Phổ tương quan huỳnh quang: Tổng quan và ứng dụng

PHỔ TƯƠNG QUAN HUỲNH QUANG

Trình bày: T N Hưng

Nội dung

 Lịch sử phát triển

 Tổng quan

 Nguyên lý cơ bản

 Một số phương pháp

Lịch sử phát triển

 Bắt đầu từ năm 1993, có nhiều kỹ thuật đo lường được phát triển để làm tăng tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu, và có khả năng nhạy với từng phân tử (đáng chú ý là việc sử dụng kính hiển vi đồng tiêu (confocal microscopy) và kính hiển vi kích thích hai photon (two- photon excitation microscopy)). Chính những cải tiến cách mạng này, FCS đã được nghiên cứu và phát triển rộng rãi trên khắp thế giới cho tới ngày nay.

 FCS lần đầu tiên (1972) được nhóm tác giả Magde, Elson và Webb áp dụng để đo sự khuếch tán và quá trình phản ứng hóa học của tương tác thuốc và DNA. Kỹ thuật này ngay sau đó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Tuy nhiên, ban đầu các phép đo đều gặp phải khó khăn do tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu thấp.

Tổng quan

vào

các

hạt màu

hoặc

 Khác với các kỹ thuật huỳnh quang khác, FCS không quan tâm tới cường độ phát xạ mà tập trung phân tích sự nhiễu loạn cường độ. Những nhiễu loạn ngẫu nhiên của các tham số vật lý vi mô đã gây ra nhiễu loạn cường độ phát xạ huỳnh quang. Phân tích hàm tự tương quan theo thời gian của tín hiệu cho phép định lượng được sự nhiễu loạn và từ đó xác định được các tham số động học của hệ.

 Được ứng dụng rộng rãi để phân tích động học của hệ vi mô trong hóa học, vật lý và sinh học. Ví dụ: nghiên cứu các quá trình sinh học, các protein được hợp nhất với các phân tử phát huỳnh (Rhodamine-6G, gắn quang, Fluoresceine…), hoặc chấm lượng tử.

Nguyên lý cơ bản

Khuếch tán

 Khuếch tán là hiện tượng các phân tử hoặc nguyên tử chuyển động từ vùng có mật độ cao tới vùng có mật độ thấp hơn. Quỹ đạo chuyển động của hạt khuếch tán là ngẫu nhiên.

 Hệ số khuếch tán D mô tả khả năng khuếch tán của hạt trong môi trường. Hệ số khuếch tán càng lớn, các hạt chuyển động càng nhanh. Phương trình Stokes – Einstein:

𝐷 =

𝑘𝐵𝑇 6𝜋. 𝜂. 𝑅ℎ

Rh là bán kính thủy động học, nó bằng bán kính hạt cầu tương đương có hệ số khuếch tán bằng hạt đang xem xét. Vì độ nhớt cũng là hàm của nhiệt độ nên D không tỉ lệ tuyến tính với nhiệt độ.

Khuếch tán

 Trong dung dịch, quỹ đạo của hạt có thể được mô tả bằng đại lượng dịch

chuyển bình phương trung bình (MSD):

𝑟2 = 6. 𝐷. 𝜏

 Ví dụ: Protein trong sinh chất có hệ số khuếch tán D = 50 μm2/s. Với đường kính tế bào khoảng 20 μm thì protein cần khoảng thời gian ~ 0.3 s để đi tới biên của tế bào.

• Môi trường trong tế bào phức tạp hơn (chứa các bào quan, tiểu bào, nhiễm sắc thể…). Các hạt có kích thước khác nhau tương tác với nhau trong quá trình khuếch tán:

𝑟2 = Γ. 𝜏𝛼 (0 < 𝛼 < 1) (khuếch tán dị thường)

Liên hệ giữa khuếch tán và cường độ huỳnh quang

- Số hạt huỳnh quang trong thể tích quan sát:

𝑁 𝑡 = 𝑁(𝑡) + 𝛿𝑁(𝑡)

Tại mỗi thời điểm, số hạt không thể được xác định chính xác. Phân bố số hạt trong thể tích đo tuân theo thống kê Poisson.

- Thăng giáng cường độ huỳnh quang phụ thuộc vào

thăng giáng số hạt.

𝐼 𝑡 = 𝐼(𝑡) + 𝛿𝐼(𝑡)

𝑇

𝐼(𝑡) =

න

𝐼 𝑡 𝑑𝑡

1 𝑇

Sự thăng giáng tương quan sẽ nhỏ đi nếu số hạt trung bình trong thể tích đo lớn.

Hàm tự tương quan theo thời gian

Hàm tự tương quan của Rhodamine 6G

Phổ huỳnh quang tương quan (FCS) là phương pháp phân tích tính tương quan thời gian của cường độ phát xạ huỳnh quang để nhận được các tham số động học của các quá trình vi mô.

Thông tin thu được từ FCS

(diffusion coefficients).

𝑘𝐵𝑇 6𝜋𝜂𝑟

- Hệ số khuếch tán 𝐷 =

- Bán kính thủy động học (hydrodynamic radii).

- Mật độ phân tử trung bình (average concentrations).

- Tỉ lệ phản ứng hóa học (kinetic chemical reaction rates).

- Động học tam tuyến (triplet dynamics).

Hệ FCS cơ bản

 Vật kính hiển vi có khẩu độ lớn (>

0.9).

 Gương lưỡng triết có thể quay quanh trục để điều khiển vị trí hội tụ trên mẫu. Do đó có thể quét ảnh trên một vùng mẫu quan sát. Kích thước vùng quan sát trên mẫu cỡ 1 fl. Chùm laser vào có đường kính càng lớn thì vùng tiêu điểm càng nhỏ.

 Tỉ số S/N phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: hiệu suất lọc của gương lưỡng chiết, độ rộng dải tần số của phin lọc, hiệu suất lượng tử của đầu thu...

MỘT SỐ DẠNG HÀM TỰ TƯƠNG QUAN

Hàm tự tương quan của đơn hạt khuếch tán

Hàm số tương quan của đa hạt khuếch tán

 Trong đó, ρi là tỉ lệ hạt loại i.

Hàm số tương quan của đa hạt khuếch tán

Hiệu ứng của động học tam tuyến (triplet dynamics)

ΘT là tỉ lệ hạt trong trạng thái triplet

 Từ trạng thái S1 điện tử hồi phục không phát xạ xuống trạng thái T, và sau đó hồi phục phát xạ xuống S0.

Hiệu ứng của động học tam tuyến (triplet dynamics)

 Tỉ lệ hạt trong trạng thái triplet càng lớn, cường độ cực đại hàm tự tương quan càng lớn.

Các quá trình khác phân tích từ FCS

 Quá trình nhanh nhất có thể quan sát được trong FCS là hiện tượng “antibunching”.

phân tử

 Nhiễu loạn do quá trình quay của

MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp kích thích đơn photon

Excited state

lên trạng thái kích thích.

hν

hν0

 Điện tử hấp thụ một photon để

Ground state

 Chùm laser phát từ nguồn liên diode Ag-Kr, He-Ne, tục: laser… có bước sóng trong vùng khả kiến (cỡ 400 – 700 nm).

 Tăng tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu và độ phân giải không gian bằng kính hiển vi đồng tiêu (confocal microscopy).

FCS với kính hiển vi đồng tiêu

sáng nhiễu xạ ngoài mặt phẳng tiêu.

 Sử dụng pinhole để loại bỏ thành phần ánh

 Sử dụng kính hiển vi đồng tiêu quét chúng ta có thể thu nhận được hình ảnh ba chiều của mẫu.

Phương pháp kích thích hai photon

Excited state

 Điện tử hấp thụ hai photon để lên trạng thái kích thích. Phương pháp kích thích hai photon cần bước sóng 700 – 1000 nm (vùng hồng ngoại gần).

Ground state

 Kích thích nhiều photon được tiên đoán bởi Maria Goppert-Mayer (1931). Thí nghiệm kích thích hai photon đầu tiên được thực hiện bởi Kaiser và Garret (1963).

Phương pháp kích thích hai photon

Ưu điểm:

 Xác suất hấp thụ tỉ lệ bình phương với cường độ laser kích thích. Do đó, phát xạ huỳnh quang tại vùng hội tụ lớn hơn nhiều ở các vùng nhiễu xạ xung quanh. Điều này đã loại bỏ được hầu hết tín hiệu huỳnh quang của đối tượng ngoài tiêu điểm. Nói cách khác phương pháp này cho độ phân giải không gian rất cao mà không cần pinhole như kính hiển vi đồng tiêu.

 Tế bào và các mô ít hấp thụ và tán xạ ánh sáng hồng ngoại gần nên chúng sẽ ít

bị tổn thương.

Nhược điểm:

 Kích thích hai photon là một quá trình phi tuyến, tiết diện hấp thụ nhỏ. Xác suất hấp thụ đồng thời hai photon nhỏ hơn nhiều so với đơn photon nên để tăng khả năng xảy ra thì mật độ photon phải rất lớn. Do đó, phương pháp này đòi hỏi cần có nguồn laser xung với công suất lớn. Hiện nay, người ta thường sử dụng nguồn laser Ti-sapphire phát xung ngắn cỡ fs.

Phương pháp phân tích tương quan ngang

 Nhiễu sinh ra do đầu thu hoặc nguồn laser có thể được loại bỏ bằng phương pháp phân tích tương quan ngang cường độ huỳnh quang. Ngoài ra, chúng ta có thể thu được nhiều thông tin vật lý về mẫu hơn so với phương pháp tự tương quan.

 Phương pháp này phân tích tính tương quan của hai tín hiệu huỳnh quang đồng thời được kích thích từ hai nguồn laser khác nhau.