Khoá luận tốt nghiệp: Bước đầu nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su (Hevea brasiliensis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại tỉnh Bình Dương

Chia sẻ: _ _ | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:54

Thêm vào BST

Báo xấu

9
lượt xem 3
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Mục đích nghiên cứu của khoá luận "Bước đầu nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su (Hevea brasiliensis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại tỉnh Bình Dương" nhằm thăm dò điều kiện khử trùng và môi trường thích hợp để tạo cụm chồi cây Cao su (Hevea brasiliensis) trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khoá luận tốt nghiệp: Bước đầu nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su (Hevea brasiliensis) bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào tại tỉnh Bình Dương

TRƢỜNG ĐẠI HỌC THỦ DẦU MỘT KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (CAO ĐẲNG) NIÊN KHÓA 2011 – 2014 BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU VI NHÂN GIỐNG CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis) BẰNG PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO TẠI TỈNH BÌNH DƢƠNG Chuyên Ngành: SƢ PHẠM SINH HỌC Giáo viên hƣớng dẫn : ThS. PHAN VĂN THUẦN Sinh viên thực hiện : HUỲNH NGỌC ANH MSSV : 111C840002 Lớp : C11SH02 Bình Dƣơng, Tháng 05 Năm 2014
LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này trƣớc tiên em xin cảm ơn thầy giáo ThS. Phan Văn Thuần đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và động viên em trong suốt thời gian qua. Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo ThS. Nguyễn Thanh Thuận và bạn Nguyễn Thị Xuân Thùy đã đồng hành và giúp đỡ em. Em xin cảm ơn Trƣờng Đại học Thủ Dầu Một, khoa Khoa học Tự nhiên, bộ môn Sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi để khóa luận này đƣợc hoàn thành. Em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cô trong khoa Khoa học Tự nhiên, gia đình và các bạn sinh viên lớp C11SH02 đã động viên và giúp đỡ nhiệt tình trong suốt thời gian em thực hiện khóa luận này. Sinh viên thực hiện Huỳnh Ngọc Anh
NHẬN XÉT Của giáo viên hƣớng dẫn .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... Bình Dương, Ngày tháng năm 2014
NHẬN XÉT Của giáo viên phản biện .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... .................................................................................................................................................... Bình Dương, Ngày tháng năm 2014
MỤC LỤC MỤC LỤC ................................................................................................................. i DANH MỤC CÁC BẢNG ...................................................................................... iv DANH MỤC CÁC HÌNH ........................................................................................ v DANH MỤC BIỂU ĐỒ .......................................................................................... vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ............................................ vii MỞ ĐẦU.................................................................................................................. 1 1. Lý do chọn đề tài................................................................................................. 1 2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................... 2 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu ...................................................................... 2 4. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 3 5. Bố cục của đề tài ................................................................................................. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU.................................................................... 5 1.1. LƢỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ........................................... 5 1.2. NHỮNG ƢU ĐIỂM VÀ HẠN CHẾ CỦA NHÂN GIỐNG INVITRO ......... 10 1.2.1. Ƣu điểm của nhân giống vô tính in vitro .................................................... 10 1.2.2. Hạn chế của nhân giống vô tính in vitro ..................................................... 11 1.3. ỨNG DỤNG CỦA NHÂN GIỐNG INVTRO Ở MỘT SỐ CÂY CÔNG NGHIỆP ..................................................................................................... 12 1.4. VÀI NÉT VỀ CÂY CAO SU ........................................................................ 15 1.4.1. Đặc điểm chung của họ Cao su ................................................................... 15 1.4.2. Đặc điểm riêng của cây Cao su ................................................................... 17 1.4.2.1. Tên khoa học .......................................................................................... 17 1.4.2.2. Đặc tính thực vật .................................................................................... 17 1.4.2.3. Thành phần hóa học ............................................................................... 19 i
1.4.3. Giá trị kinh tế của cây Cao su ..................................................................... 20 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 22 2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ........................................................................... 22 2.1.1. Trang thiết bị và dụng cụ ............................................................................. 22 2.1.2. Vật liệu ........................................................................................................ 22 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................ 22 2.2.1. Phƣơng pháp nghiên cứu tài liệu ................................................................. 22 2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm ...................................... 23 2.2.2.1. Điều kiện và môi trƣờng nuôi cấy ............................................................ 23 2.2.2.2. Nghiên cứu khả năng khử trùng của mẫu................................................. 25 2.2.2.3. Nghiên cứu khả năng tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro .................... 26 2.2.3. Phƣơng pháp xử lý thống kê số liệu ............................................................ 28 Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN................................ 29 3.1. THÍ NGHIỆM 1: KHẢO SÁT KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ MỘT SỐ MẪU CÂY CAO SU ........................................................................................ 29 3.2. THÍ NGHIỆM 2: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG KHỬ TRÙNG TỪ CÀNH CỦA CÂY CAO SU .................................................................................. 31 3.3. THÍ NGHIỆM 3: NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÁT SINH CHỒI TỪ CÁC MẪU VẬT VÔ TRÙNG CỦA CÂY CAO SU...................................... 34 KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ ...................................................................... 39 ii
1. KẾT LUẬN ....................................................................................................... 39 2. KHUYẾN NGHỊ ............................................................................................... 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................... 40 iii
DANH MỤC CÁC BẢNG TT TÊN CÁC BẢNG TRANG 1. Bảng 2.1. Thành phần môi trƣờng cơ bản Murashige và Skoog (1962) ........................................................................................ 24 2. Bảng 3.1. Tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nƣớc javel) ...................................... 29 3. Bảng 3.2. Tỉ lệ (%) mẫu đƣợc vô trùng với chất khử trùng HgCl2 0,1% ở thời gian khác nhau............................................................ 32 4. Bảng 3.3. Khả năng phát sinh chồi từ các mẫu ở các môi trƣờng nuôi cấy .................................................................................................... 34 iv
DANH MỤC CÁC HÌNH TT TÊN CÁC HÌNH TRANG 1. Hình 3.1. Mẫu in vitro từ hạt cây cao su .................................................... 31 2. Hình 3.2. Mẫu chồi đỉnh và chồi nách vô trùng khi khử trùng bằng HgCl2 0,1% ....................................................................... 33 3. Hình 3.3. Chồi in vitro hình thành sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng MS .................................................................................... 36 4. Hình 3.4. Sự thích ứng của mẫu với môi trƣờng MS bổ sung 5 mg/L BAP + 5 mg/L IBA .......................................................... 37 5. Hình 3.5. Chồi in vitro hình thành từ chồi nách sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng MS bổ sung BAP 5mg/L + IBA 5mg/L ............ 38 v
DANH MỤC BIỂU ĐỒ TT TÊN BIỂU ĐỒ TRANG 1. Biểu đồ 3.1. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ phần trăm (%) hiệu quả khử trùng của mẫu với các chất khử trùng ( HgCl2 0,1% và nƣớc javel) ......... 30 vi
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ABA : Abscisis acid BA : N6-Benzyl adenine BAP : Benzyl amino purine cs : cộng sự DNA : Deoxyribonucleotid acid IBA : Indole-3-butyric acid MS : Murashige và Skoog (1962) NAA :  - naphthaleneacetic acid IAA :  -indolacetic acid 2,4-D : 2,4-D dichlorophenoxy acetic acid TDZ : Thidiazuron vii
MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Nuôi cấy mô và tế bào thực vật là một lĩnh vực bao gồm nhiều kỹ thuật khác nhau trong nuôi cấy in vitro nhƣ: Nuôi cấy phôi, cơ quan, tế bào và protoplast. Việc ra đời của các kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mở ra một hƣớng mới cho nghiên cứu thực vật, nó nhanh chóng dành đƣợc một vị trí quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học về sản xuất và cải thiện giống cây trồng [24]. Kỹ thuật nhân giống in vitro không chỉ ứng dụng để nhân giống và phục tráng cây trồng mà nó còn đem lại hiệu quả kinh tế cao trong việc nhân nhanh và tạo ra một số lƣợng lớn cây con đồng đều, sạch bệnh, đặc biệt là còn giữ đƣợc tính trạng quý của bố mẹ và cho phép chủ động cung cấp nguồn giống cũng nhƣ vật liệu vô trùng cho các thí nghiệm [16]. Cho đến nay, có nhiều đối tƣợng cây công nghiệp đã đƣợc nhân giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào và thu đƣợc nhiều kết quả đáng kể nhƣ: Cây cà phê, cây tiêu, cây chè… Cây Cao su (Hevea brasiliensis), là một loài cây thân gỗ thuộc về họ Đại kích (Euphorbiaceae) và là thành viên có tầm quan trọng kinh tế lớn nhất trong chi Hevea. Nó có tầm quan trọng kinh tế lớn là do chất lỏng chiết ra tựa nhƣ nhựa cây của nó (gọi là nhựa mủ-latex) có thể đƣợc thu thập lại nhƣ là nguồn chủ lực trong sản xuất cao su tự nhiên [34]. Cây Cao su là loài cây thân gỗ, có thể cao tới trên 30 m. Nhựa hay mủ màu trắng có trong các mạch ở vỏ cây. Cây đạt độ tuổi 5-6 năm thì ngƣời ta bắt đầu thu hoạch mủ. Cho năng suất cao nhất trong độ tuổi từ 11 đến 25, sẽ ngừng sản sinh mủ khi đạt độ tuổi 26-32 năm. Ngoài ra, gỗ cao su còn đƣợc dùng sản xuất đồ gỗ, đƣợc xem là loại gỗ thân thiện với môi trƣờng vì chỉ đƣợc khai thác khi cây kết thúc chu trình sinh mủ [36]. 1
Cây Cao su không những mang lại giá trị kinh tế cao cho ngƣời dân tỉnh Bình Dƣơng mà còn là một lợi thế xuất khẩu của Việt Nam. Nhƣng mặc khác chất lƣợng giống cây Cao su ở Việt Nam còn chƣa cao và chƣa phù hợp với điều kiện khí hậu ở nƣớc ta, bên cạnh đó sâu bệnh phá hoại, các phƣơng pháp nhân giống chủ yếu là truyền thống làm cho mầm bệnh cây Cao su truyền từ thế hệ này qua thế hệ khác, chất lƣợng cây con không đồng đều… Xuất phát từ tiềm năng to lớn và những hạn chế gặp phải, chúng tôi đề xuất đề tài: “Bƣớc đầu nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su (Hevea brasiliensis ) bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào tại tỉnh Bình Dƣơng.” 2. Mục tiêu đề tài Thăm dò điều kiện khử trùng và môi trƣờng thích hợp để tạo cụm chồi cây Cao su (Hevea brasiliensis) trong phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào thực vật. 3. Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu 3.1. Đối tƣợng và nguồn mẫu nghiên cứu Đối tƣợng nghiên cứu là cây Cao su (Hevea brasiliensis) thuộc: Họ: Euphorbiaceae Bộ: Euphorbiales Lớp: Dicotyledonae Ngành: Angiospermatophyta [20]. Nguồn mẫu nghiên cứu đƣợc lấy từ các hộ nông dân trồng cây Cao su tại huyện Tân Uyên, tỉnh Bình Dƣơng. 3.2. Phạm vi nghiên cứu Bƣớc đầu nghiên cứu điều kiện khử trùng và khả năng tạo cụm chồi của cây Cao su. 2
Khóa luận đƣợc tiến hành trong thời gian từ tháng 11 năm 2013 đến tháng 05 năm 2014 tại phòng thí nghiệm bộ môn Sinh học, trƣờng Đại học Thủ Dầu Một. 4. Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất khử trùng HgCl2 0,1%, dung dịch javel với các thời gian khác nhau lên chồi đỉnh, chồi nách, hạt của cây Cao su. Nghiên cứu ảnh hƣởng của môi trƣờng MS bổ sung các chất điều hòa sinh trƣởng khác nhau lên khả năng tạo cụm chồi in vitro của mẫu. 5. Bố cục của khóa luận Bố cục của khóa luận gồm các phần sau: - Mở đầu (4 trang) Phần này gồm các nội dung: Lý do chọn đề tài, mục tiêu đề tài, đối tƣợng phạm vi nghiên cứu, nội dung nghiên cứu và bố cục của khóa luận. - Chƣơng 1. Tổng quan tài liệu (17 trang) Trong chƣơng này, chúng tôi trình bày các cơ sở lý thuyết và tình hình nghiên cứu liên quan đến nội dung khóa luận. Gồm các nội dung: Lƣợc sử phát triển của nuôi cấy mô và tế bào thực vật, những ƣu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro, ứng dụng của nhân giống in vitro ở một số cây công nghiệp và vài nét về cây cao su. - Chƣơng 2. Vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu (7 trang) Chúng tôi trình bày về vật liệu và phƣơng pháp nghiên cứu bao gồm: Trang thiết bị, dụng cụ và vật liệu nghiên cứu, phƣơng pháp nghiên cứu tài liệu, phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, phƣơng pháp xử lý thống kê số liệu. - Chƣơng 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận (10 trang) Trong chƣơng này, các kết quả nghiên cứu đƣợc trình bày và thảo luận. Chúng tôi trình bày các nội dung sau: 3
+ Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng khử trùng từ một số mẫu cây Cao su và thảo luận. + Thí nghiệm 2: Nghiên cứu khả năng khử trùng từ cành của cây Cao su và thảo luận. + Thí nghiệm 3: Nghiên cứu khả năng phát sinh chồi từ các mẫu vật vô trùng của cây Cao su và thảo luận. - Kết luận và khuyến nghị (1 trang) Ở phần này, chúng tôi rút ra những kết luận trên cơ sở của kết quả nghiên cứu. Đồng thời, chúng tôi cũng đƣa ra những khuyến nghị cho việc tiếp tục nghiên cứu vi nhân giống cây Cao su. - Tài liệu tham khảo (4 trang) Phần này, chúng tôi liệt kê các tài liệu tham khảo gồm có: Tài liệu tiếng việt, tài liệu nƣớc ngoài và tài liệu internet. 4
Chƣơng 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. LƢỢC SỬ PHÁT TRIỂN CỦA NUÔI CẤY MÔ VÀ TẾ BÀO THỰC VẬT Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật là quá trình nuôi cấy vô trùng in vitro các bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật nhanh chóng đi vào thực tiễn cuộc sống. Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật đƣợc bao hàm trong ứng dụng của Công nghệ Sinh học. Nó bao gồm nhân giống và nhân nhanh giống, sản xuất sinh khối các sản phẩm sinh hóa, sản xuất và chuyển hóa sinh học các dƣợc liệu tự nhiên, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý, cải thiện và tạo giống cây trồng, nghiên cứu bệnh học thực vật, làm sạch virus…[16]. Năm 1838, hai nhà sinh học ngƣời Đức là Schleiden và Schwann đã chính thức xây dựng học thuyết tế bào. Học thuyết tế bào khẳng định: Mỗi cơ thể động thực vật đều bao gồm những thể tồn tại độc lập, riêng rẽ và tách biệt, đó chính là tế bào [29]. Năm 1898, Haberlandt tiến hành nuôi cấy tế bào đơn, các tế bào này tách từ nhu mô lá, tƣợng tầng của tầng biểu bì và lông hút của nhiều loài thực vật, kết quả thu đƣợc là không thành công [23]. Năm 1902, Haberlandt để chứng minh cho tính toàn năng của tế bào ông đã đề xƣớng ra phƣơng pháp nuôi cấy tế bào thực vật. Theo ông, mỗi một tế bào bất kỳ của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh. Điều đó, theo kiến thức sinh học hiện đại có nghĩa là: Mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ toàn bộ lƣợng thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật đó và nếu gặp điều kiện thích hợp thì mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh. Tuy nhiên, Haberlandt đã không thành công trong thí nghiệm chứng minh 5
chứng tính toàn năng của tế bào do bởi ông đã chọn cây Một lá mầm là đối tƣợng rất khó nuôi cấy, mặt khác do ông lại dùng các tế bào đã mất hết khả năng tái sinh. Một nguyên nhân khác nữa của sự thất bại là do vào thời kỳ đó những hiểu biết khoa học về nhu cầu dinh dƣỡng của mô thực vật còn hạn chế nên ông đã không tìm ra đƣợc môi trƣờng dinh dƣỡng tối thích hợp cho sự phân chia tế bào [1], [16], [23]. Phải mất hàng chục năm sau mới có những thí nghiệm thành công để chứng minh cho khả năng tồn tại và phát triển độc lập của tế bào. Nỗi bật là các công trình sau: Năm 1922, Kotte và cs. đã nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng tách từ đầu rễ của một cây hòa thảo và đã tạo đƣợc một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Nhƣng sau một thời gian ngắn thì hệ rễ này sinh trƣởng chậm dần và ngừng lại [23], [32]. Đến năm 1934, White đã nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ Cà chua (Lycopersicum esculentum) trên một môi trƣờng lỏng chứa muối khoáng, glucose và nƣớc chiết nấm men. Năm 1937, ông phát hiện tầm quan trọng của các vitamin thuộc nhóm B là B1, B6 và PP để thay thế cho dịch chiết nấm men và thấy rằng việc thay thế này hoàn toàn phù hợp. Từ đó việc nuôi cấy đầu rễ trong thời gian vô hạn đã đƣợc tiến hành ở nhiều cây khác nhau. Cùng lúc với White, Gautheret cũng đã thu đƣợc kết quả phân chia các tế bào của tầng sinh gỗ ở cây liễu [16], [23]. Năm 1939, Nobécourt và Gautheret đã thành công trong việc duy trì sự sinh trƣởng trong thời gian vô hạn của mô sẹo Cà rốt (Daucus carota) bằng cách cấy chuyền đều đặn 6 tuần một lần. Lúc này, White đã thành công tƣơng tự với cây thuốc lá. Kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật đƣợc khai sinh từ đó [17]. Từ năm 1941 – 1954, những phát hiện về vai trò của các chất kích thích sinh trƣởng nhƣ IAA, NAA, 2,4-D, kinetin và vai trò của các vitamin, nƣớc dừa là tiền 6
đề kỹ thuật cho việc làm thí nghiệm ổn định, dẫn đến các giai đoạn tiếp theo của kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào [31]. Năm 1951, Nitsch đã khắc phục đƣợc tính không giao hợp tiền giao tử khi nghiên cứu và thành công trong nuôi cấy mô quả bầu non, cà chua, dƣa chuột và lần đầu tiên tạo đƣợc hạt trong quả cà chua in vitro có khả năng nảy mầm (hạt có sức sống). Sau này có rất nhiều nhà khoa học thành công trong nuôi cấy hạt phấn, các quá trình sinh trƣởng của ống phấn, thụ tinh và tạo thành quả trong điều kiện in vitro [19]. Năm 1953, Miller và Skoog tạo đƣợc rễ từ mãnh mô cắt từ thân cây Thuốc lá (Nicotiana tabacum). Đến năm 1957, hai ông công bố kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của tỷ lệ kinetin/auxin trong môi trƣờng nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo thuốc lá. Khi giảm tỉ lệ kinetin/auxin mô sẹo có khuynh hƣớng phát triển rễ, ngƣợc lại nếu tỉ lệ này tăng thì dẫn đến sự tạo chồi ở mô sẹo. Hiện tƣợng này đƣợc xác nhận trên nhiều đối tƣợng thực vật khác nhau và đóng góp rất lớn vào việc điều khiển sinh trƣởng, phát triển, phát sinh cơ quan của mô tế bào trong nuôi cấy [16], [17], [29], [32]. Năm 1958, Reinert và Steward tạo đƣợc phôi và cây cà rốt hoàn chỉnh từ tế bào đơn nuôi cấy trong dung dịch [30]. Năm 1960, Cooking ở Đại học Nottingham (Anh) lần đầu tiên đã tách đƣợc tế bào trần (protoplast) khi dùng enzyme cellulose để phân hủy vỏ cellulose của tế bào thực vật. Cũng trong năm 1960, Bergman thành công trong việc thu một số dung dịch huyền phù không có các tế bào kết cụm mà gồm hầu hết các tế bào đơn. Các tế bào này có thể gieo trên môi trƣờng, trong các hộp lồng, nó sẽ tiếp tục sống, phân chia và tái tạo lại mô sẹo [16], [17]. Năm 1962, Kante và cs. thông báo về khả năng thụ phấn trong điều kiện in vitro của cây Thuốc phiện (Papaver somniferum) [2]. 7
Năm 1964, Guha và cs. thu đƣợc phôi trƣởng thành từ nuôi cấy bao phấn cây Cà độc dƣợc (Datura inoxia). Năm 1966, ông tạo thành công cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn cây Cà độc dƣợc. Năm 1967, nhóm Bourgin và Nitsch lại thành công khi tạo cây đơn bội từ túi phấn thuốc lá. Những thành công này đã khiến giới khoa học bắt đầu chú ý đến việc tạo cây đơn bội thông qua nuôi cấy túi phấn và hạt phấn. Việc này đã đóng góp rất nhiều kiến thức cho lĩnh vực di truyền thực vật và thực tiễn chọn giống [29]. Năm 1966, Morel hoàn thành quy trình nhân nhanh cây hoa lan thuộc chi Cymbidium. Ý tƣởng của ông đƣợc thai nghén từ năm 1960 khi ông ngẫu nhiên quan sát sự sinh trƣởng và phát triển của chồi ngọn cây hoa lan trong lúc cố tìm cách để làm sạch bệnh cây hoa lan giống bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật [2]. Năm 1970, Nagata và Takebe đã sử dụng kỹ thuật tế bào của Bergman để nuôi cấy protoplast của lá cây thuốc lá và tái sinh đƣợc cây hoàn chỉnh. Cho đến nay, kỹ thuật protoplast đã đƣợc thực tế xác nhận sau nhiều công bố lai thành công giữa các loài, một việc không thể thực hiện đƣợc bằng lai hữu tính cổ điển. Protoplast giúp sự nghiên cứu hiện tƣợng nhiễm sắc thể hòa hợp của các tế bào khác loài sau khi dung hợp, giúp cho việc nghiên cứu vai trò của các DNA trong các cơ quan tử và quan hệ của chúng với DNA trong phân bào. Tính đến ngày 1/1/1985 kỹ thuật dung hợp protoplast đã thu đƣợc 104 trƣờng hợp lai, bao gồm con lai trong loài, con lai giữa các loài, con lai giữa các chi và con lai giữa các chi phụ. Đến năm 1995, con số trên đã gấp hai lần. Điều đó chứng tỏ kỹ thuật dung hợp protoplast đã trợ giúp rất hiệu quả cho công tác chọn tạo giống [16], [17]. Từ năm 1972 đến 1977, Melchers đã đƣa ra những cải tiến mới về phƣơng pháp nuôi cấy bao phấn và túi phấn để nhận đƣợc cây con đơn bội với số lƣợng lớn và đƣa ra các luận điểm cần phải gắn phƣơng pháp nuôi cấy mô, tế bào thực vật với các phƣơng pháp chọn giống khác [18]. 8
Từ năm 1980 đến nay là giai đoạn thành công của lĩnh vực công nghệ gene thực vật. Đó là kỹ thuật đƣa một gene cần thiết có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật hay một gene tổng hợp vào các giống cây trồng muốn cải tạo. Chỉ trong một thời gian ngắn một loạt phƣơng pháp đƣa gene ngoại lai vào thực vật đƣợc công bố. Sau khi đƣa đƣợc gene ngoại lai vào tế bào ngƣời ta sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật để nuôi cấy các tế bào đã đƣợc chuyển nạp. Sau đó cho tái sinh lại thành cây nguyên vẹn mang những đặc tính sinh học mới. Chúng sinh trƣởng, phát triển, ra hoa, kết hạt bình thƣờng và đƣợc coi nhƣ một giống cây trồng mới. Lĩnh vực công nghệ gene đã có những thành công to lớn không chỉ trên đối tƣợng thực vật mà còn thành công trên đối tƣợng động vật và vi sinh vật. Năm 1988, Toriyama thành công khi chuyển gene kháng bệnh vàng lụi (Tungro) vào protoplast lúa nhóm Japonica và tái sinh cây hoàn toàn từ protoplast chuyển gene. Năm 1991, Burbank đã thành công trong việc ghép gene miễn dịch đối với loài gián cánh cứng Colorado cho khoai tây đã đƣợc trồng thử ở một vài nơi ở Maine Oregar. Kết quả khoai tây có thể miễn dịch đặc biệt với loài gián cánh cứng [3], [16], [23]. Ở viện nghiên cứu Nông nghiệp Pháp (INRA), các nhà khoa học đã chuyển thành công gene Capsul vào cây thuốc lá. Các nhà khoa học của viện lúa Quốc tế (IRRI) đã chuyển thành công các gene khác nhau vào cây lúa, cụ thể là gene Bt (gene chống sâu đục thân ở lúa), gene Chitinase chống bệnh do nấm gây ra nhƣ đạo ôn, khô vằn. Các giống cây trồng chuyển gene hiện đang đƣợc khảo nghiệm và trồng trong điều kiện nhà kính tại Công ty Di truyền chọn giống và sản xuất hạt giống tại Bruxell (Bỉ). Ở Mỹ đã sản xuất hai loại cây trồng là cà chua cứng quả và bảo quản lâu hơn 45 ngày, loại thứ hai là giống ngô chống sâu đục thân và có năng suất cao. Thực vật chuyển gene thực tế đã trở thành hàng hóa trên thị trƣờng. Năm 1996, ngƣời ta đã ứng dụng cho trồng trọt khoảng 18.000 km2 từ Ả rập đến Bắc Mỹ và sản phẩm đƣợc đem bán trên thị trƣờng với những ƣu việt nhƣ bí ngô chống chịu đƣợc virus, khoai tây và bông không bị côn trùng phá hoại, bông và 9