Luận văn: Xác định thành phần môi trường nuôi cấy nấm mốc sinh tổng hợp enzyme pectinase

ÑAÏI HOÏC QUOÁC GIA THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH

TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC BAÙCH KHOA

KHOA COÂNG NGHEÄ HOÙA HOÏC & DAÀU KHÍ

BOÄ MOÂN COÂNG NGHEÄ THÖÏC PHAÅM

---------------o0o---------------

LUAÄN VAÊN TOÁT NGHIEÄP

XAÙC ÑÒNH THAØNH PHAÀN MOÂI

TRÖÔØNG NUOÂI CAÁY NAÁM MOÁC SINH

TOÅNG HÔÏP ENZYME PECTINASE

GVHD : TS. Leâ Vaên Vieät

Maãn

SVTH : Vuõ Thò Hoàng Vaân

MSSV : 60103229

Tp HCM, thaùng 12/2005

LÔØI CAÛM ÔN

Luaän vaên toát nghieäp

Lôøi ñaàu tieân, con xin chaân thaønh caûm ôn Boá, Meï vaø gia ñình ñaõ giuùp ñôõ con veà moïi maët töø vaät chaát ñeán tinh thaàn ñeå con coù theå hoaøn thaønh toát baøi luaän vaên toát nghieäp naøy.

Em xin chaân thaønh caûm ôn Ban giaùm hieäu Tröôøng ÑHBK – TpHCM, caûm ôn quyù thaày coâ, caùn boä phoøng thí nghieäm ñaõ giuùp ñôõ, taïo ñieàu kieän thuaän lôïi cho em trong suoát nhöõng naêm hoïc vöøa qua.

Ñaëc bieät, em xin baøy toû loøng bieát ôn chaân thaønh ñeán thaày Leâ Vaên Vieät Maãn laø giaùo vieân höôùng daãn vaø taäp theå thaày coâ boä moân Coâng ngheä thöïc phaåm tröôøng ÑH Baùch Khoa ñaõ chæ daïy vaø giuùp ñôõ em trong suoát thôøi gian thöïc hieän luaän vaên toát nghieäp naøy.

Mình cuõng caûm ôn caùc baïn trong nhoùm Chaâu, Tuøng, Song, Ñöùc, caùc baïn phoøng 101 vaø caùc em ñaõ luoân giuùp ñôõ vaø ñoäng vieân mình.

Moät laàn nöõa, em xin chaân thaønh caûm ôn vaø chuùc moïi

ngöôøi nhieàu söùc khoûe vaø thaønh coâng.

Tp.HCM, thaùng 1/2006

VUÕ THÒ HOÀNG VAÂN

-ii-

TOÙM TAÉT LUAÄN VAÊN

Luaän vaên toát nghieäp

Teân ñeà taøi “Xaùc ñònh thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi

caáy naám moác sinh toång hôïp enzyme pectinase”

Pectinase laø nhoùm enzyme xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân pectin. Cheá phaåm pectinase ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong coâng nghieäp thöïc phaåm vaø döôïc phaåm, nhaát laø trong coâng nghieäp saûn xuaát caùc loaïi nöôùc eùp traùi caây. Hieän nay, caùc cheá phaåm enzyme ñöôïc saûn xuaát chuû yeáu töø vi sinh vaät, trong ñoù phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu coù nhieàu öu ñieåm hôn caùc phöông phaùp khaùc. Phöông phaùp beà saâu cho pheùp ñieàu khieån chính xaùc caùc thoâng soá kyõ thuaät cuûa quaù trình leân men vaø thuùc ñaåy quaù trình sinh toång hôïp enzyme ôû vi sinh vaät.

Trong luaän vaên toát nghieäp naøy, noäi dung nghieân cöùu

cuûa chuùng toâi goàm coù nhöõng phaàn sau:

 Nuoâi caáy 3 loaøi naám moác thuoäc gioáng Aspergillus coù khaû naêng toång hôïp enzyme pectinase baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu: töø keát quaû thöïc nghieäm thu ñöôïc, chuùng toâi tuyeån choïn loaøi A.   awamori coù khaû naêng toång hôïp pectinase cao nhaát ñeå nghieân cöùu tieáp.

 Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon vaø nitô

leân quaù trình sinh toång hôïp pectinase cuûa naám moác.

 Toái öu hoùa haøm löôïng cô chaát carbon vaø nitô trong moâi

tröôøng nuoâi caáy baèng phöông phaùp quy hoaïch thöïc nghieäm.

 Thöû öùng duïng cheá phaåm enzyme pectinase thoâ thu

ñöôïc ñeå laøm giaûm ñoä nhôùt nöôùc oåi eùp.

-iii-

DANH MUÏC CAÙC BAÛNG

Luaän vaên toát nghieäp

Baûng 2.1: AÛnh höôûng cuûa nguoàn Nitô leân hoaït tính

enzyme pectinase.

Baûng 2.2: Noàng ñoä caùc chaát khoaùng caàn thieát cho vi

sinh vaät phaùt trieån.

Baûng 2.3: Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät

theo phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu.

Baûng 3.1: Thöïc hieän phaûn öùng giöõa pectinase vaø cô

chaát.

Baûng 3.2: Döïng ñöôøng chuaån monogalacturonic acid.

Baûng 3.3: Xaây döïng ñöôøng chuaån Tyrosin.

Baûng 4.1: Söï thay ñoåi hoaït tính endo-polygalacturonase trong

canh tröôøng nuoâi caáy naám moác theo thôøi gian.

Baûng 4.2: Söï thay ñoåi hoaït tính exo-polygalacturonase trong

canh tröôøng nuoâi caáy naám moác theo thôøi gian.

Baûng 4.3: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng pectin ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase trong moâi tröôøng nuoâi caáy A.  awamori.

Baûng 4.4: AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán hoaït tính endo-

polygalacturonase trong moâi tröôøng nuoâi caáy A. awamori.

Baûng 4.5: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng NH4Cl trong moâi

tröôøng nuoâi caáy ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase.

Baûng 4.6: Thaønh phaàn moâi tröôøng cuûa caùc maãu thí

nghieäm quy hoaïch thöïc nghieäm.

Baûng 4.7: Hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase trong caùc maãu trong thí nghieäm toái öu hoùa theo phöông phaùp tröïc giao baäc hai.

Baûng 4.8: Caùc heä soá cuûa phöông trình hoài quy.

Baûng 4.9: Theå tích dòch oåi eùp vaø dòch enzyme söû duïng.

Baûng 4.10: Thôøi gian chaûy cuûa dòch oåi eùp khi boå sung

enzyme vaø khi khoâng boå sung enzyme.

-iv-

Luaän vaên toát nghieäp

-v-

DANH MUÏC CAÙC HÌNH

Luaän vaên toát nghieäp

Hình 2.1: Phaân töû pectin.

Hình 2.2: Cô cheá taùc duïng cuûa exo-polygalacturonase .

Hình 2.3: Cô cheá taùc duïng cuûa endo-polygalacturonase .

Hình 2.4: Cô cheá taùc duïng cuûa enzyme pectinesterase.

Hình 2.5: Cô cheá taùc duïng cuûa enzyme pectate lyase.

Hình 2.6: Cô cheá taùc duïng cuûa enzyme pectin lyase.

Hình 2.7: Keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH moâi

tröôøng ban ñaàu ñeán hoaït tính enzyme polygalacturonase.

Hình 3.1: Sô ñoà nghieân cöùu.

Hình 4.1: Söï thay ñoåi hoaït tính endo-polygalacturonase trong

canh tröôøng nuoâi caáy naám moác theo thôøi gian.

Hình 4.2: Söï thay ñoåi hoaït tính exo-polygalacturonase trong

canh tröôøng nuoâi caáy naám moác theo thôøi gian.

Hình 4.3: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng pectin ñeán hoaït tính

endo-polygalacturonase.

Hình 4.4: AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán hoaït tính endo-

polygalacturonase trong moâi tröôøng nuoâi caáy A. awamori.

Hình 4.5: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng NH4Cl trong moâi

tröôøng nuoâi caáy ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase.

Hình 4.6: Ñoà thò bieåu dieãn phöông trình hoài quy.

-vi-

MUÏC LUÏC

2        MÔÛ ÑAÀU: ............................................................................................................................

2        Lôøi môû ñaàu ................................................................................................................................

5        CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU ...........................................................................

Pectin:[7,8]

5     ......................................................................................................................................                                                                                                                                               1.1.1. Nguoàn goác:  5     ........................................................................................................................................      5                                                                                                                                  ...........................................................................................................................       1.1.2. Caáu taïo cuûa pectin:                                                                                                                1.1.3. Moät soá tính chaát cuûa pectin:  6     ...........................................................................................................      7     1.1.4. Phaân loaïi pectin: .................................................................................................................................

1.2. Enzyme pectinase:[2,3,5,8,9]

7       ....................................................................................................    7                                                                                                                     ..............................................................................................................       1.2.1. Phaân loaïi enzyme pectinase:           1.2.2. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp enzyme pectinase ôû vi sinh vaät:  12      ......                                                                                       1.2.3. Phöông phaùp thu nhaän enzyme pectinase:[2, 4]  17      ..............................................................................      22                                                                                ........................................................................       1.2.4. ÖÙng duïng cuûa cheá phaåm  enzyme pectinase:[2]

24

1.3. Ñaëc ñieåm cuûa moät soá loaøi naám moác trong sinh toång hôïp enzyme pectinase:[7]                                                                                                                                                     1.3.1. Aspergillus niger:  25      ................................................................................................................................      25                                                                                                                                     .............................................................................................................................       1.3.2. Aspergillus oryzae:  25                                                                                                                                    ..........................................................................................................................     1.3.3. Aspergillus awamori:

28         CHÖÔNG 3: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU: ...............

28       Nguyeân lieäu: ...............................................................................................................................                                                                                                                                                                                                                28      ...................................................................   1.3.4. Vi sinh vaät söû duïng ñeå thu nhaän enzyme pectinase:                                                                                                                                                 28      .........................................................................................................................................   1.3.5. Hoùa chaát:                                                                                                          1.3.6.         Moâi tröôøng ñeå giöõ gioáng:  28      ...................................................................................................      29                            ....................       1.3.7. Moâi tröôøng cô baûn ñeå nuoâi caáy naám moác sinh toång hôïp  enzyme pectinase:

.................................................................................................                                                                                                    1.4. Phöông phaùp nghieân cöùu:  30             Sô ñoà nghieân cöùu thöïc nghieäm:                                                                                                               30      ...........................................................................................................      31      ............................................................................................................                                                                                                                      Thuyeát minh sô ñoà nghieân cöùu:

35      1.5. Phöông phaùp phaân tích: .....................................................................................................      35                                                                                          ..................................................................................

1.5.1. Caùch xaùc ñònh hoaït tính enzyme pectinase:

44        2. Chöông 4: Keát quaû vaø baøn luaän: ...............................................................................

2.1. Khaûo saùt choïn loaøi naám moác sinh toång hôïp pectinase coù hoaït tính cao nhaát:

.  44

48        2.2. AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng pectin ñeán hoaït tính pectinase: ....................................

51        2.3. Choïn nguoàn Nitô voâ cô cho moâi tröôøng nuoâi caáy: ....................................................

54        2.4. AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng nitô leân hoaït tính pectinase: .........................................

57      2.5. Quy hoaïch thöïc nghieäm: .....................................................................................................                                                                                                                2.5.1. Thöïc hieän:                                                                                                                                            57      ........................................................................................................................................      59      ..........................................................................................................................................                                                                                                                                                   2.5.2. Keát quaû:

2.6. Thöû öùng duïng cheá phaåm pectinase thoâ thu ñöôïc ñeå laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa   64        dòch quaû:  .....................................................................................................................................

67        3. Keát luaän vaø ñeà nghò: ....................................................................................................

Luaän vaên toát nghieäp

-vii-

67        3.1. Keát luaän: ..............................................................................................................................

67        3.2. Ñeà nghò: .................................................................................................................................

69        4. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO ...........................................................................................

71        5. PHUÏ LUÏC ..........................................................................................................................

Luaän vaên toát nghieäp

-viii-

Luaän vaên toát nghieäp CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU

-1-

MÔÛ ÑAÀU:

Luaän vaên toát nghieäp CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU

Lôøi môû ñaàu Trong voøng vaøi chuïc naêm gaàn ñaây, coâng nghieäp saûn xuaát cheá phaåm enzyme ñaõ coù nhöõng böôùc tieán khoång loà vôùi toác ñoä phaùt trieån khaù maïnh meõ. Caùc cheá phaåm enzyme ñöôïc saûn xuaát ngaøy caøng nhieàu veà soá löôïng, ña daïng veà chuûng loaïi. Vì enzyme laø nhöõng chaát khoâng theå toång hôïp baèng con ñöôøng hoùa hoïc neân ngöôøi ta chæ thu chuùng töø caùc nguoàn sinh hoïc. Ta coù theå thu nhaän enzyme töø ñoäng vaät, thöïc vaät vaø vi sinh vaät. Tuy nhieân, haàu heát caùc nguoàn nguyeân lieäu ñoäng vaät, thöïc vaät khoâng theå duøng laøm nguyeân lieäu ñeå saûn xuaát cheá phaåm enzyme vôùi quy moâ coâng nghieäp lôùn. Nhö vaäy, trong caùc nguoàn nguyeân lieäu sinh hoïc thì nguoàn nguyeân lieäu vi sinh vaät laø doài daøo vaø ñaày höùa heïn vì enzyme töø vi sinh vaät coù toác ñoä sinh tröôûng nhanh vaø coù hoaït löïc xuùc taùc maïnh meõ. Nguyeân lieäu laøm moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät laïi deã kieám vaø reû tieàn, do ñoù duøng vi sinh vaät laøm nguoàn thu enzyme seõ ñem laïi hieäu quaû kinh teá lôùn.

Moät trong caùc cheá phaåm enzyme ñöôïc öùng duïng nhieàu nhaát laø pectinase. Enzyme naøy ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong coâng nghieäp thöïc phaåm, coâng nghieäp deät, y döôïc vaø noâng nghieäp.

Trong coâng nghieäp saûn xuaát nöôùc rau quaû, moät hieän töôïng gaây aûnh höôûng khoâng toát ñeán chaát löôïng saûn phaåm trong quaù trình toàn tröõ laø nöôùc rau quaû bò hoaù ñuïc. Nguyeân nhaân chuû yeáu laø do trong caùc loaïi rau quaû chöùa moät löôïng lôùn hôïp chaát pectin. Coù nhieàu giaûi phaùp ñeå giaûi quyeát vaán ñeà treân, trong ñoù giaûi phaùp söû duïng caùc cheá phaåm enzyme thuûy phaân pectin laø cho hieäu quaû vaø toát hôn caû.

Hieän nay trong saûn xuaát coâng nghieäp, caùc cheá phaåm pectinase ñöôïc thu nhaän töø caùc nguoàn vi sinh vaät nhö naám moác hoaëc vi khuaån… chuû yeáu baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà maët hay beà saâu. Ñeå ñaùp öùng cho yeâu caàu töï ñoäng hoùa, cô giôùi hoùa trong coâng nghieäp, phöông phaùp nuoâi caáy

-2-

Luaän vaên toát nghieäp CHÖÔNG 1: MÔÛ ÑAÀU

beà saâu ngaøy caøng ñöôïc öùng duïng roäng raõi trong saûn xuaát caùc cheá phaåm enzyme. Treân cô sôû ñoù, chuùng toâi böôùc ñaàu khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp pectinase töø naám moác baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu, töø ñoù toái öu hoùa thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy nhaèm thu nhaän pectinase coù hoaït tính cao.

-3-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

-4-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU Pectin:[7,8]

Luaän vaên toát nghieäp

1.1.1. Nguoàn goác:

Pectin coù maët trong quaû vaø cuû. Pectin coù chöùc naêng duy trì hình daùng vaø söï vöõng chaéc cuûa traùi caây. Ngöôøi ta thaáy coù 2 daïng toàn taïi cuûa pectin laø protopectin khoâng tan (laø phöùc chaát giöõa pectin vaø caùc thaønh phaàn khaùc nhö cellulose vaø hemicellulose laøm neân caáu truùc vaùch teá baøo) vaø pectin tan laø chaát coù trong thaønh phaàn dòch baøo cuûa thöïc vaät.

Töø thôøi tieàn söû, chaát pectin ñaõ laø thaønh phaàn trong khaåu phaàn aên cuûa con ngöôøi. Nhöng chæ môùi trong nöûa theá kyû tröôùc, ngaønh coâng nghieäp thöïc phaåm môùi nhaän bieát ñöôïc vai troø quan troïng cuûa phuï gia pectin trong vieäc ña daïng hoùa caùc saûn phaåm thöïc phaåm.

Trong coâng nghieäp, pectin ñöôïc thu nhaän töø dòch chieát cuûa caùc nguyeân lieäu thöïc vaät, thöôøng laø taùo hay caùc quaû coù muùi.

Ñoái vôùi vieäc saûn xuaát nöôùc quaû, söï coù maët cuûa pectin laø ñieàu khoâng mong muoán vaø khoâng coù lôïi. Do noù coù tính chaát keo neân laøm cho dòch quaû coù ñoä nhôùt cao, vì theá seõ laøm caûn trôû caùc quaù trình nhö eùp, loïc, trích ly dòch chieát töø quaû. Ngoaøi ra, pectin coøn laøm giaûm ñoä beàn keo cuûa nöôùc quaû.

1.1.2. Caáu taïo cuûa pectin:

Pectin laø moät polysaccharide dò theå, maïch thaúng, caáu taïo töø acid polygalacturonic ñaõ ñöôïc ester hoùa 1 phaàn hay toaøn boä vôùi röôïu methylic.

Acid polygalacturonic laø 1 polymer cuûa acid D- monogalacturonic lieân keát vôùi nhau baèng lieân keát (cid:0) 1,4- glucoside.

Tuøy thuoäc nguoàn goác pectin maø maïch acid polygalacturonic daøi hay ngaén, do ñoù khoái löôïng phaân töû cuûa chuùng cuõng khaùc nhau, dao ñoäng trong khoaûng 20.000-

-5-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

200.000 ñôn vò. Ví duï nhö: phaân töû löôïng cuûa pectin töø taùo, maän laø 25.000-35.000, töø nguoàn cam laø 50.000.

ÔÛ thöïc vaät, coù söï bieán ñoåi giöõa thaønh phaàn protopectin vaø pectin trong quaù trình chín cuûa quaû. Khi quaû xanh, haøm löôïng protopectin trong quaû raát cao, phaân taùn chuû yeáu ôû thaønh teá baøo vaø coù taùc duïng laøm cho quaû cöùng. Ñeán khi quaû chín, döôùi taùc duïng cuûa caùc acid höõu cô vaø vai troø xuùc taùc cuûa enzyme protopectinase coù trong quaû, protopectin khoâng tan seõ chuyeån daàn sang daïng protopectin tan vaø pectin laøm quaû meàm ra.

Phaân töû pectin

1.1.3. Moät soá tính chaát cuûa pectin:

Pectin thöông phaåm laø chaát boät maøu traéng xaùm hay vaøng nhaït, tan trong nöôùc, dung dòch ñöôøng, kieàm, carbonat natri vaø trong glycerin noùng. Pectin khoâng tan trong röôïu vaø caùc dung moâi höõu cô khaùc. Pectin deã daøng bò keát tuûa bôûi ethanol, isopropanol, sulfat amon, clorua nhoâm, muoái ñoàng, muoái canxi vaø bôûi acid.

ÔÛ traïng thaùi dung dòch, pectin coù nhöõng ñaëc tính coâng ngheä quan troïng nhö: laø chaát laøm ñaëc, chaát oån ñònh caáu truùc, chaát taïo gel, trong ñoù khaû naêng taïo gel laø quan troïng nhaát.

Pectin hoøa tan khi bò taùc duïng cuûa caùc chaát kieàm loaõng hoaëc enzyme pectinesterase seõ giaûi phoùng röôïu methylic vaø acid polygalacturonic töï do. Acid polygalacturonic keát hôïp vôùi ion canxi seõ cho ra canxi polygalacturonate keát tuûa. Tính chaát naøy ñöôïc öùng duïng ñeå ñònh löôïng pectin.

-6-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

1.1.4. Phaân loaïi pectin:

1.1.4.1. Theo tæ leä  % nhoùm methylen trong phaân töû pectin:

 HMP: High Methoxyl Pectin: DE >50%.

 LMP: Low Methoxyl Pectin: DE (cid:0) 50%.

Vôùi DE (degree of esterification): laø phaàn traêm veà soá löôïng cuûa caùc goác acid galacturonic ñöôïc ester hoùa treân toång soá löôïng goác acid galacturonic coù trong phaân töû.

1.1.4.2. Theo khaû naêng hoøa tan trong nöôùc:

 Pectin hoøa tan: methoxyl polygalacturonic.

 Pectin khoâng hoøa tan: protopectin laø daïng keát hôïp giöõa

1.2. Enzyme pectinase:

[2,3,5,8,9]

pectin vôùi caùc polysaccharid khaùc.

Enzyme pectinase laø nhoùm enzyme thuûy phaân pectin, saûn phaåm taïo thaønh laø acid galacturonic, oligogalacturonic, polygalacturonic maïch ngaén, methanol...

Enzyme pectinase raát phoå bieán trong theá giôùi sinh vaät. Noù coù nhieàu trong laù vaø cuû khoai taây, trong chanh, caø chua vaø trong caùc loaïi quaû khaùc. Ngoaøi ra, noù cuõng ñöôïc taïo thaønh töø caùc vi sinh vaät nhö: naám moác, vi khuaån, naám men.

1.2.1. Phaân loaïi enzyme pectinase:

Döïa vaøo tính ñaëc hieäu, cô cheá taùc duïng vaø kieåu phaûn öùng cuûa enzyme, naêm 1966 Koller vaø Newkom ñaõ chia pectinase thaønh 2 nhoùm chính:

 Nhoùm enzyme hydrolase: goàm pectinesterase vaø

polygalacturonase

 Nhoùm enzyme trans-eliminase: goàm pectinlyase vaø

pectatelyase

1.2.1.1. Nhoùm enzyme hydrolase:

Laø nhoùm enzyme xuùc taùc quaù trình thuûy phaân pectin.

Goàm coù caùc enzyme sau:

-7-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

 Polygalacturonase

 Pectinesterase

a)      Enzyme polygalacturonase (vieát taét PG):

Laø enzyme xuùc taùc thuûy phaân lieân keát (cid:0) -1,4-D- galacturosiduronic giöõa caùc goác acid galacturonic trong pectin vaø acid polygalacturonic, taùch caùc goác D-galacturonic thaønh caùc phaân töû D-galacturonic töï do. Coù 2 loaïi polygalacturonase laø endo-polygalacturonase vaø exo-polygalacturonase:

 Endo-polygalacturonase: laø enzyme coù taùc duïng caét giöõa maïch caùc phaân töû pectin hoaëc caùc phaân töû acid polygalacturonic, taïo thaønh caùc maïch ngaén hôn laøm cho ñoä nhôùt cuûa dung dòch pectin giaûm ñi nhieàu. Thoâng thöôøng, endo-polygalacturonase chæ xuùc taùc thuûy phaân lieân keát (cid:0) - 1,4-D-galacturosiduronic giöõa 2 nhoùm acid galacturonic khoâng bò methyl hoùa [13].

 Exo-polygalacturonsase: laø enzyme coù khaû naêng phaân caét daàn daàn töøng goác acid galacturonic baét ñaàu töø ñaàu khoâng khöû cuûa maïch. Enzyme naøy khoâng laøm giaûm roõ reät ñoä nhôùt cuûa dung dòch pectin, nhöng laøm taêng haøm löôïng caùc chaát chieát coù phaân töû löôïng thaáp trong quaù trình trích ly dòch quaû.

Khoâng nhöõng theá, moät soá endo vaø exo-polygalacturonase coù theå taùc duïng ñöôïc treân pectin ñaõ methyl hoùa. Do ñoù coù teân laø endo hay exo-polymethylgalacturonase. Moät soá khaùc chæ coù khaû naêng phaân caét nhöõng cô chaát pectin ñaõ maát heát nhoùm methyl, nghóa laø chæ taùc duïng treân acid polygalacturonic. [12]

Endo-polygalacturonase coøn coù teân nöõa

laø polygalacturonase “dòch hoùa”. Coøn exo-polygalacturonase coøn coù teân laø polygalacturonase “ñöôøng hoùa”. Ñoù laø do cô cheá thuûy phaân cuûa chuùng töông töï nhö (cid:0) -amylase vaø glucoamylase treân cô chaát amylo cuûa tinh boät.

Caùc saûn phaåm cuûa quaù trình thuûy phaân bôûi polygalacturonase coù theå laø caùc acid polygalacturonic maïch

-8-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

ngaén, tetra-galacturonic, tri-galacturonic, di-galacturonic, mono- galacturonic...

+.[2]

pH toái öu cuûa caùc polygalacturonase khaù khaùc nhau vaø phuï thuoäc vaøo nguoàn thu nhaän enzyme. Vaø chuùng hoaït ñoäng toát chuû yeáu trong vuøng pH töø 4 ñeán 6.

COOH O

COOH O

COOH O

H

COOH O

H

H

COOH O

COOH O

OH

H

COOH O

COOH O

H

H

O

O

OH

H

OH

H

H OH

H

O

O

H OH

H

H OH

H

H OH

O

H

O

+

H

O

H OH

H

H OH

H

H

H OH

H

H OH

H

H

H

H

OH

H

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

exo-polygalacturonase

Nhieät ñoä toái thích cuûa ña soá polygalacturonase chuû yeáu naèm trong vuøng töø 40-450C, enzyme bò voâ hoaït ôû 55-650C. Caùc polygalacturonase ñöôïc hoaït hoùa bôûi caùc cation cuûa kim loaïi kieàm vaø NH4

COOH O

COOH O

COOH O

COOH O

COOH O

H

H

COOH O

H

O

O

H OH

O

H

H OH

O

H

O

O

H OH

H

H OH

H

H OH

H

O

H

OH

H OH

H

H

H

H

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

H

OH

endo-polygalacturonase

COOH O

COOH O

+

OH

O

O

H OH

H

OH

H

H

H

OH

H

OH

Cô cheá taùc duïng cuûa exo-polygalacturonase

Cô cheá taùc duïng cuûa endo-polygalacturonase.

b)      Enzyme pectinesterase (vieát taét laø PE):

Ñaây laø enzyme xuùc taùc söï thuûy phaân lieân keát ester trong phaân töû pectin ñeå taïo thaønh methanol vaø acid polygalacturonic.

Pectinesterase cuûa naám moác seõ thuûy phaân tröôùc nhaát laø nhoùm methylester naèm ôû giöõa hai nhoùm carboxyl töï do. Vaø enzyme seõ thuûy phaân laàn löôït caùc lieân keát ester doïc theo phaân töû pectin. Ngöôøi ta cuõng thaáy raèng PE cuûa naám moác thuûy phaân pectin saâu saéc hôn PE cuûa thöïc vaät. Hoaït ñoä cuûa PE phuï thuoäc nhieàu vaøo möùc ñoä ester hoùa cuûa pectin vaø tyû leä thuaän vôùi möùc ñoä ester hoùa. Ví duï nhö PE

-9-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

töø naám moác A. niger, chæ xuùc taùc cô chaát pectin ester hoùa ôû möùc ñoä cao (DE khoâng nhoû hôn 70%).

pH toái öu cuûa PE töø naám moác dao ñoäng töø 4,5 ñeán 5,5. Traùi laïi, pH toái öu cuûa PE töø thöïc vaät thöôøng naèm trong khoaûng töø 6 ñeán 8.

Nhieät ñoä toái öu cuûa PE töø naám moác thay ñoåi töø 40 ñeán 450C. Khi taêng nhieät ñoä ñeán 55-620C thì enzyme bò voâ hoaït. Trong khi ñoù, PE thu nhaän töø thöïc vaät laïi coù nhieät ñoä toái öu cao hôn, töø 55-600C.

pectinestearase

COOH O

COOH O

COOH O

H

COOH O

H

H

H

O

O

H OH

H

O

O

H OH

H

H OH

H

O

COOCH3

H OH

H

H

COOH O

H

COOH O

O

H

COOH O

H

H

H

OH

H

H

O

OH

H

OH

O

H

OH

H OH

H

O

O

H OH

H

H OH

H

O

H OH

H

H

H

H

+

OH

H

OH

H

OH

H

OH

CH3OH

Caùc ion Na+, Ca2+, K+ coù taùc duïng hoaït hoùa enzyme PE töø naám moác, coøn caùc ion: Hg2+, Pb2+, Fe3+, Al3+ seõ coù taùc duïng kieàm haõm hoaït tính cuûa PE.

Cô cheá taùc duïng cuûa enzyme pectinesterase

1.2.1.2. Nhoùm enzyme trans­eliminase:

Laø nhoùm enzyme xuùc taùc söï phaân caét caùc hôïp chaát pectin baèng con ñöôøng khaùc con ñöôøng thuûy phaân, keát quaû laø taïo ra caùc saûn phaåm coù chöùa goác galacturonic coù chöùa noái ñoâi (4-dezoxy-5-cetogalacturonic).

Caùc enzyme trans-eliminase thöôøng gaëp goàm coù:  Pectinlyase (poly-[1,4-(cid:0) -D methoxygalacturonide] lyase): laø

enzyme phaân caét hôïp chaát pectin.

 Pectatelyase (poly-[1,4-(cid:0) -D galacturonide] lyase): laø enzyme

phaân caét hôïp chaát polygalacturonate (hay pectate).

Trans-eliminase töø nhöõng nguoàn khaùc nhau thì coù caùc tính chaát khaùc nhau. Ví duï nhö trans-eliminase töø naám moác hoaït ñoäng toái öu ôû pH 5.2, traùi laïi trans-eliminase töø vi khuaån hoaït ñoäng toái öu ôû pH töø 7 ñeán 8.5.

-10-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

Cô cheá taùc duïng cuûa enzyme pectatelyase

-11-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

Cô cheá taùc duïng cuûa enzyme pectinlyase.

1.2.2. Caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp enzyme

pectinase ôû vi sinh vaät:

Hieän nay trong saûn xuaát coâng nghieäp, caùc cheá phaåm pectinase chæ ñöôïc thu nhaän töø vi sinh vaät. Do ñoù trong luaän vaên toát nghieäp naøy, chuùng toâi chæ ñeà caäp ñeán coâng ngheä saûn xuaát cheá phaåm pectinase theo phöông phaùp vi sinh.

1.2.2.1. Vi sinh vaät söû duïng ñeå sinh toång hôïp pectinase:

Ngöôøi ta thöôøng thu nhaän pectinase töø canh tröôøng beà maët hoaëc töø canh tröôøng beà saâu cuûa naám moác. Caùc vi khuaån vaø naám men cuõng toång hôïp ñöôïc enzyme naøy:

 Naám moác: Nhieàu loaøi naám moác coù theå saûn xuaát ra enzyme pectinase. Loaøi naám moác Aspergillus   niger laø ñöôïc söû duïng nhieàu nhaát. Ngoaøi ra, ngöôøi ta coøn söû duïng caùc loaøi naám moác khaùc nhö Aspergillus oryzae, Aspergillus awamori, Thermoascus  aurantiacus  vaø Penicillium   expansum.... Caùc loaøi naám moác khaùc nhau thöôøng sinh toång hôïp caùc kieåu enzyme khaùc nhau. Ví duï nhö: A. niger chuû yeáu laø toång hôïp ra pectinesterase. Pen.citrimin  taïo ra chuû yeáu laø polygalacturonase.

 Vi khuaån: moät soá loaøi vi khuaån coù khaû naêng sinh toång hôïp enzyme pectinase nhö: Erwinia caralovora, Bacillus polymyxa, caùc loaøi thuoäc gioáng  Streptomyces...

-12-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

 Naám men: moät soá loaøi naám men cuõng coù theå taïo ra enzyme pectinase. Saccharomyces cerevisiae  vaø  Saccharomyces fragilis coù khaû naêng taïo ra endo-polygalacturonase [12]

Toùm laïi, tuøy vaøo vi sinh vaät söû duïng maø ta coù theå thu nhaän ñöôïc hoãn hôïp enzyme pectinase coù nhöõng ñaëc tính khaùc nhau.

1.2.2.2. AÛnh   höôûng   cuûa   caùc   caáu   töû   trong   moâi   tröôøng   dinh

döôõng:[2]

Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy aûnh höôûng ñeán hoaït ñoäng soáng cuûa vi sinh vaät vaø quaù trình sinh toång hôïp enzyme pectinase. Vi sinh vaät muoán phaùt trieån caàn phaûi coù caùc nguoàn dinh döôõng cung caáp caùc hôïp chaát chöùa C, N, H vaø O. Trong thaønh phaàn moâi tröôøng cuõng phaûi coù chöùa caùc chaát khoaùng nhö Mg, Ca, P, S, Fe, K,..

a)      AÛnh höôûng cuûa nguoàn Carbon:

Enzyme pectinase cuõng thuoäc nhoùm enzyme caûm öùng nhö caùc enzyme thuûy phaân khaùc. Do ñoù, vieäc choïn ñuùng cô chaát cho vi sinh vaät söû duïng laø raát quan troïng. Nguoàn carbon thöôøng söû duïng nhaát laø caùc polysaccharide, disaccharide, monosaccharide…

Ñaëc bieät, söï coù maët cuûa pectin trong moâi tröôøng laø khoâng theå thieáu, vì pectin vöøa coù vai troø laø chaát caûm öùng laïi vöøa laø nguoàn cung caáp carbon cho cho vi sinh vaät phaùt trieån. Ta coù theå boå sung pectin vaøo moâi tröôøng baèng caùch theâm vaøo moâi tröôøng pectin hoaëc nhöõng nguyeân lieäu giaøu pectin nhö boät taùo, baõ cuû caûi ñöôøng, baõ mía hay voû cuûa caùc loaïi quaû coù muùi…

Ñoái vôùi moät soá loaøi vi sinh vaät, khi trong moâi tröôøng coù söû duïng phoái hôïp giöõa pectin vôùi caùc loaïi ñöôøng nhö glucose, saccharose, fructose thì ñöôøng coù theå gaây öùc cheá quaù trình sinh toång hôïp enzyme pectinase. Ví duï nhö khi ta nuoâi caáy A. niger, neáu moâi tröôøng chæ coù nguoàn carbon laø pectin thì hoaït tính cuûa PE laø 0,127 UI/ml vaø cuûa PG laø 0,055UI/ml sau 48 giôø nuoâi caáy. Nhöng khi theâm glucose vaøo moâi tröôøng

-13-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

vôùi haøm löôïng laø 5g/l thì hoaït tính cuûa PE chæ coøn khoaûng 0,08 UI/ml vaø cuûa PG laø 0,03 UI/ml [16].

b)      AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô:

Nguoàn thöùc aên nitô cuõng coù vai troø raát quan troïng trong quaù sinh toång hôïp enzyme pectinase. Nguoàn nitô söû duïng coù theå laø nöôùc chieát ngoâ, boät ñaäu naønh, boät mì, dòch thuûy phaân casein, pepton… hay laø caùc hôïp chaát nitô voâ cô. Nguoàn nitô voâ cô söû duïng coù theå ôû daïng muoái amon hay muoái nitrat nhö (NH4)2SO4, NH4NO3, (NH4)2HPO4, NaNO3… Vieäc söû duïng caùc loaïi muoái amon coù theå laøm giaûm pH cuûa moâi tröôøng + töø trong quaù trình nuoâi caáy do quaù trình vaän chuyeån ion NH 4 moâi tröôøng vaøo beân trong teá baøo chaát cuûa vi sinh vaät xaûy ra keøm theo vôùi quaù trình vaän chuyeån ngöôïc ion H+ töø beân trong teá baøo chaát ra moâi tröôøng beân ngoaøi. Tæ leä thích hôïp giöõa carbon vaø nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy thay ñoåi tuøy theo loaøi vi sinh vaät söû duïng, thoâng thöôøng tæ leä naøy laø 7:1 [4].

Caùc muoái amon vaø caùc hôïp chaát höõu cô chöùa nitô ñöôïc vi sinh vaät haáp thu deã daøng vaø nhanh choùng söû duïng chuùng, coøn nitô cuûa nitrate seõ ñöôïc khöû thaønh daïng nitrite roài môùi ñöôïc vi sinh vaät haáp thu [2].

Ngöôøi ta nhaän thaáy nguoàn nitô söû duïng cuõng aûnh höôûng khaù nhieàu leân hoaït tính cuûa vi sinh vaät. Ví duï nhö: khi khaûo saùt aûnh höôûng cuûa caùc nguoàn nitô khaùc nhau leân hoaït tính pectinase cuûa Streptomyces   sp,  sau 24 giôø nuoâi caáy, ngöôøi ta thu ñöôïc keát quaû sau: [17]

Baûng 2.1: AÛnh höôûng cuûa nguoàn Nitô leân hoaït tính

enzyme pectinase cuûa Streptomyces sp.

Nguoàn Nitô (haøm löôïng: 0,5%w/v) Hoaït tính pectinase (UI/l)

Peptone 66

Tryptone 65

57

Chieát xuaát naám men 50

NH4NO3

-14-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

48 (NH4)2HPO4

60 NaNO3

54 KNO3

62 (NH4)2SO4

Vieäc löïa choïn nguoàn nitô vaø haøm löôïng söû duïng cho moãi loaøi vi sinh vaät seõ ñöôïc xaùc ñònh baèng phöông phaùp thöïc nghieäm.

c)      AÛnh höôûng cuûa caùc nguyeân  toá khaùc:

Söï coù maët cuûa caùc chaát khoaùng ña löôïng vaø vi löôïng cuõng aûnh höôûng lôùn ñeán quaù trình sinh toång hôïp enzyme cuûa vi sinh vaät. Do chuùng laø thaønh phaàn caáu taïo neân moät soá hôïp chaát vaø cô quan trong teá baøo.

Ví duï nhö phosphor, löu huyønh raát caàn cho vi sinh vaät, vì chuùng tham gia vaøo thaønh phaàn cuûa nhöõng chaát quan troïng cuûa teá baøo (a. nucleic, protein). Ngoaøi ra, phosphor coøn tham gia vaøo raát nhieàu phaûn öùng trao ñoåi chaát cuûa teá baøo. Caùc nguyeân toá nhö saét, keõm, ñoàng, coban… raát caàn thieát cho vi sinh vaät ñeå caáu taïo neân moät soá loaïi enzyme duø raèng haøm löôïng cuûa caùc nguyeân toá aáy raát nhoû.

Caùc nguyeân toá ña löôïng ñöôïc ñöa vaøo thaønh phaàn moâi tröôøng ôû daïng muoái voâ cô, coøn caùc nguyeân toá vi löôïng ñöôïc ñöa vaøo töø nguoàn nöôùc maùy, nöôùc gieáng hoaëc nguyeân lieäu höõu cô.

Ngöôøi ta nhaän thaáy noàng ñoä caàn thieát cuûa caùc muoái khoaùng ñoái vôùi vi khuaån, naám moác thöôøng thay ñoåi trong phaïm vi sau ñaây:

Baûng 2.2: Noàng ñoä caùc chaát khoaùng caàn thieát cho vi

sinh vaät phaùt trieån [7]

Muoái khoaùng Noàng ñoä caàn thieát (g/l)

Ñoái vôùi vi khuaån Ñoái vôùi naám moác

0,2-0,5 1-2 K2HPO4

0,2-0,5 1-2 KH2PO4

0,1-0,2 0,2-0,5 MgSO4.7H2O

-15-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

0,005-0,01 0,02-0,1 MnSO4.4H2O

0,005-0,01 0,05-0,2 FeSO4.7H2O

0,001-0,005 0,02-0,1 ZnSO4.7H2O

0,01-0,03 0,01-0,1 CaCl2

0,001-0,005 0,01-0,05 CaSO4.5H2O

Thaønh phaàn tham khaûo cuûa moät soá moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät theo phöông phaùp beà saâu vôùi muïc ñích sinh toång hôïp enzyme pectinase ñöôïc trình baøy trong baûng 2.3.

-16-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

Baûng 2.3: Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy vi sinh vaät

theo phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu [11,12,14,18]

A. niger A. oryzae Bacillus sp Streptomyces sp

Boät mì: 40g/l Petin: 2,5g/l Glucose: 5g/l

Pectin: 15g/l (NH4)2SO4: 2g/l Petin: 10g/l chieát

Chaát naám men: 5g/l KH2PO4: 4g/l

Chaát chieát naám men: 10g/l KH2PO4: 1g/l NaHPO4: 0,2g/l

Chaát chieát naám men: 0,5g/l CaCl2: 0,05g/l FeSO4: 0,1g/l

pH: 7,2 MgSO4.7H2O: 0,1g/l (NH4)2SO4: 5g/l CaCl2: 0,01g/l

pH: 8 KH2PO4: 2,5g/l

MnSO4: 37,8mg/l MgSO4: 0,5g/l

H3BO3: 10mg/l

FeSO4.7H2O:6x1 0-5 g/l pH: 4,5

ZnSO4: 6x10-5 g/l

MnSO4: 10-6 g/l

pH: 4

Ngoaøi ra, caùc yeáu toá khaùc nhö pH cuûa moâi tröôøng dinh döôõng, phöông phaùp nuoâi caáy, nhieät ñoä vaø ñieàu kieän nuoâi caáy... ñeàu aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp enzyme pectinase.

1.2.3. Phöông phaùp thu nhaän enzyme pectinase: [2, 4]

Ñeå thu ñöôïc enzyme pectinase töø vi sinh vaät, ta coù 2

phöông phaùp nuoâi caáy:

 Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët

 Phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu

1.2.3.1. Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët:

Trong phöông phaùp naøy, ngöôøi ta thöôøng söû duïng vi sinh vaät laø naám moác hoaëc xaï khuaån. Vi sinh vaät phaùt trieån vaø bao phuû treân beà maët caùc haït chaát dinh döôõng raén ñaõ ñöôïc laøm aåm. Vi sinh vaät seõ laáy thöùc aên töø nhöõng chaát

-17-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

coù trong moâi tröôøng vaø söû duïng oxy phaân töû cuûa khoâng khí ñeå hoâ haáp. Moâi tröôøng ñeå nuoâi caáy vi sinh vaät thöôøng laø caùm mì, caùm gaïo, baõ caø pheâ, haït ñaäu ñaõ ñöôïc haáp chín. Trong nhöõng nguyeân lieäu naøy coù chöùa nhieàu chaát dinh döôõng vaø chuùng cuõng coù caáu truùc caàn thieát ñeå giöõ aåm cho moâi tröôøng. Trong ñieàu kieän ñoù, heä sôïi naám cuûa vi sinh vaät seõ phaùt trieån nhanh choùng vaø ñoàng boä, löôïng enzyme ñöôïc tích luõy nhieàu nhaát trong canh tröôøng sau 48-72 giôø. Ñeå taêng hoaït ñoä cuûa enzyme pectinase, ta coøn theâm vaøo moâi tröôøng nhöõng vaät lieäu coù chöùa nhöõng chaát caûm öùng caàn thieát giaøu pectin nhö boät caø roát, boät taùo, hay pectin, …

Muoán cho moâi tröôøng ñaït ñöôïc ñoä thoaùng khí, ngöôøi ta coù theå theâm traáu, muøn cöa,… nhaát laø trong tröôøng hôïp söû duïng caùm mòn ñeå laøm moâi tröôøng. Tuy nhieân, nhöõng phuï lieäu naøy coù theå laø nhöõng chaát caûm öùng cho quaù trình sinh toång hôïp cellulase vaø hemicellulase. Thöôøng nhöõng phuï lieäu naøy seõ laøm ngheøo moâi tröôøng ñi, do ñoù neáu theâm vaøo nhieàu hôn 15-20% thì seõ laøm giaûm hoaït ñoä cuûa caùc enzyme pectinase trong canh tröôøng beà maët. Neáu tröôøng hôïp löôïng chaát dinh döôõng trong caùm gaïo bò giaûm ñi do theâm phuï lieäu thì coù theå boå sung theâm nguoàn nitô voâ cô, phosphor cuõng nhö caùc nguyeân lieäu höõu cô khaùc nhö malt, nöôùc chieát ngoâ, dòch khoai taây,…..

Trong phöông phaùp nuoâi caáy beà maët, caùc yeáu toá khaùc nhö ñoä aåm cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy, ñoä tôi xoáp, nhieät ñoä, thôøi gian nuoâi… cuõng aûnh höôûng ñeán quaù trình sinh toång hôïp enzyme. Haøm aåm toái öu cuûa moâi tröôøng neáu vöôït quaù 70% thì moâi tröôøng seõ dính beát laïi gaây khoù khaên cho vieäc thoâng khí. Nhöng neáu ñoä aåm chæ 45-50% thì moâi tröôøng seõ khoâ nhanh neân cuõng laøm giaûm khaû naêng sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp enzyme cuûa naám moác. Khi naám moác ñöôïc nuoâi caáy trong ñieàu kieän tieät truøng nghieâm ngaët thì hoaït ñoä cuûa enzyme seõ toát nhaát khi haøm aåm vaøo khoaûng 65-68%. Vì vaäy, vieäc duy trì haøm aåm toái öu cuûa moâi tröôøng trong suoát quaù trình phaùt trieån cuûa vi sinh vaät seõ raát quan troïng vì giaûm hay taêng haøm aåm quaù möùc cuõng seõ laøm löôïng enzyme taïo ra bò giaûm ñi.

-18-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

Quaù trình nuoâi caáy naám moác ñeå taïo enzyme trong phöông phaùp nuoâi caáy beà maët thöôøng keùo daøi töø 48-72 giôø.

ÔÛ moät soá loaøi thuoäc gioáng Aspergillus, söï taïo thaønh löôïng enzyme toái ña seõ truøng vôùi söï baét ñaàu taïo ra ñænh baøo töû, do ñoù cho ngöøng quaù trình nuoâi caáy vaøo luùc naøy laø thích hôïp. Trong moät soá tröôøng hôïp khaùc, söï tích luõy enzyme coù theå coøn tieáp tuïc keùo daøi trong caû thôøi gian taïo ra ñænh baøo töû moät caùch maïnh meõ. Vaø canh tröôøng naám moác hoaït ñoäng kieåu naøy thöôøng coù nhieàu ñænh baøo töû. Do ñoù khi saáy, nghieàn vaø bao goùi canh tröôøng thoâ seõ laøm cho khoâng khí bò nhieãm bôûi ñænh baøo töû cuûa gioáng vi sinh vaät söû duïng. Ñeå traùnh hieän töôïng naøy, taát caû thieát bò phaûi kín vaø coù cô caáu huùt buïi. Toát hôn caû laø trong saûn xuaát enzyme, choïn nhöõng chuûng naám moác taïo ñænh baøo töû yeáu.

Toaøn boä chu trình phaùt trieån cuûa naám moác treân moâi

tröôøng raén coù theå chia thaønh 3 thôøi kì sau:

 Trong 10-14 giôø ñaàu, xaûy ra söï naûy maàm cuûa baøo töû gioáng vaø baét ñaàu moïc naám. Trong thôøi kyø naøy, phoøng nuoâi caáy caàn giöõ ôû nhieät ñoä khoâng döôùi 28-300C ñeå khoâng kìm haõm söï phaùt trieån ban ñaàu cuûa chuùng.

 Qua thôøi gian treân, heä sôïi naám baét ñaàu phaùt trieån nhanh. Thôøi kyø naøy keùo daøi töø giôø thöù 14 ñeán giôø thöù 48. Naám moác phaùt trieån maïnh meõ, söû duïng moät löôïng lôùn caùc chaát dinh döôõng, hoâ haáp raát maïnh vaø löôïng nhieät thoaùt ra nhieàu. Vì vaäy trong lôùp canh tröôøng nhieät ñoä taêng leân ñeán 37-400C vaø coù theå coøn cao hôn, tuøy thuoäc vaøo ñoä daøy cuûa lôùp. Do ñoù caàn phaûi thoåi khoâng khí ñeå ñieàu tieát nhieät ñoä cuûa lôùp canh tröôøng.

 Thôøi kì thöù 3 keùo daøi töø 1-20 giôø. Trong thôøi kyø naøy, quaù trình trao ñoåi chaát xaûy ra khoâng maïnh meõ laém vaø daàn daàn yeáu ñi, löôïng nhieät thoaùt ra beù hôn, nhöng söï taïo neân enzyme coù theå coøn xaûy ra. Phuï thuoäc vaøo tính chaát sinh lyù cuûa vi sinh vaät söû duïng vaø thôøi ñieåm keát thuùc sinh toång hôïp enzyme, ta coù theå laøm ngöøng söï phaùt trieån cuûa

-19-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

naám moác vaøo moät thôøi gian xaùc ñònh sao cho hoaït ñoä cuûa enzyme laø cao nhaát.

Canh tröôøng beà maët cuûa naám moác sau ñoù ñem nghieàn nhoû trong maùy nghieàn vaø saáy khoâ ñeán ñoä aåm 8-12% ñeå söû duïng. Cheá phaåm enzyme döôùi daïng naøy laø cheá phaåm thoâ.

1.2.3.2. Phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu:

Trong phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu, ngöôøi ta cho vi sinh vaät phaùt trieån trong moâi tröôøng loûng. Caùc vi sinh vaät ñöôïc söû duïng trong nuoâi caáy beà saâu goàm coù vi khuaån, naám men vaø caû naám sôïi. Thaønh phaàn dinh döôõng cuûa moâi tröôøng loûng thích hôïp cho moãi loaøi vi sinh vaät seõ khaùc nhau.

Nguoàn carbon thöôøng duøng laø pectin, boät taùo hay boät caø roát. Nguoàn nitô thöôøng duøng laø nöôùc chieát ngoâ, nöôùc chieát malt, chaát chieát naám men hay nguoàn nitô voâ cô.

Quaù trình sinh toång hôïp caùc enzyme trong canh tröôøng beà saâu dieãn ra trong khoaûng thôøi gian töø 48-120 giôø tuøy vaøo gioáng vi sinh vaät söû duïng [11,12,13,14, 18].

Trong saûn xuaát hieän nay, ngöôøi ta thöôøng söû duïng nhoùm vi sinh vaät hieáu khí. Moâi tröôøng nuoâi caáy phaûi luoân ñöôïc suïc khí vaøo lieân tuïc vaø khuaáy ñeàu baèng caùnh khuaáy (neáu ta söû duïng boàn leân men loûng quy moâ coâng nghieäp) hoaëc moâi tröôøng phaûi luoân ñöôïc laéc ñaûo (neáu ta söû duïng caùc bình erlen ôû quy moâ phoøng thí nghieäm) Muïc ñích cuûa quaù trình naøy laø nhaèm cung caáp ñuû khí oxy cho vi sinh vaät phaùt trieån.

Vì enzyme pectinase laø enzyme ngoaïi baøo vaø ñöôïc tieát ra moâi tröôøng beân ngoaøi, neân ta coù theå thu ñöôïc enzyme pectinase töø phaàn canh tröôøng loûng sau khi loïc taùch boû sôïi naám vaø caùc chaát khoâng hoøa tan. Trong tröôøng hôïp naøy, cheá phaåm enzyme thu ñöôïc laø enzyme thoâ.

pH cuûa moâi tröôøng cuõng laø 1 yeáu toá aûnh höôûng raát lôùn ñeán quaù trình sinh toång hôïp enzyme pectinase vì moãi vi sinh vaät seõ coù moät pH toái öu ñeå noù sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp enzyme. pH thích hôïp cho naám moác laø töø 4-5 vaø

-20-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

vôùi vi khuaån laø 7-8. Moâi tröôøng dinh döôõng ñeå nuoâi caáy beà saâu phaûi luoân chöùa ñaày ñuû nhöõng muoái voâ cô caàn thieát cho vi sinh vaät. Thaønh phaàn vaø tính chaát cuûa caùc muoái voâ cô coù trong canh tröôøng vaø söï haáp thuï muoái cuûa vi sinh vaät seõ laøm thay ñoåi giaù trò pH canh tröôøng trong quaù trình nuoâi caáy.

Ví duï nhö khi khaûo saùt aûnh höôûng giaù trò pH ban ñaàu cuûa moâi tröôøng leân hoaït tính cuûa polygalacturonase thu nhaän töø Aspergillus oryzae, ngöôøi ta thu ñöôïc keát quaû sau:

Keát quaû khaûo saùt aûnh höôûng cuûa pH moâi tröôøng ban ñaàu ñeán hoaït tính enzyme polygalacturonase sinh toång hôïp töø A.  oryzae [15]

Nhìn vaøo ñoà thò ta thaáy giaù trò pH 4.0 ñöôïc xem laø thích hôïp nhaát cho quaù trình sinh toång hôïp enzyme pectinase cuûa chuûng naám moác söû duïng.

1.2.3.3. So saùnh phöông phaùp nuoâi caáy beà maët vaø phöông phaùp

nuoâi caáy beà saâu:

Khi so saùnh 2 phöông phaùp, ta thaáy phöông phaùp nuoâi

caáy beà saâu coù 1 soá öu ñieåm sau:

 Haøm löôïng cô chaát soùt khoâng ñaùng keå, do ñoù ta coù

theå tieát kieäm chi phí saûn xuaát.

-21-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

 Trong quaù trình nuoâi caáy vi sinh vaät, ta seõ deã daøng hieäu chænh caùc giaù trò nhieät ñoä, pH… cuûa moâi tröôøng. Vì vaäy quaù trình sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp enzyme seõ toát hôn.

 Quaù trình tinh saïch enzyme khoâng caàn qua giai ñoaïn trích

ly.

 Phöông phaùp nuoâi caáy beà maët ít chieám dieän tích nhaø xöôûng, toán ít nhaân coâng hôn vaø deã daøng cô khí hoaù, töï ñoäng hoùa hôn so vôùi phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu.

Hieän nay, trong coâng ngheä enzyme, haàu heát caùc nhaø

maùy söû duïng phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu.

1.2.4. ÖÙng duïng cuûa cheá phaåm  enzyme pectinase: [2]

Pectinase ñöôïc xem nhö laø moät trong nhöõng cheá phaåm enzyme quan troïng trong coâng ngheä thöïc phaåm vaø thöôøng ñöôïc söû duïng trong caùc ngaønh nhö: saûn xuaát röôïu vang vaø nöôùc traùi caây leân men coù ñoä coàn thaáp, saûn xuaát nöôùc rau quaû khoâng coàn, saûn xuaát caùc saûn phaåm töø quaû: möùt nhöø, möùt ñoâng, saûn xuaát caø pheâ, ca cao... Caùc lónh vöïc öùng duïng cuûa enzyme pectinase raát ña daïng vaø coù theå quy veà ba muïc ñích chính sau:

1.2.4.1. Naâng cao hieäu suaát thu hoài chaát chieát töø rau quaû:

Trích ly hoaëc eùp rau quaû ñeå thu hoài chaát chieát laø 1 trong nhöõng coâng ñoaïn quan troïng caû veà maët kyõ thuaät laãn kinh teá trong coâng ngheä cheá bieán rau quaû. Hieäu suaát thu hoài chaát chieát phuï thuoäc vaøo nhieàu yeáu toá nhö: ñoä thaåm thaáu cuûa teá baøo moâ quaû, caáu taïo teá baøo, moâ thöïc vaät vaø tính chaát cô lyù cuûa nguyeân lieäu, ñoä nhôùt cuûa dòch baøo, ñoä chaéc cuûa thòt quaû, thaønh phaàn, haøm löôïng vaø söï phaân boá cuûa pectin trong rau quaû… Thoâng thöôøng, hieäu suaát thu hoài chaát chieát töø rau quaû chæ ñaït döôùi 70%, nhöng neáu ta boå sung cheá phaåm enzyme pectinase trong quaù trình xöû lyù thì seõ laøm taêng hieäu suaát thu hoài chaát chieát leân theâm 15-25%. Neáu trong khoái rau quaû nghieàn coøn pectin toàn taïi traïng thaùi keo, khi eùp dòch quaû khoâng thoaùt trieät ñeå ra

-22-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

ngoaøi teá baøo ñöôïc. Nhôø pectinase phaân giaûi caùc chaát pectin (laø caùc chaát lieân keát caùc teá baøo trong moâ thöïc vaät) neân quaù trình chieát ruùt caùc chaát hoøa tan, chaát maøu, tanin seõ ñöôïc taêng leân.

1.2.4.2. Laøm trong vaø caûi thieän ñoä nhôùt cho caùc  saûn phaåm

thöùc uoáng töø rau quaû :

Söï coù maët cuûa pectin trong dòch rau quaû thu ñöôïc seõ taïo ñoä nhôùt cho saûn phaåm. Hôn nöõa pectin trong dung dòch ôû daïng keo neân deã gaây ñuïc saûn phaåm trong quaù trình baûo quaûn. Ñoái vôùi nöôùc quaû trong, ta caàn phaûi coù bieän phaùp xöû lyù, phaù huûy heä thoáng keo do pectin gaây neân trong dòch rau quaû, töùc laø phaûi khöû haøm löôïng pectin coù trong nöôùc quaû.

Coù nhieàu phöông phaùp ñeå laøm trong dòch rau quaû nhö ly taâm, laéng, loïc ñeå taùch pectin... hay lôïi duïng quaù trình töï laøm trong cuûa dòch rau quaû nhôø enzyme pectinase coù saün trong nguyeân lieäu. Enzyme pectinase seõ xuùc taùc phaûn öùng thuûy phaân pectin laøm giaûm kích thöôùc vaø troïng löôïng phaân töû. Khi ñoù ñoä trong cuûa dòch rau quaû seõ taêng leân. Tuy nhieân, quaù trình töï laøm trong naøy dieãn ra raát chaäm vaø khoâng trieät ñeå. Vôùi vieäc söû duïng cheá phaåm enzyme pectinase, ta coù theå khaéc phuïc hoaøn toaøn nhöõng baát lôïi naøy. Hôn nöõa, neáu söû duïng nhöõng phöông phaùp ly taâm, laéng hoaëc loïc ñeå laøm trong dòch rau quaû, khi keát thuùc quaù trình laøm trong, pectin seõ bò loaïi boû khoûi saûn phaåm. Neáu ta xöû lyù baèng phöông phaùp enzyme, pectin seõ chuyeån thaønh caùc chaát hoøa tan coù phaân töû löôïng thaáp, do ñoù laøm taêng haøm löôïng chaát khoâ cho dòch rau quaû.

Ñoàng thôøi vôùi taùc duïng laøm trong, söï thuûy phaân pectin do enzyme pectinase seõ taïo thaønh caùc acid polygalacturonic maïch ngaén hay caùc monogalacturonic, digalacturonic... Nhöõng saûn phaåm naøy khoâng coù khaû naêng keo hoùa, do ñoù laøm taêng haøm löôïng chaát chieát hoaø tan töø nguyeân lieäu vaøo dòch quaû, giaûm ñoä nhôùt vaø taêng ñoä beàn hoùa lyù cuûa saûn phaåm nöôùc quaû.

-23-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

1.2.4.3. Moät soá öùng duïng khaùc cuûa enzyme pectinase:

Trong saûn xuaát caùc saûn phaåm töø quaû (möùt nhöø, möùt ñoâng… ) pectinase cuõng coù vai troø quan troïng. Nhôø pectinase maø coù theå thu ñöôïc dòch quaû coù noàng ñoä ñaäm ñaëc. Chaúng haïn nhö dòch taùo coâ ñaëc ñeán 72 ñoä Brix, neáu khoâng taùch caùc pectin töï nhieân chöùa trong ñoù thì saûn phaåm seõ bò keo tuï moät caùch maïnh meõ vaø khoâng theå coâ ñaëc ñeán noàng ñoä cao ñöôïc.

Trong saûn xuaát caø pheâ vaø ca cao, ngöôøi ta duøng cheá phaåm pectinase ñeå hoã trôï quaù trình taùch lôùp keo ôû treân beà maët cuûa haït. Tröôùc ñaây ngöôøi ta chæ duøng heä vi sinh vaät coù trong nguyeân lieäu ñeå thöïc hieän nhöõng chuyeån hoùa phaân giaûi pectin, nhöng thöôøng quaù trình xaûy ra khoâng ñoàng ñeàu vaø hieäu quaû thaáp [13].

1.3. Ñaëc ñieåm cuûa moät soá loaøi naám moác trong sinh toång hôïp    enzyme pectinase:[7]

Ngoaøi ra, enzyme pectinase cuõng ñöôïc söû duïng keát hôïp vôùi cellulase trong ngaønh coâng nghieäp deät, ñaëc bieät laø trong lónh vöïc xöû lyù nhöõng loaïi vaûi sôïi thoâ nhö linen vaø ramie. [13]

Naám moác laø nhoùm vi sinh vaät hieáu khí. Chuùng phaùt trieån raát nhanh treân nhieàu nguoàn cô chaát höõu cô khi gaëp khí haäu noùng aåm. Treân nhieàu vaät lieäu voâ cô do bò dính buïi baån thì naám moác vaãn coù theå phaùt trieån ñöôïc.

Trong töï nhieân, naám moác phaân boá raát roäng raõi vaø tham gia tích cöïc vaøo caùc voøng tuaàn hoaøn vaät chaát, nhaát laø quaù trình phaân giaûi chaát höõu cô vaø hình thaønh chaát muøn.

Do ñaëc tính deã moïc vaø deã phaùt trieån neân raát nhieàu loaøi naám moác ñaõ ñöôïc söû duïng roäng raõi trong coâng nghieäp cheá bieán thöïc phaåm (laøm töông, nöôùc chaám, naáu coàn, röôïu sakeâ, saûn xuaát acid citric... ), trong coâng nghieäp enzyme (saûn xuaát amilase, protease, cellulase, pectinase... ), ngoaøi ra chuùng coøn ñöôïc öùng duïng trong caùc ngaønh khaùc

-24-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

nhö coâng nghieäp döôïc phaåm, saûn xuaát thuoác tröø saâu sinh hoïc, kích thích toá sinh tröôûng thöïc vaät…

Trong saûn xuaát enzyme pectinase, gioáng naám moác Aspergillus ñöôïc söû duïng khaù phoå bieán. Caùc loaøi thöôøng ñöôïc söû duïng laø A. niger, A. oryzae, A. awamori, A. ficuum, A. japonicus…

 Gioáng Aspergillus

 Hoï Aspergillaceae

 Boä Moniliales

 Lôùp Fungi imperfecti

1.3.1. Aspergillus niger:

Aspergillus niger coù theå bình hai taàng. Khuaån laïc moïc khoâng lan nhanh treân moâi tröôøng Czapek, khuaån laïc nhìn baèng maét thöôøng coù maøu ñen nhö than. Ñænh baøo töû tröôûng thaønh coù hình caàu, phaàn lôùn coù kích thöôùc 4-5 m(cid:0) , xuø xì, khoâng ñeàu vôùi nhöõng gôø vaø gai.

A. niger laø moät trong nhöõng loaøi naám moác coù khaû naêng sinh nhieàu enzyme trong quaù trình phaùt trieån cuûa noù nhö: enzyme pectinase, protease, celluslase... Tuøy theo thaønh phaàn moâi tröôøng, chaát caûm öùng vaø ñieàu kieän nuoâi caáy maø noù taïo ra enzyme naøo vôùi haøm löôïng cao.

1.3.2. Aspergillus oryzae:

, nhöng coù theå tôùi 8 hoaëc 10 m(cid:0)

Khuaån laïc cuûa A. oryzae bieán ñoåi thaønh maøu luïc nhaït khi giaø treân moâi tröôøng Czapek. Theå bình khoâng coù hình chuøy. Khi theå bình coøn non thì coù maøu vaøng saùng, daïng hình tia loûng leûo, ña soá coù theå bình hai taàng. Cuoáng baøo töû thöôøng xuø xì, khoâng maøu. Ñænh baøo töû lôùn, ña phaàn coù kích thöôùc 4,5-7 m(cid:0) . Môùi ñaàu, baøo töû hình elip, roài thay ñoåi daàn daàn ñeán hình caàu, nhaün hoaëc xuø xì khoâng ñeàu.

1.3.3. Aspergillus awamori:

A. awamori coù theå bình hai taàng, khuaån laïc maøu naâu oâliu, hôi xaùm hoaëc naâu ñaäm khi coøn non, khi giaø thì khuaån laïc

-25-

CHÖÔNG 2: TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU

Luaän vaên toát nghieäp

nhanh choùng coù maøu naâu ñen ñaäm hoaëc hôi ñoû. Ñænh baøo töû coù ñöôøng kính döôùi 5 m(cid:0) , deït theo chieàu ngang. Khi tröôûng thaønh, cuoáng ñænh baøo töû phaàn lôùn daøi 1-1,5 m(cid:0) , ñænh baøo töû coù ñöôøng kính khoaûng 4-4,5 m(cid:0) .

-26-

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

CHÖÔNG 3: NGUYEÂN LIEÄU VAØ PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU: Nguyeân lieäu:

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

1.3.4. Vi sinh vaät söû duïng ñeå thu nhaän enzyme pectinase:

Loaøi naám moác Aspergillus   niger,   Aspergillus   oryzae   vaø   Aspergillus   awamori söû duïng trong luaän vaên do Phoøng thí nghieäm vi sinh, boä moân Coâng ngheä Thöïc phaåm vaø Phoøng thí nghieäm Coâng ngheä sinh hoïc, boä moân Coâng ngheä sinh hoïc cung caáp. Naám moác ñöôïc baûo quaûn theo phöông phaùp caáy chuyeàn ñònh kyø. Thôøi gian giöõa 2 laàn caáy chuyeàn lieân tieáp laø 3 thaùng.

1.3.5. Hoùa chaát:

 Nguoàn pectin: chuùng toâi söû duïng nguoàn pectin cuûa

haõng Degussa (Phaùp).

 Caùc hoùa chaát khaùc: NaNO3, KH2PO4, FeSO4, MgSO4, CaCl2, MnSO4, HBO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, (NH4)2HPO4, thuoác thöû DNS, thuoác thöû Folin, ZnSO4, Ba(OH)2. Caùc hoùa chaát naøy do caùc coâng ty Trung Quoác, chaâu AÂu vaø Myõ saûn xuaát.

1.3.6.         Moâi tröôøng ñeå giöõ gioáng:

Söû duïng moâi tröôøng Czapek cho caû ba loaïi naám moác.

Thaønh phaàn moâi tröôøng:

 Saccharose 30g

3g  NaNO3

1g  KH2PO4

0,5g  MgSO4

0,01g  FeSO4

 Thaïch 20g

 Nöôùc caát 1000ml

 pH 6

Cho thaïch vaøo nöôùc vaø ñun caùch thuûy cho ñeán khi thaïch tan hoaøn toaøn, khi ñoù, ta cho caùc thaønh phaàn coøn laïi vaøo vaø khuaáy cho tan ñeàu. Sau ñoù, ta kieåm tra laïi löôïng nöôùc cho

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

ñuû 1000ml vaø chænh pH moâi tröôøng. Chia moâi tröôøng vaøo caùc oáng nghieäm roài ñem ñi tieät truøng. Sau tieät truøng, khi moâi tröôøng coøn noùng, ta ñaët nghieâng oáng nghieäm ñeå taïo moâi tröôøng thaïch nghieâng roài baûo quaûn trong tuû laïnh.

1.3.7. Moâi tröôøng cô baûn ñeå nuoâi  caáy naám moác sinh toång hôïp

enzyme pectinase:

Chuùng toâi söû duïng moâi tröôøng loûng, thaønh phaàn cô baûn trong moâi tröôøng do MC Maldonado ñaõ ñeà nghò [16] – Nhoùm taùc giaû naøy ñaõ söû duïng moâi tröôøng coù thaønh phaån döôùi ñaây ñeå khaûo saùt quaù trình sinh toång hôïp pectinase ôû gioáng naám moác Aspergillus. Nguoàn C trong moâi tröôøng laø pectin. Nguoàn N laø muoái Sulphate ammonium. Ngoaøi ra, moâi tröôøng coøn chöùa moät soá nguyeân toá khoaùng khaùc cho naám moác phaùt trieån. Do naám moác sinh tröôûng trong moâi tröôøng acid neân giaù trò pH ñöôïc choïn laø 4.5.

Thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy:

 Pectin 15 g/l

2 g/l  (NH4)2SO4

4 g/l  KH2PO4

0,2 g/l  Na2HPO4

0,1 g/l  FeSO4

0,01 g/l  CaCl2

0,04 g/l  MnSO4

0,01 g/l  HBO3

 pH 4,5

Ñaàu tieân, chuùng toâi söû duïng moâi tröôøng cô baûn treân ñeå khaûo saùt khaû naêng sinh toång hôïp pectinase cuûa caùc loaøi naám moác khaùc nhau. Khi ñaõ choïn ñöôïc loaøi naám moác, tieáp theo chuùng toâi toái öu hoùa thaønh phaàn moâi tröôøng ñeå naâng cao hoaït tính enzyme trong canh tröôøng nuoâi caáy.

1.4. Phöông phaùp nghieân cöùu:

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

Giai ñoaïn 1: Choïn loaøi naám moác sinh toång hôïp pectinase vôùi hoaït tính cao nhaát. K haûo saùt 3 loaøi : A. oryzae, A. niger, A. awamori

Giai ñoaïn 2: K haûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon vaø nitô ñeán quaù trình sinh toång hôïp pectinase:

 Nguoàn carbon: Xaùc ñònh haøm löôïng pectin trong moâi tröôøng nuoâi caáy.  Nguoàn Nitô: Choïn nguoàn nitô voâ cô: K haûo saùt 4 muoái NaNO3, (NH4)2SO4,

NH4Cl, (NH4)2HPO4

Xaùc ñònh haøm löôïng nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy

Giai ñoaïn 3: Toái öu hoùa haøm löôïng nguoàn carbon vaø nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy naám moác sinh toång hôïp pectinase baèng phöông phaùp qui hoaïch thöïc nghieäm

Giai ñoaïn 4: Thöû öùng duïng cheá phaåm pectinase thoâ thu ñöôïc ñeå laøm giaûm ñoä nhôùt nöôùc traùi caây.

Sô ñoà nghieân cöùu thöïc nghieäm:

Hình 3.1: Sô ñoà nghieân cöùu

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

Thuyeát minh sô ñoà nghieân cöùu:

1.4.1.1. Giai ñoaïn 1: Choïn loaøi  naám moác sinh toång hôïp pectinase

coù hoaït tính cao nhaát

 Muïc ñích:

Khaûo saùt ñoäng hoïc quaù trình sinh toång hôïp endo vaø exopectinase cuûa 3 loaøi naám moác: A. oryzae, A. awamori, A. niger, söû duïng moâi tröôøng loûng. Treân cô sôû ñoù:

 Choïn ra loaøi naám moác cho pectinase (endo-

enzyme) coù hoaït tính cao nhaát.

 Choïn thôøi gian thích hôïp cho quaù trình nuoâi caáy.

 Thöïc hieän:

Nuoâi caáy 3 loaøi naám moác A. niger, A. oryzae, A. awamori trong moâi tröôøng coù thaønh phaàn trình baøy trong muïc 3.1.4. Nhieät ñoä nuoâi caáy laø 300C, thôøi gian nuoâi caáy laø 120 giôø. Cöù sau moãi 12 giôø, ta laáy maãu canh tröôøng vaø xaùc ñònh hoaït tính enzyme.

Ñeå thu dòch enzyme töø dòch canh tröôøng nuoâi caáy, chuùng toâi taùch heä sôïi naám baèng phöông phaùp loïc. Dòch enzyme seõ ñöôïc baûo quaûn ôû – 200 C (neáu caàn ).

1.4.1.2. Giai ñoaïn  2: Khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn carbon

vaø nitô ñeán quaù trình sinh toång hôïp pectinase:

(a) Thí   nghieäm   1:   Xaùc   ñònh   haøm   löôïng   pectin   trong   moâi

tröôøng nuoâi caáy:

 Muïc ñích:

Xaùc ñònh haøm löôïng pectin (nguoàn C vaø chaát caûm öùng) trong moâi tröôøng nuoâi ñeå hoaït tính pectinase (endo-enzyme) thu ñöôïc laø cao nhaát.

 Thöïc hieän:

Thöïc hieän 9 maãu thí nghieäm coù thaønh phaàn moâi tröôøng ñöôïc trình baøy trong muïc 3.1.4. Rieâng haøm löôïng pectin ñöôïc thay ñoåi nhö sau (%w/v): 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4; 4,5.

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

(b) Thí nghieäm 2: Choïn nguoàn nitô voâ cô cho moâi tröôøng

nuoâi caáy:

 Muïc ñích:

Choïn ra nguoàn nitô vöøa coù giaù thaønh reû, vöøa giuùp naám moác sinh toång hôïp pectinase (endo-enzyme) vôùi hoaït tính cao.

 Thöïc hieän:

Thöïc hieän 4 maãu thí nghieäm, töông ñöông vôùi 4 nguoàn

nitô sau: NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl, (NH4)2HPO4.

ÔÛ thí nghieäm naøy, chuùng toâi söû duïng moâi tröôøng nuoâi caáy coù thaønh phaàn trình baøy trong muïc 3.1.4, tuy nhieân söû duïng haøm löôïng pectin nhaän ñöôïc töø thí nghieäm 1. Haøm löôïng caùc nguoàn nitô laø 0,2% (w/v).

(c) Thí nghieäm 3: Xaùc ñònh   haøm löôïng nguoàn nitô trong

moâi tröôøng nuoâi caáy:

 Muïc ñích:

Xaùc ñònh haøm löôïng nitô thích hôïp trong moâi tröôøng ñeå naám moác phaùt trieån vaø cho pectinase (endo-enzyme) coù hoaït tính cao nhaát.

 Thöïc hieän:

Töø thí nghieäm 2, ta choïn ñöôïc nguoàn nitô thích hôïp. Sau ñoù chuùng toâi thöïc hieän 5 maãu thí nghieäm töông ñöông vôùi haøm löôïng nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy nhö sau: 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 %(w/v).

Caùc thaønh phaàn khaùc cuûa moâi tröôøng ñöôïc trình baøy

trong muïc 3.1.4.

1.4.1.3. Giai ñoaïn 3: Toái öu hoùa  haøm löôïng nguoàn carbon vaø nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy naám moác sinh toång hôïp pectinase baèng phöông   phaùp qui hoaïch thöïc nghieäm:

 Muïc ñích:

Khaûo saùt söï aûnh höôûng ñoàng thôøi cuûa haøm löôïng pectin vaø haøm löôïng nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy leân hoaït tính endo-polygalacturonase.

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

 Thöïc hieän:

Chuùng toâi thöïc hieän phöông phaùp tröïc giao baäc 2 ñeå qui

hoaïch thöïc nghieäm.

Kyù hieäu: X1: haøm löôïng pectin trong moâi tröôøng nuoâi

caáy (% w/v)

X 2 : haøm löôïng muoái nitô trong moâi tröôøng nuoâi caáy (%w/v)

Y: hoaït tính endo – polygalacturonase trong canh tröôøng (UI/ml)

Chuùng toâi xaây döïng ma traän vôùi 12 maãu thí nghieäm

(xem trang 47)

Sau khi thöïc hieän thí nghieäm, caùc soá lieäu thu ñöôïc seõ ñöôïc xöû lyù ñeå tính toaùn caùc heä soá cuûa phöông trình hoài qui.

Vieäc kieåm tra caùc heä soá phöông trình phöông trình hoài qui

ñöôïc thöïc hieän theo tieâu chuaån Student.

Vieäc kieåm tra söï töông thích cuûa phöông trình hoài qui vôùi

thöïc nghieäm ñöôïc thöïc hieän theo tieâu chuaån Fisher.

Döïa vaøo phöông trình hoài qui thu ñöôïc, chuùng toâi ruùt ra keát luaän veà söï aûnh höôûng ñoàng thôøi cuûa haøm löôïng pectin vaø haøm löôïng N leân hoaït tính endo- polygalacturonase trong canh tröôøng nuoâi caáy.

1.4.1.4. Giai ñoaïn 4: Thöû öùng duïng cheá phaåm pectinase thoâ thu

ñöôïc ñeå laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa dòch quaû:

 Muïc ñích:

So saùnh khaû naêng laøm giaûm ñoä nhôùt nöôùc oåi eùp cuûa cheá phaåm pectinase cuûa haõng Novo (Ñan Maïch) vôùi cheá phaåm pectinase thoâ maø chuùng toâi thu nhaän ñöôïc trong luaän vaên.

 Thöïc hieän:

Laáy moät löôïng oåi nhaát ñònh ñem nghieàn nhoû roài eùp

laáy dòch nöôùc oåi

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

Cho vaøo moãi erlen 35 ml dòch oåi eùp. Chuùng toâi thöïc hieän 3 erlen töông öùng vôùi 3 maãu: maãu I ñoái chöùng (khoâng boå sung cheá phaåm pectinase), maãu II ñöôïc boå sung cheá phaåm enzyme cuûa Novo, maãu III ñöôïc boå sung cheá phaåm enzyme maø chuùng toâi thu nhaän.

Maãu II vaø III ñöôïc boå sung caùc cheá phaåm enzyme vôùi

cuøng soá ñôn vò hoaït tính (0,0275UI/ml dòch quaû).

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

Ñieàu kieän ñeå phaûn öùng:

 Nhieät ñoä: 300C

 Thôøi gian: 30 phuùt

 pH töï nhieân cuûa dòch oåi laø 4,42

Sau ñoù, ta so saùnh möùc ñoä giaûm ñoä nhôùt trong 3 maãu

1.5. Phöông phaùp phaân tích:

thí nghieäm.

1.5.1. Caùch xaùc ñònh hoaït tính enzyme pectinase:

1.5.1.1. Hoùa chaát:

 Dung dòch pectin 0,5% pha trong ñeäm acetate 0,1M; pH=4,5

 Dung dòch ZnSO4 5%

 Dung dòch Ba(OH)2 10%

 Thuoác thöû DNS, hoãn hôïp goàm:

 Nöôùc caát: 60-70ml

 NaOH raén: 1,6g

 Acid dinitrosalicylic (DNS: C7H4N2O7): 1g

 Muoái Seignette (C4H4O6KNa.4H2O): 30g

 Khuaáy tan hoaøn toaøn hoãn hôïp baèng maùy khuaáy töø vaø ñònh möùc ñeán vaïch 100ml baèng bình ñònh möùc. Thuoác thöû ñöôïc baûo quaûn trong chai naâu ôû ñieàu kieän laïnh (dung dòch duøng toát trong khoaûng 10-15 ngaøy).

 Dung dòch acid monogalacturonic noàng ñoä 0,2%: hoøa tan 0,2g monogalacturonic baèng nöôùc caát vaø ñònh möùc ñeán 100ml.

1.5.1.2. Tieán haønh:

Ñeå thöïc hieän phaûn öùng thuûy phaân pectin baèng xuùc

taùc enzyme pectinase, ta tieán haønh nhö baûng sau:

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

Baûng 3.1: Thöïc hieän phaûn öùng giöõa pectinase vaø cô

chaát.

Erlen Dòch emzyme (ml) Nöôùc caát (ml)

Dung dòch pectin 0,5% pha trong ñeäm acetate (ml)

35 0 5

Kieåm chöùng

35 5 0

Maãu thí nghieäm

Sau thôøi gian phaûn öùng laø 30 phuùt ôû 450C, ta ñem voâ hoaït enzyme baèng caùch nhuùng caùc erlen trong beå ñieàu nhieät baèng nöôùc ôû 980C trong 5 phuùt, ta seõ thu ñöôïc dung dòch pectin ñaõ phaûn öùng.

1.5.1.1. Xaùc ñònh hoaït tính endo­polygalacturonase:

 Nguyeân taéc:

Döôùi taùc duïng cuûa endo-polygalacturonase, maïch pectin seõ bò phaân caét nhoû vaø ñoä nhôùt cuûa dòch pectin bò giaûm ñi. Duøng nhôùt keá ta seõ ño ñöôïc ñoä giaûm ñoä nhôùt cuûa dòch pectin.

 Ñònh nghóa:

Moät ñôn vò hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase laø löôïng enzyme coù khaû naêng thuûy phaân laøm giaûm 50% ñoä nhôùt cuûa dòch pectin coù noàng ñoä 0,5% sau thôøi gian phaûn öùng laø 30 phuùt ôû 450C.

 Caùch thöïc hieän:

Cho dòch pectin kieåm chöùng vaøo nhôùt keá vaø ño thôøi gian chaûy cuûa noù. Thôøi gian chaûy cuûa dòch pectin kieåm chöùng laø t0.

Sau ñoù, ta cho dòch pectin ñaõ phaûn öùng vaøo nhôùt keá

vaø ño thôøi gian chaûy t cuûa noù.

 Coâng thöùc xaùc ñònh hoaït tính endo-polygalacturonase:

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

t

(

H d

t ). 100 0 nt . .50 0

(cid:0) (cid:0) (1)

 Hd: hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase, ñôn vò laø

UI/ml.

 t0: thôøi gian chaûy cuûa dòch pectin kieåm chöùng, ñôn

vò laø giaây.

t: thôøi gian chaûy cuûa dòch pectin bò thuûy phaân bôûi

 enzyme, ñôn vò laø giaây.

 n: theå tích dòch enzyme phaûn öùng, ñôn vò laø ml.

Vì theå tích dòch enzyme phaûn öùng laø 5ml, neân ta thay

n=5, vaø do ñoù ta coù coâng thöùc:

t

).

H d

t ( 0 t .25

0

(cid:0) (cid:0) (2)

1.5.1.2. Khaûo saùt  hoaït tính exo­polygalacturonase:

 Nguyeân taéc:

Phöông phaùp quang phoå so maøu döïa treân cô sôû phaûn öùng taïo maøu giöõa chaát khöû (monogalacturonic acid) vôùi thuoác thöû dinitrosalicylic acid. Cöôøng ñoä maøu cuûa hoãn hôïp phaûn öùng tæ leä thuaän vôùi noàng ñoä chaát khöû trong moät phaïm vi nhaát ñònh. Döïa vaøo phöông trình ñöôøng chuaån seõ xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng chaát khöû cuûa maãu thí nghieäm.

Trong nghieân cöùu naøy, phöông trình ñöôøng chuaån ñöôïc xaây döïng döïa treân monogalacturonic acid, söû duïng böôùc soùng 540nm ñeå xaùc ñònh ñoä haáp thu.

(cid:0)

 Ñònh nghóa:

Moät ñôn vò hoaït tính cuûa exo-polygalacturonase laø löôïng enzyme thuûy phaân dung dòch pectin 0,5% ñeå cho ra 1 mol monogalacturonic acid trong 1 phuùt ôû 450C.

 Döïng ñöôøng chuaån monogalacturonic acid:

Töø dung dòch monogalacturonic noàng ñoä 0,2%, pha caùc dung dòch ñöôøng chuaån vôùi noàng ñoä laàn löôït laø 0; 0,25; 0,5; 1; 1,5 vaø 2 (mg/ml).

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

Baûng 3.2: Döïng ñöôøng chuaån monogalacturonic acid

OÁng nghieäm Nöôùc caát (ml)

Dung dòch monogalacturonic acid 0,2% (ml) 0 1 1 2 3 1 1 7 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 Noàng ñoä dung dòch chuaån (mg/ml) 0 0,25 0,5 1 1,5 2

Hoãn hôïp giöõa dung dòch monogalacturonic acid 0,2% vaø nöôùc ñöôïc laéc ñeàu vaø öùng vôùi töøng noàng ñoä chuaån, chuùng toâi huùt ra 1ml roài thöïc hieän phöông phaùp so maøu vôùi 1ml DNS.

 Caùch thöïc hieän:

Huùt ra 15 ml dòch pectin ñaõ phaûn öùng vaø cho vaøo erlen töông öùng, sau ñoù theâm 1ml ZnSO4 5% vaø 1ml Ba(OH)2 vaøo, laéc maïnh roài loïc taùch boû keát tuûa, thu phaàn dòch trong A.

Ta cuõng laøm töông töï vôùi maãu kieåm chöùng.

Huùt 1ml dòch trong A thu ñöôïc cho vaøo töøng oáng nghieäm

töông öùng roài thöïc hieän phöông phaùp so maøu vôùi 1ml DNS.

 Ño ñoä haáp thu:

Caùc dung dòch chuaån vaø caùc maãu sau khi cho DNS ñöôïc ñem ñi ñun caùch thuûy ôû 1000C trong khoaûng thôøi gian laø 5 phuùt. Sau ñoù laøm nguoäi nhanh dung dòch. Pha loaõng dung dòch baèng 10ml nöôùc caát, laéc ñeàu ñeán khi dung dòch khoâng coøn phaân lôùp

Dung dòch ñöôïc ñem ñi ño ñoä haáp thu ôû böôùc soùng 540nm. Ñoái vôùi caùc dung dòch chuaån, sau khi ño ñoä haáp thu, ta laäp ñöôïc phöông trình ñöôøng chuaån.

Töø phöông trình ñöôøng chuaån, chuùng ta xaùc ñònh ñöôïc haøm löôïng monogalacturonic acid coù trong maãu nghieân cöùu, do ñoù xaùc ñònh ñöôïc hoaït tính exo-polygalacturonase.

 Coâng thöùc xaùc ñònh hoaït tính exo-polygalacturonase:

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

MM

(

1000

H e

*) 0 nt ..194

(cid:0) (cid:0) (4)

 He: hoaït tính cuûa exo-polygalacturonase, ñôn vò laø

UI/ml.

 M: löôïng chaát khöû coù trong maãu coù enzyme (mg).

 M0: löôïng chaát khöû coù trong maãu kieåm chöùng

(mg).

 t: thôøi gian phaûn öùng, ñôn vò laø phuùt.

 n: laø theå tích dòch enzyme cho vaøo, ñôn vò laø ml.

Trong thí nghieäm naøy, ta cho enzyme phaûn öùng trong 30 phuùt, vôùi theå tích dòch enzyme cho vaøo laø 5ml, neân ta coù coâng thöùc:

(

1000

0MM

H e

*) 5.30.194

(cid:0) (cid:0) (5)

1.5.1.3. Xaùc ñònh hoaït tính protease theo phöông phaùp Anson caûi

tieán:

 Nguyeân taéc:

Duøng protein casein laøm cô chaát. Xaùc ñònh hoaït ñoä phaân giaûi protein cuûa enzyme treân cô sôû ñònh löôïng saûn phaåm taïo thaønh trong phaûn öùng vôùi thuoác thöû Folin-Cio-Calteau. Döïa treân ñoà thò chuaån, ñònh löôïng Tyrosin töông öùng vôùi haøm löôïng saûn phaåm thuûy phaân döôùi taùc duïng cuûa enzyme.

(cid:0)

 Ñònh nghóa:

Moät ñôn vò hoaït tính cuûa protease laø löôïng enzyme coù tyrosin trong thôøi

khaû naêng thuûy phaân protein taïo ra 1 mol gian 1 phuùt ôû nhieät ñoä 300C.

 Hoaù chaát:

 Dung dòch Casein 1% pha trong dung dòch ñeäm 0,2N

Glycin-NaOH pH 9,5.

 Thuoác thöû Folin

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

 Dung dòch tyrosin 1mM: caân 18,12mg tyrosin, hoøa tan

trong nöôùc caát vaø ñònh möùc ñeán 100ml.

 Döïng ñöôøng chuaån:

Töø dung dòch tyrosin 1mM, ta pha thaønh caùc dung dòch

tyrosin coù noàng ñoä nhö sau:

Baûng 3.3: Xaây döïng ñöôøng chuaån tyrosin:

1 2 3 4 5 6 7

0 1 1 3 1 1 3

1 19 9 17 4 3 7

0 0,2 0,3 0,0 5 0, 1 0,1 5 0,2 5

OÁng soá Dung dòch tyrosin 1mM (ml) Theå tích nöôùc caát (ml) Noàng ñoä dung dòch chuaån ( (cid:0) mol/ml)

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

 Tieán haønh:

 OÁng 1: 0,8ml dung dòch Casein ñeå 5 phuùt ôû 300C, theâm 0,4 ml maãu enzyme ôû 300C trong 10 phuùt. Theâm 2ml TCA 5%. Ly taâm 10000 voøng/phuùt, 15 phuùt. Ñònh löôïng tyrosin.

 OÁng 2: 0,8ml dung dòch casein, cho vaøo 2ml TCA 5%. Theâm 0,4ml maãu enzyme ôû 300C. Ly taâm 10000 voøng/phuùt, 15 phuùt. Ñònh löôïng tyrosin.

 Ñònh löôïng tyrosin:

 oáng 1: 2ml dung dòch NaOH 0,5N cho theâm 0,5ml maãu, ñeå 10 phuùt. Theâm 0,5 ml Folin, pha loaõng 5 laàn. Ñeå yeân 30 phuùt ño ôû böôùc soùng 750nm.

 OÁng 2: 2ml dung dòch NaOH 0,5N cho theâm 0,5ml nöôùc caát ñeå 10 phuùt. Theâm 0,5ml Folin, pha loaõng 5 laàn. Ñeå yeân 30 phuùt, ño ôû böôùc soùng 750nm

 Haøm löôïng tyrosin cuûa maãu ñöôïc suy ra töø ñöôøng

chuaån.

 Tính toaùn keát quaû:

 Xaùc ñònh phöông trình ñöôøng chuaån tyrosin.

 Xaùc ñònh OD: maät ñoä quang cuûa oáng maãu.

 Xaùc ñònh haøm löôïng tyrosin töø phöông trình ñöôøng

chuaån tyrosin.

 Xaùc ñònh ñôn vò hoaït tính cuûa enzyme protease.

n

(

*

hh

HP

PP 1 2 V

V t

*) *

E

(cid:0) (cid:0)

(cid:0)

HP: hoaït tính protease (UI/ml).

(cid:0)

tyrosin trong oáng maãu (oáng 1). P1: soá mol

tyrosin trong oáng kieåm chöùng (oáng 2). P2: soá mol

n: heä soá pha loaõng.

Vhh: theå tích hoãn hôïp phaûn öùng (ml).

VE: theå tích enzyme phaûn öùng (ml).

CHÖÔNG 3: PHÖÔNG PHAÙP NGHIEÂN CÖÙU Luaän vaên toát nghieäp

t: thôøi gian phaûn öùng (phuùt).

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

2. Chöông 4: Keát quaû vaø baøn luaän:

2.1. Khaûo   saùt   choïn   loaøi   naám   moác   sinh   toång   hôïp   pectinase   coù hoaït tính cao nhaát:

Luaän vaên toát nghieäp

 Caùch thöïc hieän:

 3 loaøi naám moác A. niger, A. oryzae, A. awamori ñöôïc nuoâi caáy trong moâi tröôøng coù thaønh phaàn xaùc ñònh nhö muïc 3.1.4.

 Ñieàu kieän nuoâi caáy: Nhieät laø 300C, toác ñoä laéc laø

125 voøng/phuùt.

 Chuùng toâi tieán haønh laáy maãu enzyme taïi caùc thôøi ñieåm sau: 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120 giôø nuoâi caáy.

 Ñeå khaûo saùt hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase, chuùng toâi söû duïng phöông phaùp phaân tích ñöôïc trình baøy ôû muïc 3.3.1.1.

 Ñeå khaûo saùt hoaït tính cuûa exo-polygalacturonase, chuùng toâi söû duïng phöông phaùp phaân tích ñöôïc trình baøy ôû muïc 3.3.1.2.

 Keát quaû:

Baûng 4.1: Söï thay ñoåi hoaït tính endo-polygalacturonase (UI/ml) trong canh tröôøng nuoâi caáy naám moác theo thôøi gian.

Thôøi gian nuoâi caáy (giôø)

12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Loaøi naám moác

0,014 A. awamori

0,073 A. niger

0,087 A. oryzae 0,03 8 0,04 5 0,01 3 0,03 6 0,06 4 0,05 9 0,08 5 0,10 9 0,14 4 0,18 3 0,15 4 0,15 3 0,20 6 0,15 4 0,15 9 0,21 0 0,19 1 0,17 7 0,21 5 0,21 7 0,15 9 0,18 3 0,20 5 0,21 7 0,02 2 0,21 6 0,16 7

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

0,25

0,20

)

ml

A.awamori A.niger A.oryzae

/ I

0,15

0,10

U ( h n í t

0,05

aït o H

0,00

0

12

24

36

84

96 108 120 132

48 72 60 Thôøi gian (giôø)

Luaän vaên toát nghieäp

Hình 4.1: Söï thay ñoåi hoaït tính endo-polygalacturonase trong canh tröôøng nuoâi caáy naám moác theo thôøi gian.

Baûng 4.2: Söï thay ñoåi hoaït tính exo-polygalacturonase (UI/ml) trong canh tröôøng nuoâi caáy naám moác theo thôøi gian.

Thôøi gian nuoâi caáy (giôø)

12 24 36 48 60 72 84 96 108 120 Loaøi naám moác

0,532 A. awamori

0,304 A. niger

0,338 A. oryzae 0,06 3 0,14 4 0,06 4 0,13 2 0,18 7 0,11 7 0,18 9 0,23 7 0,14 4 0,64 6 0,47 7 0,48 0 0,71 4 0,51 1 0,51 7 0,47 7 0,68 6 0,79 1 0,37 2 0,41 8 0,70 5 0,19 1 0,22 4 0,27 1 0,09 8 0,03 0 0,17 2

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

)

ml

/ I

A.awamori A.niger A.oryae

U ( m y z n e h n í t

aït o H

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0

0

12

24

36

48

60

72

84

96

108 120

Thôøi gian (giôø)

Luaän vaên toát nghieäp

Hình 4.2: Söï thay ñoåi hoaït tính exo-polygalacturonase trong canh tröôøng nuoâi caáy naám moác theo thôøi gian.

 Töø hình 4.1 chuùng toâi coù nhöõng nhaän xeùt sau:

 Trong giai ñoaïn ñaàu (0-12 giôø), söï sinh toång hôïp endo-polygalacturonase cuûa caû 3 loaøi naám moác töông ñoái thaáp, hoaït tính enzyme trong canh tröôøng khoâng vöôït quaù 0,05UI/ml.

 Sau 12 giôø, hoaït tính enzyme thu ñöôïc taêng nhanh trong canh tröôøng nuoâi caáy. Ñoái vôùi A.   awamori, hoaït tính enzyme ñaït 0,206UI/ml sau 60 giôø nuoâi. Töø giôø nuoâi caáy thöù 60 ñeán 84, hoaït tính enzyme taêng chaäm, hoaït tính cöïc ñaïi laø 0,215 UI/ml sau 84 giôø nuoâi. Ñoái vôùi hai loaøi A.   niger vaø A.   oryzae, hoaït tính enzyme cöïc ñaïi thu ñöôïc laø 0,217UI/ml sau caùc thôøi gian nuoâi caáy töông öùng laø 84 vaø 96 giôø.

 Sau 84 giôø ñoái vôùi A. awamori, A. niger vaø sau 96 giôø ñoái vôùi A. oryzae, hoaït tính endo-polygalacturonase trong 3 canh tröôøng ñeàu giaûm raát nhanh.

 Töø hình 4.2 chuùng toâi coù nhöõng nhaän xeùt sau:

 Trong giai ñoaïn töø 0-12 giôø, hoaït tính cuûa exo- polygalacturonase thu ñöôïc trong 3 canh tröôøng khaù thaáp. Neáu chæ xeùt trong giai ñoaïn thích nghi, A. niger cho enzyme coù hoaït

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

tính cao hôn so vôùi 2 loaøi coøn laïi, chöùng toû A. niger thích nghi vôùi moâi tröôøng nhanh hôn.

 Ñoái vôùi A. awamori, trong giai ñoaïn töø giôø nuoâi caáy thöù 36 ñeán 72, hoaït tính enzyme trong canh tröôøng taêng nhanh vaø ñaït cöïc ñaïi laø 0,714UI/ml sau 72 giôø nuoâi. Sau ñoù, hoaït tính enzyme giaûm maïnh.

 Ñoái vôùi A. niger, hoaït tính exo-polygalacturonase trong canh tröôøng taêng daàn theo thôøi gian nuoâi caáy vaø ñaït giaù trò cao nhaát laø 0,686UI/ml sau 84 giôø nuoâi. Sau ñoù hoaït tính cuûa enzyme cuõng giaûm nhanh.

 Quaù trình sinh toång hôïp exo-polygalacturonase ôû A.  oryzae cuõng töông töï nhö ôû A.   niger: theo thôøi gian hoaït tính enzyme trong canh tröôøng taêng daàn ñeán cöïc ñaïi laø 0,791 UI/ml sau 84 giôø nuoâi. Sau ñoù, hoaït tính cuûa enzyme cuõng bò giaûm ñi.

 Baøn luaän:

 Thôøi gian ñaàu cuûa quaù trình nuoâi caáy (0-12 giôø) laø thôøi gian ñeå naám moác thích nghi vôùi moâi tröôøng môùi. Vì vaäy, löôïng enzyme pectinase chöa ñöôïc sinh ra nhieàu, hoaït tính enzyme thu ñöôïc trong canh tröôøng khaù thaáp.

 Theo lyù thuyeát, sau khi ñaõ thích nghi vôùi moâi tröôøng, naám moác baét ñaàu phaùt trieån vaø taêng sinh khoái. Caùc teá baøo khoâng ngöøng tieát ra enzyme pectinase ñeå thuûy phaân pectin-laø nguoàn carbon duy nhaát trong moâi tröôøng nhaèm muïc ñích taïo ra chaát dinh döôõng ñeå chuùng söû duïng. Vì theá, hoaït tính enzyme thu ñöôïc trong canh tröôøng taêng nhanh.

 Sau khi ñaït ñöôïc giaù trò cöïc ñaïi, hoaït tính endo vaø exo-polygalacturonase trong caùc canh tröôøng bò giaûm xuoáng. Coù leõ theo thôøi gian, haøm löôïng caùc chaát dinh döôõng trong canh tröôøng giaûm daàn, do ñoù quaù trình sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp pectinase ôû naám moác cuõng bò giaûm theo. Ngoaøi ra, moät soá phaân töû pectinase ñöôïc sinh ra trong canh tröôøng cuõng coù theå bò giaûm hoaït tính theo thôøi gian.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

 Khi söû duïng cheá phaåm pectinase nhaèm muïc ñích laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa dòch quaû, taêng hieäu suaát thu hoài chaát chieát töø quaû, cheá phaåm endo-polygalacturonase seõ cho hieäu quaû toát hôn so vôùi cheá phaåm exo-polygalacturonase. Do ñoù, trong nhöõng thí nghieäm tieáp theo, chuùng toâi nghieân cöùu toái öu hoùa thaønh phaàn moâi tröôøng nuoâi caáy naám moác sao cho hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase thu ñöôïc trong canh tröôøng laø cao nhaát.

 Chuùng toâi nhaän thaáy chæ sau 60 giôø nuoâi caáy, A.   awamori cho endo-polygalacturonase coù hoaït tính khaù cao (0,206 UI/ml). Giaù trò naøy nhoû hôn 4,2% so vôùi giaù trò cöïc ñaïi laø 0,215 UI/ml sau 84 giôø nuoâi. Khi so saùnh vôùi hoaït tính cöïc ñaïi cuûa A. niger vaø A. oryzae (0,217UI/ml), giaù trò naøy nhoû hôn 5%. Tuy nhieân, thôøi gian nuoâi caáy 2 loaøi A. niger vaø A. oryzae ñeå hoaït tính endo-polygalacturonase ñaït giaù trò cöïc ñaïi laïi keùo daøi ñeán 84 giôø vaø 96 giôø. Thôøi gian nuoâi caáy daøi laø moät nhöôïc ñieåm lôùn trong thöïc tieãn vì laøm taêng chi phí naêng löôïng vaø giaûm naêng suaát saûn xuaát cuûa nhaø maùy.

2.2. AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng pectin ñeán hoaït tính pectinase:

 Treân cô sôû ñoù, chuùng toâi choïn loaøi A. awamori ñeå nghieân cöùu tieáp. Thôøi gian nuoâi caáy ñeå thu nhaän enzyme ñöôïc choïn laø 60 giôø. Khi ñoù, hoaït tính cuûa endo- polygalacturonase gaàn baèng giaù trò cöïc ñaïi, coøn hoaït tính exo- polygalacturonase laø 0,646 UI/ml (giaù trò naøy baèng 90% so vôùi giaù trò cöïc ñaïi 0,714 UI/ml sau 72 giôø nuoâi).

 Caùch thöïc hieän:

 Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi söû duïng loaøi

naám moác A. awamori vaø thôøi gian nuoâi caáy laø 60 giôø.

 Ñeå khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng pectin leân hoaït tính cuûa pectinase, chuùng toâi thay ñoåi haøm löôïng pectin trong moâi tröôøng nuoâi caáy nhö sau: 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 g/l. Nhöõng thaønh phaàn khaùc cuûa moâi tröôøng seõ ñöôïc giöõ coá ñònh nhö trong muïc 3.1.4.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

 Nhieät ñoä nuoâi caáy laø 300C vaø toác ñoä laéc laø 125

voøng/phuùt.

 Hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase ñöôïc xaùc ñònh theo phöông phaùp phaân tích trình baøy trong muïc 3.3.1. Thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän 2 laàn vaø laáy keát quaû trung bình.

 Keát quaû thí nghieäm:

Baûng 4.3: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng pectin ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase.

Haøm löôïng pectin (%w/v) Hoaït tính enzyme(UI/ml)

5 0,211

10 0,220

15 0,224

20 0,212

25 0,213

30 0,211

35 0,176

40 0,156

45 0,159

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

0,25

)

ml

/ I

0,20

0,15

0,10

U ( G P - o d n e h n í t

aït o H

0,05

0,00

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Haøm löôïng pectin (g/l)

Luaän vaên toát nghieäp

Hình 4.3: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng pectin ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase.

 Nhaän xeùt:

 Töø hình 4.3, ta nhaän thaáy: Khi taêng haøm löôïng pectin trong moâi tröôøng nuoâi caáy töø 5g/l ñeán 15g/l, hoaït tính endo-polygalacturonase taêng nheï töø 0,211 ñeán 0,224 UI/ml.

 Neáu ta tieáp tuïc taêng noàng ñoä pectin trong moâi tröôøng töø 15g/l ñeán 30g/l, hoaït tính endo-polygalacturonase thu ñöôïc trong canh tröôøng bò giaûm nheï töø 0,224 UI/ml xuoáng 0,211 UI/ml

 Neáu ta taêng cao hôn noàng ñoä pectin trong moâi tröôøng (35, 40, 45 g/l), hoaït tính endo-polygalacturonase seõ bò giaûm ñi raát nhieàu so vôùi nhöõng giaù trò noàng ñoä pectin thaáp hôn.

 Hoaït tính endo-polygalacturonase thu ñöôïc cao nhaát khi haøm löôïng pectin trong moâi tröôøng nuoâi caáy ban ñaàu laø 15g/l.

 Baøn luaän:

 Ta nhaän thaáy keát quaû thí nghieäm thu ñöôïc phuø hôïp vôùi quy luaät aûnh höôûng cuûa haøm löôïng chaát dinh döôõng carbon leân quaù trình sinh toång hôïp enzyme. Khi taêng

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

haøm löôïng pectin trong moät khoaûng giôùi haïn nhaát ñònh, löôïng chaát dinh döôõng chöùa carbon trong moâi tröôøng seõ taêng. Do ñoù, naám moác seõ sinh tröôûng toát hôn vaø quaù trình sinh toång hôïp pectinase cuõng ñöôïc caûi thieän. Pectin vöøa laø chaát dinh döôõng carbon vöøa laø chaát caûm öùng. Tuy nhieân, neáu ta taêng haøm löôïng pectin vöôït quaù moät giaù trò giôùi haïn xaùc ñònh, seõ xuaát hieän hieän töôïng öùc cheá dò hoùa (catabolite repression). Ñoù laø do haøm löôïng pectin trong moâi tröôøng nuoâi caáy cao seõ laøm taêng haøm löôïng caùc saûn phaåm thuûy phaân pectin nhö a. galacturonic, oligogalacturonic… Saûn phaåm thuûy phaân pectin coù phaân töû löôïng thaáp nhö a. galacturonic seõ ñoùng vai troø laø chaát öùc cheá quaù trình sinh toång hôïp pectinase ôû naám moác.

2.3. Choïn nguoàn Nitô voâ cô cho moâi tröôøng nuoâi caáy:

 Maët khaùc, naám moác laø vi sinh vaät hieáu khí. Haøm löôïng oxy hoøa tan trong moâi tröôøng aûnh höôûng ñeán söï sinh tröôûng, phaùt trieån cuûa naám moác vaø quaù trình sinh toång hôïp enzyme. Neáu haøm löôïng pectin taêng cao seõ laøm cho ñoä nhôùt cuûa moâi tröôøng lôùn, do ñoù haøm löôïng oxy hoøa tan vaøo moâi tröôøng seõ giaûm. Coù leõ ñaây cuõng laø moät lyù do laøm giaûm hoaït tính endo-polygalacturonase trong canh tröôøng.

 Caùch thöïc hieän:

 Haøm löôïng pectin trong moâi tröôøng nuoâi caáy ñöôïc

choïn laø 15g/l.

 Thöïc hieän 4 maãu thí nghieäm, töông ñöông vôùi 4

nguoàn Nitô sau: NaNO3, (NH4)2SO4, NH4Cl vaø (NH4)2HPO4.

 Haøm löôïng nguoàn Nitô söû duïng laø 0,2% (w/v) cho moãi maãu thí nghieäm. Caùc thaønh phaàn coøn laïi cuûa moâi tröôøng ñöôïc ñöôïc giöõ coá ñònh nhö trong muïc 3.1.4.

 Nhieät ñoä nuoâi caáy A. awamori laø 300C, toác ñoä laéc

laø 125voøng/phuùt, thôøi gian nuoâi caáy laø 60 giôø.

 Hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase ñöôïc xaùc ñònh

theo phöông phaùp trong muïc 3.3.1.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

 Ngoaøi ra, trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi tieán haønh xaùc ñònh theâm hoaït tính cuûa protease coù trong dòch enzyme thu nhaän ñöôïc. Hoaït tính protease ñöôïc xaùc ñònh theo phöông phaùp trong muïc 3.3.2.

 Thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän 2 laàn, laáy keát quaû

trung bình.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

 Keát quaû:

Baûng 4.4: AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán hoaït tính endo- polygalacturonase trong moâi tröôøng nuoâi caáy A. awamori.

Nguoàn Nitô NaNO3 (NH4)2SO4 NH4Cl (NH4)2HPO4

0,1926 0,2153 0,2175 0,2152

0,250

)

ml

/ I

0,200

0,150

0,100

U ( G P - o d n e h n í t

0,050

aït o H

0,000

NaNO3

(NH4)2SO4

NH4Cl

(NH4)2HPO4

Nguoàn Nitô

Hoaït tính endo- polygalacturonase (UI/ml)

Hình 4.4: AÛnh höôûng cuûa nguoàn nitô ñeán hoaït tính endo- polygalacturonase trong moâi tröôøng nuoâi caáy A. awamori.

 Nhaän xeùt vaø baøn luaän:

 Töø hình 4.4, chuùng toâi nhaän thaáy khi söû duïng caùc nguoàn nitô khaùc nhau, hoaït tính endo-polygalacturonase thu ñöôïc trong canh tröôøng beà saâu cuõng seõ thay ñoåi. Hoaït tính endo-polygalacturonase cao nhaát (0,2175UI/ml) khi ta nuoâi caáy A.  awamori trong moâi tröôøng söû duïng NH4Cl. Moâi tröôøng söû duïng NaNO3 cho hoaït tính endo-polygalacturonase thaáp nhaát: 0,1926 UI/ml.

 Tuy nhieân, chuùng toâi cuõng nhaän thaáy moâi tröôøng chöùa nguoàn nitô laø (NH4)2SO4 hoaëc (NH4)2HPO4 cho hoaït tính endo-polygalacturonase töông ñöông vôùi moâi tröôøng chöùa

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

nguoàn nitô laø NH4Cl. Nhö vaäy, söï aûnh höôûng cuûa 3 loaïi muoái ((NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NH4Cl) leân söï sinh toång hôïp endo- polygalacturonase cuûa naám moác A. awamori laø töông ñöông nhau.

 Chuùng toâi tham khaûo theâm keát quaû thí nghieäm khaûo saùt söï aûnh höôûng cuûa nguoàn nitô leân hoaït tính endo- polygalacturonase sinh toång hôïp töø Aspergillus sp cuûa M. Galiotou- Panayotou vaø coäng söï [15]. Caùc taùc giaû naøy cuõng thu ñöôïc keát luaän töông töï: Nguoàn nitô amoân seõ giuùp cho gioáng naám moác Aspergillus sinh toång hôïp enzyme pectinase vôùi hoaït tính cao hôn so vôùi nguoàn nitô nitrate. Coù leõ, ñoù laø do caùc muoái amoân ñöôïc vi sinh vaät haáp thu deã daøng vaø nhanh choùng hôn so vôùi muoái nitrate. Vì vaäy, quaù trình sinh tröôûng vaø sinh toång hôïp enzyme cuûa naám moác seõ toát hôn.

 Vì caû 3 nguoàn nitô (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, NH4Cl ñeàu cho enzyme coù hoaït tính gaàn nhö nhau, neân ñeå choïn nguoàn Nitô cho caùc thí nghieäm tieáp theo, chuùng toâi seõ choïn loaïi muoái coù giaù thaønh reû nhaát. Treân cô sôû ñoù, NH 4Cl ñöôïc xem laø nguoàn Nitô thích hôïp.

2.4. AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng nitô leân hoaït tính pectinase:

 Ngoaøi ra, trong thí nghieäm naøy chuùng toâi cuõng tieán haønh khaûo saùt hoaït tính cuûa protease trong canh tröôøng nuoâi caáy söû duïng nguoàn nitô laø NH4Cl. Theo phöông phaùp Anson caûi tieán, chuùng toâi xaùc ñònh ñöôïc hoaït tính protease laø 0,00964UI/ml. Nhö vaäy, hoaït tính protease trong canh tröôøng sau 60 giôø nuoâi caáy laø khoâng ñaùng keå. Neáu hoaït tính protease cao, enzyme naøy coù theå xuùc taùc quaù trình thuûy phaân protein-laø nhöõng phaân töû pectinase coù trong canh tröôøng vaø laøm giaûm hoaït tính pectinase cuûa canh tröôøng.

 Caùch thöïc hieän:

 Trong thí nghieäm naøy, chuùng toâi seõ tieáp tuïc khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng NH4Cl leân quaù trình sinh toång hôïp endo-polygalacturonase cuûa naám moác A. awamori.

 Chuùng toâi chuaån bò caùc moâi tröôøng coù haøm

löôïng NH4Cl laø 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 %w/v.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

 Haøm löôïng pectin trong moâi tröôøng 1,5% w/v. Caùc thaønh phaàn khaùc cuûa moâi tröôøng ñöôïc giöõ coá ñònh nhö trong muïc 3.1.4.

 Ñieàu kieän nuoâi caáy:

o Nhieät ñoä: 300C

o Toác ñoä laéc: 125voøng/phuùt

o Thôøi gian nuoâi caáy: 60 giôø.

 Hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase seõ ñöôïc xaùc

ñònh theo phöông phaùp trong muïc 3.3.1.

 Thí nghieäm ñöôïc thöïc hieän 2 laàn, laáy keát quaû

trung bình.

 Keát quaû:

Baûng 4.5: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng NH4Cl trong moâi

tröôøng nuoâi caáy ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase .

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Noàng ñoä hôïp chaát NH4Cl (%w/v)

Hoaït tính

enzyme (UI/ml) 0,18 0,21 5 0,23 6 0,21 6 0,21 5 6

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

0,25

) l

m

0,20

/ I

(

0,15

0,10

U G P ­ o d n e   h n í t

0,05

ạt o H

0,00

0,1

0,3

0,4

0,5

0,2 Haøm lượng NH4Cl (%w/v)

Luaän vaên toát nghieäp

Hình 4.5: AÛnh höôûng cuûa haøm löôïng NH4Cl trong moâi

tröôøng nuoâi caáy ñeán hoaït tính endo-polygalacturonase .

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

 Nhaän xeùt vaø baøn luaän:

Töø hình 4.6, chuùng toâi nhaän thaáy khi haøm löôïng NH 4Cl trong moâi tröôøng ban ñaàu laø 0,1%, hoaït tính endo- polygalacturonase thu ñöôïc thaáp nhaát. Neáu taêng haøm löôïng NH4Cl trong moâi tröôøng töø 0,1% ñeán 0,3%, hoaït tính enzyme taêng daàn vaø ñaït cöïc ñaïi khi haøm löôïng NH 4Cl laø 0,3%. Khi ta tieáp tuïc taêng haøm löôïng NH4Cl töø 0,3 ñeán 0,5%, hoaït tính cuûa enzyme thu ñöôïc seõ giaûm nheï.

+, giaù trò pH cuûa moâi tröôøng seõ giaûm. Ñoù laø do quaù trình vaän + töø moâi tröôøng vaøo beân trong teá baøo chaát chuyeån ion NH4 cuûa vi sinh vaät xaûy ra keøm theo vôùi quaù trình vaän chuyeån ngöôïc ion H+ töø beân trong teá baøo chaát ra beân ngoaøi moâi + thì pH tröôøng. Neáu naám moác haáp thu moät löôïng lôùn NH4 canh tröôøng nuoâi caáy seõ bò thay ñoåi lôùn. Coù leõ söï thay ñoåi lôùn giaù trò pH cuûa canh tröôøng ñaõ laøm thay ñoåi hoaït tính cuûa caùc polygalacturonase coù trong canh tröôøng.

Theo lyù thuyeát, khi vi sinh vaät haáp thuï muoái NH4

Döïa vaøo keát quaû thí nghieäm, chuùng toâi choïn haøm

2.5. Quy hoaïch thöïc nghieäm:

löôïng NH4Cl thích hôïp laø 0,3% (w/v).

2.5.1. Thöïc hieän:

 Sau khi tieán haønh caùc ñôït thí nghieäm khaûo saùt aûnh höôûng cuûa haøm löôïng pectin vaø haøm löôïng NH4Cl ñeán quaù trình sinh toång hôïp endo-polygalacturonase töø A. awamori, chuùng toâi nhaän thaáy löôïng pectin trong moâi tröôøng-15g/l vaø löôïng NH4Cl trong moâi tröôøng-0,3%(w/v) laø thích hôïp cho quaù trình sinh toång hôïp endo-polygalacturonase cuûa naám moác. Trong nhöõng thí nghieäm ñaõ thöïc hieän, chuùng toâi chæ khaûo saùt rieâng reõ söï aûnh höôûng cuûa töøng yeáu toá maø chöa xeùt ñeán söï aûnh höôûng cuøng luùc cuûa 2 yeáu toá leân quaù trình sinh toång hôïp endo-polygalacturonase. Trong phaàn qui hoaïch thöïc nghieäm, chuùng toâi seõ khaûo saùt tieáp söï aûnh höôûng ñoàng thôøi cuûa haøm löôïng pectin vaø haøm löôïng NH 4Cl trong

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

moâi tröôøng nuoâi caáy naám moác leân hoaït tính endo- polygalacturonase thu nhaän ñöôïc.

 Chuùng toâi söû duïng phöông phaùp tröïc giao baäc 2 ñeå quy hoaïch thöïc nghieäm. Caùc maãu coù thaønh phaàn moâi tröôøng nhö sau:

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

Baûng 4.6: Thaønh phaàn moâi tröôøng cuûa caùc maãu thí nghieäm.

Moâi tröôøng 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

1 1 1 2 2 2 Haøm löôïng pectin (%w/v) 1, 5 1, 5 1, 5 1, 5 1, 5 1, 5

0, 2 0, 4 0, 3 0, 2 0, 4 0, 3 0, 2 0, 4 0, 3 0, 3 0, 3 0, 3 Haøm löôïng NH4Cl (%w/v)

 Caùc thaønh phaàn coøn laïi cuûa moâi tröôøng nuoâi caáy

ñöôïc trình baøy trong muïc 3.1.3.

 Ñieàu kieän nuoâi caáy:

o Nhieät ñoä: 300C

o Toác ñoä laéc: 125 voøng/phuùt

o Thôøi gian nuoâi caáy: 60 giôø.

 Hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase seõ ñöôïc xaùc ñònh

theo phöông phaùp trong muïc 3.3.1.

2.5.2. Keát quaû:

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

Baûng 4.7: Hoaït tính cuûa endo-polygalacturonase trong caùc maãu trong thí nghieäm toái öu hoùa theo phöông phaùp tröïc giao baäc hai.

Maãu thí nghieäm

Haøm löôïng pectin (%w/v) Haøm löôïng NH4Cl (%w/v) Hoaït tính endo- polygalacturon ase (UI/ml)

Maãu 1 1 0,2 0,2200

Maãu 2 1 0,4 0,2054

Maãu 3 1 0,3 0,2170

Maãu 4 2 0,2 0,2190

Maãu 5 2 0,4 0,2290

Maãu 6 2 0,3 0,2286

Maãu 7 1,5 0,2 0,2250

Maãu 8 1,5 0,4 0,2110

Maãu 9 1,5 0,3 0,2290

Maãu 10 0,3 1,5 0,23434

Maãu 11 0,3 1,5 0,23074

Maãu 12 0,3 1,5 0,2319

 Töø caùc keát quaû thu ñöôïc, chuùng toâi thöïc hieän tính toaùn theo phöông phaùp tröïc giao caáp 2 vaø coù caùc heä soá cuûa phöông trình hoài quy nhö baûng 4.8:

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

Baûng 4.8: Caùc heä soá cuûa phöông trình hoài quy:

Heä soá b s t

0 0,220444 0,000613 359,8188

1 0,0057 0,00075 7,596507

2 -0,0031 0,00075 -4,13143

12 0,00615 0,000919 6,692195

11 -0,00183 0,0013 -1,41065

22 -0,00663 0,0013 -5,104

(cid:0)0

 Caùc thí nghieäm ôû taâm:

1Y

0,23434

(cid:0)0 2Y

(cid:0)0

0,23074

3Y

o

0,2319

(cid:0)2 ths

Y

(cid:0) (cid:0) 0,232327 ; 3,38.10-6 ;

t0.05(3-1) = 4.3

(cid:0) t2 < t0.05(2): khoâng choïn heä soá b2.

t11 < t0.05(2): khoâng choïn heä soá b11.

^

(cid:0) Chuùng toâi coù phöông trình hoài quy nhö sau:

Y 0,22 + 0,057X1+0,00615X1X2 -0,00663(X2)2

(cid:0)

 Kieåm tra söï töông thích cuûa phöông trình hoài quy vôùi

thöïc nghieäm theo tieâu chuaån Fisher:

(cid:0)2 tts

6,1.10-5

Ftính = 18,064

F0.95(9 – 4, 3 – 1) = 19.3 (cid:0) F < F0.95(5, 2 ): Phöông trình töông thích vôùi thöïc nghieäm.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

^

 Phöông trình hoài quy:

(cid:0) [-1;1].

Y 0,22 + 0,057X1+0,00615X1X2 -0,00663(X2)2 (*) Vôùi X1 (cid:0) [-1;1], X2

(cid:0)

 Töø phöông trình hoài quy, ta nhaän thaáy söï sinh toång hôïp endo-polygalacturonase töø A. awamori bò aûnh höôûng ñoàng thôøi cuûa haøm löôïng pectin X1 vaø haøm löôïng NH4Cl X2.

 Khi X1 taêng thì Y taêng, neân X1 =1 (töông öùng vôùi haøm

löôïng pectin laø 2%) thì Y ñaït max

 Thay X1=1 vaøo phöông trình (*), ta coù:

Y = 0,2257+0,00615X2-0,00663(X2)2 (**)

 Töø (**), ta tìm Y max baèng caùch ñaïo haøm Y theo X2, ta coù:

Y’=-0,01326X2+0,00615

 Ymax töông öùng vôùi Y’=0, do ñoù ta tìm ñöôïc X2=0,464. Giaù

0,35%). trò naøy töông öùng vôùi haøm löôïng NH4Cl laø 0,346% ( (cid:0)

 Ymax coù giaù trò laø 0,2275 UI/ml

 Vaäy sau khi thöïc hieän quy hoaïch thöïc nghieäm, chuùng toâi xaùc ñònh ñöôïc ñieàu kieän toái öu ñeå thu nhaän endo- polygalacturonase coù hoaït tính cao nhaát: haøm löôïng pectin laø 2% vaø haøm löôïng NH4Cl laø 0,5%.

 Veõ ñoà thò phöông trình hoài qui baèng laäp trình Matlab, chuùng toâi kieåm tra laïi giaù trò toái öu laø Ymax =0,2275 UI/ml taïi X1 = 1, X2 = 0,464. Caùc giaù trò naøy phuø hôïp vôùi vieäc giaûi baèng cöïc trò.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

Hình 4.6: Ñoà thò bieåu dieãn phöông trình hoài quy.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

2.6. Thöû öùng duïng cheá phaåm pectinase thoâ thu ñöôïc ñeå laøm giaûm ñoä nhôùt cuûa dòch quaû:

Töø phöông trình hoài quy, chuùng toâi ñaõ tìm ra giaù trò toái öu cho moâi tröôøng nuoâi caáy A. awamori: hoaït tính enzyme cöïc ñaïi laø 0,2275UI/ml töông öùng vôùi haøm löôïng pectin laø 2% vaø haøm löôïng NH4Cl laø 0,35%.

 Caùch thöïc hieän:

 Söû duïng cheá phaåm enzyme thu nhaän töø thí

nghieäm 5 vaø vôùi hoaït tính laø 0,22 UI/ml.

 Hieäu chænh hoaït tính cuûa cheá phaåm enzyme

pectinase cuûa haõng Novo veà giaù trò 0,22UI/ml.

 Ta tieán haønh thí nghieäm nhö baûng sau:

Baûng 4.9: Theå tích dòch oåi eùp vaø dòch enzyme söû duïng

Maãu 1 2 3

35ml 35ml 35ml Theå tích dòch oåi eùp (ml)

5 5 0 Theå tích cheá phaåm enzyme (ml)

Theå tích nöôùc (ml) 0 0 5

o Maãu 1: söû duïng cheá phaåm enzyme cuûa haõng

Novo.

o Maãu 2: söû duïng cheá phaåm enzyme cuûa chuùng

toâi.

o Maãu 3: laø maãu ñoái chöùng.

 Ñieàu kieän phaûn öùng:

o Nhieät ñoä: 450C

o Thôøi gian: 60 phuùt

o Dòch oåi eùp coù pH töï nhieân laø 4,42.

 Sau phaûn öùng, chuùng toâi voâ hoaït enzyme baèng nhieät, laøm nguoäi roài duøng nhôùt keá ñeå xaùc ñònh thôøi gian chaûy cuûa caû 3 maãu.

CHÖÔNG 4: KEÁT QUAÛ VAØ BAØN LUAÄN

Luaän vaên toát nghieäp

 Keát quaû:

Baûng 4.10: Thôøi gian chaûy cuûa dòch oåi eùp khi boå sung

enzyme vaø khi khoâng boå sung enzyme.

Maãu 1 2 3

91,2 86,79 131,16 Thôøi gian chaûy (giaây)

 Töø baûng 4.10, khi so vôùi maãu 3 (kieåm chöùng), ta

thaáy:

o Maãu 1 (söû duïng cheá phaåm enzyme cuûa haõng

Novo): ñoä nhôùt giaûm 30,47%.

o Maãu 2 (söû duïng cheá phaåm enzyme chuùng toâi

thu nhaän): ñoä nhôùt giaûm 33,83%.

 Nhaän xeùt vaø baøn luaän:

Töø keát quaû thí nghieäm, chuùng toâi nhaän thaáy sau 30 phuùt xöû lyù baèng enzyme, möùc ñoä giaûm ñoä nhôùt cuûa dòch oåi khi söû duïng hai cheá phaåm enzyme laø töông ñöông nhau. Nhö vaäy, chuùng toâi coù theå söû duïng cheá phaåm enzyme thu nhaän töø naám moác baèng phöông phaùp nuoâi caáy beà saâu vaøo vieäc ruùt ngaén thôøi gian loïc trong saûn xuaát nöôùc oåi vaø naâng cao ñoä beàn hoùa lyù, giaù trò caûm quan cuûa saûn phaåm.

Luaän vaên toát nghieäp CHÖÔNG 5: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ

3. Keát luaän vaø ñeà nghò:     3.1. Keát luaän:

Luaän vaên toát nghieäp CHÖÔNG 5: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ

Töø nhöõng keát quaû thöïc nghieäm, chuùng toâi ñöa ra moät

soá keát luaän nhö sau:

 Sau khi nuoâi caáy 3 loaøi naám moác A.   niger,   A.   oryzae,   A.   awamori ñeå thu nhaän enzyme pectinase, chuùng toâi thaáy loaøi naám moác thích hôïp ñeå sinh toång hôïp pectinase laø A. awamori   do thôøi gian nuoâi caáy ngaén hôn 2 loaøi coøn laïi.

 Thaønh phaàn moâi tröôøng toái öu ñeå nuoâi caáy A. awamori   nhaèm muïc ñích sinh toång hôïp endo-polygalacturonase coù hoaït tính cao nhaát:

 Haøm löôïng pectin: 2% (w/v).

 Nguoàn nitô söû duïng: NH4Cl.

 Haøm löôïng NH4Cl laø 0,35% (w/v).

hoaït tính endo-

 Sau 60 giôø nuoâi caáy, polygalacturonase thu ñöôïc laø 0,2275 UI/ml.

3.2. Ñeà nghò:

 Cheá phaåm pectinase thu ñöôïc töø A. awamori coù taùc duïng laøm giaûm ñoä nhôùt dòch nöôùc oåi eùp vôùi möùc ñoä töông ñöông nhö cheá phaåm pectinase cuûa haõng Novo khi chuùng toâi söû duïng 2 cheá phaåm vôùi cuøng soá ñôn vò hoaït ñoä ñeå thuûy phaân pectin.

Vì thôøi gian nghieân cöùu coù haïn, neáu coù ñieàu kieän,

chuùng toâi thaáy caàn tieáp tuïc caùc nghieân cöùu sau:

 Nghieân cöùu boå sung theâm caùc yeáu toá sinh tröôûng (growth factor) vaøo moâi tröôøng nuoâi caáy nhaèm ruùt ngaén thôøi gian nuoâi caáy naám moác vaø caûi thieän hoaït tính enzyme.

 Nghieân cöùu söï aûnh höôûng cuûa ñieàu kieän nuoâi caáy (pH, nhieät ñoä, oxy, löôïng gioáng caáy... ) leân quaù trình sinh toång hôïp enzyme pectinase.

 Nghieân cöùu tinh saïch enzyme töø canh tröôøng nuoâi caáy

beà saâu.

Luaän vaên toát nghieäp CHÖÔNG 5: KEÁT LUAÄN VAØ KIEÁN NGHÒ

 Xaùc ñònh caùc tính chaát cuûa cheá phaåm pectinase thu

nhaän ñöôïc.

 ÖÙng duïng cheá phaåm pectinase thu nhaän ñöôïc trong

Coâng ngheä Thöïc phaåm.

4. TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

Luaän vaên toát nghieäp TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

[1] Laâm Thò Kim Chaâu vaø caùc coäng taùc, Thöïc taäp lôùn sinh

hoùa, Tuû saùch Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân, TPHCM, 1998.

[2] Leâ Ngoïc Tuù, Hoùa sinh coâng nghieäp, NXB Khoa hoïc vaø kyõ

thuaät, Haø Noäi, 2002.

[3] Leâ Ngoïc Tuù, Enzyme vi sinh vaät taäp 2, NXB Khoa hoïc vaø kyõ

thuaät, Haø Noäi, 1982.

[4] Leâ Vaên Nhöông, Thu nhaän vaø öùng duïng caùc chaát hoaït ñoäng

sinh hoïc töø vi sinh vaät, NXB Khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø noäi, 1978.

[5] Nguyeãn Caûnh, Quy   hoaïch   thöïc   nghieäm, Tröôøng ñaïi hoïc

Baùch khoa thaønh phoá Hoà Chí Minh, 2004.

[6] Löông Ñöùc Phaåm,  Coâng   ngheä   vi   sinh   vaät, NXB Noâng

nghieäp, TpHCM.

[7] Nguyeãn Laân Duõng, Nguyeãn Ñình Quyeán, Phaïm Vaên

Ty, Vi sinh vaät hoïc, NXB Giaùo duïc Haø Noäi, 2002.

[8] Nguyeãn Ñöùc Löôïng, Coâng   ngheä   sinh   hoïc, Ñaïi hoïc Kyõ

thuaät, 1998.

[9] Nguyeãn Troïng Caån (Chuû bieân), Coâng ngheä enzyme, NXB

Noâng nghieäp TpHCM, 1998.

[10] Ñoàng Thò Thanh Thu, Hoùa sinh  öùng duïng, Tuû saùch Ñaïi

hoïc Khoa hoïc töï nhieân Tphcm, 1998.

[11] C.Lang, Perspectives   in   the   biological   function   and   the   technological   application of polygalacturonases, Appl Microbiol Biotechnol, Vol 53, 2000, pp 366-375.

[12] D.R.Kashyap, S.Chandra, A.Kaul, R.Tewari,

Production,   purification   and   characterization   of   pectinase   from   a   Bacillus   sp.   DT7, World Journal of Microbiology & Biotechnology, Vol 16, 2000, pp 277-282.

[13] Eloane Malvessi, Mauricio Moura Da Silveira, Influence   of  medium composition and pH on the production of polygalacturonase by Aspergillus   oryzae, Brazilian archives of biology and technology, Vol 47, september 2004, pp 693-702.

Luaän vaên toát nghieäp TAØI LIEÄU THAM KHAÛO

[14] G. Hoondal, R. Tiwari, R. Tewari, N. Dahiya, Q. Beg, Microbial   alkaline pectinases and their industrial applications, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol 59, January 2002, pp 409-418.

[15] M. Galiotou, Panayotou, M. Kapantai, O. Kalantzi, Growth   conditions of Aspergillus.sp. ATHUM­3482 for polygalacturonase production, Appl Microbiol Biotechnol, Vol 47, 1997, pp 425-429.

[16] Mc Maldonado, Am Strasser De Saad,

Production   of   pectinesterase and polygalacturonase by Aspergillus niger in submerged and solid   state   systems, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, Vol 20, 1998, pp 34-38.

[17] Ramesh Chander Kuhad, Mukesh Kapoor, Renuka Rustagi, Enhanced production of an alkaline pectinase from Streptomyces sp, World Journal of Microbiology & Biotechnolog, Vol 20, 2000, pp 257-236.

[18] V.Taragano, V.E.Sanchez, A.M.R. Pilosof, Combined   effect   of   water activity depression and glucose addition on pectinase and protease production   by Aspergillus niger, Biotechnology Letters, Vol 19, March 1997, pp 233- 236.

5. PHUÏ LUÏC

Luaän vaên toát nghieäp PHUÏ LUÏC

PHỤ LỤC

1. Caùc coâng thöùc tính toaùn cho phöông aùn caáu truùc coù taâm caáp hai:

Soá thí nghieäm cuûa phöông aùn caáu truùc coù taâm, k yeáu

toá:

K < 5: N = 2k + 2k + n0

K 5(cid:0) : N = 2k-1 + 2k + n0

Soá thí nghieäm ôû taâm phöông aùn: n0 = 1  caùnh tay ñoøn

sao α= 1

2

Khi ñoù:

2

X

X

X

'

j

j

2 j

3

(cid:0) 24 9

(cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (j = 1:k )

N

N

N

Caùc heä soá cuûa phöông trình hoài quy:

(

)

YXX i l

i

i

YX ' ji i

YX i ji

i

i

1

b

b

b

j

l (

)

j

ji

jj

1 N

i N

1 N

2

(cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) ; ;

X

X

(

)

(

'

)

2 ji

XX j

l

2 i

ji

i

1

i

1

i

1

(cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0)

2 cuûa caùc heä soá bj:

2 s th

2 s th

2 s th

Caùc phöông sai sbj

s

s

2 b

2 b

2 s b

N

N

N

ji

jj

j

2

X

(

)

(

'

)

X

XX j

l

2 i

ji

2 ji

i

i

1

1

i

1

(cid:0) (cid:0) (cid:0) ; ; (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0)

n

n

o

2

Trong ñoù:

Y

)

o Y u

o Y ( u

o

u

u

1

Y

s

2 th

1 n

n

1

(cid:0) (cid:0) (cid:0) ; (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0)

Vôùi n: soá thí nghieäm laøm theâm taïi taâm.

Tính yù nghóa cuûa caùc heä soá ñöôïc kieåm tra theo tieâu

chuaån Student:

b

b

b

j

jl

jj

Luaän vaên toát nghieäp PHUÏ LUÏC

t

t

t

j

jl

jj

s jlb

s jjb

s jb

(cid:0) (cid:0) (cid:0) ; ;

Tra baûng 2 – trang 112 – taøi lieäu tham khaûo [ ], tìm tp(f)

Vôùi möùc yù nghóa p = 0.05; soá baäc töï do taùi hieän: f = n –

l

Neáu tj < tp(f) thì heä soá bj seõ bò loaïi khoûi phöông trình hoài

quy.

Ta coù phöông trình hoài quy:

^ Y

...

...

...

b o

Xb 1

1

Xb 2

2

XXb 12

1

2

Xb 11

2 11

(cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0) (cid:0)

Kieåm tra söï töông thích cuûa phöông trình hoài quy vôùi thöïc

N

2

nghieäm:

i

)

^ YY ( i

F (cid:0)

i

(cid:0) 1

s

s s

2 tt

2 tt 2 th

lN

(cid:0) (cid:0) vôùi: (cid:0) (cid:0)

Tra baûng 4 – trang 114 – taøi lieäu tham khaûo [5], tìm F1-p(f1,f2)

Trong ñoù: f1 = N – 1 vaø f2 = n-l, vôùi l laø heä soá coù yù

nghóa trong phöông trình hoài quy.

Neáu F < F1-p(f1,f2): phöông trình töông thích vôùi thöïc nghieäm

2. Caùc baûng soá lieäu:

Baûng 1: Soá lieäu ñöôøng chuaån monogalacturonic acid:

0 0,25 0,5 1 1,5 2

Noàng ñoä dung dòch chuaån (mg/ml)

OD(A) 0 0,10 1 0,21 1 0,44 2 0,68 2 0,9 3

Baûng 2: Soá lieäu ñöôøng chuaån Tyrosin:

0 0,05 0,1 0,2 0,25 0,3 0,1 5 Noàng ñoä dung dòch chuaån ( (cid:0) mol/ml)

OD(A) 0 0,10 2 0,21 6 0,42 7 0,53 4 0,61 8 0,3 1

Luaän vaên toát nghieäp PHUÏ LUÏC

Luaän vaên toát nghieäp PHUÏ LUÏC

1

0,8

y = 0,4667x - 0,014 R2 = 0,9992

0,6

) A (

D O

0,4

0,2

0

0

0,5

1

1,5

2

2,5

Noàng ñoä ñöôøng khöû (mg/ml)

3. Ñoà thò caùc ñöôøng chuaån:

1,2

y = 2,0744x + 0,0039 R2 = 0,9995

0,8

) A ( D O

0,4

0

0

0,2

0,4

0,6

(cid:0)

Noàng ñoä tyrosin ( mol/ml)

Hình 1: Ñöôøng chuaån monogalacturonic acid

Hình 2: Ñöôøng chuaån Tyrosin