Khóa luận tốt nghiệp đại học: Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic

Chia sẻ: Minh Nhân | Ngày: | Loại File: PDF | Số trang:70

Thêm vào BST

Báo xấu

25
lượt xem 5
download

Download Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ

Các nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic là rất cần thiết và tiềm năng trong việc phát hiện các chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn chất đầu và ít độc tính hơn. Khóa luận này tiến hành đề tài "Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic" nhằm góp phần vào việc nâng cao trình độ nghiên cứu của các cán bộ thực hiện trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ và hóa hợp chất thiên nhiên.

Chủ đề:

Bình luận(0) Đăng nhập để gửi bình luận!

Lưu

Nội dung Text: Khóa luận tốt nghiệp đại học: Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic

TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA HÓA HỌC ĐỖ THỊ HỘI TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA AXIT GAMBOGIC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Hóa học Hữu cơ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS. TRẦN THỊ THU THỦY HÀ NỘI, 2017
LỜI CẢM ƠN Khóa luận với đề tài: “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic” đƣợc thực hiện tại phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Em xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phạm Quốc Long và Ban lãnh đạo Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện cho em đƣợc học tập và sử dụng các thiết bị tiên tiến của viện để hoàn thành tốt các mục tiêu đề ra trong khóa luận của mình. Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS.Trần Thị Thu Thủy, cùng các anh - chị phòng Hóa sinh hữu cơ - Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên đã giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện khóa luận. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong khoa Hóa Học - Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tận tình dạy dỗ và chỉ bảo cho em trong suốt 4 năm học tập tại trƣờng. Trong quá trình thực hiện khóa luận, mặc dù đã hết sức cố gắng nhƣng chắc chắn sẽ không tránh khỏi những thiếu sót. Vì vậy, em kính mong nhận đƣợc sự đóng góp, chỉ bảo của các quý thầy cô và bạn bè. Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng 05 năm 2017 Sinh viên Đỗ Thị Hội
MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .......................................................................... 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU ................................... 3 1.1.1. Giới thiệu chi Garcinia ....................................................................... 3 1.1.2. Giới thiệu về cây Garcinia hanburyi................................................... 4 1.1.3. Axit gambogic (GA). ........................................................................... 8 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................. 12 1.2.1. ớp m ng .................................................................... 12 122 ột ................................................................................. 14 1.3. CÁC PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC ................................. 15 1 3 1 Phổ hối ượng M ........................................................................ 15 1.3.2. Phổ cộng từ hạt nhân ( NMR) ........................................................... 16 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM .................................................................... 18 2.1. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT ...................................... 18 2.1.1. Nguyên liệu....................................................................................... 18 2.1.2. Thiết bị ............................................................................................. 18 2.1.3. Dụng cụ và hóa chất ......................................................................... 18 2.2. CÁC QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM .................................................... 19 2.2.1.Phân lập axit gambogic ..................................................................... 19 2.2.2. Tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic ........................................ 20 2.2.3. Thử hoạt tính gây độc tế bào của axit gambogic và các dẫn xuất ..... 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 25 3.1. TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA AXIT GAMBOGIC ................... 25 3 1 1 Định hướng nghiên cứu .................................................................... 25 3.1.2. Kết quả tổng hợp các dẫn xuất ......................................................... 26
3.2. HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO IN VITRO CỦA AXIT GAMBOGIC VÀ CÁC DẪN XUẤT ........................................................ 34 KẾT LUẬN .................................................................................................. 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 38 PHỤ LỤC .................................................................................................... 43
DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Bản đồ phân bố cây Đằng hoàng .................................................. 4 Hình 1.2: Lá và quả Đằng hoàng ................................................................. 5 Hình 1.3: Nhựa Đằng hoàng dạng bột và dạng thỏi ..................................... 6 Hình 1.4. Một số hợp chất trong nhựa cây Đằng hoàng ............................... 7 Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của axit gambogic ............................................ 9 Hình 1.6: Bình giải ly bản mỏng ................................................................ 13 Hình 1.7: Sắc ký cột .................................................................................. 14 Hình 2.1: Cấu trúc hóa học của axit gambogic .......................................... 19 Hình 3.1: Cấu trúc hóa học và tinh thể của axit gambogic ......................... 25 Hình 3.2: Phản ứng chuyển hóa nhóm COOH của axit gambogic. ............. 27 Hình 3.3: Cấu trúc hóa học của hợp chất (2)............................................... 28 Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của axit gambogic ................................................ 28 Hình 3.5: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (2) ................................................... 29 Hình 3.6: Phổ 13C-NMR của axit gambogic ............................................... 29 Hình 3.7: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (2) .................................................. 30 Hình 3.8: Cấu trúc hóa học của hợp chất (3)............................................... 31 Hình 3.9: Phổ 1H-NMR của chất (3) .......................................................... 31 Hình 3.10: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (3) ................................................ 32 Hình 3.11: Cấu trúc hóa học của hợp chất (4) ............................................. 33 Hình 3.12: Phổ 1H-NMR của dẫn xuất (4) ................................................. 33 Hình 3.13: Phổ 13C-NMR của dẫn xuất (4) ................................................ 34
DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1: Hiệu suất phản ứng chuyển hóa của axit gambogic ..................... 34 Bảng 3.2: Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của axit gambogic và các dẫn xuất. .......................................................................................... 35 Bảng 3.3: Giá trị IC50 của axit gambogic và các dẫn xuất ............................ 35
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 13C-NMR : Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân Cacbon 13) 1H-NMR : Proton Magnetic Resonance Spectroscopy (Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân proton) COSY : 1H-1H Chemical Shift Correlation Spectroscopy (Phổ tƣơng tác hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H) DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer (Phổ DEPT) HMBC : Heteronuclear Multiple Bond Connectivity (Phổ tƣơng tác đa liên kết hai chiều trực tiếp dị hạt nhân) HSQC : Heteronuclear Single Quantum Coherence (Phổ tƣơng tác hai chiều trực tiếp dị hạt nhân) MS : Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng) HR-MS : Hight resolution Mass Spectroscopy (Phổ khối lƣợng phân giải cao) s: singlet q: quartet d: doublet dd: doublet doublet t: triplet dt: doublet triplet m: multiplet δH, δC : Độ chuyển dịch hóa học của proton và cacbon ppm : parts per million (phần triệu) CC : Column Chromatography (Sắc ký cột) TLC : Thin Layer Chromatography (Sắc ký lớp mỏng) Me : Nhóm metyl DCM : Diclomethane EtOAc : Etyl axetat
EtOH : Etylic MeOH : Methanol EDC : 1-Ethyl-3-3(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide DNAP : Dimetylaminopiridin GA : axit gambogic EGA1 : ethyl gambogate (2) DIALY.GA : N –diallyl-gambogamide (3) 3FGA : 1(4-trifuoromethylbenzene-piperazinyl)-gambogamide (4)
MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới nên đƣợc thừa hƣởng nguồn thiên nhiên vô cùng phong phú và đa dạng sinh học với nhiều loại dƣợc liệu quý. Theo số liệu thống kê gần đây, hệ thực vật Việt Nam có trên 10.000 loài trong đó có khoảng 3.200 loài cây đƣợc sử dụng trong Y học dân tộc [1]. Các hợp chất thiên nhiên thể hiện hoạt tính sinh học rất phong phú và là một trong những định hƣớng để con ngƣời có thể chiết, tách, tổng hợp tìm ra các loại thuốc mới chống lại bệnh tật, chất bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm cũng nhƣ các chế phẩm phục vụ nông nghiệp, chăn nuôi có hoạt tính sinh học cao mà không ảnh hƣởng đến môi trƣờng sinh thái. Cùng với sự phát triển của ngành sinh học phân tử, hóa học các hợp chất thiên nhiên đã và đang đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu. Tìm kiếm và phát hiện các chất có hoạt tính sinh học trong thảm thực vật Việt Nam, qua đó đƣa ra các giải pháp bảo tồn sự đa dạng sinh học của môi trƣờng xung quanh là một nhiệm vụ luôn đòi hỏi sự cố gắng của tất cả mọi ngƣời trong xã hội đặc biệt là các nhà khoa học. Tuy nhiên, phần lớn các cây cỏ đƣợc sử dụng làm thuốc chƣa đƣợc nghiên cứu đầy đủ và có hệ thống về mặt hóa học cũng nhƣ hoạt tính sinh học mà chủ yếu dựa trên kinh nghiệm dân gian.Vì vậy chƣa phát huy hết hiệu quả của nguồn tài nguyên quý giá này. Trong vô số các loài thực vật ở Việt Nam, có nhiều loài cây thuộc họ Guttiferae có giá trị sử dụng cao đƣợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh. Đặc biệt, trong số đó phải kể đến cây Đằng hoàng. Axit gambogic (GA) là thành phần chính mang lại hoạt tính đáng chú ý của nhựa cây Đằng hoàng. Mặc dù đƣợc phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 60 của thế kỷ trƣớc [2,3] nhƣng mãi đến năm 2004 hoạt tính ức chế sự phát triển và di căn của nhiều loại tế bào ung thƣ của axit gambogic 1
mới đƣợc giới khoa học chú ý nhƣ ung thƣ phổi, ung thƣ bạch cầu, ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ tụy, ung thƣ dạ dày, ung thƣ vú, ung thƣ ruột kết, ung thƣ não, ung thƣ gan… Từ đó đến nay, các nhà khoa học trên thế giới đã phân lập đƣợc axit gambogic có độ tinh từ 95-99 và có gần 200 bài báo khoa học đƣợc công bố về hoạt tính in vitro, in vivo, mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (QSAR), chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các kết quả thử lâm sàng của axit gambogic. Hiện nay, ở Việt Nam chƣa có nghiên cứu nào về vấn đề này đƣợc công bố. Trong khi đó, nƣớc ta lại là một trong những vùng đặc hữu mà nguồn nguyên liệu này sinh trƣởng tốt. Bởi vậy việc khai thác hoạt tính chống ung thƣ từ nhựa cây Đằng hoàng, nhất là axit gambogic là việc làm cần thiết từ các nhà khoa học để không phí hoài nguồn tài nguyên dƣợc liệu s n có. Các nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất của axit gambogic là rất cần thiết và tiềm năng trong việc phát hiện các chất mới có hoạt tính sinh học cao hơn chất đầu và ít độc tính hơn. Việc thực hiện nhiệm vụ góp phần vào việc nâng cao trình độ nghiên cứu của các cán bộ thực hiện trong lĩnh vực tổng hợp hữu cơ và hóa hợp chất thiên nhiên Xuất phát từ những cơ sở trên tôi đã chọn đề tài “Tổng hợp một số dẫn xuất của axit gambogic”. 2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. TỔNG QUAN VỀ ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 1.1.1. Giới thiệu chi Garcinia Garcinia là một trong những chi lớn nhất thuộc họ Bứa (hay Măng cụt) với khoảng 400 loài trên thế giới. Tên gọi Garcinia lấy theo tên của nhà thực vật học Laurence Garcinia, ngƣời đã sƣu tập các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn Độ vào thế kỷ 18. Họ Bứa ở Việt Nam có tất cả 62 loài, phân bố trên khắp đất nƣớc từ vùng rừng núi phía Bắc đến ven sông rạch của các tỉnh phía Nam 1]. Các loài trong họ Bứa chủ yếu là cây gỗ hoặc cây bụi, đặc trƣng bởi có nhựa mủ vàng, cành thƣờng nằm ngang, hoa thƣờng đơn tính, nhị thƣờng nhiều, rời hay hợp thành bó. Ở Việt Nam, chi này có khoảng 29 loài và là chi lớn nhất trong họ Măng cụt [4]. Các loài trong chi này thuộc loại thân thẳng có chiều cao trung bình 8- 30m. Lá của chúng có màu xanh đậm, có các đƣờng gân r ràng. Hoa màu vàng nhạt hoặc trắng hơi xanh có từ 4-5 cánh, bao phấn không cuống, buồng phấn hẹp. Nhiều loài cây trong chi Garcinia có quả ăn đƣợc nhƣ quả măng cụt, quả dọc…Quả thƣờng hình tròn, có từ 4-10 múi, có nhiều nƣớc, hạt có lớp vỏ mỏng bao bọc. Vỏ cây, vỏ quả và gỗ của các cây thuộc chi này thƣờng tiết ra nhựa màu vàng hoặc trắng. Thành phần hóa học của chi Garcinia khá đa dạng, chủ yếu là các xanthon, benzophenon, biflavonoid [5] và triterpenoid [6]. Trong đó, xanthon là nhóm hợp chất đặc trƣng của chi Garcinia. Nhiều loài thuộc chi Garcinia có quả ăn đƣợc và rất ngon nhƣ quả măng cụt (G. mangostana , bứa lửa (G. fusca , bứa mọi (G. harmandii , bứa núi (G. oliveri . Hạt của trái G. indica có chƣa một loại chất b o ăn đƣợc giống nhƣ bơ. Trái của loài G. livingstonei dùng để lên men thức uống. Trƣớc đây khi 3
chƣa có acid citric tổng hợp ngƣời ta xem tai chua (G.pendunculata là nguồn cung cấp acid citrcic đáng quý. Trong công nghiệp, nhựa và vỏ trái nhiều loài đƣợc dùng làm phẩm nhuộm vàng nhƣ vỏ trái sơn v (G. merguensis , nhựa cây đằng hoàng (G. hanburyi . Dầu lọc (G. multiflora đƣợc dùng làm xà phòng, dầu nhờn… Từ lâu trong dân gian ngƣời ta đã biết sử dụng nhiều loài thuộc chi Garcinia để làm thuốc chữa các bệnh đơn giản. Vỏ cây bứa lá tròn, dài (G. oblongifolia thƣờng dùng trị lo t dạ dày, lo t tá tràng, viêm dạ dày, ho ra máu, mụn nhọt, nhựa dùng trị bỏng. Vỏ trái bứa mọi (G. harmandii đƣợc dùng ăn với trầu, phối hợp với nhiều vị thuốc khác để trị tiêu chảy. Dầu dọc đƣợc dùng để đắp mụn nhọt khi chƣa vỡ mủ. Ngoài ra, khi phối hợp với các thuốc khác nhƣ Calomel và Lô hội, nhựa của chúng còn đƣợc dùng để trị giun và cả sán sơ mít… 1.1.2. Giới thiệu về cây Garcinia hanburyi 1.1.2.1. Đặ điểm hình thái và phân bố Cây Garcinia hanburyi có tên thông thƣờng là Đằng hoàng, thuộc họ Măng cụt Clusiaceae (Guttiferae) phân bố đặc hữu ở vùng Đông Nam Á bao gồm Việt Nam, Hải Nam (Trung Quốc), Campuchia, Thái Lan, và mới đây đƣợc trồng thành công ở Singapo [7]. Hình 1.1: Bản đồ phân bố cây Đằng hoàng 4
Cây cao, to 10 - 20cm, thân nh n, thẳng đứng. Lá mọc đối, cuống ngắn, hình bầu dục hay hình mác, hai đầu hơi tù, phiến lá dai, nguyên nh n, rộng 3 - 10cm. Quả mọng hơi hình cầu, đƣờng kính 2 - 5cm, phía cuống có đài tồn tại, 4 ngăn, mỗi ngăn có một hạt hơi cong hình cung. Mùa hoa tháng 12 - 1, mùa quả tháng 2 - 3. Hình 1.2: Lá và quả Đằng hoàng Tất cả các bộ phận của cây đều có những ống bài tiết nằm trong mô vỏ, trong libe, tủy và cả trong mô gỗ. Thƣờng sau mùa mƣa (ở miền Nam, vào các tháng 1 - 5 ngƣời ta dùng rìu khía thành vòng xoắn ốc trên thân, những khía sâu vài mm từ dƣới đất lên đến cành thứ nhất. Một chất dịch mủ màu vàng chảy ra đƣợc hứng vào các ống tre, sau một thời gian nhựa mủ đặc lại. Hơ nóng đều ống tre cho nƣớc bốc hết đi. Chẻ lấy vị Đằng hoàng. Mỗi cây mỗi năm có thể cho ba thỏi đằng hoàng dài 0,50cm, đƣờng kính 4cm. Loại Đằng hoàng thỏi này đƣợc chuộng nhất trên thị trƣờng tiêu thụ. Nhƣng có khi vị Đằng hoàng còn đang mềm, ngƣời ta nặn thành bánh hay thành miếng to nhỏ không đều. Có nơi ngƣời ta uốn cong cả cành Đằng hoàng cắt đầu cho nhựa mủ chảy ra, hứng vào ống tre hay vại rồi chế thành đằng hoàng thỏi hay miếng. Vị Đằng hoàng thỏi thƣờng là những thỏi dài 15-20 cm, đƣờng kính 3- 6 cm, trên mặt thƣờng có những khía dọc dấu vết của ống tre, trên mặt có bụi màu vàng nhạt. Đằng hoàng dễ vỡ, vết vỡ bóng hay mờ, màu vàng, sẫm hay 5
vàng cam nâu nhạt. Khi miết ngón tay ƣớt lên vị đằng hoàng ta sẽ thấy tay có màu vàng tƣơi. Đằng hoàng tan trong cồn (cho màu đỏ), trong ete (cho màu vàng . Đun nóng mềm ra nhƣng không chảy lỏng và cháy không cho mùi gì đặc biệt. Vị hắc, mùi không rõ. Hình 1.3: Nhựa Đằng hoàng d ng ột và d ng th i 1.1.2.2. hành ph n h h ủ nh ây Garcinia hanburyi Trong nhựa cây Đằng hoàng có 70-80% chất nhựa, 18 đến 24% chất gôm, ngoài ra còn có tinh dầu, một ête phenolic. Thành phần chính của chất nhựa này là axit gambogic (G , axit neogambogic và axit allogambogic [8,9]. Ngoài ra còn có một số xanthone, các triterpene khác và có hoạt tính gây độc tế bào nhƣng ở hàm lƣợng rất nhỏ [10,11]. 6
H nh 1.4. Một số hợp chất t ong nhựa cây Đằng hoàng 7
1.1.2.3. Công dụng - Là thuốc tẩy rất mạnh: với liều 0,1 đến 0,2g đã cho phân lỏng, với liều 0,25 đến 0,4g phân rất nhiều, đau bụng và có khi nôn, với liều cao nữa thì độc (nôn, viêm dạ dày và ruột) có khi đến chết sau khi đau bụng nặng, phân có máu… Đằng hoàng chỉ có tác dụng ở khu vực ruột khi tiếp xúc với chất béo và với mật nhung không có tác dụng thông mật. - Nhựa Đằng hoàng là một vị thuốc cổ truyền đƣợc dùng để điều trị một số bệnh nhƣ cầm máu, tẩy giun sán, viêm hô hấp, viêm phế quản, sổ mũi, nhuận tràng, trị các vết thƣơng nhiễm trùng ngoài da. - Trong công nghiệp dùng trong sơn, vẽ màu, phẩm nhuộm và chế vecni phủ lên kim loại. 1.1.3. Axit gambogic (GA). 1.1.3.1. Giới thiệu về axit gambogic Axit gambogic (GA- còn gọi là -guttiferin, axit guttatic) là thành phần chính mang hoạt tính của nhựa cây Đằng hoàng. - CTPT là C38H44O8 - Khối lƣợng phân tử: 628 (g/mol) - Trạng thái: dạng bột - Màu: vàng nghệ - Độ tan: DMSO 10 mg/mL - Tỉ trọng: 1,29 (g/cm3) - Tan trong các dung môi: Diclometan, methanol, axeton, cồn, n-hexan, etyl axetat... 8
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của axit gambogic 1.1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của G đƣợc thực hiện chủ yếu tại các nƣớc châu Á nhƣ Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan và Hàn Quốc. Mặc dù đƣợc phân lập và xác định cấu trúc từ những năm 60 của thế kỷ trƣớc [12,13] nhƣng mãi đến năm 2004 hoạt tính chống ung thƣ của axit gambogic mới đƣợc chú ý. Từ đó đến nay, đã có gần 200 bài báo khoa học trên thế giới công bố về hoạt tính in vitro, in vivo, mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (QSAR), chuyển hóa hóa học cũng nhƣ các kết quả thử lâm sàng của AG. xit gambogic đã đƣợc chứng minh in vitro và in vivo là có hoạt tính ức chế sự phát triển và di căn của nhiều loại tế bào ung thƣ 14,15], ví dụ nhƣ: ung thƣ phổi (IC50 tại 24h, 48h, 72 h : 1,74 ; 1,01; 0,81g/mL thấp hơn 4 lần so với thuốc chống ung thƣ hydroxycamthothecin , ung thƣ bạch cầu (ED50 0,35 g/mL , ung thƣ tiền liệt tuyến, ung thƣ tụy, ung thƣ dạ dày (MGC-803: IC50 0,96 g/mL , ung thƣ vú (ED50 1,64 g/mL , ung thƣ ruột kết (ED50 0,45 g/mL , ung thƣ não, ung thƣ gan…Ngoài ra, axit gambogic còn đƣợc phát hiện có hoạt tính ức chế kênh ion chỉnh lƣu Kir2.1 (EC< 100 nm 16]. Cơ chế chống ung thƣ của G có liên quan đến việc thúc đẩy quá trình tự chết (apoptosis) của tế bào bằng cách hoạt hóa enzyme caspase 3 (EC50 0,78 M), ức chế sự gắn kết của protein anti-apoptotic với peptid BH3 (IC50 = 1,47; 1,21; 2,02; 0,66; 1,06; 0,79 M lần lƣợt đối với Bcl-XL, Bcl-2, Bcl-W, Bcl-B, Bfl-1, 9
Mcl-1) [12, 13, 14]. AG gắn với thụ thể transferring (IC50 = 4,1 M) gây ra sự chết lập trình của nhiều dòng tế bào ung thƣ 17,18]. Một số nghiên cứu khác chỉ ra AG ức chế hoạt động của chymptrypsin trên 20S proteasome [19], gây độc trên dòng tế bào ung thƣ não thông qua cơ chế AMPK ảnh hƣởng trên EGFR và tín hiệu Akt/mTORC1 [20]. G ngăn chặn sự tạo mạch máu, ức chế quá trình tăng sinh tế bào và di căn 21]. xit gambogic có độc tính thấp, hoạt tính chọn lọc và khả năng là một tác nhân hóa trị tiềm năng. Nghiên cứu độc tính cấp và trƣờng diễn trên chuột và chó đã chỉ ra liều không gây độc theo đƣờng uống là 60 mg/kg trọng lƣợng trong 13 tuần, gấp 18 lần so với liều thử lâm sàng trên ngƣời (20 mg/60 kg, hàng ngày) [22,23]. Hiện tại, axit gambogic đã đƣợc các nhà khoa học Trung Quốc điều chế thuốc từ trạng thái tinh khiết 92-95 và đã thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn I và II trên bệnh nhân ung thƣ phổi, ruột và thận [24]. Kết quả nghiên cứu lâm sàng giai đoạn II đã bƣớc đầu chứng minh tác dụng hiệu quả của AG trên các bệnh nhân ung thƣ và cho thấy AG dạng bào chế an toàn hơn so với nhựa Đằng hoàng tự nhiên, đồng thời có thể tiếp tục đƣa vào thử nghiệm lâm sàng ở các giai đoạn sau. Nhiều công trình khoa học gần đây nhất cũng cho thấy AG còn thể hiện khả năng tăng cƣờng hiệu lực điều trị (synergistic) khi kết hợp với một số loại thuốc điều trị ung thƣ khác nhƣ docetaxel, vincristine, verapamil, adreamycin, cisplatin, 5-fluorouracil hay sunitinib trên các dòng tế bào ung thƣ ác tính khác nhau [25,26,27,28]. Cấu trúc hóa học của axit gambogic đã đƣợc xác định bằng phƣơng pháp phổ NMR [29], và gần đây đƣợc khẳng định thêm nhờ phân tích nhiễu xạ tia X tinh thể [30]. Nó bao gồm một hệ vòng 4-oxatricyclo[4.3.1.0]decan- 10
2-one, một dạng cấu trúc của một số hợp chất thiên nhiên phân lập đƣợc từ các loài Garcinia (chi Bứa) [31]. Vào năm 2004, công trình đầu tiên về việc chuyển hóa AG nhằm nghiên cứu mối quan hệ hoạt tính – cấu trúc (S R đƣợc công bố bởi các nhà khoa học của hãng Dƣợc Maxim (San Diego, Mỹ) [32]. Từ đó đến nay, đã có hơn 10 công bố về việc tổng hợp các dẫn xuất (derivative) và các chất tƣơng tự (analogue). Một số chất tổng hợp đƣợc từ AG có hoạt tính mạnh hơn nhiều lần so với chất đầu, ví dụ nhƣ methyl ester của AG có hoạt tính trên dòng tế bào ung thƣ phổi A549 mạnh hơn 2-3 lần, dẫn xuất epoxy có hoạt tính mạnh hơn 3-6 lần GA trên dòng tế bào ung thƣ gan 33], 3 dẫn xuất este khác có hoạt tính ức chế tăng sinh tế bào ung thƣ gan mạnh hơn G và hơn 27,8-14,5 lần so với taxol [34]… Các hợp chất analogue tổng hợp đƣợc tuy không có hoạt tính kháng ung thƣ mạnh nhƣ G nhƣng việc nghiên cứu chúng đã làm sáng tỏ phần cấu trúc có hoạt tính của axit gambogic [35-38]. 1.1.3.3. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam xit gambogic cũng nhƣ dƣợc liệu Đằng hoàng chƣa có trên thị trƣờng Việt Nam nên tiêu chuẩn cơ sở là chƣa có. Việc xây dựng tiêu chuẩn chất lƣợng cơ sở và phƣơng pháp phân tích định tính, định lƣợng axit gambogic là rất quan trọng. Nhờ thế, sản phẩm axit gambogic mới trở thành thƣơng phẩm có giá trị. Tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, từ năm 2013, chỉ có nhóm TS. Trần Thị Thu Thủy đang tiến hành nghiên cứu quy trình phân lập axit gambogic tinh khiết ở quy mô phòng thí nghiệm và hiện đang triển khai ở quy mô lớn hơn. Cấu trúc của axit gambogic phân lập đƣợc đã đƣợc khẳng định bằng phổ NMR và MS, kết hợp với so sánh dữ liệu đã công bố. Các nghiên cứu sơ bộ về hoạt tính sinh học tại Viện đã chứng minh hoạt tính gây độc tế 11
bào trên 3 dòng tế bào ung thƣ phổi, gan và màng tim. Hoạt tính và cơ chế tác dụng của axit gambogic trên dòng tế bào ung thƣ não T98 đã đƣợc thực hiện và công trình đã đƣợc đăng trên tạp chí Bioorg. Med. Chem. Lett. vào năm 2015. 1.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.2.1. ớ ) Sắc ký lớp mỏng (TLC đƣợc sử dụng để phân tích định tính các hỗn hợp chất, định hƣớng và kiểm tra các quá trình phân tách và phân lập bằng sắc ký. Phân tích sắc ký lớp mỏng thƣờng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng silica gel, chiều dày 0,2 mm trên nền nhôm. Nếu các chất không phát hiện đƣợc bằng đèn UV 256/354 nm thì dùng các thuốc thử hiện màu là dung dịch Vanilin/H2SO4 đặc1%, Ce(SO4)2/H2SO4đặc 15%, p-Anisaldehyde/H2SO4, Ce(SO4)2 / molybdate / H2SO4, I2, KMnO4, N-inhydrin… Các dung môi thƣờng dùng cho TLC đƣợc xếp theo thứ tự độ phân cực tăng dần là: ete dầu hỏa < hexane < cyclo hexane < toluen < diethyl ete < dichloromethan < chloroform < etyl axetat < axeton < ethanol < axit axetic.  Giải ly bản m ng Pha dung môi (hệ dung môi) phù hợp cho vào bình giải ly có đặt s n một tấm giấy thấm (giấy lọc , nghiêng đảo nhẹ để dung môi thấm ƣớt tờ giấy lọc (làm cho dung môi trong bình đƣợc bão hòa). Đặt tấm bản mỏng vào bình giải ly, cạnh đáy của bản mỏng chạm vào đáy của bình và ngập vào dung môi. Các vết chấm mẫu không đƣợc ngập vào dung môi. 12