TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br />
<br />
NGHIÊN CỨU PHÂN LÂP VI KHUẨN VÀ TÁCH CHIẾT ENZYM<br />
UREASE TỪ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY HELICOBACTER PYLORI<br />
Đỗ Hoàng Long*; Đỗ Minh Trung*<br />
Lê Thu Hồng**; Lê Văn Đông*<br />
TÓM TẮT<br />
Ức chế enzym urease bằng kháng thể đặc hiệu theo đường uống là một hướng nghiên cứu mới<br />
trong điều trị nhiễm Helicobacter pylori, nhằm đối phó với tình trạng vi khuẩn (VK) kháng kháng sinh.<br />
Nghiên cứu này được tiến hành nhằm phân lập VK từ mô sinh thiết ổ loét dạ dày tá tràng (DD-TT);<br />
nuôi cấy tăng sinh và tách chiết urease từ môi trường nuôi cấy VK làm nguyên liệu chế tạo kháng<br />
thể kháng urease. Kết quả: đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ 18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết,<br />
đạt tỷ lệ thành công 94,5%. Ba chủng H. pylori có hoạt độ urease cao được chọn và tăng sinh trong<br />
môi trường Brucella broth. Tách chiết urease từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa phân đoạn với<br />
ammonium sulfate 50% bão hòa. Sản phẩm thu được có hoạt tính urease và tương đối tinh khiết.<br />
Kết quả điện di SDS-PAGE trong điều kiện biến tính cho một băng đậm, tương ứng với tiểu đơn vị<br />
có trọng lượng phân tử khoảng 60,3 kDa của urease.<br />
* Từ khóa: Urease; Helicobacter pylori; Tách chiết enzym.<br />
<br />
HELICOBACTER PYLORI ISOLATION AND UREASE EXTRACTION FROM<br />
CULTURE BROTH SUPERNATANT<br />
<br />
SUMMARY<br />
Urease inhibition with oral specific antibody is a new approach in treatment of Helicobacter pylori<br />
infection, coping with antibiotic resistance of this bacterium. This research aims to isolate H. pylori<br />
from gastric-peptic ulcer biopsies and extract urease from bacterial culture broth to be used as<br />
material for the development of antibody to urease. 17 H. pylori strains were obtained from 18 biopsy<br />
samples (94.5%). Among them, three strains which showed highest urease activity were then<br />
sub-cultured in Brucella broth. Urease was extracted from culture supernatant by precipitation with<br />
ammonium sulfate 50% saturation. The obtained product maintained urease activity and relatively<br />
pure. SDS-PAGE analysis in denature condition showed that, the urease contained product express<br />
as a single band, corresponding with subunit B of urease with molecular masses of approximately<br />
60.3 kDa.<br />
* Key words: Urease; Helicobacter pylori; Enzyme extraction.<br />
* Học viện Quân y<br />
** Bệnh viện 103<br />
Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com)<br />
Ngày nhận bài: 28/11/2013; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 8/12/2013<br />
Ngày bài báo được đăng: 18/12/2013<br />
<br />
11<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br />
ĐẶT VẤN ĐỀ<br />
Viêm loét DD-TT là bệnh lý thường gặp<br />
ở Việt Nam cũng như trên thế giới. Tỷ lệ<br />
mắc bệnh này khá cao, 60 - 70% ở Việt Nam,<br />
còn ở các nước khác dao động từ 50 - 90%.<br />
Có nhiều nguyên nhân gây viêm loét DDTT, trong đó, nguyên nhân thường nhắc<br />
đến hiện nay là do nhiễm VK Helicobacter<br />
pylori, chiếm 75 - 95% [3, 5, 10]. Việc điều<br />
trị viêm loét DD-TT do nhiễm H. pylori rất<br />
phức tạp, vì phải sử dụng phác đồ phối hợp<br />
các thuốc kháng sinh với thuốc giảm toan,<br />
giảm tiết đúng, đủ liều, đủ thời gian và đúng<br />
quy cách. Tuy nhiên, khả năng thất bại trong<br />
điều trị rất lớn, do tình trạng VK kháng kháng<br />
sinh [1, 6]. Xuất phát từ thực tế lâm sàng,<br />
nhu cầu tìm ra các thuốc mới có tác dụng<br />
ức chế hoặc ngăn ngừa nhiễm H. pylori<br />
mà không lo ngại tình trạng kháng thuốc,<br />
trong đó có phương pháp miễn dịch trị liệu<br />
thụ động sử dụng kháng thể kháng trực tiếp<br />
H. pylori hoặc kháng enzym urease của<br />
H. pylori, thành phần quan trọng trong quá<br />
trình sinh bệnh của H. pylori, giúp chúng né<br />
tránh, tồn tại và phát triển được trong môi<br />
trường axít của dịch dạ dày, là một việc làm<br />
triển vọng [8]. Từ đó, nghiên cứu này được<br />
tiến hành nhằm mục tiêu: Phân lập VK và<br />
tách chiết urease từ H. pylori làm nguyên liệu<br />
chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng urease.<br />
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP<br />
NGHIÊN CỨU<br />
1. Vật liệu nghiên cứu.<br />
18 mẫu bệnh phẩm sinh thiết ổ loét DDTT qua nội soi của 18 bệnh nhân bị loét<br />
DD-TT đến khám tại phòng khám nội soi<br />
tiêu hóa, Bệnh viện 103 từ tháng 12 - 2011<br />
và tháng 3 - 2012.<br />
Các hóa chất sinh phẩm: BHI (Brainheart infusion broth) (BioRad, Mỹ), Brucella<br />
broth (Neogen Corporation, Mỹ), huyết thanh<br />
<br />
bào thai bê (FBS - Fetal bovine serum)<br />
(Gibco, Mỹ), Pylori agar (BioMérieux, Pháp)<br />
và túi ủ GENbag microear (BioMérieux, Pháp).<br />
2. Phƣơng pháp nghiên cứu.<br />
* Phân lập và định danh H. pylori từ bệnh<br />
phẩm:<br />
Bệnh phẩm sinh thiết qua nội soi được<br />
bảo quản trong ống nghiệm chứa BHI broth<br />
vô trùng và vận chuyển về phòng thí nghiệm<br />
tại Bộ môn Khoa Vi sinh, Bệnh viện 103. Tại<br />
đây, nghiền nát bệnh phẩm bằng dụng cụ<br />
vô trùng và nuôi cấy phân lập chọn lọc<br />
trong đĩa petri chứa môi trường Pylori agar<br />
đặt trong túi vi hiếu khí GENbag microear<br />
(5% O2, 10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở<br />
37oC. VK được phân lập sau 5 ngày nuôi<br />
cấy và định danh bằng nhuộm Gram, các<br />
phản ứng sinh hóa như oxidase, catalase<br />
và urease [3, 5].<br />
* Nuôi cấy tăng sinh H. pylori và tách<br />
chiết urease từ dịch nuôi cấy:<br />
Nuôi cấy các chủng H. pylori có hoạt tính<br />
urease mạnh nhất tăng sinh trong môi<br />
trường Brucella broth trong tủ ấm 37oC có<br />
lắc liên tục trong 72 giờ. Urease được tách<br />
chiết từ dịch nuôi cấy bằng kỹ thuật kết tủa<br />
phân đoạn với ammonium sulfate 50% độ<br />
bão hòa. Sản phẩm kết tủa được thẩm tích<br />
loại muối, xác định hoạt tính urease, xác<br />
định độ tinh sạch và kích thước. Xác định<br />
hoạt tính urease trong dịch nuôi cấy và sản<br />
phẩm sau mỗi bước tách chiết nhờ test<br />
urease theo nguyên lý urease thủy phân ure<br />
thành ammonia, tạo môi trường kiềm và<br />
chuyển chỉ thị màu đỏ phenol trong môi<br />
trường phản ứng thành màu hồng cánh sen<br />
có độ hấp phụ quang mạnh nhất ở bước<br />
sóng 340 nm. Xác định nồng độ protein<br />
enzym thu được bằng kỹ thuật Bradford.<br />
Xác định độ tinh sạch và kích thước của<br />
<br />
13<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br />
sản phẩm bằng phương pháp điện di SDSPAGE 10% trong điều kiện biến tính.<br />
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ<br />
BÀN LUẬN<br />
1. Phân lập VK.<br />
Sau 5 ngày nuôi cấy, 17/18 mẫu phân<br />
lập (94,5%) (trừ mẫu số 10) có VK mọc với<br />
hình ảnh khuẩn lạc tròn, bóng, màu xám<br />
trong, đường kính 0,5 - 1 mm.<br />
<br />
Kết quả nhuộm Gram và các phản ứng<br />
sinh hóa cho thấy cả 17 chủng phân lập đều<br />
cho kết quả nhuộm Gram (-) và hình thể đa<br />
số là hình cong, mức độ xoắn nhẹ, không<br />
điển hình. Kết quả các phản ứng sinh hóa<br />
để định danh H. pylori gồm urease, oxydase<br />
và catalase đều cho kết quả dương tính.<br />
Bảng 1: Kết quả nuôi cấy phân lập và định<br />
danh VK.<br />
PHẢN ỨNG SINH HÓA<br />
<br />
MÃ SỐ<br />
NGHIÊN<br />
CỨU<br />
<br />
NUÔI<br />
CẤY<br />
<br />
01<br />
02<br />
03<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
NHUỘM<br />
GRAM Urease Oxydase Catalase<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
+<br />
+<br />
+<br />
+<br />
<br />
08<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
09<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
10<br />
<br />
-<br />
<br />
11<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
12<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
13<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
14<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
15<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
16<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
17<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
18<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
+<br />
<br />
H. pylori là một trong những VK rất khó<br />
phân lập và chỉ mọc ở những môi trường<br />
chuyên biệt với điều kiện thích hợp. Pylori<br />
agar và túi ủ GENbag microear (5% O2,<br />
10% CO2, 85% N2 và độ ẩm cao) ở 37oC<br />
được xác định là thích hợp cho chúng tăng<br />
sinh theo khuyến cáo của nhiều tác giả [5].<br />
Đó có thể là lý do giải thích tại sao tỷ lệ<br />
phân lập H. pylori của chúng tôi đạt được<br />
94,5%, cao hơn các tác giả khác trong nước<br />
(47 - 56,4%) [1].<br />
2. Tách chiết urease.<br />
0.7<br />
OD (340 nm)<br />
<br />
Hình 1: Khuẩn lạc thu được khi nuôi cấy<br />
trong môi trường vi hiếu khí.<br />
<br />
04<br />
05<br />
06<br />
07<br />
<br />
0.6<br />
0.5<br />
0.4<br />
0.3<br />
0.2<br />
0.1<br />
0.0<br />
01 02 03 04 05 06 07 08 09 11 12 13 14 15 16 17 18<br />
Chñng vi khuÈn Helicobacter pylori<br />
<br />
Hình 2: Kết quả phản ứng urease của các<br />
chủng H.pylori thu được.<br />
14<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br />
Kết quả phân tích hoạt tính urease trong<br />
dịch nổi của 17 chủng VK nghiên cứu nhận<br />
thấy 3 chủng H. pylori (HP13, HP16 và<br />
HP18) có hoạt tính cao hơn và hoạt tính<br />
này còn cao hơn nữa sau khi cho tăng sinh<br />
lần 1 (sau 24 giờ), lần 2 (qua đêm) và lần 3<br />
(sau 48 giờ) của cả 3 chủng H. pylori này<br />
[4, 8]. Ba chủng HP13, HP16 và HP18<br />
được lựa chọn để nuôi cấy tăng sinh và<br />
phân lập urease<br />
<br />
tiểu đơn vị. Tuy nhiên, kết quả thu được chỉ<br />
gần giống nhau chứ không trùng khớp với<br />
nhau hoàn toàn, mặc dù cùng chung một<br />
phương pháp xác định. Điều này chứng<br />
tỏ urease từ các chủng khác nhau của<br />
H. pylori có một số khác biệt về phân tử<br />
lượng từng chuỗi tiểu đơn vị. Trong nghiên<br />
cứu này, trên băng điện di của ba chủng VK<br />
H. pylori cũng chỉ có một vạch sáng nhất,<br />
tương đương nhau và tương ứng về lý thuyết<br />
với kích thước của tiểu đơn vị B trong phân<br />
tử urease. Tại Việt Nam, mới chỉ có nghiên<br />
cứu tách chiết, tinh sạch urease từ thực vật<br />
và hoàn toàn chưa có tác giả nào nghiên<br />
cứu về urease của VK H. pylori [2].<br />
KẾT LUẬN<br />
<br />
Hình 3: Điện di SDS-PAGE 10%. M: protein<br />
chuẩn; HP13, PH16, HP18 là sản phẩm kết<br />
tủa của các chủng tương ứng.<br />
Bằng phương pháp kết tủa phân đoạn<br />
dịch nuôi cấy các chủng HP13, HP16 và<br />
HP18 với ammonium sulfate 50% thu được<br />
lượng protein có hoạt tính urease lần lượt<br />
là 1,78 mg/ml, 1,95 mg/ml và 1,71 mg/ml.<br />
Kết quả điện di cho thấy sản phẩm thu<br />
được sau kết tủa và thẩm tích tương đối<br />
thuần nhất, trong đó, băng đậm nhất có<br />
kích thước khoảng 60,3 kDa.<br />
Trên thế giới, đã có một số nghiên cứu<br />
về enzym urease của H. pylori và các đặc<br />
tính của chúng về phân tử lượng của chuỗi<br />
<br />
Đã phân lập được 17 chủng H. pylori từ<br />
18 mẫu sinh thiết ổ loét DD-TT. Đã tách<br />
chiết được enzym urease từ dịch nuôi cấy<br />
của 3 chủng sinh urease với hoạt tính cao<br />
nhất; sản phẩm thu được còn giữ được<br />
hoạt tính urease đặc trưng, tương đối tinh<br />
khiết, có thể sử dụng làm nguyên liệu gây<br />
miễn dịch tạo kháng thể kháng urease.<br />
TÀI LIỆU THAM KHẢO<br />
1. Lê Đình Minh Nhân, Võ Thị Chi Mai. Tính<br />
đề kháng kháng sinh của Helicobacter pylori<br />
trong bệnh viêm loét DD-TT. Y học Thành phố<br />
Hồ Chí Minh. 2006, 10 (1), tr.73-75.<br />
2. Lê Thị Phú & Nguyễn Thị Cẩm Vi. Xác<br />
định phân tử lượng và các thông số động học<br />
của urease từ đậu nành hạt vàng Việt Nam. Tạp<br />
chí Phát triển KH & CN. 2007, 10 (5), tr.41-50.<br />
<br />
15<br />
<br />
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 1-2014<br />
3. Phùng Đắc Cam, Nguyễn Thái Sơn.<br />
Helicobacter pylori và bệnh viêm, loét DD-TT.<br />
Nhà xuất bản Y học. Hà Nội. 2003, tr.7-104.<br />
4. Icatlo FC, Kuroki M, Kobayashi C,<br />
Yokoyama H, Ikemori Y, Hashi T et al. Affinity<br />
purification of Helicobacter pylori urease. J Biol<br />
Chem. 1998, 273 (29), pp.18130-18138.<br />
5. Kusters JG, van Vliet AHM & Kuipers EJ.<br />
Pathogenesis of Helicobacter pylori infection.<br />
Clin Microbiol Rev. 2006, 19 (3), pp.449-490.<br />
6. Malfertheiner P, Megraud F, O'Morain CA,<br />
Atherton J, Axon AT, Bazzoli F et al. Management<br />
of Helicobacter pylori infection--the Maastricht<br />
IV/Florence Consensus Report. Gut. 2012, 61 (5),<br />
pp.646-664.<br />
<br />
7. Mobley HLT, Island MD & Hausinger RP.<br />
Molecular biology of microbial ureases. Microbiol<br />
Rev. 1995, 59 (3), pp.451-480.<br />
8. Suzuki H, Nomura S, Masaoka T, Goshima H,<br />
Kamata N, Kodama Y, et al. Effect of dietary<br />
anti-Helicobacter pylori-urease immunoglobulin<br />
Y on Helicobacter pylori infection. Aliment Pharmacol<br />
Ther. 2004, 20 (1), pp.185-192.<br />
9. Turbett GR, Høj PB, Horne R & Mee BJ.<br />
Purification and characterization of the urease<br />
enzymes of Helicobacter species from humans<br />
and animals. Infect Immun. 1992, 60 (12),<br />
pp.5259-5266.<br />
10. Versalovic J. Helicobacter pylori: pathology<br />
and diagnostic strategies. Am J Clin Pathol.<br />
2003, 119, pp.403-412.<br />
<br />
16<br />
<br />
Thêm vào BST
Báo xấu
Download
Vui lòng tải xuống để xem tài liệu đầy đủ
