TNU Journal of Science and Technology
230(01): 383 - 390
http://jst.tnu.edu.vn 383 Email: jst@tnu.edu.vn
ISOLATION AND SELECTION OF BACTERIA STRAINS WITH
INSOLUBLE PHOSPHATE SOLUBILIZING ACTIVITY
Nguyen Thi Giang, Pham Thi Tuyet Mai, Trinh Thi Chung, Tran Thi Tam, Le Duc Duy, Tran Van Chi*
TNU - University of Agriculture and Forestry
ARTICLE INFO
ABSTRACT
Received:
19/9/2024
Microbial products used in agricultural production often contain
several strains of microorganisms with high biological activity. One
of the microorganisms currently receiving much attention is the group
of Phosphate Solubilizing Microorganisms (PSM). This study was
conducted with the aim of finding bacterial strains capable of
effectively solubilizing phosphate. From 08 soil samples, 04 bacterial
strains were isolated on NBRIP medium, all of which had phosphate
solubilizing ability; among them, the BGL-16 strain showed the
highest phosphate solubilizing activity, reaching 362.7 mg/L. The
colony of strain BGL-16 is round, white-yellowish, flat, with serrated
edges, smooth, dry surface, short rod-shaped cells, Gram-negative,
and motile. Sequencing results and comparison of the 16S rRNA gene
sequence with standard strains published on EzBioCloud data showed
that strain BGL-16 is considered a new species candidate of the genus
Pseudomonas and is named Pseudomonas sp. BGL-16. Through
evaluation and comparison with previous publications, it is shown that
the strain Pseudomonas sp. BGL-16 has great potential for research
and application in the production of microbial products for sustainable
agricultural production.
Revised:
17/11/2024
Published:
19/11/2024
KEYWORDS
Insoluble phosphate
Solubilization
Isolation
Selection
Bacteria
PHÂN LP, TUYN CHN CHNG VI KHUN
HOT TÍNH PHÂN GII LÂN K TAN
Nguyn Th Giang, Phm Th Tuyết Mai, Trnh Th Chung, Trn Th Tâm, Lê Đc Duy, Trn Văn C*
Trường Đại hc Nông Lâm ĐH Thái Nguyên
TÓM TT
Ngày nhn bài:
19/9/2024
Chế phm vi sinh ng dng trong sn xut nông nghiệp thường cha
mt vài chng vi sinh vt hot tính sinh hc cao, mt trong nhng
vi sinh vật được quan tâm nhiu hin nay nhóm phân gii lân
(PSM- Phosphate Solubilizing Microorganisms). Nghiên cu này
đưc thc hin vi mc tiêu tìm ra chng vi khun kh năng phân
gii lân hiu qu. T 08 mẫu đất trng, tiến hành phân lp trên môi
trường NBRIP đã thu được 04 chng vi khun, tt c đều có kh năng
phân giải lân; trong đó, chng BGL-16 th hin hot tính phân gii
lân cao nhất, đạt 362,7 mg/L. Khun lc ca chng BGL-16 dng
tròn, màu trng ng vàng, dẹt, bìa răng cưa, b mt trơn, láng khô, tế
bào dng que ngn, Gram âm và kh năng di động. Kết qu gii
trình t so sánh trình t gen 16S rRNA vi các chng chun công
b trên d liu EzBioCloud cho thy chng BGL-16 được coi ng
viên loài mi thuc chi Pseudomonas được đặt tên khoa hc
Pseudomonas sp. BGL-16. Qua đánh giá so sánh vi nhng công
b trước đó cho thấy, chng Pseudomonas sp. BGL-16 rt tim
năng trong nghiên cứu để ng dng vào sn xut chế phm vi sinh
phc v sn xut nông nghip bn vng.
Ngày hoàn thin:
17/11/2024
Ngày đăng:
19/11/2024
DOI: https://doi.org/10.34238/tnu-jst.11143
* Corresponding author. Email: tranvanchi@tuaf.edu.vn
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 383 - 390
http://jst.tnu.edu.vn 384 Email: jst@tnu.edu.vn
1. Đặt vấn đề
Photpho (P) chất dinh dưỡng quan trng cho s sinh trưởng phát trin ca cây trng. P
tham gia vào các quá trình trao đổi cht quan trọng như hấp thu chất dinh dưỡng, oxy hóa sinh
hc chuyển hóa năng lượng [1]. Trên thế gii khong 52,3 t tn phân bón gốc P được s
dụng hàng năm để duy trì mc P sn có trong h thống đất - cây trng [2]. Tuy nhiên, ch khong
15 - 20% trong s ợng này được cây trng s dng [3], phn còn li b kết ta bi các cation
kim loại trong đất như st, nhôm, magie, canxi, thể làm giảm khả năng hấp thụ dinh dưỡng
của cây trồng và gây tích tụ chất độc hại trong môi trường đất. Phn lớn lượng phân lân được bón
cho cây trồng là phân vô cơ (phân hoá hc), đây có th là nguyên nhân dẫn đến các vấn đề v môi
trường như ô nhiễm nước ngm,... [4]. Hiện nay, đất canh tác nông nghip Việt Nam đang gặp
phi hiện tượng thoái hóa bc màu; để tăng độ phì nhiêu của đất, người nông dân thường bón
phân N-P-K. Tuy nhiên, hu hết phân bón cha P tn tại trong đất dng khó tiêu do liên kết
vi ion kim loi. Mt trong nhng giải pháp được áp dụng đ ci tạo đất s dng vi sinh vt,
đặc bit là các chng vi sinh vt bản địa vì chúng th hin hot tính ổn định có kh năng thích
nghi tt với điều kin ngoi cnh. Nhiu hot tính quý ca nhóm vi sinh vật đất đã góp phn ci
thiện độ phì nhiêu, cân bằng dinh dưỡng, ci thin các tính cht hóa của đất, ci thin cu trúc
đất và gim thiu ô nhiễm môi trường do hiện tượng ra trôi [5], [6], như: khả năng phân giải lân
[7], c định đạm [8], phân gii cellulose [9], [10], Đặc bit, chúng còn có kh năng chuyển hóa
các chất dinh dưỡng trong phân bón cung cp cho cây trng [11], phân gii các cht hữu trong
đất, chuyn các cht k tan thành d tan giúp cho cây trng d dàng hp thu [12], giúp thúc đẩy s
phát trin ca thc vt [13] bo v thc vt khi s tn ng ca mm bnh [14]. Hàng m,
ợng phân lân được s dng trong trng trt rt ln, nh nhng li ích to ln t các chng vi
khun phân gii lân (PSM- Phosphate Solubilizing Microorganisms) có th mang li như hòa tan P
vô cơ (khoáng cht) không hòa tan và khoáng hóa P hữu cơ không hòa tan to ra sn phm mà cây
trng th hp th đưc [15]. Do đó, vic nghiên cu pn lp và tuyn chn chng vi sinh vt có
kh năng phân giải lân khó tan định hưng phc v sn xut nông nghip ln đưc quan tâm.
2. Vt liu và phương pháp nghiên cứu
2.1. Vt liu
Nguyên liu: c mu đt trng ngô, lúa đưc thu thp ti Ti Ngun, Bc Giang Vĩnh Phúc.
Hoá cht: Môi trường NBRIP gm: 5,0g Ca3(PO4)2 (Biobasic); 0,25g MgSO4.7H2O (Sigma-
Aldrich); 0,2g KCl (Biobasic); 0,1g (NH4)2SO4 (Trung Quc); 5g MgCl2.6H2O (Biobasic); 10g
glucose (Vit Nam); 20g Agar (Vit Nam); nưc 1 lít và pH 7,0.
2.2. Phương pháp
Phương pháp thu mẫu
Tiến hành thu mẫu đất theo TCVN 7538-6:2010 [16], mu đất được ly độ sâu 6 - 15 cm,
sau khi đã loại b 5 cm phần đất loi b sinh khi thc vt, sỏi đá bằng rây kích thước 2 mm.
Mẫu đất (8 mu; 100 gam/mẫu) được thu tại các địa phương bao gồm: xã Ôn Lương – huyn Phú
Lương tnh Thái Nguyên (4 mẫu), Đồng K - huyn Yên Thế - tnh Bc Giang (2 mu),
Yên Bình huyện Vĩnh Tường tỉnh Vĩnh Phúc (2 mẫu).
Phương pháp phân lập
Mẫu đất (10 g) được cho vào bình tam giác 250 mlcha 100 ml nước ct trùng, lc vi
tc độ 100 vòng/phút trong 20 phút. Tiếp đến, mẫu được pha loãng theo dãy thp phân liên tiếp
cho đến khi đt nồng độ pha loãng 10-6. Dch huyn phù (0,1ml) mi nồng độ pha loãng đưc
cy tri trên môi trường thch đĩa NBRIP [17]. Các đĩa môi trường này được úp ngược các
đĩa petri nhiệt độ 30°C trong 5 ngày. Trên mi mu phân lp, các chng vi khun kh năng
phân gii lân s hình thành các vòng phân gii (vòng trong sut) bao quanh khun lc trên môi
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 383 - 390
http://jst.tnu.edu.vn 385 Email: jst@tnu.edu.vn
trưng NBRIP. Các chng vi khun có kh năng phân giải P sau đó sẽ được cy chuyn sang các
đĩa petri chứa môi trường NBRIP khác để làm thun.
Định tính kh năng phân giải lân khó tan ca các chng phân lp thông qua xác định đường
kính vòng phân gii lân Ca3(PO4)2 theo công thc [18]:
k = D − d (cm)
Trong đó:
- k là đường kính phân gii lân (cm);
- D là đường kính vòng phân gii (cm);
- d là đường kính l đục (cm)
Kích thước vòng phân giải được đo sau 5 ngày nuôi cấy.
Hình thái khun lc, tế bào nhum gram ca vi khun phân lp được tiến hành phân tích
theo phương pháp ca Nguyn Xuân Thành cng s (2007) [19]. Khun lạc được quan sát v
hình dng, màu sắc, độ bóng b mt. Tế bào vi khuẩn được kim tra qua nh hin vi sau khi
nhuộm gram để xác định tính cht gram hình dng tế bào. Kh năng di động ca vi khun
được thc hin trên môi trường thch mm (5g Agar/ 1 lít môi trường).
Phương pháp xác định kh năng phân giải lân khó tan
Hot tính phân giải lân khó tan được xác định da trên s biến thiên nồng độ PO43- trong
dch nuôi cy bằng phương pháp so màu xanh molybdate [20]. Chng vi khuẩn được nuôi trong
bình tam giác chứa 25 ml môi trường NBRIP lng (nhiệt độ: 30°C, trong 4 ngày nuôi lc 150
vòng/phút). Dch sau khi nuôi cấy được ly tâm 10.000 vòng/phút, 4°C trong 10 phút. Hút dch
trong sung 30 ml nước mi bình, thêm 8 ml hn hp kh tạo màu và thêm nước cất đến vạch định
mc (50ml), lắc đều, để yên 20 phút, so màu bước sóng 820 nm. Dựa vào phương trình đường
chun: y = 0,5337x + 0,0248 (R2 = 0,9995) th hin mối tương quan giữa độ hp th tia UV vi
nồng độ dch PO43- để xác định giá tr nồng độ PO43- có trong môi trường nuôi cy.
Định danh chng phân gii lân khó tan đã tuyển chn
Định danh phân t xây dựng đ ph h: DNA tng s ca chng tuyn chọn được tách
chiết theo phương pháp ca Sambrook & Russell (2001) [21]. Trình t gen 16SrRNA được khuếch
đại, s dng cp mi 27F GAGAGTTGATCCGGCTCAG 1495R
CTACGGCTACCTTGTTACGA được đọc trình t thông qua h thng Applied Biosystems
3730 xl DNA analyzer s dng Big Dye terminator cycle sequencing kit v.3.1 (Macrogen, Hàn
Quc). S dng d liu công b trên EzTaxon để nhn din chng phân lp
(https://www.ezbiocloud.net/). T l tương đồng v trình t gen lớn hơn 98% của chng nào
ln nht s đưc la chn là gn nhất. Đồng thi, v trí phân loi ca chng phân lập được xây
dng bng phn mm MEGA 7.
X lý s liu
S liệu được x bng phn mm Microsoft Excel 2019 s dng phn mm SPSS 20.0
vi kiểm định Duncan để so sánh khác bit trung bình gia các chng vi khun.
3. Kết qu
3.1. Phân lp các chng phân gii lân t đt trng
T 08 mẫu đất trng thu ti tnh Bc Giang, Thái Nguyên Vĩnh Phúc đã phân lập được 15
chng vi khun, trong đó có 04 chng vi khun có kh năng phân giải lân (01 chủng được phân lp
t mu đất trng lúa ti tnh Bc Giang, 02 chng t đt trnga ti tnh Thái Nguyên 01 chng
t đất trng ngô ti tỉnh nh Phúc). Mt s đặc điểm ca 4 chng đưc trình bày ti Bng 1.
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 383 - 390
http://jst.tnu.edu.vn 386 Email: jst@tnu.edu.vn
Bng 1. Kết qu phân lp chng vi khun có kh năng phân gii lân t đất trng
Ký hiu
chng
Địa điểm
ly mu
Đặc điểm khun lc
Hình thái
tế bào
Tính
cht
Gram
Kh
năng di
động
Đưng kính vòng
phân gii lân
Ca3(PO4)2 (cm)
BGL-16
Bc Giang
Tròn, trng ng vàng, dt, bìa
răng cưa, trơn, láng khô
Que ngn
-
+
3,1a 0,2
DL01
Thái
Nguyên
Tròn, trng sa, dt, bìa răng
cưa, trơn, láng khô
Que ngn
-
+
2,3b 0,15
DL06
Thái
Nguyên
Tròn, trng ngà, bìa nguyên,
li, b mt bóng, láng ướt
Que ngn
-
+
2,5b 0,15
PL03
Vĩnh Phúc
Tròn, trng trong, bìa nguyên,
lồi, trơn, láng ưt
Cu nh
-
+
1,8c 0,15
Ghi chú: Các ch trong cùng mt ct biu th s sai khác có ý nghĩa thng kê mức α ≤ 0,05
Dấu “-”: không có kh năng/ âm tính
Dấu “+”: có khả năng/ dương tính
1.1
1.2
1.3
1.4
Hình 1. So sánh kh năng to vòng phân gii lân ca các chng phân lp được
Ghi chú:
1.1 Đối chng (a); Vòng tròn phân gii lân Ca3(PO4)2 ca dòng BGL-16 (b)
1.2 Đối chng (a); Vòng tròn phân gii lân Ca3(PO4)2 ca dòng DL01 (b)
1.3 Đối chng (a); Vòng tròn phân gii lân Ca3(PO4)2 ca dòng DL06 (b)
1.4 Đối chng (a); Vòng tròn phân gii lân Ca3(PO4)2 ca dòng PL03 (b)
Kết qu t Bng 1 cho thy, khun lc ca các chng vi khun phân lp có hình dng tròn, vi
màu sắc thay đi t trng trong, trng sữa đến trng ngà. B mt khun lc s đa dạng, gm:
bóng, trơn, láng ưt hoc láng khô, khun lc 2 dng bìa nguyên hoặc bìa răng cưa. Về
đặc điểm tế bào, các chng vi khun này hình dng nh cu nh hoc que ngn, c 4 chng
đều th hin tính cht gram âm kh năng di động. Đưng kính vòng phân gii Ca3(PO4)2
ca các chng vi khun phân lập được dao động t 1,8 đến 3,1 cm (hình 1) cho thy kh năng
phân giải lân của chúng khá mnh. Kh năng này đặc bit quan trng trong vic cung cp
ngun P d hp th cho cây trồng, giúp tăng cường năng suất phát trin h r. Kết qu nghiên
cu s tương đồng vi nghiên cu ca Nguyễn Đức Thành công s năm 2019 v hình thái
kh năng phân giải lân ca các chng vi khun, trong đó mẫu T2917 T3602 hình thái
khun lc hình tròn, lồi trơn bóng, màu vàng nhạt và màu trắng đc; hình thái tế bào hình que
TNU Journal of Science and Technology
230(01): 383 - 390
http://jst.tnu.edu.vn 387 Email: jst@tnu.edu.vn
ngn, hình cu; tính cht gram th hin âm tính; kh năng di động; đường kính phân gii
Ca3(PO4)2 đạt 3,7 và 2,2 cm [18].
3.2. Xác định kh năng phân giải lân ca các chủng đã phân lập
Đánh giá khả năng phân giải lân ca các chng vi khuẩn đã phân lập trên môi trường NBRIP
lng cho thy hiu qu phân gii lân biến động mức sai khác ý nghĩa gia các chng
được nêu ti bng 2. Bng 2. Kết qu định lượng PO43- t các chng phân lp
STT
Ký hiu chng
Hàm lưng PO43-
1
BGL-16
362,7a 2,69
2
DL01
312,9b 3,81
3
DL06
225,6d 3,39
4
PL03
302,8c 2,33
Ghi chú: Các ch trong cùng mt ct biu th s sai khác có ý nghĩa thng kê mức α ≤ 0,05
Kết qu định lượng PO³trong dch trong sau khi ly tâm dch nuôi cy th hin kh năng
phân gii lân ca tt c 4 chng vi khun dao động t 225,6 mg/L đến 362,7 mg/L. Chng BGL-
16 có kh năng phân giải lân cao nhất (đạt 362,7 mg/L), trong khi chng DL06 có hot tính phân
gii lân thp nht (225,6 mg/L). Kết qu này cho thy s biến động v kh năng phân giải lân
gia các chng vi khun, t đó gợi ý rng s khác bit v hot tính ca enzym phosphatase
hoặc các cơ chế phân gii lân trong mi chng vi khun là khác nhau.
Khi so nh vi kết qu nghiên cu ca Nguyễn Thu Hương (2018) [22], hot nh phân gii
lân ca chng BGL-16 cao hơn với chng HD3 (14,26 mg/L) khong 20 ln. Hot tính phân gii
lân khó tan ca chng BGL-16 cũng cao hơn gấp 2 ln so vi chủng CF3 được công b bi
Nguyễn Đức Thành (2020) [18] khi phân lp và tuyn chn vi khun phân gii lân khó tan t đất
trng cà phê ti khu vực Tây Nguyên, trong đó dòng vi khuẩn CF3 có kh năng phân giải lân cao
nht 145,55 mg/L. Ngoài ra, kết qu nghiên cu này s tương đồng vi nghiên cu ca
Qingwei Zeng (2023) khi phân lập và xác định vi khun hòa tan lân t vùng r ca cây dương để
xác định qun th vi khun hòa tan lân và chức năng của chúng trong đất ven đường đô th, trong
đó 7 chủng có hot tính hòa tan lân cao t 150453 mg/L [23].
T kết qu nghiên cứu định tính định lượng v kh năng phân giải lân ca 4 chng vi
khun phân lập được, BGL-16 được la chn chng tiềm năng nhất phc v cho các
nghiên cu tiếp theo.
3.3. Định danh chng vi khun tuyn chn
Trình t gen 16S rRNA ca chng BGL-16 (kích thước 1416 nucleotide) được so sánh vi các
chng chun công b trên d liu EzBioCloud cho thy chng BGL-16 mc độ tương đồng
97,88% vi hai chng vi khun Pseudomonas aeruginosa JCM 5962T (BAMA01000316)
Pseudomonas paraeruginosa PA7T (ON359917) t 95,11 - 96,47% vi các thành viên khác
thuc chi Pseudomonas (Bng 3). So sánh vi gii hn chn (<98,7%), chng BGL-16 được coi
ng viên loài mi, thuc chi Pseudomonas [24]. Sơ đồ ph h (phylogenetic tree) đồng thi
được thiết lp (hình 2) cũng cho thy chng BGL-16 được sp xếp thuc chi Pseudomonas,
nhưng giữ v trí độc lp vi hai loài công b gn nht bao gm Pseudomonas aeruginosa JCM
5962T (BAMA01000316) Pseudomonas paraeruginosa PA7T (ON359917). Da vào d liu
so sánh trình t gen 16S rRNA đồ ph h, chng BGL-16 được đặt tên khoa hc
Pseudomonas sp. BGL-16.