của nó cũng để lại hậu quả rất lớn<br /> đối với sức khỏe của con người, do đó việc<br /> xác định hàm lượng kháng sinh là rất cần<br /> thiết. Bên cạnh kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng<br /> cao, điện di mao quản cũng là một kỹ thuật<br /> đầy triển vọng để tách các chất phân tích có<br /> mang điện tích cũng như trung tính và được<br /> ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau.<br /> Trong những năm gần đây phương pháp này<br /> đã thu hút rất nhiều nhà khoa học bởi những<br /> ưu điểm nổi bật như kỹ thuật dể sử dụng, tính<br /> linh hoạt cao, tiết kiệm hóa chất và khả năng<br /> tách tốt hơn nữa phương pháp cũng cho độ tin<br /> cậy cao[2,3].<br /> <br /> Trong nghiên cứu này, chúng tôi công bố điều<br /> kiện tách và xác định một số kháng sinh họ β<br /> – lactam bằng phương pháp điện di mao quản<br /> điện động học kiểu mixen(dùng mao quản<br /> Highsensitip).<br /> PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU<br /> Phương pháp tách và xác định các β-Lactam<br /> sử dụng chất hoạt động bề mặt, sodium<br /> dodecyl sunfate- SDS làm pha tĩnh, là các<br /> mixen mang điện tích âm, còn gọi là các pha<br /> tĩnh giả. Các mixen mang tính anion, được<br /> pha chế trong dung dịch đệm, chứa trong mao<br /> quản hẹp bằng silic, có đường kính 50 µm.<br /> Áp vào hai đầu mao quản trường điện áp cao<br /> (10-30KV), khi đó dung dịch đệm di chuyển<br /> từ cực dương sang cực âm, các mixen cũng di<br /> chuyển về phía cực âm nhưng có tốc độ khác<br /> với tốc độ dung dịch đệm. Các mixen có chức<br /> năng hấp thu các chất phân tích ở mức độ<br /> khác nhau tùy thuộc vào tính tương tự về độ<br /> phân cực giữa các mixen và từng chất phân tích.<br /> <br /> Hình 1. Tách các β-Lactam bằng phương pháp MEKC*<br /> *<br /> <br /> 295<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> Nhờ sự phân bố khác nhau, các β-Lactam di<br /> chuyển với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau.<br /> Điều kiện rất quan trọng là giá trị pH, nồng<br /> độ đệm, thế điện di để phương pháp tách có<br /> hiệu quả cao nhất.<br /> THỰC NGHIỆM<br /> Thiết bị và hóa chất<br /> - Máy điện di model 1602A của hãng Agilent,<br /> HP3D, detector DAD, mao quản silica trần<br /> d=50µm, chiều dài 75.5 cm, hiệu dụng 70 cm.<br /> - Axít Boric H3BO3, muối natri tetraborat<br /> Na2B4O7.10H2O, chất hoạt động bề mặt SDS,<br /> NaOH … của hãng Merk. Nước deion được<br /> lọc qua giấy lọc 0.45µm của hãng Millipore.<br /> Các chất chuẩn: amoxicillin – AMO,<br /> ampicillin – AMP, penicillin G – PENG,<br /> oxacillin – OXA, cloxacillin – CLO,<br /> cephalexin – CEP, do Viện kiểm nghiệm Bộ<br /> Y tế cung cấp<br /> Nghiên cứu điều kiện tách các β- Lactam<br /> bằng phương pháp điện di.<br /> Ảnh hưởng pH của dung dịch đệm điện di đến<br /> khả năng tách các β- Lactam<br /> Nghiên cứu này, ảnh hưởng của pH trong<br /> dung dịch đệm điện di được khảo sát với<br /> dung dịch điện di chứa các chất kháng sinh<br /> cùng nồng độ 2 µg/ml, 15mM đệm Borat +<br /> 75mM SDS. Mao quản được đặt ở nhiệt độ<br /> 280C, điện áp phân cực 22kV. Mẫu được bơm<br /> ở áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 10s.<br /> Các giá trị pH thay đổi là 6,5; 6,8; 7,0; 7,2.<br /> Trong nghiên cứu này, cặp CEP-AMP có ∆t<br /> giảm dần theo chiều tăng của pH, cặp OXACLO có ∆t thay đổi không đáng kể. Sự thay<br /> đổi pH làm thay đổi lớp điện kép của thành<br /> mao quản, do đó làm ảnh hưởng đến sự điện<br /> di của các chất.<br /> <br /> 89(01/2): 295 – 299<br /> <br /> Như vậy tăng pH của dung dịch đệm, rút ngắn<br /> thời gian phân tích, tuy nhiên khả năng tách<br /> giảm, nên phải chọn một giá tri pH phù hợp.<br /> Ở pH = 6,5 các β- Lactam tách tốt nhưng có<br /> một píc nhỏ dính vào píc của PEN-G làm cho<br /> diện tích của píc không chính xác nên chúng<br /> tôi chọn pH = 6,8 để tách các β-Lactam trong<br /> những nghiên cứu tiếp theo. Khảo sát ảnh<br /> hưởng của nồng độ đệm.<br /> Chất điện ly trong pha động cũng có vai trò<br /> quan trọng vì nó là chất dẫn điện, tạo dòng<br /> điện di thẩm thấu. Trong thực tế, người ta cố<br /> gắng chọn chất đệm pH cũng đồng thời chính<br /> là chất điện giải của sắc ký điện di. Chúng tôi<br /> chọn Natritetraborat vừa là chất đệm pH vừa<br /> là chất điện giải.<br /> Khảo sát nồng độ đệm tại 4 gía trị là 10mM;<br /> 15mM; 20 mM; 25mM với 75mM SDS, pH =<br /> 6,8. Thế điện di 22kV, bơm mẫu áp suất<br /> 50mbar, thời gian bơm mẫu 8s, nhiệt độ mao<br /> quản 250C Các chất kháng sinh cùng nồng độ<br /> 1µg/ml. Kết quả cho thấy tăng nồng độ đệm<br /> thì độ điện di hiệu dụng của 6 kháng sinh βLactam càng tăng, thời gian lưu của chất tan<br /> tăng nhưng hiệu quả tách cũng không tốt.<br /> Theo dõi sự chênh lệch thời gian lưu (∆tR)<br /> của các cặp: CEP-AMP; PENG- OXA cho<br /> thấy quy luật biến đổi ∆tR theo nồng độ dung<br /> dịch đệm cũng không giống nhau (bảng 2).<br /> Nồng độ đệm 20mM, lực ion thấp hơn, giảm<br /> được dòng điện di, tăng sự hấp phụ của mẫu<br /> lên thành mao quản, tốc độ di chuyển của các<br /> chất tan nhanh hơn vì vậy hiệu quả tách kém,<br /> hai pic của CEP và AMP dính vào nhau.<br /> Chúng tôi chọn nồng độ 15mM đệm Borat là<br /> điều kiện tối ưu.<br /> <br /> Bảng 1. Khảo sát ảnh hưởng của pH đến thời gian di chuyển của β-Lactam<br /> pH<br /> t0<br /> 7,2<br /> 6,253<br /> Khoảng cách 2 pic, ∆tR<br /> 7,0<br /> 6,960<br /> Khoảng cách 2 pic ,∆tR<br /> 6,8<br /> 7,368<br /> Khoảng cách 2 pic, ∆tR<br /> 6,5<br /> 7,594<br /> Khoảng cách 2 pic, ∆tR<br /> <br /> Thời gian di chuyển của β-Lactam, phút<br /> AMO<br /> PENG<br /> OXA<br /> CLO<br /> 7,889<br /> 10,283<br /> 10,699<br /> 11,717<br /> 0,416<br /> 1,018<br /> 0,731<br /> 0,306<br /> 8,896<br /> 11,345<br /> 11,613<br /> 12,612<br /> 0,268<br /> 0,999<br /> 0,792<br /> 0,568<br /> 9,466<br /> 12,342<br /> 12,908<br /> 14,229<br /> 0,566<br /> 1,321<br /> 0,564<br /> 0,732<br /> 9,505<br /> 12,536<br /> 13,160<br /> 14,622<br /> 0,624<br /> 1,362<br /> 1,345<br /> 0,805<br /> <br /> CEP<br /> 12,448<br /> <br /> AMP<br /> 12,754<br /> <br /> 13,404<br /> <br /> 13,972<br /> <br /> 14,793<br /> <br /> 15,525<br /> <br /> 15,967<br /> <br /> 16,772<br /> <br /> 296<br /> <br /> Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên<br /> <br /> http://www.lrc-tnu.edu.vn<br /> <br /> Nguyễn Thị Ánh Tuyết và Đtg<br /> <br /> Tạp chí KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ<br /> <br /> 89(01/2): 295 – 299<br /> <br /> Bảng 2. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đệm tới thời gian lưu (phút)<br /> Nồng độ<br /> đệm<br /> <br /> t0<br /> 10 mM<br /> 6,958<br /> ∆tR của 2 β-Lactam<br /> 15 mM<br /> 7,363<br /> ∆tR của 2 β-Lactam<br /> 20 mM<br /> 7,403<br /> ∆tR của 2 β-Lactam<br /> 25 mM<br /> 7,505<br /> ∆tR của 2 β-Lactam<br /> <br /> AMO<br /> 8,896<br /> 9,375<br /> 9,576<br /> 10,012<br /> <br /> Thời gian di chuyển của β-Lactam, phút<br /> PENG<br /> OXA<br /> CLO<br /> 11,345<br /> 11,613<br /> 12,612<br /> 0,268<br /> 12,087<br /> 12,881<br /> 14,178<br /> 0,794<br /> 12,238<br /> 12,542<br /> 14,231<br /> 0,304<br /> 12,879<br /> 12,932<br /> 15,375<br /> 0,053<br /> <br /> CEP<br /> 13,404<br /> 0,586<br /> 14,990<br /> 0,835<br /> 16,013<br /> 0,069<br /> 16,873<br /> 0,061<br /> <br /> AMP<br /> 13,972<br /> 15,825<br /> 16,082<br /> 16,934<br /> <br /> Hình 2. Sắc đồ điện di của 6 kháng sinh họ β-lactam tại điều kiện tối ưu: pH = 6,8; 15 mM đệm borat,<br /> 75 mM SDS, thế 22 kV, nhiệt độ mao quản 250C, bơm mẫu 8s, nồng độ các chất 2µg/ml. Thứ tự các<br /> chất: 1- AMO; 2- PENG; 3-OXA; 4-CLO; 5-CEP và 6- AMP<br /> <br /> Khảo sát ảnh hưởng của thế điện di và các<br /> điều kiện khác<br /> Khi tăng thế điện từ 18kV đến 25kV thì thời<br /> gian di chuyển của các β-Lactam càng giảm<br /> do độ linh động điện di tỷ lệ thuận với thế.<br /> Mặt khác thế càng cao, nhiệt sinh ra trong<br /> mao quản càng tăng, làm cho sự chênh lệch<br /> nhiệt độ giữa thành mao quản và trong lòng<br /> của nó, dẫn đến độ nhớt chênh lệch đây chính<br /> là nguyên nhân làm giảm hiệu quả tách. Tại<br /> thế 18kV và 20kV đạt hiệu quả tách tốt,<br /> nhưng thời gian lưu lớn (20,6 phút cho AMP),<br /> nhưng thế 25kV thời gian lưu ngắn hơn<br /> nhưng hiệu quả tách kém hơn, pic CEP và<br /> CLO dính chân vào nhau. Vì vậy chúng tôi<br /> chọn thế tại 22kV là phù hợp nhất để tách các<br /> β-Lactam.<br /> Để có được píc rõ ràng và độ hấp thụ píc cao<br /> nhất thì thời gian bơm mẫu cần 8s cho nồng<br /> độ từ 0,2- 15 µg/ml ,nồng độ SDS 75mM,<br /> nhiệt độ mao quản 250C<br /> <br /> Đánh giá phương pháp phân tích.<br /> Tiến hành lập đường chuẩn của 6 chất kháng<br /> sinh β-lactam tại các nồng độ khác nhau: với<br /> AMO, CEP, CLO thì nồng độ khảo sát từ 0,210µg/ml còn các chất AMP, OXA và PEN-G<br /> nồng độ khảo sát từ 0,3-10µg/ml. Mỗi nồng<br /> độ được đo lặp lại 3 lần và lấy kết quả trung<br /> bình. Sử dụng origin 8.0 xử lý, kết quả thu<br /> được trình bày ở bảng 3.<br /> Để đánh giá độ chính xác của phương pháp<br /> phân tích, chúng tôi tiến hành chọn 3 mẫu<br /> tương ứng với điểm đầu, điểm giữa và điểm<br /> cuối của khoảng tuyến tính đó là 1µg/ml;<br /> 5µg/ml và 10µg/ml. Tiến hành đo các mẫu<br /> trên với điều kiện tối ưu, mỗi mẫu đo lặp lại 5<br /> lần. Kết quả cho thấy độ chính xác nằm trong<br /> giới hạn cho phép