TNU Journal of Science and Technology
230(01): 137 - 143
http://jst.tnu.edu.vn 137 Email: jst@tnu.edu.vn
AN INVESTIGATION OF CHARACTERIZE ANTIBIOTIC RESISTANCE
GENES AND VIRULENCE GENES OF ACINETOBACTER BAUMANNII USING
ADVANCED NEXT-GENERATION SEQUENCING
Nghiem Ngoc Minh, Tran Thi Hop, Nguyen Thi Diem, Vo Thi Bich Thuy*
Institute of Genome Research - Vietnam Academy of Science and Technology
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
15/7/2024
Acinetobacter baumannii is one of the common Gram-negative
bacteria causing hospital-acquired infections, posing a serious global
health threat due to its ability to resist multiple antibiotics and rapid
reproduction. Thirty strains of Aci. baumannii resistant to antibiotics
were studied using next-generation genome sequencing techniques,
combined with bioinformatic analysis to identify genetic
characteristics, gene groups related to pathogenicity and multidrug
resistance. The research results showed 11 different sequence types
(ST), in with ST2 being the most prevalent (36.67%). Among the 30
isolates, there were 28/30 (93.33%) exhibited resistance to three or
more types of antibiotics, with all isolated strains resistant to
ampicillin, whereas showing lower ratio resistance to ciprofloxacin,
cefoxitin, and trimethoprim (3.33%). All multidrug-resistant strains in
the study contained virulence genes. These findings indicate the
circulation of multidrug-resistant Aci. baumannii strains in several
major hospitals in Hanoi, helping doctors ensure effective treatment
and reduce bacterial resistance, thereby minimizing patient mortality.
Revised:
17/10/2024
Published:
18/10/2024
KEYWORDS
Acinetobacter baumannii
Multidrug resistance
Antibiotic resistance genes
Virulence genes
Next-generation sequencing
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM MT S GEN KHÁNG KHÁNG SINH GEN
ĐỘC CA ACINOBACTER BAUMANNII BNG GII TRÌNH T TH H MI
Nghiêm Ngc Minh, Trn Th Hp, Nguyn Th Dim, Võ Th Bích Thy*
Vin Nghiên cu h gen - Vin Hàn lâm Khoa hc và Công ngh Vit Nam
TÓM TT
Ngày nhn bài:
15/7/2024
Acinetobacter baumannii (Aci. baumannii) mt trong nhng loài vi
khun Gram âm gây nhim trùng bnh vin ph biến, tr thành mối đe
da nghiêm trọng đối vi y tế toàn cu do kh năng chống li nhiu
loi kháng sinh kh năng sinh sản nhanh chóng. Ba mươi chủng vi
khun Aci. baumannii kháng thuc được nghiên cu bng k thut gii
trình t gen thế h mi, kết hợp phân tích tin sinh cho phép xác định
được đặc điểm h gen ca vi khun, các nhóm gen chức năng ln quan
đến kh năng gây bệnh đa kháng thuốc. Kết qu nghiên cu cho
thấy 11 sequence type (ST) khác nhau, trong đó ST2 phổ biến
nht (36,67%). Có 28/30 chng (93,33%) có kiu hình kháng t ba loi
kháng sinh tr lên, trong đó 100% các chủng phân lp đều có kiu hình
kháng ampicillin, ngược lại, đề kháng thp vi các kháng sinh
ciprofloxacin, cefoxitin trimethoprim (3,33%). Tt c các chủng đa
kháng trong nghiên cứu đều chng cha gen yếu t độc lc. T
các kết qu thu được có th biết tình hình nhim khun Aci. baumannii
đa kháng thuốc lưu hành tại mt s bnh vin ln trong thành ph
Nội, giúp bác bảo đảm điều tr, gim kh năng đ kháng ca vi
khun, t đó gim thiu t vong bnh nhân.
Ngày hoàn thin:
17/10/2024
Ngày đăng:
18/10/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.10771
* Corresponding author. Email: thuybvo.igr@gmail.com
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 137 - 143
http://jst.tnu.edu.vn 138 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Gii thiu
Hin nay, trên thế giới cũng như tại Vit Nam, Aci. baumannii ngun nhân hàng đầu gây
nhim khun bnh vin, th dẫn đến nhiu loi bệnh như nhim trùng huyết, nhim trùng vết
m, nhiễm trùng đường tiết niu, viêm phi và viêm màng não mủ, đặc bit nhng bnh nhân
h min dch suy yếu hoặc đã có các thủ thut y tế phc tp [1], [2]. T chc Y tế Thế gii gần đây
đã công bố danh sách các c vi khun kháng kháng sinh gây nguy him ln đối vi sc khe con
người. Danh sách đưc chia theo 3 cấp độ ưu tiên của WHO v đánh giá và phát triển thuc kháng
sinh mới. Đáng chú ý, Aci. baumanni đưc xếp vào mc độ ưu tiên 1, biểu th mc độ nguy him
cao nht [3].
S phát trin s lan rng ca vi khun Aci. baumanni kháng thuc mt vấn đề phc tp.
Ti Vit Nam, vi khun Aci. baumannii đa kháng thuốc (MDR-Ab) cũng có xu hướng lan rng ra
cộng đồng mối đe dọa ln cho sc khỏe con người. Trong nghiên cu ca Trần Lĩnh Sơn
năm 2022, cho biết Aci. baumannii kháng 75% vi tobramycin 100% vi cefazolin, ch còn
nhy vi mt vài kháng sinh như colistin (91%), trimethoprim/sulfamethoxazole (50%) hay
tobramycin 22% [4]. Theo kho sát ca mt nhóm nghiên cứu đến t Đại hc Linkoping (Thy
Điển) đã thực hiện điều tra trên 2.200 bnh nhân ti 12 bnh vin ti Vit Nam cnh báo v
nguy cơ gia tăng ca vi khuẩn đường rut kháng thuc carbapenem (CRE) ti các bnh vin Vit
Nam như E.coli, Klebsiella sp, Enterobacter sp. Nghiên cu cho thấy ban đầu ch có mt trong s
tám bnh nhân nhp vin mang vi khun siêu kháng thuốc, nhưng nửa tháng nm vin, s ng
này tăng lên 7 người [5].
Aci. baumannii kháng đa thuốc nghĩa kháng lại ít nht ba loại kháng sinh khác nhau, do đó
làm gim các la chọn điều tr cho bnh nhân bác trong nhiều sở chăm sóc sức khe [6],
[7]. Có nhiu cơ chế kháng thuc ca Aci. baumannii như kh năng chuyn gen qua ngang gia các
chng loài thông qua các phn t di động như plasmid, transposon integron giúp vi khuẩn
kháng thuc khi đối mt vi các loi kháng sinh khác nhau, nhưng nguy hiểm nht là cơ chế truyn
gen kng thuc [8], [9]. S kết hp của c cơ chế bao gm biu hin beta-lactamase, thay đổinh
không thm cang tế o,ng cưng hoạt động của bơm thải, topoisomerase và DNA gyrase
nhng yếu t góp phn vào s kháng thuc ca Aci. baumannii [7]. Tuy nhiên, nghiên cu v cơ
chế kháng thuc qua gen ng dng các k thut gii trình t gen để c định các gen liên quan
đến tính kháng thuc ca vi khun Aci. baumanni vn còn hn chế. Các nghiên cứu trước đây đã
ch ra rng, Aci. baumanni nhiu nhóm gen chc năng trong hệ gen của mình, trong đó nhóm
gen kháng thuc, gen độc lực gen đích ca thuc quan trng nht [10]. Các nhóm gen này
quyết đnh tính kháng thuc ca vi khun và khác nhau gia các chủng được phân lp ti v trí khác
nhau trên thế gii [11].
Mt s gen độc quan trng ca chng Aci. baumannii nsản xut colicin V (cvaC), si tròn
(csg) có trách nhim bám dính, protein siderophore aerobactin (iutA) cung cp st và ngoi độc t
có tác dụng gây độc tế bào yếu t hoi t (cnf) [12]. Mt trong nhng yếu t độc lc quan trng
Aci. baumannii phopholipase C (PLC) và D, thy phân phospholipid, to điều kin cho sy lan
ca nhim trùng vt ch [13]. Mt s gen độc thường liên quan đến kh năng sn xut c
enzyme β-lactamase, đặc bit β-lactamase nhóm D nhóm B (MBLs - metallo-β-lactamase),
giúp vi khun y kháng thuc. Ngoài ra, c yếu t trình t chèn (Insertion sequence - IS) cũng
đóng vai trò quan trọng trong di chuyn và biu hin ca các gen β-lactamase loi OXA, góp phn
đến s kháng thuc ca vi khun y [14].
Mặc dù đã có nhiều n lực đ khám phá ra đặc điểm kháng nhiu loi thuc và vô s yếu t độc
lc khiến vi khun này tr tnh mối đe dọa nghm trng đối vi sc khe cộng đồng trên toàn thế
giới, nng nó vn tiếp tc làm các n nghiên cu bi ri do bn cht thích nghi cao, phát sinh đột
biến để đáp ng vi một môi trường nhất định. S tn ti dai dng ca Aci. baumannii trong môi
trường lâm sàng cũng cho pp tiếp c gn vt ch tim năng, to điu kin cho nhim trùng và
xâm chiếm. Trong nghiên cu này, cngi đánh giá đặc điểm phân t gen liên quanc yếu t
độc lc và kh ng đa kháng kháng sinh của vi khuẩn, đặc bit đề cập đến cơ chế bnh sinh hình
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 137 - 143
http://jst.tnu.edu.vn 139 Email: jst@tnu.edu.vn
thành kiểu hình đó Aci, baumannii đa kháng thuốc phân lập đưc ti mt s bnh vin Vit
Nam, gii mt s chế giúp các tác nhân gây bnh này lây nhim thành công cho vt ch
ca chúng.
2. Đối ợng phương pháp nghn cứu
2.1. Đối tượng nghiên cu
Ba mươi mẫu vi khun Aci. baumannii đã được nuôi cy, phân lp ti Khoa Vi sinh ca Bnh
vin 103, Bnh vin Trung ương Quân đội 108 và mt s bnh viện đa khoa khác trên địa bàn Hà
Ni. Các mu vi khuẩn y được bác s chuyên ngành vi sinh y hc ca các bnh vin trên xác
nhn. Chng Aci. baumannii được định danh th nghim nhy cm kháng sinh bng h thng
định danh và kháng sinh đồ t động Phoenix, BD.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Gii trình t h gen ca các chng Aci. baumannii
Các chng Aci. baumannii được gii trình t h phiên mã bng công ngh gii trình t gen thế
h mi ca Illumina.
2.2.2. Phương pháp tin sinh học
Chất lượng trình t được kim tra bng phn mm FastQC. Các trình t adapter trình t
kém được loi b bng phn mm Trimmomatic 0.32. Các trình t tinh sch chất lượng Q30
được lp ráp de novo bng phn mm Geneious R11, sau đó được chú thích chức năng các gen
bằng các sở d liệu khác nhau như: RAST, PATRIC 3.5.2, BASys phần mm Geneious
R11. Để xác định gen kháng kháng sinh gen yếu t độc lc, các trình t được so sánh vi các
cơ sở d liu như ResFinder, ARG- ANNOT, CARD và PATRIC 3.5.2.
3. Kết quả
3.1. Kết quả kháng kháng sinh của các chủng Aci. baumannii phân lập
Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của 30 chng Aci. baumannii vi mt s loi kháng sinh
chn lc. T kết qu tng hp Bng 1 cho thy t l kháng ampicillin 100%, kháng
meropenem là 86,67%. C hai kháng sinh này đều thuc nhóm kháng sinh β-lactam, thuc nhóm
kháng sinh mnh nht. Aci. Baumannii kháng kanamycin thuc nhóm aminoglycoside vi t l
cao (83,33%). Các chng Aci. baumannii đề kháng vi các kháng sinh ciprofloxacin, cefoxitin,
trimethoprim thấp (3,33%).
Bng 1. Kết qu độ nhy kháng sinh ca Aci. baumannii
Kháng sinh
Đề kháng
Số lượng mẫu
Tỷ lệ %
Gentamicin
23
76,67
Kanamycin
25
83,33
Amikacin
20
66,67
Streptomycin
24
80
Rifampicin
3
10
Ampicillin
30
100
Meropenem
26
86,67
Ceftriaxone
6
20
Chloramphenicol
4
13,33
Erythromycin
22
73,33
Azithromycin
22
73,33
Sulfisoxazole
18
60
Tetracycline
17
56,67
Ciprofloxacin
1
3,33
Cefoxitin
1
3,33
Trimethoprim
1
3,33
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 137 - 143
http://jst.tnu.edu.vn 140 Email: jst@tnu.edu.vn
3.2. Kết quả định danh các chủng Aci. baumannii phân lập
Hệ gen của 30 mẫu nghiên cứu được chú giải bằng công cụ phân tích genome tự động Prokka
so sánh với hệ gen chú giải của các chủng tham chiếu phổ biến, bao gồm Acinetobacter
baumannii ATCC 17978 (CP000521), AYE (CU459141), ACICU (CP000863), AB0057
(CP001182), BJAB0686, BJAB07104 BJAB0715. Core genome được xác định sử dụng phần
mềm Roarry, một gen được xác định core gen khi với độ tương đồng tối thiểu 95% trong
trình tự axit amin xuất hiện trong 99% số lượng mẫu. Từ kết quả dóng hàng của core gen t
Roarry, xây dựng cây phân loại theo Maximum-likehood (ML) sử dụng phần mềm RaxML. Kết
quả thu được 11 sequence type khác nhau, trong đó có 2 sequence type chiếm tỷ lệ lớn ST2 và
ST571. ST2 phổ biến nhất (11/30 chủng); đứng thứ 2 ST571 (6/30 chủng). Các ST25,
ST575 ST164 2/30 chủng, riêng ST1160, ST52, ST161, ST119, ST1336, ST16 ST193
chỉ xuất hiện 1/30 chủng.
3.3. Kết quả phân tích các nhóm gen ở các chủng Aci. baumannii phân lập
3.3.1. Nhóm gen kháng kháng sinh
Đánh giá khả năng kháng kháng sinh của Aci. baumannii giúp cung cấp thông tin chi tiết về
đặc điểm kháng kháng sinh theo từng chủng. Trong nghiên cứu này, kết quả cho thấy 28/30
chủng (93,33%) biểu hiện kiểu hình đa kháng sinh. Phân tích de novo kết quả giải trình t
ng phát hiện có 283 gen kháng kháng sinh bao gồm 105 gen kháng kháng sinh nhóm β-lactam,
57 gen kháng nhóm aminoglycoside, 44 gen kháng nhóm macrolide, 27 gen kháng nhóm
streptomycin 24 gen kháng nhóm sulfonamides. Ngoài ra, còn phát hiện được 26 gen kháng
kháng sinh nhóm rifamycin, chloramphenicol, tetracyclines, trimethoprim và florfenicol. Các gen
liên quan tới kháng kháng sinh nhóm β-lactam - phân nhóm kháng sinh mạnh nhất được xác định
mặt trong hệ gen của toàn bộ 30 chủng Aci. baumannii nghiên cứu. Trong đó, đại diện gen
blaADC-25 có trong 29 chủng (96,67%) và gen blaOXA-23 có ở 23 chủng (76,67%). Kết quả thu
được cũng cho thấy rằng, các gen armA trong 20 chủng (66,67%) hay gen aph (6)-ld có ở 18
chủng (60%) đều thuộc nhóm kháng sinh aminoglycoside (Hình 1).
Hình 1. S phân b gen kháng kháng sinh trong 30 chng Aci. baumannii nghiên cu
ARR-3_4
aac(3)-IIa_1
aac(3)-IId_1
aac(6')-Ian_1
ant(2'')-Ia_13
ant(3'')-Ia_1
aph(3'')-Ib_2
aph(3')-Ia_7
aph(3')-VI_1
aph(3')-VIb_1
aph(6)-Id_1
armA_1
blaADC-25_1
blaCARB-16_1
blaCARB-2_1
blaNDM-1_1
blaOXA-120_1
blaOXA-144_1
blaOXA-23_1
blaOXA-402_1
blaOXA-421_1
blaOXA-51_1
blaOXA-58_1
blaOXA-64_1
blaOXA-66_1
blaOXA-67_1
blaOXA-91_1
blaPER-1_1
blaPER-7_1
blaTEM-1D_1
cmlA1_1
dfrA19_1
floR_2
mph(E)_1
msr(E)_1
oqxA_1
oqxB_1
sul1_5
sul2_2
tet(39)_1
tet(B)_1
Ab1 ## 98 .## . . ## . . . ## ## ## . . . . . ## . . . . ## . . . . ## .## . . ## ## . . ## ## .##
Ab2 . . . . . . ## . . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . . . . ##
Ab3 . . . . . . ## ## . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . . ## .##
Ab4 . . . . . . ## . . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . . . . ##
Ab5 . . . . . . . . . . . . ## . . . ## . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ab6 . . . . . . ## . . ## ## .## . . . . ## ## . . . . . . . . ## . . . . . . . . . . ## . .
Ab7 . . . . . 83 ## ## . . ## ## 93 . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . ## ## .##
Ab8 . . . . . 83 ## ## . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . ## ## .##
Ab9 . . . . . 83 ## ## . . ## ## 93 . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . ## ## .##
Ab10 . . . . . . ## ## . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . . . . ##
Ab11 . . . . . . ## . . ## ## .## . . . . ## ## . . . . . . . . ## . . . . . . . . . . ## . .
Ab12 . . . . . . . . . . . . ## . . . . . . . . . . . . ## . . . . . . . ..## ## . . . .
Ab13 . . . . . . ## ## . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . . . . . ## ## . . . ## .##
Ab14 ## . . . . . ## . . . ## .## .## ## . . . ## . . . . . . . . . . . ## ### ## . . ## ## ## .
Ab15 . . . . . . . . . . . . ## . . . ## . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ab16 . . . . . . ## . . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . . . . . ## ## . . . ## .##
Ab17 . . . . . 83 . . . . . ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . . . . .
Ab18 . . . . . 83 . . . . . ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . ## . . .
Ab19 . . . . . . ## ## . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . . . . . ## ## . . . ## .##
Ab20 . . . . . . ## ## . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . . . . . . ## .##
Ab21 ## ## .## . . ## . . . ## ## ## . . . . . ## . . . . ## . . . . ## .## . . ## ## . . ## ## .##
Ab22 . . . . . 83 . . . . . ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . ## . . .
Ab23 . . ## . . . ## . . ## 89 . . . . . . . ## . . . ## . . . 81 ## . . . . . ## ## . . . . ## .
Ab24 . . . . . . . . . . . . ## . . . . . . . ## . . . . . . . . . . . . ## ## . . . . . .
Ab25 . . . . . . ## . . . ## ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . . . . . ## ## . . . . . ##
Ab26 . . . . . 83 . . . . . ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . ## . . .
Ab27 . . . . . . . . . . . . ## . . . . . . . . ## . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Ab28 . . . . . 83 . . . . . ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . ## . . .
Ab29 . . . . ## ...## ...84 ## . . . . ## . . . . . . . ## . . . . . . . . . . . . 91 .
Ab30 . . . . . 83 . . . . . ## ## . . . . . ## . . . . . ## . . . . ## . . . ## ## . . ## . . .
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 137 - 143
http://jst.tnu.edu.vn 141 Email: jst@tnu.edu.vn
3.3.2. Nhóm gen yếu tố độc lực (Virelence gen)
Hiện nay, các gen liên quan đến độc lực của Aci. baumannii đã được nghiên cứu và phát hiện,
tuy nhiên chức năng chế hoạt động của phần lớn các gen này vẫn chưa được nghiên cứu
đầy đủ. Trong nghiên cứu này, có tổng cộng 48 gen độc lực được xác định. Các gen ompA, adeF,
adeG, adeH, pgaA, pgaB, pgaC, pgaD, plc, plcD, lpsB, lpxA, lpxB, lpxD, lpxL, lpxM, barA, barB,
basA, basB, basC, basD, basF, basG, bash, basJ, nhóm gen bau, entE, bfmR, bfmS, pbpG
trong tất cả các chủng Aci. baumannii. Tuy nhiên, một số gen như gen bap, csuA/B, csuA, csuB,
csuC, csuD, csuE, lpxC, basJ, hemO, abal, abaR tỷ lệ thấp từ 4,16% (2/48) đến 22,91%
(11/48) (Hình 2). Các gen này vai trò trong quá trình gây bệnh thể vai trò đối với
kháng kháng sinh Aci. baumannii.
Hình 2. S phân b Virelence gen trong 30 chng Aci. baumannii nghiên cu
4. Thảo luận
Phân tích s tương đồng v sequence type (ST) giữa ba mươi chủng Aci. baumanni thu thp t
các bnh vin ln ti Ni cho thy s đa dạng gen gia các chng, vi 11 sequence type
khác nhau được xác định. Trong s đó, ST2 ST571 hai nhóm lớn nhất. Đáng chú ý, hai ST
chiếm ưu thế mang nhiu cu hình gen kháng kháng sinh riêng biệt, như: bla OXA-23 - mphE -
msrE - aph3′Ia armA strA strB - sulIII -bla TEM - tetB đối vi ST2 và bla OXA-23 mphE
msrE aadA armA sulI - bla TEM cho ST571 [4]. Đây hai nhóm ph biến không ch ti
Vit Nam còn trên toàn thế gii. Các kết qu này phn ánh mức độ ph biến kh năng lây
lan ca ST2 ti Việt Nam Đông Nam Á [15], th liên quan đến chia s thiết b y tế hoc
chuyn bnh nhân gia các khoa và các bnh vin. Các kết qu này cũng tương tự vi nghiên cu
của Kumkar (2023) đã quan sát thy s ng ln các chng phân lp t Ấn Độ thuc genotype
ST2 [8]. Việc định danh qua ST này rt quan trng, cho thy s lưu hành của các chng vi
khun Aci. baumanni đa kháng thuốc ca Vit Nam.
Khả năng kháng kháng sinh của Aci. baumannii một vấn đề cấp bách trong y học hiện đại,
đặc biệt khi vi khuẩn này thường gây ra c nhiễm trùng nghiêm trọng khó điều trị. Nghiên
cứu cho thấy tất cả các chủng vi khuẩn được kiểm tra đều có các gen kháng kháng sinh, giống với
nghiên cứu của Jale và cộng sự (2015) [2] khi phát hiện các gen kháng β-lactam như blaADC-25
ompA
adeF
adeG
adeH
bap
csuA/B
csuA
csuB
csuC
csuD
csuE
pgaA
pgaB
pgaC
pgaD
plc
plcD
lpsB
lpxA
lpxB
lpxC
lpxD
lpxL
lpxM
barA
barB
basA
basB
basC
basD
basF
basG
basH
basI
basJ
bauA
bauB
bauC
bauD
bauE
bauF
entE
hemO
abaI
abaR
bfmR
bfmS
pbpG
Ab1
Ab2
Ab3
Ab4
Ab5
Ab6
Ab7
Ab8
Ab9
Ab10
Ab11
Ab12
Ab13
Ab14
Ab15
Ab16
Ab17
Ab18
Ab19
Ab20
Ab21
Ab22
Ab23
Ab24
Ab25
Ab26
Ab27
Ab28
Ab29
Ab30