TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế
Tập 23, Số 2 (2023)
33
NGHIÊN CỨU CHIẾT XUẤT VÀ KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH NẢY MẦM HẠT LÚA
CỦA COLLAGEN TỪ DA CÁ BA SA
Lê Trung Hiếu1, Nguyễn Hoàng Lương Ngọc1,2, Lê Lâm Sơn1, Nguyễn Đăng Giáng Châu1,
Trần Thanh Minh1, Lê Thùy Trang1, Nguyễn Thị Như1, Trần Thị Văn Thi1*
1Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế
2Trường Đại học Công Nghiệp Thực Phẩm thành phố Hồ Chí Minh
*Email: ttvthi@hueuni.edu.vn
Ngày nhận bài: 21/12/2022; ngày hoàn thành phản biện: 26/12/2022; ngày duyệt đăng: 14/4/2023
TÓM TẮT
Da cá thải ra từ ngành chế biến cá được coi là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản
xuất collagen. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng cồn 96° để tủa collagen
thay NaCl 4 M, để rút ngắn thời gian chiết xuất collagen. Đặc tính của collagen
được xác định thông qua phổ hồng ngoại (phổ IR) và kính hiển vi điện tử quét
(SEM). Phổ hồng ngoại thể hiện các peak đặc trưng của các nhóm chức amid I,
amid II và amid III của collagen ở bước sóng 1741 cm-1, 1402 cm-1 và 1280 cm-1. Ảnh
SEM cho thấy mẫu collagen gồm các sợi hình cầu có đường kính khoảng 3,5 µm.
Glycin, Alanin và Prolin là ba amino acid chính trong mẫu collagen nghiên cứu.
Nồng độ collagen 200 mg/mL và thời gian xử lý 6 giờ là thích hợp cho sự nảy mầm
hạt lúa.
Từ khóa: Da cá basa; collagen; kích thích nảy mầm, SEM, IR.
1. MỞ ĐẦU
Các ngành công nghiệp chế biến thịt động vật tạo ra khoảng 50–80% chất thải
rắn và lỏng. Loại chất thải này có thể được sử dụng làm thành phần trong thức ăn chăn
nuôi và phân bón [1, 2], nhưng hiện nay đa số được xử lý tại các bãi chôn lấp, đốt hoặc
đổ xuống các nguồn nước, gây ra các vấn đề nghiêm trọng về môi trường. Điều này
đặt ra cho các nhà khoa học nhiệm vụ cấp thiết là nghiên cứu nhằm tạo ra các sản
phẩm có giá trị cao hơn từ lượng chất thải này như sản xuất dầu diesel sinh học, các
acid béo, acid amin, omega, collagen …
Collagen là thành phần protein chính của da, gân, sụn, xương và mô trong tất
cả các động vật đa bào [3, 4]. Collagen được coi là một trong những vật liệu sinh học
phổ biến nhất, không độc, có khả năng hấp thụ nước, tạo gel, có khả năng hình thành
Nghiên cứu chiết xuất và khả năng kích thích nảy mầm hạt lúa của collagen từ da cá ba sa
34
và ổn định nhũ tương [5, 6], có thể dùng sản xuất da người, mạch máu và dây chằng
nhân tạo dùng trong y sinh học, các mỹ phẩm làm đẹp da ... Một số nghiên cứu khác
cũng cho thấy collagen chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học với đặc tính kháng
khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa và kích thích nảy mầm [7- 12]. Trên thế giới hiện
nay, collagen được sản xuất từ chất thải từ công nghệ chế biến thịt của nhiều loại động
vật khác nhau. Collagen từ các nguồn nguyên liệu khác nhau thì có cấu trúc, đặc tính
khác nhau và do đó, có khả năng ứng dụng hoàn toàn khác nhau.
Trong những năm qua, Việt Nam đã có những thành tựu đáng ghi nhận không
chỉ trong nước mà trên thị trường thế giới về nuôi trồng, chế biến, xuất khẩu thủy sản,
trong đó công nghệ nuôi và chế biến cá Basa đã tạo được tiếng vang trên thị trường
trong nước và quốc tế. Khi sản xuất cá phi lê hoặc cá đóng hộp, các bộ phận đầu,
xương, vây, da, đuôi và nội tạng bị loại bỏ, tạo ra một lượng lớn chất thải sinh học lên
đến hàng nghìn tấn mỗi năm. Các công bố về chiết xuất collagen từ da cá nuôi tại Việt
Nam còn rất lẻ tẻ và thông tin về điều kiện thực nghiệm cũng còn rất sơ sài. Nhóm
nghiên cứu chúng tôi đã bước đầu đưa ra kết quả nghiên cứu về chiết xuất và tinh chế
collagen từ da cá Basa trong một bài báo trước đây. Trong nghiên cứu này, chúng tôi
tiếp tục cải thiện điều kiện tinh chế collagen và thử nghiệm ứng dụng collagen thu
được trong kích thích nảy mầm của hạt lúa HT1 (Oryza sativa) tại Thừa Thiên Huế.
2. THỰC NGHIỆM
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và thiết bị
Da cá Basa nuôi công nghiệp phục vụ xuất khẩu, được chế biến bởi Công ty Cổ
phần Đầu tư và Phát triển Đa Quốc Gia IDI. Natrium hydroxide, citric monohydrate
acid, hydroperoxide được mua từ công ty Xilong (Trung Quốc). Tất cả các thuốc thử và
dung môi được sử dụng đều thuộc loại tinh khiết phân tích. Hạt lúa HT1 (Oryza sativa)
mua của công ty bán giống lúa cho nông dân tại Thừa Thiên Huế.
2.2. Quy trình chiết xuất collagen
Quy trình tách chiết collagen từ da cá Basa thực hiện qua 2 giai đoạn (hình 1)
[13]. Các điều kiện thực nghiệm trong quy trình đã được thông báo trong nghiên cứu
trước của nhóm.
Giai đoạn 1. Loại tạp để thu nhận collagen thô, gồm 3 bước:
Bước 1. Xử lý bằng NaOH để loại bỏ lipid: nồng độ NaOH 0,10 M; tỷ lệ nguyên
liệu đầu/thể tích dung dịch (w/v) là 1/25, tiến hành 3 lần, thời gian: 8 giờ/lần.
Bước 2. Sử dụng citric acid để loại bỏ chất khoáng: nồng độ citric acid là 0,05 M;
tỷ lệ nguyên liệu đầu/thể tích dung dịch (w/v): 1/25; tiến hành 3 lần; thời gian: 8
giờ/lần.
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế
Tập 23, Số 2 (2023)
35
Bước 3. Sử dụng H2O2 loãng để loại bỏ sắc tố: tỷ lệ nguyên liệu đầu/thể tích
dung dịch (w/v): 1/25; tiến hành 3 lần, thời gian: 2 giờ/ lần.
Giai đoạn 2. Tinh chế collagen
Hòa tan collagen thô trong citric acid 0,05 M; tỉ lệ khối lượng mẫu/thể tích dung
dịch citric acid (w/v): 1/20 (g/ml); thời gian khuấy: 24 giờ. Lọc để loại tạp chất không
tan, sau đó kết tủa bằng NaCl hay cồn 96°.
Hình 1. Sơ đồ quy trình tách chiết collagen từ da cá Basa
2.3. Các phương pháp đặc trưng vật liệu
Thành phần acid amin được ghi nhận bằng phân tích sắc ký lỏng hiệu năng cao
(HPLC). Các liên kết trong collagen được chỉ ra trong phổ hồng ngoại trên thiết bị
Prestige-21, Shimadzu (Nhật Bản). Hình thái được đặc trưng bởi kính hiển vi điện tử
quét trên thiết bị JSM-6010PLUS – JEOL.
2.4. Xác định thành phần acid amin của collagen thu được bằng phương pháp phân
tích HPLC
Quá trình phân tích thành phần amino acid được thực hiện trên cột: ZORBAX
Eclipse-AAA; 3.5 µm; L x i.d = 150 x 4.6 mm. Dung dịch rửa giải gồm : Methanol/
~20g da cá
1. 500 ml NaOH 0,100 M, 8 giờ/ 1 lần, 3 lần
2. 500 ml citric acid 0,05 M, 8 giờ/ 1 lần, 3 lần
3. 200 ml H2O2 5 %, 5 giờ
4. 50-100 ml acetone, 48 giờ
Collagen thô
Giai đoạn 1
Loại bỏ các
tạp chất
(lipid,
protein,
muối khoáng
và sắc tố)
Giai đoạn 2
Chiết xuất và
tinh chế
collagen
1. Citric acid 0,05 M, 24 giờ
Dung dịch trắng, nhớt
1. Lọc loại tạp
2. Tủa bằng cồn 96° (1:4 (v/v))
3. Ly tâm
4. Rửa tủa nhiều lần bằng ethanol
Collagen
Nghiên cứu chiết xuất và khả năng kích thích nảy mầm hạt lúa của collagen từ da cá ba sa
36
Acetonitrile/ Nước = 45/45/10, điều chỉnh pH = 7,8 bằng đệm phosphate. Tốc độ dòng:
2,0 ml/phút. Nhiệt độ: 40 oC. Detector: DAD.
2.5. Nghiên cứu ảnh hưởng của collagen đến sự nảy mầm của hạt lúa
Tiến hành: cát trắng sạch được phun nước cho ẩm (không quá ướt) rồi cho vào
đĩa peptri với những lượng bằng nhau sao cho phủ đều trên đĩa với độ dày khoảng 0,5
cm. Chọn 100 hạt lúa có kích cỡ và màu sắc tương đối như nhau, cho vào cốc 100 mL.
Dùng pipet lấy 25 mL dung dịch collagen có các nồng độ cần khảo sát lần lượt là 50
mg/L; 100 mg/L; 200 mg/L và đối chứng nồng độ 0 mg/L (nước) cho vào đĩa peptri. Sau
những thời gian ngâm hạt thay đổi lần lượt là 2, 4, 6, 8 giờ trong dung dịch, lấy ra và
gieo hạt vào đĩa peptri đã chuẩn bị ở trên, phủ thêm cát đều lên trên với khoảng cách
của hạt lúa với mặt trên cùng là 1 cm. Mỗi ngày dùng bình phun tia nhỏ tưới lại 2 lần
để giữ độ ẩm. Theo dõi sự phát triển của mầm trong thời gian 4 ngày thì lấy mầm ra,
rửa sạch cát, thấm khô rồi kiểm tra các chỉ tiêu của mầm như sau: số hạt nảy mầm,
chiều dài thân và lá (cm), chiều dài rễ (cm) và số rễ trên 1 hạt.
2.6. Phương pháp xử lý số liệu:
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện ba lần (n = 3). Các kết quả được trình bày
dưới dạng giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn (SD). Phần mềm Origin 8.0 và Microsoft
Excel (2010) được sử dụng để phân tích thống kê.
3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Đặc trưng collagen thu nhận được khi sử dụng dung môi tinh chế khác nhau
Các nghiên cứu trước đây đều kết tủa collagen bằng NaCl. Collagen là một
polymer thiên nhiên có các nhóm chức phân cực. Căn cứ vào tính chất đối với các
polymer phân cực, chúng tôi thử nghiệm thay NaCl bằng cồn 96o.
- Về mặt cảm quan và thời gian tinh chế:
Hình thái của collagen thu được trong 2 trường hợp được thể hiện trên Hình 1.
Sản phẩm thu được khi tinh chế bằng cồn 96o có màu sắc trắng đẹp hơn nhiều. Mặt
khác, khi kết tủa bằng NaCl, đòi hỏi thời gian ngâm và thẩm tách sau đó lên đến hàng
tuần mà vẫn không tách loại được hết NaCl ra khỏi sản phẩm, vì vậy mẫu còn chứa
nhiều nước, rất khó đông khô. Trong khi đó, kết tủa bằng cồn 96o thì không tốn thời
gian để thẩm tách, đông khô mẫu dễ dàng.
TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ, Trường Đại học Khoa học, ĐH Huế
Tập 23, Số 2 (2023)
37
Hình 1. Sản phẩm collagen được tinh chế bằng NaCl (A) và cồn 96o (B)
- Về phổ hồng ngoại:
Sản phẩm thu được trong 2 trường hợp có phổ hồng ngoại được trình bày trên
Hình 2.
Hình 2. Phổ hồng ngoại của collagen được tinh chế bằng NaCl (A) và cồn 96° (B)
Hình 2A cho thấy mẫu có chứa các nhóm chức đại diện cho collagen: xuất hiện
N-H ở 3442 cm-1; CH2 ở 2967 và 2928 cm-1; amide bậc I ở 1634 cm-1; amide bậc II ở 1587
cm-1; amide bậc III ở 1275 cm-1.
Hình 2B cho thấy mẫu kết tủa bằng cồn 96° cũng có các peak tương tự nhau, có
độ dịch chuyển trong khoảng cho phép của phổ hồng ngoại: vùng 3472 cm-1 đặc trưng
cho dao động hóa trị của liên kết N-H. Độ truyền qua của các peak ở số sóng 2924 cm-1
và 2825 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C-H. Các đỉnh mạnh tập trung
ở 1741 cm-1, 1402 cm-1 và 1280 cm-1 có thể được gán tương ứng cho các dải amide I, II
và III, là các đặc tính điển hình của collagen [14, 15]. Như vậy, phổ hồng ngoại của 2
mẫu đều có chứa đầy đủ các peak tương ứng các nhóm chức đặc trưng của collagen.
(B)
(A)
(B)