KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014
108
PHÂN LẬP TUYỂN CHỌN CHỦNG NẪM MEN ĐỂ LÊN MEN VANG
TỪ QUẢ BẦN CHUA (SONNERATIA CASEOLARIS)
Phạm Thị Thanh Hường, Lớp K60A, Khoa Sinh học
GVHD: TS. Đoàn Văn Thược
Tóm tắt: Từ mẫu dịch quả bần chua lên men tự nhiên chúng tôi đã phân lập được 80 chủng nấm men.
Chủng nấm men (kí hiệu NM2*) có khả năng lên men rượu mạnh (tạo được lượng rượu lên đến 17%)
đã được chúng tôi tuyển chọn từ 80 chủng nấm men này. Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu ảnh
hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh trưởng và lên men của chủng này như nhiệt độ, pH ban
đầu, hàm lượng đường, hàm lượng men giống. Khả năng lên men của NM2* cao nhất khi ở trong môi
trường dịch quả có hàm lượng đường 220g/l, hàm lượng giống 10%, môi trường có pH = 3,5 và
được duy trì ở nhiệt độ 30oC. Chúng tôi đã xây dựng được quy trình lên men và tiến hành sản xuất
rượu vang từ dịch quả bần chua ở quy mô phòng thí nghiệm, sản phẩm rượu vang thu được có giá trị
cảm quan và giá trị dinh dưỡng cao.
Từ khóa: Bần chua, Sonneratia caseolaris, lên men, rượu vang.
I. MỞ ĐẦU
Rừng ngập mặn là hệ sinh thái quan trọng đối với môi trƣờng và có ý nghĩa lớn trong
công tác phòng hộ. So với diện tích rừng ngập mặn trƣớc năm 1945 thì diện tích này đã bị
suy giảm nghiêm trọng, nguyên nhân trƣớc kia là do chiến tranh tàn phá, khi xã hội phát
triển, sức ép về dân số và kinh tế đã khiến diện tích rừng ngập mặn bị suy giảm.
Cây bần chua (Sonneratia caseolaris) đƣợc trồng và mọc tự nhiên ở các rừng ngâp
măn trải dài từ Bắc vào Nam nƣớc ta. Cùng với việc diện tích rừng ngập mặn bị suy giảm
thì diện tích đất trồng loài cây này cũng bị thu hẹp. Nguyên nhân chính về phía con ngƣời
là do ngƣời dân chƣa nhận thức đƣợc giá trị kinh tế mà cây bần chua mang lại, vì thế loài
cây này vẫn đang tiếp tục bị đe dọa nghiêm trọng. Hàng năm, cây bần chua cho một sản
lƣợng quả rất lớn nhƣng chƣa đƣợc tận dụng vào mục đích kinh tế. Nhiều nghiên cứu đã
chỉ ra rằng trái bần có rất nhiều công dụng hữu ích. Hiện nay, một số nƣớc trên thế giới đã
sử dụng loại quả này để tạo một số sản phẩm đồ uống nhƣng mới chỉ dừng lại ở phƣơng
pháp thủ công truyền thống, trên quy mô hộ gia đình nhỏ hẹp [6, 7, 13].
Xuất phát từ mục đích tận dụng nguồn nguyên liệu dồi dào có sẵn là quả bần chua,
đồng thời giúp ngƣời dân vùng ven biển nhận thức đúng đắn về giá trị của cây bần chua,
tránh hiện tƣợng chặt phá rừng ngập mặn. Căn cứ vào điều kiện nghiên cứu chúng tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “Phân lập tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang
từ quả bần chua (Sonneratia caseolaris)”.
II. NỘI DUNG
1. Mục tiêu của đề tài
Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng chuyển hóa dịch quả bần
chua thành rƣợu vang.
2. Nội dung nghiên cứu
- Phân lập và tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có khả năng lên men cồn cao.
- Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố (nhiệt độ, pH, hàm lƣợng đƣờng và hàm
lƣợng giống) tới khả năng lên men của chủng nấm men đƣợc chọn.
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014
109
- Xây dựng quy trình lên men, tiến hành lên men rƣợu vang ở quy mô phòng thí
nghiệm nhằm tạo sản phẩm rƣợu vang có giá trị dinh dƣỡng và giá trị cảm quan cao.
2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.1. Phương pháp phân lập [1, 4, 6]
Nghiền nhỏ quả bần chua, để dịch nghiên lên men tự nhiên trong 3 ngày sau đó tiến
hành pha loãng với nồng độ từ 10-6- 10-2, hút 10 µl cho vào các đĩa petri có chứa môi
trƣờng Hansen đặc, dùng que trang dàn đều trên bề mặt đĩa petri. Gói lại bằng giấy báo và
giữ ở nhiệt độ 300C trong 2 ngày. Lấy ra quan sát khuẩn lạc, dựa vào các đặc điểm hình
dạng, màu sắc, trạng thái khuẩn lạc để chọn những khuẩn lạc nấm men to, riêng rẽ để cấy
ria giữ giống vào các đĩa petri hoặc ống nghiệm chứa môi trƣờng Hansen đặc.
2.2. Phương pháp tuyển chọn chủng [5, 6]
Tiến hành tuyển chọn chủng có khả năng lên men tốt bằng việc xác định thông qua
khối lƣợng CO2 thoát ra và hàm lƣợng rƣợu tao ra khi tiến hành lên trong bình Smith.
2.3. Phương pháp xác định độ rượu
Chƣng cất một lƣợng dịch lên men (V1), thu đƣợc V2 (mL) rƣợu. Tiến hành đo độ
rƣợu tạo ra trong V2 bằng cồn kế thu đƣợc giá trị a. Từ đó tính đƣợc độ rƣợu tạo ra (b) theo
tỉ lệ % (v/v) theo công thức:
b = (a x V2):V1
2.4. Xác định đường tổng
Xác định hàm lƣợng đƣờng tổng bằng khúc xạ kế.
2.5. Định lượng tannin theo phương pháp Leventhal
2.6. Phương pháp khuếch đại gen để giải trình tự đoạn ITS
Nuôi cấy chủng tuyển chọn trên môi trƣờng Hansen lỏng, tốc độ lắc 180 vòng/phút ở
nhiệt độ 300C sau đó li tâm, thu sinh khối tế bào. Tiến hành tascg chiết AND tổng số.
Khuếch đại đoạn AND bằng phản ứng PCR chuẩn, sử dụng cặp mồi gồm mồi xuôi: ITS4
(5‟-CCTCCGCTTATTGATATGC-3‟) và mồi ngƣợc: ITS5 (5‟-GGAAGTAAAAGTCGT
AACAAGG-3‟). Đặt chu trình nhiệt cho phản ứng: biến tính ở 950C trong 3 phút; giai đoạn
khuếch đại trình tự ADN với 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ xảy ra trong điều kiện: 950C trong 30s,
550C trong 30s, 720C trong 60s; giai đoạn kéo dài ở 720C trong 10 phút và 40C - ∞. Sản
phẩm PCR đƣợc gửi sang Hàn Quốc để giải trình tự. Trình tự gen sau đó đƣợc so sánh với
ngân hàng gen để xác định chủng loại phát sinh của chủng nấm men đƣợc tuyển chọn.
2.7. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của một số nhân tố tới khả năng lên men
của chủng nấm men
Khảo sát sự ảnh hƣởng của các nhân tố: nhiệt độ; pH ban đầu; hàm lƣợng đƣờng;
hàm lƣợng men giống tới khả năng lên men của chủng nấm men giống dựa vào khối lƣợng
CO2 thoát ra khỏi bình lên men và lƣợng rƣợu tạo thành theo một số phƣơng pháp đã đƣợc
mô tả trƣớc đó [3, 11, 12].
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014
110
3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Xác định hàm lượng một số chất trong dịch quả
Sau khi thu quả, chúng tôi tiến hành nghiền nhỏ, sau đó phân tích hàm lƣợng đƣờng
và hàm lƣợng tannin trong dịch quả [3]. Kết quả thu đƣợc: hàm lƣợng đƣờng tổng là 3% và
hàm lƣợng tanin là 7,215%.
3.2. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men tốt từ dịch lên
men quả bần chua
3.2.1. Phân lập, tuyển chọn
Hình 1. Khả năng lên men của một số chủng nấm men phân lập được
Chúng tôi đã tiến hành phân lập vi sinh vật từ dịch quả bần chua lên men, kết quả thu
đƣợc 80 chủng. Dựa vào hình thái khuẩn lạc chúng tôi chọn ra 20 chủng. Sau đó tiến hành
kiểm tra khả năng lên men của 20 chủng này, dựa vào khối lƣợng CO2 thoát ra khỏi bình
lên men, chúng tôi chọn đƣợc 3 chủng có khả năng lên men tốt: NM2*; NM3*; NM15*.
3.2.2. Kết quả tuyển chọn
Chúng tôi tiến hành quá trình lên men của 3 chủng trên trong môi trƣờng dịch quả
nghiền có bổ sung 220g/l đƣờng saccharose. Sau 14 ngày, lấy dịch lên men đem chƣng cất
thu đƣợc kết quả đƣợc trình bày ở bảng 1.
Bảng 1. Khả năng lên men của 3 chủng NM2*, NM3*, NM15*
trên môi trường dịch quả
Kí hiệu chủng
V dịch lên men (mL)
Thể tích rƣợu thu đƣợc (mL)
NM2*
100
17.3
NM3*
100
16
NM15*
100
16.01
Kết quả trên cho thấy chủng NM2* là chủng có khả năng lên men tốt, so sánh với
các nghiên cứu ở Việt Nam và trên thế giới cho tới nay thì NM2* là chủng nấm men quý,
có ý nghĩa lớn về khoa học và ứng dụng [4, 5, 10, 11]
3.3. Nghiên cứu định tên chủng NM2*
Chúng tôi đã tiến hành nuôi cấy chủng NM2* trên môi trƣờng Hansen đặc, sau 24 -
48h nuôi cấy chúng tôi quan sát đƣợc những khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng đục, bề mặt
bóng, viền xung quanh nhẵn (Hình 2).
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014
111
Hình 2. Hình thái khuẩn lạc NM2*
Hình 3. Hình thái tế bào NM2*
dưới kính hiển vi quang học
Dƣới kính hiển vi quang học và kính hiển vi điện tử, tế bào chủng NM2* có hình
ovan (hoặc hình trứng), kích thƣớc trung bình: 1.5-4 x 4-7 µm, sinh sản theo hình thức nảy
chồi. Bên cạnh đó còn có những tế bào dị hình có dạng dài. Chúng tôi cho rằng, những tế
bào này có ảnh hƣởng tích cực tới khả năng lên men.
Hình 4. Hình thái tế bào NM2* dưới kính hiển vi điện tử
Chúng tôi tiến hành tách ADN tổng số của chủng NM2* sau đó kiểm tra kết quả
bằng chạy điện di (Hình 5). ADN tổng số này sau đó đƣợc sử dụng làm khuôn để tiến hành
phản ứng PCR với tình tự mồi ITS4, ITS5. Sau đó cũng kiểm tra kết quả PCR bằng điện di.
Kết quả cho thấy, chúng tôi đã tách đƣợc một đoạn ADN có kích thƣớc khoảng trên 500
bp. Đoạn gen này đạt đƣợc chúng tôi đã gửi sang Hàn Quốc để giải trình tự. Kết quả giải
trình tự cho thấy chủng NM2* thuộc loài nấm men Candida tropicalis.
Hình 6. Kết quả điện di
sản phẩm PCR
(1) (2)
Chú thích:
(1):Marker
(2): NM2*
(1)
(2)
KỈ YẾU HỘI NGHỊ SINH VIÊN NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NĂM HỌC 2013-2014
112
3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ tới khả năng sinh trƣởng và lên men của chủng NM2*
Khảo sát khả năng sinh trƣởng và lên men của NM2* trong khoảng nhiệt từ 250C -
450C, chúng tôi nhận thấy trên môi trƣờng nuôi cấy ở 30 -350C, NM2* sinh trƣởng tốt
nhất. Trong môi trƣờng lên men, sự ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình lên men của
NM2* đƣợc thể hiện trong Hình 7.
Hình 7. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới khả năng lên men của NM2*
Từ đó chúng tôi đƣa ra kết luận: 30 - 350C là nhiệt độ tối ƣu cho quá trình sinh
trƣởng và lên men của chủng NM2*.
3.5. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng và lên men của chủng NM2*
Bằng phƣơng pháp xác định mật độ quang học của dịch nuôi cấy NM2* ở các môi
trƣờng có pH khác nhau, chúng tôi thu đƣợc kết quả trình bày ở Hình 8.
Hình 8. Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh trưởng của NM2*
Có thể thấy rằng, ở pH = 4, mật độ quang học đo đƣợc lớn nhất. Chứng tỏ trong bình
môi trƣờng có ban đầu là pH = 4 có số lƣợng tế bào lớn nhất. Vì vậy chúng tôi kết luận:
chủng NM2* sinh trƣởng tốt nhất ở pH bằng 4.
Bên cạnh đó, chúng tôi khảo sát ảnh hƣởng của pH tới khả năng lên men của chủng
này, kết quả nhƣ sau đƣợc trình bày ở Hình 9.
Hình 9. Ảnh hưởng của pH tới khả năng lên men của NM2*